CN116615452A - 人源化抗tdp-43结合分子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子量为43 kDa的反式激活应答DNA结合蛋白(TARDB或也称为TDP‑43)的领域。本发明涉及人源化TDP‑43特异性结合分子、特别是人源化抗TDP‑43抗体或其抗原结合片段或衍生物及其用途。本发明提供了诊断、预防、减轻和/或治疗与TDP‑43聚集体相关的包括但不限于以下的疾病、障碍和/或异常的手段和方法：额颞痴呆(FTD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、慢性创伤性脑病(CTE)和边缘主导年龄相关性TDP‑43脑病(LATE)。

Description

人源化抗TDP-43结合分子及其用途
技术领域
本发明属于分子量为43kDa的反式激活应答DNA结合蛋白(TARDB或也为TDP-43)的领域。本发明涉及人源化TDP-43特异性结合分子、特别是人源化抗TDP-43抗体或其抗原结合片段或衍生物及其用途。本发明提供了诊断、预防、减轻和/或治疗与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病(proteinopathy)的手段和方法，所述疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病包括但不限于额颞痴呆(Frontotemporal dementia，FTD)、肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、慢性创伤性脑病(Chronic Traumatic Encephalopathy，CTE)和边缘主导年龄相关性TDP-43脑病(limbic-predominant age-related TDP-43 encephalopathy，LATE)。
背景技术
以蛋白质在中枢神经***(central nervous system，CNS)(蛋白质病)和外周器官中病理性聚集为特征的年龄相关性脑病是世界上失能和死亡率的主要原因之一。形成聚集体的最佳表征的蛋白质是阿尔茨海默病和相关障碍中的β淀粉样蛋白。导致神经变性的其他疾病相关的、倾向于聚集的蛋白质包括但不限于Tau、α-突触核蛋白(aSyn、a-syn)、亨廷顿蛋白(huntingtin)、肉瘤融合蛋白(fused in sarcoma，FUS)、通过C9orf72重复扩增的非常规翻译产生的二肽重复蛋白(dipeptide repeat protein，DPR)、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)和TDP-43。涉及TDP-43聚集体的疾病通常被列为TDP-43蛋白质病，包括但不限于ALS和FTD。
I.TDP-43介绍
反式激活应答(transactive response，TAR)DNA结合蛋白43kDa(TDP-43)是由染色体1p36.2(ALS10)上的TARDBP基因编码的具有414个氨基酸的蛋白质。TARDBP由六个外显子(外显子1是非编码的；外显子2至6是蛋白质编码的)构成。TDP-43属于异质核糖核蛋白(hnRNP)RNA结合蛋白家族(Wang et al.，Trends in Molecular Medicine Vol.14 No.11，2008，479-485；Lagier-Tourenne et al.，Human Molecular Genetics，2010，Vol.19，Review Issue 1R46-R64)。TDP-43包含五个功能结构域(Warraich et al.，TheInternational Journal of Biochemistry&Cell Biology 42(2010)1606-1609，图1)：两个RNA识别基序(RRM1和RRM2)，其具有两个高度保守的六聚核糖核蛋白2(RNP2)和八聚核糖核蛋白1(RNP1)区域；核输出信号(nuclear export signal，NES)和核定位信号(nuclearlocalization signal，NLS)，使其能够在细胞核和细胞质之间穿梭，转运结合的mRNA；以及位于C-末端的富含甘氨酸的结构域，其介导蛋白质间相互作用。TDP-43涉及RNA加工的多个方面，包括转录、剪接、转运和稳定化(Buratti and Baralle，FEBS Journal 277(2010)2268-2281)。TDP-43是高度保守、普遍表达且表达水平严格自调节的蛋白质，其不断在细胞核与细胞质之间穿梭，但主要定位于细胞核。2006年，TDP-43被鉴定为在绝大部分具有tau阴性、泛素阳性包涵体的额颞叶变性(frontotemporal lobar degeneration，FTLD)(之后称为FTLD-TDP)的病例中，以及在大多数肌萎缩侧索硬化(ALS)病例中积累的蛋白质(Araiet al.，Biochemical and Biophysical Research Communications 351(2006)602-611；Neumann et al.，Science 314，(2006)，130-133)。
已在散发性和家族性ALS患者以及患有遗传性FTD的患者中鉴定了38个TDP-43负显性突变，其主要位于富含甘氨酸的结构域中(Lagier-Tourenne and Cleveland，Cell136，2009，1001-1004，图1)。TDP-43本质上是倾向聚集的，如沉降测定所示，并且这种倾向由于一些ALS相关的TARDBP突变而进一步提高(Ticozzi et al.，CNS Neurol.Disord.DrugTargets.2010，9(3)，285-296.)使TDP-43聚集与临床疾病表现相联系。
II.神经变性中的TDP-43
已在越来越多的神经退行性病症中鉴定出TDP-43聚集体(Lagier-Tourenne etal.，Human Molecular Genetics，2010，Vol.19，Review Issue 1 R46-R64)，包括但不限于：额颞痴呆(FTD，例如散发性或家族性、伴有或不伴有运动神经元疾病(motor-neurondisease，MND)、有颗粒蛋白前体(GRN)突变、有C9orf72突变、有TARDBP突变、有含缬酪肽蛋白(valosine-containing protein，VCP)突变、与9p染色体连锁、皮质基底节变性、有泛素阳性TDP-43包涵体的额颞叶变性(FTLD)(FTLD-TDP)、嗜银颗粒病(Argyrophilic graindisease)、皮克病(Pick’s disease)、语义变异型原发性进行性失语(semantic variantprimary progressive aphasia，svPPA)、行为变异型FTD(behavioural variant FTD，bvFTD)、非流利性变异型原发性进行性失语(Nonfluent Variant Primary ProgressiveAphasia，nfvPPA)，等)、肌萎缩侧索硬化(ALS，例如散发性ALS、有TARDBP突变、有血管生成蛋白(angiogenin，ANG)突变)、亚历山大病(Alexander disease，AxD)、边缘主导年龄相关性TDP-43脑病(LATE)、慢性创伤性脑病(CTE)、佩里综合征(Perry syndrome)、阿尔茨海默病(AD，包括散发性和家族性形式的AD)、唐氏综合征(Down syndrome)、家族性英国型痴呆(Familial British dementia)、多聚谷氨酰胺病(亨廷顿病和脊髓小脑共济失调3型(SCA3(spinocerebellar ataxia type 3)；也称为马-约病(Machado Joseph Disease)))、海马硬化性痴呆和肌病(散发性包涵体肌炎；包涵体肌病，有含缬酪肽蛋白突变(VCP；以及佩吉特骨病(Paget disease of bone)和额颞痴呆)；有镶边空泡的眼咽肌营养不良；有肌收缩蛋白(MYOT)基因突变或编码结蛋白(DES)之基因的突变的肌原纤维肌病))、创伤性脑损伤(Traumatic Brain Iniury，TBI)、路易体痴呆(Dementia with Lewy Body，DLB)或帕金森病(PD)。术语LATE旨在涵盖与TDP-43蛋白质病相关的几个先前使用的名称，这些名称可能与认知损害相关，包括海马硬化、衰老性海马硬化、海马硬化性痴呆、脑年龄相关性TDP-43及硬化(CARTS)，和老年人中的TDP-43病理状况(综述参见Kuslansky et al.，2004；Lippaand Dickson，2004；Nelson et al.，2013，2016b；Dutra et al.，2015)。
来自患者脑的聚集TDP-43显示出大量异常修饰，包括过度磷酸化、泛素化、乙酰化和通过蛋白水解切割的C-末端片段(Arai et al.，Biochemical and BiophysicalResearch Communications 351(2006)602-611；Neumann et al.，Science 314，(2006)，130-133；Neumann et al.，Acta Neuropathol.(2009)117：137-149；Hasegawa et al.，(2008)Annals of Neurology Vol 64No 1，60-70；Cohen et al.，Nat Commun.6：5845，2015)。TDP-43病理状况的另一个特征性特征是TDP-43从细胞核到细胞质的重分布和积累。FTLD-TDP的标志性病变是神经元胞质包涵体和胶质细胞胞质包涵体(分别为NCI(neuronalcytoplasmic inclusion)和GCI(glial cytoplasmic inclusion))和营养不良性神经突(dystrophic neurite，DN)，其对TDP-43以及泛素和p62具有免疫反应性，但对其他神经退行性疾病相关蛋白呈阴性。包涵体形态及其组织分布的差异与特定突变和/或临床表现相关。迄今为止，通过组织学分类描述了四种类型的TDP-43病理状况(Mackenzie andNeumann，J.Neurochem.(2016)138(增刊1)，54-70)。FTLD-TDP A型病例的特征在于大量的短的营养不良性神经突(dystrophic neuritis，DN)和紧凑的椭圆形或新月形NCI，主要在新皮质II层(Mackenzie et al.，2016 J.Neurochem.138(增刊1)，54-70，图2f)。这种病理的情况通常在临床上在行为变异型额颞痴呆(bvFTD)或非流利性/语法变异型原发性进行性失语(nfvPPA)的情况下出现，并且与颗粒蛋白前体(GRN)突变相关。B型病例在浅表和深皮质层二者中均显示出中等数目的紧凑或颗粒状NCI，且具有相对较少的DN和NII(神经元核内包涵体(neuronal intranuclear inclusion)；Mackenzie et al.，2016J.Neurochem.138(增刊1)，54-70，图2g)。发现大多数同时出现FTD和ALS症状的病例具有FTLD-TDP B型病理。C型病例有大量长而弯曲的神经突，主要在浅表皮质层中，具有很少或没有NCI(Mackenzie et al.，2016 J.Neurochem.138(增刊1)，54-70，图2j)。这种病理特别地在出现语义变异型原发性进行性失语(svPPA)的病例中发现。FTLD-TDP D型显示在新皮质层中具有丰富的豆状神经元核内包涵体(NII)和短的DN，且具有仅稀少的NCI(Mackenzieet al.，2016J.Neurochem.138(增刊1)，54-70，图2k)。E型的特征在于：除白质中的曲线性少突胶质细胞包涵体之外还有颗粒丝状神经元包涵体(granulofilamentous neuronalinclusion，GFNI)和非常细的点状神经毡聚集体，其影响所有新皮质层(Edward B.Lee etal.，Acta Neuropathol.2017 July；134(1)：65-78.)。这种病理模式仅在VCP与包涵体肌炎相关的病例中发现。
III.FTD中的TDP-43
额颞痴呆(FTD)是一个临床术语，其涵盖基于额和颞叶的变性-称为额颞叶变性(FTLD)的病理性特征的广谱障碍。FTD是65岁以下年龄组中早期退行性痴呆的第二大最主要原因(Le Ber，Revue Neurologique 169(2013)811-819)。FTD表现为数种综合征，包括以人格和行为变化为特征的bvFTD；以语言功能变化为特征的语义痴呆(semantic dementia，SD)和进行性非流利性失语(progressive nonfluent aphasia，PNFA)；以运动功能障碍为特征的皮质基底节综合征(corticobasal syndrome，CBS)、进行性核上性麻痹综合征和运动神经元疾病(FTD-MND)。这些综合征的临床诊断复杂并且最终结论只能通过进行死后组织病理学分析以检测聚集的蛋白质并确定受影响的脑区域而得出。就病理性蛋白质包涵体而言，约45％的病例显示出错折叠Tau的病理性积累，45％的病例具有病理性TDP-43并且较小的亚组具有FUS和其他蛋白质的聚集体。
IV.ALS中的TDP-43
肌萎缩侧索硬化(ALS)是一种神经退行性疾病，其特征在于上和下运动神经元的过早丧失。ALS的进展以致命性麻痹和呼吸衰竭为特征，其病程从诊断到死亡为1至5年。在大多数散发性ALS病例中，该神经病理的特征在于初级运动皮质、脑干运动核、脊髓和相关白质道的神经元和胶质细胞中TDP-43的异常细胞质积累。伴有痴呆的ALS涉及运动外新皮质和海马中TDP-43的积累。TDP-43磷酸化在ALS患者中的作用已借助于抗体进行了探索，所述抗体与细胞核和细胞质包涵体中磷酸化TDP-43特异性结合，其中氨基酸S379、S403、S404、S409、S410为TDP-43磷酸化的主要位点(Hasegawa et al.，Ann Neurol 2008；64：60-70；Neumann et al.，Acta Neuropathol(2009)117：137-149)。
V.AD和其他疾病中的TDP-43
TDP-43病理状况发生在多达57％的患有阿尔茨海默病的患者的脑中(Josephs KAet al.，Acta Neuropathol.2014；127(6)：811-824；Josephs KA et al.，ActaNeuropathol.2014；127(3)：441-450；McAleese et al.，Brain Pathol.2017Jul；27(4)：472-479)。TDP-43聚集与患者的年龄相关，并且与AD中认知下降、记忆丧失和颞内侧萎缩相关。显然，在AD中，TDP-43代表与颞叶内侧中β淀粉样蛋白和tau病理共有重叠脑分布的第二或独立的病理。病理性TDP-43遵循常规的进行性沉积模式，这种模式已通过所谓的AD中TDP-43(TAD)分期方案进行了描述：TDP-43首先在杏仁核中沉积(I期)，然后在海马、边缘、颞并且最终是额叶纹状体(frontostriatum)(V期)中沉积(Josephs KA et al.，ActaNeuropathol.2014；127(6)：811-824；Josephs KA et al.，Acta Neuropathol.2014；127(3)：441-450)。
VI.TDP-43扩散
尽管ALS和FTD发作和初始症状在患者间明显不同，但疾病进展的共同特征是病理从最初的病灶区域向大多数神经元扩散。症状的持续恶化可通过TDP-43病理状况的进行性扩散来解释。ALS患者脑中的TDP-43病理状况显示以四阶段过程扩散并且认为使用顺行轴突运输通过离皮质轴突透射经突触发生传播(Brettschneider et al.，Ann Neurol.2013July；74(1)：20-38.)。最近的实验证据支持β淀粉样蛋白、Tau、α-突触核蛋白和TDP-43通过朊病毒样机制在神经元组织中进行蛋白质传播的假设(Hasegawa et al.，2017)，其中起点和地形学扩散模式对于四种蛋白质是不同的(Brettschneider J et al.，NatureRev.Neuroscience，2015，109)。认为常见的疾病统一机制是基于病理性蛋白质聚集体的细胞间扩散。该机制由以下组成：聚集体从病变细胞释放，被幼稚细胞摄取，以及通过内源性蛋白质的模板化构象变化对病理性蛋白质构象进行播种(seed)。
TDP-43细胞间扩散已在分子水平上在少数体外模型中进行了研究，其中来自患者脑的不溶性TDP-43制备物能够诱导接受体细胞中的细胞内聚集体形成(Nonaka et al.，Cell Reports 4(2013)，124-134；Feiler et al.，2015；Porta et al.，Nat.Comm.，2018)。此外，已观察到细胞内TDP-43聚集体在扩散至下一个细胞之前与外排体联合释放(Nonakaet al.，Cell Reports 4(2013，124-134))。类似地，腺病毒转导的TDP-43表达导致磷酸化、泛素化且更重要地充当启动细胞间扩散的种子(seed)的细胞质聚集体(Ishii et al.，PLoS ONE 12(6)：e0179375，2017)。患者来源的病理性TDP-43在颅内接种到转基因小鼠和野生型小鼠之后可导致内源性TDP-43广泛沉积(Porta et al.，Nat.Comm.，2018)。
VII.TDP-43蛋白质病的预防和治疗
TDP-43聚集和病理扩散是ALS和FTD-目前不可治愈的致命性疾病的主要标志。因此，需要新的方法来治疗和预防TDP-43蛋白质病。TDP-43中的突变与ALS和FTD的家族性病例相关，提供了TDP-43错折叠与疾病进展之间的因果联系。
VIII.TDP-43蛋白质病的诊断
基于临床表现的FTD诊断是不充分的，因为临床表现可与其他疾病重叠，特别是在早期阶段。
许多方法旨在开发生物化学生物标志物来区分不同类型的FTD病理。针对TDP-43不同构象的抗体的开发可允许产生更加灵敏且特异性的诊断工具。与生物化学生物标志物并行，成像生物标志物的开发能够实现TDP-43蛋白质病中病理的早期且特异性检测。对脑中TDP-43沉积成像的能力可为TDP-43蛋白质病的诊断和药物开发的重大成就。使用细胞可渗透的抗体片段可实现这样的检测。
基于不同蛋白质的错折叠的神经退行性疾病中最早的事件是获得使蛋白质有毒的替代构象。此外，这种错折叠的构象可通过将内源性正常蛋白质募集到错折叠的构象中而自传播，作为观察到的通过受影响组织扩散的机制基础。
为了开发针对给定蛋白质的不同构象状态的抗体，设计了超分子抗原性构建体，其中控制所呈递抗原的构象以产生针对特定构象状态下给定靶标的构象特异性抗体(WO2012/055933和WO2012/020124)。构象特异性抗体提供许多优势，因为其可区分这些蛋白质的疾病相关构象与功能性内源性构象。该方法在治疗应用中提供了许多优势，因为这样的抗体在靶向蛋白质的错折叠疾病相关异形体的同时不太可能被其正常构象吸引。与此类似，在诊断应用中，这样的抗体仅识别蛋白质的疾病相关结构状态，这对于灵敏且特异性的诊断的开发至关重要。
基于TDP-43的生物标志物在TDP-43蛋白质病中的应用仍有待建立。这样的评价受到阻碍，部分是由于缺乏可用于合适免疫测定中用来对生物流体中病理性TDP-43进行定量的高亲和力抗体(Feneberg et al.，Molecular Neurobiology，2018)。
因此，明确需要能够检测，特别是在人样品中检测错折叠的聚集TDP-43和非聚集生理性TDP-43的生物标志物，用于诊断不同类型的TDP-43蛋白质病和/或用于监测用于治疗与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和异常、或TDP-43蛋白质病的治疗药物的效力。
TDP-43蛋白质病定义为一组以病理性TDP-43为特征的神经退行性疾病。
IX.现有技术
专利申请WO 2008/151055公开了使用生物流体中TDP-43多肽和/或TDP-43多肽切割产物(例如25kD和35kD TDP-43多肽切割产物)的水平来确定哺乳动物是否患有神经退行性疾病的方法和材料。
专利申请WO 2013/061163公开了TDP-43特异性结合分子，其包括多肽例如人抗体及其片段、衍生物和变体。
发明内容
鉴于上述内容，存在对结合错折叠的聚集TDP-43和非聚集的生理性TDP-43的人源化抗TDP-43结合分子的需求。这样的人源化结合分子、特别是抗体及其抗原结合片段可与人TDP-43(SEQ ID NO：1)的特定表位结合。此外，开发可区分FTD谱内病理状况类型的敏感和特异性生物标志物是一项紧迫的任务。
本文中提供的一些实施方案解决了该技术问题。
本发明的结合分子是鼠抗体的人源化形式，特别地，它们是与人TDP-43(SEQ IDNO：1)结合的鼠单克隆抗体的人源化形式。选择本文中称为ACI-7069-633B12-Ab1的抗体来开发人源化结合分子。如本文中所述，该抗体源自杂交瘤克隆633B12C8。它与人TDP-43(SEQID NO：1)的第397至411位氨基酸内的表位结合。更特别地，它与来自人TDP-43(SEQ ID NO：1)的第400至405位氨基酸的表位结合。该抗体具有SEQ ID NO：28中所示的VH核苷酸序列和SEQ ID NO：29中所示的VL核苷酸序列(由其编码)，参见本文中表10。该抗体具有SEQ IDNO：20中所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO：24中所示的VL氨基酸序列，参见本文中表11。该抗体具有SEQ ID NO：21中所示的VH CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：22中所示的VH CDR2氨基酸序列和ES的VH CDR3氨基酸序列，参见本文中表11。该抗体具有SEQ ID NO：25中所示的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：16中所示的VL CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：27中所示的VLCDR3氨基酸序列，参见本文中表11。
所选择的CDR序列可在特定位置处发生突变。在一些实施方案中，进行这样的突变以避免潜在的翻译后修饰位点。在一些具体的实施方案中，以下残基中的一个或更多个、直至所有在VH区(CDRH2)中发生突变：N53、N54和G55。一些具体突变包括：N53G、N53S、N53Q、N54Q、N54G和G55A。残基根据Kabat进行编号。在一些具体的实施方案中，以下残基中的一个或更多个、直至所有在VL区(CDRL1和/或CDRL2和/或CDRL3)中发生突变：K24、D28、G29、D55、S56和W89。残基根据Kabat进行编号。一些具体突变包括：K24R、D28E、D28G、G29A、D55E、S56A、W89Y、W89F和W89L。
在一些具体的实施方案中，本发明的人源化结合分子、特别是人源化抗体或其抗原结合片段包含人重链可变结构域亚家族1框架序列。更特别地，本发明的人源化结合分子、特别是人源化抗体或其抗原结合片段可包含IGHV1-3(IMGT登录号X62109、X62107、MK540645、MH779622和MN337616；UniProtKB-A0A0C4DH29)、IGHV1-2(IMGT登录号X07448、X62106、X92208、KF698733、HM855674、MH267285和MN337615；UniProtKB-P23083)、IGHV1-46(IMGT登录号X92343、J00240、L06612和MK540650；UniProtKB-P01743)或IGHV1-24(IMGT登录号M99642；UniProtKB-A0A0C4DH33)VH框架序列，优选IGHV1-3VH框架序列。
在一些具体的实施方案中，本发明的人源化结合分子、特别是人源化抗体或其抗原结合片段包含人轻链可变结构域κ亚家族2框架序列。更特别地，本发明的人源化结合分子、特别是人源化抗体或其抗原结合片段可包含IGKV2-30(IMGT登录号X63403和FM164408；UniProtKB-P06310)、IGKV2-29(IMGT登录号X63396、U41645和AJ783437；UniProtKB-A2NJV5)、IGKV2D-29(IMGT登录号M31952和U41644；UniProtKB-A0A075B6S2)或IGKV2-24(IMGT登录号X12684；UniProtKB-A0A0C4DH68)VL框架序列，优选IGKV2-30或IGKV2-29 VL框架序列，最优选IGKV2-30 VL(IMGT登录号X63403和FM164408)框架序列，特别是IGKV2-30*02 VL(IMGT登录号FM164408)框架序列。
所选择的框架序列可在特定位置处发生突变。在一些实施方案中，进行这样的突变以积极影响CDR环构象和/或VH和VL结构域之间的可变结构域堆积(packing)。在某些实施方案中，下表12中所列的根据Kabat编号的残基中的一个或更多个、直至所有发生突变。在一些具体的实施方案中，进行了根据Kabat编号的以下VH突变中的一个或更多个、直至所有：Q1E、A24T、R38K、P41H、M48I、V67A、I69L、R71V、T73K。在可与VH突变组合的一些具体实施方案中，进行了以下VL突变(根据Kabat编号)中的一个或更多个、直至所有：R24K、F36L、R45K、G57R、V58I。
因此，本发明涉及特异性识别错折叠的聚集TDP-43和非聚集生理性TDP-43的人源化结合分子、特别是人源化抗体或其抗原结合片段。在本发明中，错折叠的TDP-43包括错折叠的单体TDP-43和/或错折叠的寡聚TDP-43和/或错折叠的聚集和/或经翻译后修饰的TDP-43和/或错折叠的截短TDP-43。经翻译后修饰的TDP-43包含磷酸化、泛素化、乙酰化、类泛素化和/或甲基化的TDP-43。生理性TDP-43包括可溶性细胞核TDP-43。本文中表明，本发明的人源化结合分子能够结合病理性TDP-43，包括TDP-43聚集体和磷酸化TDP-43。因此，本发明提供了特异性识别错折叠的聚集TDP-43和非聚集生理性TDP-43的人源化结合分子、特别是人源化抗体或其抗原结合片段。这样的结合分子在本文中称为人源化“泛-TDP-43”结合分子、特别是人源化泛-TDP-43抗体。如本文中说明的，本发明的人源化TDP-43结合分子可同等地结合错折叠的聚集TDP-43和非聚集生理性TDP-43，或者在与两种类型的TDP-43特异性结合时相对于一者优先与另一者结合。本发明还提供了用于预防、减轻、治疗和/或诊断与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和异常、或TDP-43蛋白质病的人源化结合分子、特别是人源化抗体或其抗原结合片段。本发明还提供了用于检测和/或了解(即鉴定)引起神经变性的特定病理类型的人源化结合分子、特别是人源化抗体或其抗原结合片段。设想了用作诊断性生物标志物，实现临床研究中纵向监测的更有效且精确的对象选择，支持TDP-43蛋白质病的新治疗的开发的用途。
本发明还提供了作为药物(治疗剂)的人源化TDP-43结合分子、特别是人源化抗体或其抗原结合片段。
不希望受理论束缚，本发明是基于以下假设而开发的：来源于TDP-43蛋白的经修饰构象特异性抗原性肽和肽片段或整个TDP-43蛋白以及可通过或通过使用所述肽或片段或整个TDP-43蛋白作为抗原而获得的人源化抗体阻断TDP-43细胞间传播，和/或使TDP-43聚集体解聚和/或阻断TDP-43播种和/或抑制TDP-43蛋白或其片段的聚集。本发明的人源化结合分子、特别是人源化多肽、更特别是人源化抗体或其抗原结合片段，与错折叠的聚集TDP-43，特别是与细胞质错折叠TDP-43和细胞外错折叠TDP-43结合。本发明的人源化结合分子、特别是人源化多肽、更特别是人源化抗体或其抗原结合片段，与全长TDP-43和/或截短的TDP-43结合。在一个实施方案中，本发明的人源化结合分子、特别是人源化多肽、更特别是人源化抗体或其抗原结合片段，与细胞质错折叠TDP-43特异性结合。
错折叠的聚集TDP-43或病理相关TDP-43由失去其正常折叠(即是错折叠的)和定位的TDP-43蛋白构成。错折叠的聚集TDP-43可在以下中发现：前包涵体(preinclusion)，以及神经元胞质包涵体和胶质细胞胞质包涵体(分别为NCI和GCI)、神经元核内包涵体(NII)和营养不良性神经突(DN)，其对TDP-43具有免疫反应性。
非聚集生理性TDP-43是主要位于细胞核并穿梭至细胞质，处于能够在体内细胞环境中展示其期望功能的状态的生理功能性TDP-43蛋白。
本发明的人源化TDP-43结合分子、特别是人源化抗TDP-43抗体或其抗原结合片段，出乎意料地具有以下特征中的至少一个，优选两个，更优选三个，甚至更优选全部四个：
-阻断TDP-43细胞间传播；
-使TDP-43聚集体解聚；
-抑制TDP-43蛋白或其片段的聚集；
-阻断TDP-43播种；
-阻断TDP-43扩散。
独立于一个、两个、三个、四个或五个上述列举特征的组合，本发明的人源化抗TDP-43结合分子，优选人源化抗TDP-43抗体或其抗原结合片段，可改善/抑制/降低TDP-43蛋白质病体内模型中并且更重要地患有TDP-43病理状况的患者中TDP-43病理状况的形成。
人源化抗TDP-43结合分子与人TDP-43(SEQ ID NO：1)的第397至411位氨基酸内的区域结合，更特别地，人源化TDP-43结合分子与人TDP-43(SEQ ID NO：1)第400至405位氨基酸残基内的表位结合。
在一些实施方案中，本发明的人源化TDP-43结合分子包含：
-包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；和
-包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3。
本发明尤其另外涉及：(i)包含人源化TDP-43结合分子的免疫缀合物，(ii)包含人源化TDP-43结合分子的经标记抗体，(iii)包含人源化TDP-43结合分子和可药用载体和/或赋形剂和/或稀释剂的药物组合物，(iv)人源化TDP-43结合分子，其用于人用或兽用药物用途，(v)人源化TDP-43结合分子，其用于预防、减轻、治疗与TDP-43相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病，(vi)人源化TDP-43结合分子，其用于诊断用途(特别是用于体内诊断，但也用于体外测试)，(vii)人源化TDP-43结合分子，其用于研究用途，特别是作为分析工具或参考分子，(viii)人源化TDP-43结合分子，其用作监测与TDP-43相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病的诊断工具，(ix)通过用人源化TDP-43结合分子治疗患有与TDP-43相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病的个体来在所述个体中保持或提高认知记忆能力或减缓记忆丧失的方法，(x)通过用人源化TDP-43结合分子治疗所述个体来降低个体中聚集TDP-43和/或磷酸化TDP-43水平的方法，(xi)编码人源化TDP-43结合分子的核酸分子，(xii)包含本发明核酸分子的重组表达载体，(xiii)包含本发明核酸和/或载体的宿主细胞，(xiv)包含本发明重组表达载体的无细胞表达***，(xv)用于产生人源化TDP-43结合分子的方法，(xvi)使用人源化TDP-43结合分子对从对象获得的样品中的TDP-43进行定量的方法，以及(xvii)包含本发明的人源化TDP-43结合分子和/或核酸、表达载体、宿主细胞和/或用于产生它们的无细胞表达***的试剂盒。
本发明的人源化TDP-43结合分子、特别是人源化抗TDP-43抗体或其抗原结合片段，可募集和/或激活小胶质细胞。更特别地，本发明的人源化TDP-43结合分子可在细胞尺寸和活化状态方面影响小胶质细胞形态。这可有助于由本发明的TDP-43结合分子表明的TDP-43病理状况降低。
在本发明中，人源化结合分子、特别是人源化抗体或其抗原结合片段，特异性识别TDP-43。本发明的人源化结合分子包括对TDP-43蛋白具有特异性的人源化多肽和/或人源化抗体和/或其抗原结合片段。“特异性识别TDP-43”意指，与其他表位相比，本发明的人源化结合分子特异性地、一般地且共同地以更大的亲和力与TDP-43，特别是TDP-43中的一些表位，特别是TDP-43蛋白的以一种或更多种病理性构象暴露/可及的表位结合。本发明的与TDP-43特异性结合的人源化结合分子、特别是人源化多肽，更特别是人源化抗体或其抗原结合片段，特异性识别错折叠的聚集TDP-43和非聚集生理性TDP-43。
本发明的人源化TDP-43结合分子，特别是人源化抗体或其抗原结合片段，与非聚集生理性TDP-43和聚集TDP-43二者结合。因此，本发明的人源化TDP-43结合分子，特别是人源化抗体或其抗原结合片段，可与可溶性TDP-43和聚集TDP-43大致同等良好地结合。本发明的人源化TDP-43结合分子，特别是人源化抗体或其抗原结合片段，与非聚集TDP-43相比，可与聚集TDP-43大致同等地结合。更具体地，本发明的人源化TDP-43结合分子，特别是人源化抗体或其抗原结合片段，与细胞核中的非聚集TDP-43相比，可与细胞质中的聚集TDP-43大致同等地结合。在另一些实施方案中，当与两种类型的TDP-43结合时，本发明的人源化TDP-43结合分子，特别是人源化抗体或其抗原结合片段，与非聚集TDP-43相比，可优先与聚集TDP-43结合。更具体地，当与两种类型的TDP-43结合时，本发明的人源化TDP-43结合分子，特别是人源化抗体或其抗原结合片段，与细胞核中的非聚集TDP-43相比，可优先与细胞质中的聚集TDP-43结合。或者，在另一些实施方案中，当与两种类型的TDP-43结合时，本发明的人源化TDP-43结合分子，特别是人源化抗体或其抗原结合片段，与聚集TDP-43相比，可优先与非聚集TDP-43结合。更特别地，当与两种类型的TDP-43结合时，本发明的人源化TDP-43结合分子，特别是人源化抗体或其抗原结合片段，与细胞质中聚集TDP-43相比，可优先与细胞核中的非聚集TDP-43结合。这些结合特性可例如使用免疫组织化学来证明。
在一些实施方案中，本发明涵盖特异性结合TDP-43的本文中所述的本发明的人源化结合分子、特别是人源化抗体及其抗原结合片段，以及这些人源化结合分子诊断、预防、减轻和/或治疗与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病的用途，所述疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病包括但不限于：额颞痴呆(FTD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、慢性创伤性脑病(CTE)和边缘主导年龄相关性TDP-43脑病(LATE)。本文中公开的方法和组合物可应用于诊断、预防、减轻和/或治疗与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病，包括但不限于额颞痴呆(FTD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)。优选地，这些人源化结合分子诊断、预防、减轻和/或治疗与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病的用途针对肌萎缩侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病(AD)或额颞痴呆(FTD)。更优选地，该用途针对肌萎缩侧索硬化(ALS)。更优选地，该用途针对阿尔茨海默病(AD)。更优选地，该用途针对额颞痴呆(FTD)。
在另一个实施方案中，使对TDP-43具有特异性的本文中所述的本发明的人源化TDP-43结合分子、特别是人源化抗TDP-43抗体或其抗原结合片段与样品接触以检测、诊断和/或监测与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病，其选自额颞痴呆(FTD，例如散发性或家族性、伴有或不伴有运动神经元病(MND)、有颗粒蛋白前体(GRN)突变、有C9orf72突变、有TARDBP突变、有含缬酪肽蛋白(VCP)突变、与9p染色体连锁、皮质基底节变性、有泛素阳性TDP-43包涵体的额颞叶变性(FTLD)(FTLD-TDP)、嗜银颗粒病、皮克病、语义变异型原发性进行性失语(svPPA)、行为变异型FTD(bvFTD)、非流利性变异型原发性进行性失语(nfvPPA)，等)、肌萎缩侧索硬化(ALS，例如散发性ALS、有TARDBP突变、有血管生成蛋白(ANG)突变)、亚历山大病(AxD)、边缘主导年龄相关性TDP-43脑病(LATE)、慢性创伤性脑病、佩里综合征、阿尔茨海默病(AD，包括散发性和家族性形式的AD)、唐氏综合征、家族性英国型痴呆、多聚谷氨酰胺病(亨廷顿病和脊髓小脑共济失调3型(SCA3；也称为马-约病))、海马硬化性痴呆和肌病(散发性包涵体肌炎、包涵体肌病，有含缬酪肽蛋白(VCP)突变；以及佩吉特骨病和额颞痴呆)、有镶边空泡的眼咽肌营养不良、有肌收缩蛋白(MYOT)基因突变或编码结蛋白(DES)之基因的突变的肌原纤维肌病、创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(DLB)或帕金森病(PD)。
在一个实施方案中，本发明涵盖特异性结合TDP-43的本文中所述的本发明的人源化结合分子、特别是人源化抗体或其抗原结合片段，以及这些人源化结合分子，特别是这些人源化抗体检测样品中TDP-43的存在的用途。因此，本发明的人源化TDP-43结合分子，例如本文中所述的人源化抗TDP43抗体可特别用于针对样品中TDP-43的存在筛选临床样品，特别是人血液、CSF、组织间液(interstitial fluid，ISF)和/或尿，例如，通过使用基于ELISA的测定或表面适应测定进行。在一些情况下，可使用组织样品，例如脑组织样品。本发明的方法和组合物还可应用于诊断症状前疾病和/或监测疾病进展和/或治疗效力。根据一些实施方案，使对TDP-43具有特异性的人源化抗体(例如，全长人源化抗体或人源化抗体的TDP-43结合片段或衍生物)与样品(例如，血液、脑脊液(CSF)、组织间液(ISF)或脑组织)接触以检测、诊断和/或监测额颞痴呆(FTD，例如散发性或家族性、伴有或不伴有运动神经元病(MND)、有颗粒蛋白前体(GRN)突变、有C9orf72突变、有TARDBP突变、有含缬酪肽蛋白(VCP)突变、与9p染色体连锁、皮质基底节变性、有泛素阳性TDP-43包涵体的额颞叶变性(FTLD)(FTLD-TDP)、嗜银颗粒病、皮克病、语义变异型原发性进行性失语(svPPA)、行为变异型FTD(bvFTD)、非流利性变异型原发性进行性失语(nfvPPA)，等)、肌萎缩侧索硬化(ALS，例如散发性ALS、有TARDBP突变、有血管生成蛋白(ANG)突变)、亚历山大病(AxD)、边缘主导年龄相关性TDP-43脑病(LATE)、慢性创伤性脑病、佩里综合征、阿尔茨海默病(AD，包括散发性和家族性形式的AD)、唐氏综合征、家族性英国型痴呆、多聚谷氨酰胺病(亨廷顿病和脊髓小脑共济失调3型(SCA3；也称为马-约病))、海马硬化性痴呆和肌病(散发性包涵体肌炎、包涵体肌病，有含缬酪肽蛋白(VCP)突变；以及佩吉特骨病和额颞痴呆)、有镶边空泡的眼咽肌营养不良、有肌收缩蛋白(MYOT)基因突变或编码结蛋白(DES)之基因的突变的肌原纤维肌病、创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(DLB)或帕金森病(PD)。本发明的人源化TDP-43结合分子可用于对合适样品，特别是临床样品，例如血液、CSF、ISF或尿中的TDP-43进行定量，其中与合适的对照相比，相对高的TDP-43水平指示患病和/或患有较晚期的疾病。许多合适的免疫测定形式是已知的。因此，可出于诊断目的进行该方法(例如ELISA、MSD(中尺度发现(MesoScale Discovery))、HTRF(均相时间分辨荧光(Homogeneous Time ResolvedFluorescence))和AlphaLISA)，其中高TDP-43水平指示患病。或者，可出于监测目的进行该方法。随时间提高的水平可指示疾病进展。随时间降低的水平可指示疾病消退。该方法还可用于监测治疗，特别是监测特定治疗的效力。成功的治疗可参考治疗之后稳定或下降的TDP-43水平来测量。本文中表明(实施例12)，来自TDP-43蛋白质病患者的CSF样品中的TDP-43水平高于取自健康对象(健康对照)的对照样品中的。对照样品可以或可以不与受试样品并行运行。在一些实施方案中，对照水平是在类似或相同的实验条件下由取自健康对象的一系列对照样品确定的，并且用作在受试样品中确定的水平的比较水平。使用本发明的人源化结合分子对合适样品中TDP-43进行定量的方法也可用于选择治疗(用于对象的另外的治疗)。因此，设想了个性化治疗方法。在治疗之前和之后取样。如果使用该治疗的治疗导致在治疗之后稳定或优选降低的TDP-43水平，则可为该对象选择该治疗。如果该治疗在治疗之后不导致稳定或优选降低的TDP-43水平，则不为对象选择该治疗。该治疗可以是用于治疗TDP-43蛋白质病的任何合适的候选治疗剂。在一些优选实施方案中，所述治疗包含本发明的人源化TDP-43结合分子，通常以如本文中所述的药物组合物的形式。
本发明的人源化TDP-43结合分子还可用于将疾病分类为特定类型或亚型。因此，提供了用于对与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常进行分类或用于对TDP-43蛋白质病进行分类的方法，其包括：
a.进行本发明的方法，其中与合适的对照相比较地对TDP-43的水平进行定量；
b.任选地鉴定来自对象的样品中的突变，包括但不限于颗粒蛋白前体(GRN)突变、C9orf72突变、TARDBP突变、有含缬酪肽蛋白(VCP)突变、TARDBP突变、血管生成蛋白(ANG)突变)、含缬酪肽蛋白(VCP)突变、肌收缩蛋白(MYOT)基因突变或编码结蛋白(DES)之基因的突变；以及
c.对与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病进行分类。
类似地，提供了用于对与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常进行分类或用于对TDP-43蛋白质病进行分类的方法，其包括：进行本发明的方法，其中对从患有与TDP-43相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病的对象获得的样品中的TDP-43的水平进行定量，其中将该水平与取自患有不同类型或亚型的与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病的对象的对照样品(即，针对目标类型或亚型确定一组代表性对照水平)进行比较；并基于比较结果对与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病进行分类。因此，分类基于确定受试样品与一个或更多个对照样品之间的最接近的匹配。这些方法还可包括鉴定样品中的突变，包括但不限于颗粒蛋白前体(GRN)突变、C9orf72突变、TADBP突变、有含缬酪肽蛋白(VCP)突变、TARDBP突变、血管生成蛋白(ANG)突变)、含缬酪肽蛋白(VCP)突变、肌收缩蛋白(MYOT)基因突变或编码结蛋白(DES)的基因的突变，其中鉴定出的突变也用于对与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病进行分类。为免生疑问，对样品中突变的鉴定可通过任何合适的方法进行；例如，基于样品内核酸分子的核酸测序。样品可与其中测定TDP-43水平的样品分开和不同，但来自同一对象。
在另一些实施方案中，本发明提供了用于预防、减轻和/或治疗与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病的方法。根据一个实施方案，本发明的方法包括向对象施用有效浓度的本文中所述的对TDP-43具有特异性的本发明的人源化结合分子、特别是人源化抗体(例如，全长抗体或抗体的TDP-43结合片段或衍生物)。在另一个实施方案中，本发明提供了用于预防、减轻和/或治疗TDP-43蛋白质病的方法。根据一些实施方案，施用对TDP-43具有特异性的本文中所述的人源化结合分子、特别是本发明的人源化抗体或其抗原结合片段，以治疗、减轻和/或预防额颞变性(FTD)或肌萎缩侧索硬化(ALS)。在另一个实施方案中，施用对TDP-43具有特异性的本文中所述的人源化结合分子、特别是本发明的人源化抗体或其抗原结合片段以预防、减轻和/或治疗选自以下的神经退行性疾病：额颞痴呆(FTD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病(AD，包括散发性和家族性形式的AD)、帕金森病(PD)、慢性创伤性脑病(CTE)、边缘主导年龄相关性TDP-43脑病(LATE)。
在另一个实施方案中，施用对TDP-43具有特异性的本文中所述的人源化结合分子、特别是本发明的人源化抗体或其抗原结合片段以预防、减轻和/或治疗选自以下的疾病：额颞痴呆(FTD，例如散发性或家族性、伴有或不伴有运动神经元病(MND)、有颗粒蛋白前体(GRN)突变、有C9orf72突变、有TARDBP突变、有含缬酪肽蛋白(VCP)突变、与9p染色体连锁、皮质基底节变性、有泛素阳性TDP-43包涵体的额颞叶变性(FTLD)(FTLD-TDP)、嗜银颗粒病、皮克病、语义变异型原发性进行性失语(svPPA)、行为变异型FTD(bvFTD)、非流利性变异型原发性进行性失语(nfvPPA)，等)、肌萎缩侧索硬化(ALS，例如散发性ALS、有TARDBP突变、有血管生成蛋白(ANG)突变)、亚历山大病(AxD)、边缘主导年龄相关性TDP-43脑病(LATE)、慢性创伤性脑病、佩里综合征、阿尔茨海默病(AD，包括散发性和家族性形式的AD)、唐氏综合征、家族性英国型痴呆、多聚谷氨酰胺病(亨廷顿病和脊髓小脑共济失调3型(SCA3；也称为马-约病))、海马硬化性痴呆和肌病(散发性包涵体肌炎、包涵体肌病，有含缬酪肽蛋白(VCP)突变；以及佩吉特骨病和额颞痴呆)、有镶边空泡的眼咽肌营养不良、有肌收缩蛋白(MYOT)基因突变或编码结蛋白(DES)之基因的突变的肌原纤维肌病、创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(DLB)或帕金森病(PD)。
具体实施方式
X、定义
本文中使用的“抗原结合分子”是可与抗原、特别是TDP-43特异性或选择性结合的任何分子。结合分子可包括或可以是抗体或其片段。抗TDP-43结合分子是在特定识别位点(表位)与TDP-43蛋白结合的分子，例如抗TDP-43抗体或其片段。即，本发明的抗原结合分子与SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的表位结合。本文中提供的抗原结合分子、特别是抗体或其抗原结合片段，识别全长TDP-43。另一些抗TDP-43结合分子也可包括多价分子、多特异性分子(例如，双抗体(diabody))、融合分子、适配体、亲合体(avimer)或者其他天然存在或重组产生的分子。可用于本发明的举例说明性抗原结合分子包括抗体样分子。抗体样分子是可通过与靶分子结合而发挥功能的分子(参见，例如，Current Opinion in Biotechnology2006，17：653-658；Current Opinion in Biotechnology 2007，18：1-10；Current Opinionin Structural Biology 1997，7：463-469；Protein Science 2006，15：14-27)，并且包括例如DARPin(WO 2002/020565)、亲和体(Affibody)(WO 1995/001937)、亲合体(WO 2004/044011；WO 2005/040229)、Adnectin(WO 2002/032925)和fynomer(WO 2013/135588)。
本文中使用的术语“抗TDP-43抗体”和“与TDP-43结合的抗体”或简称为“抗体”是指以下抗体，其能够以足够的亲和力结合TDP-43，使得该抗体可用作靶向TDP-43的诊断剂和/或治疗剂。一般而言，术语“抗体”在本文中以最广义使用，并且涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性或双互补位抗体)、全人抗体和抗体片段，只要它们表现出所期望的抗原结合活性即可。在本发明内的抗体也可以是嵌合抗体、重组抗体、重组抗体的抗原结合片段、人源化抗体或者展示在噬菌体表面上或展示在嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)T细胞表面上的抗体。
抗体的“抗原结合片段”或“其功能片段”是指不同于完整或全长抗体的包含完整或全长抗体的一部分并且结合(完全或部分地)与完整或全长抗体结合的抗原的分子。抗体片段的一些实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。抗原结合片段也可称为“功能片段”，因为它们保留了它们所来源的原始抗体的结合功能。
“与蛋白质限定区域中表位结合的抗体”是要求该区域中存在一个或更多个氨基酸以与蛋白质结合的抗体。
在某些实施方案中，“与蛋白质限定区域中表位结合的抗体”通过突变分析来鉴定，其中对该蛋白质的氨基酸进行突变，并且该抗体与所得经改变蛋白质(例如，包含该表位的经改变蛋白质)的结合确定为与未经改变蛋白质的结合的至少20％。在一些实施方案中，“与蛋白质限定区域中表位结合的抗体”通过突变分析来鉴定，其中对该蛋白质的氨基酸进行突变，并且该抗体与所得经改变蛋白质(例如，包含该表位的经改变蛋白质)的结合确定为与未经改变蛋白质的结合的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在某些实施方案中，抗体的结合通过FACS、WB或通过合适的结合测定例如ELISA来确定。
在本发明的上下文中使用的术语“与......结合”定义至少两个“抗原相互作用位点”彼此的结合(相互作用)。根据本发明，术语“抗原相互作用位点”定义多肽的基序，即本发明的抗体或抗原结合片段的一部分，其显示出与TDP-43抗原中的特定抗原或特定组特异性相互作用的能力。所述结合/相互作用也应理解为定义“特异性识别”。根据本发明，术语“特异性识别”意指抗体能够与如本文中定义的TDP-43的至少两个氨基酸特异性相互作用和/或结合，特别地与人TDP-43(SEQ ID NO：1)的第181至195位、第199至213位、第307至321位、第352至366位、第389至411位、第397至411位和第140至200位氨基酸残基中的至少两个氨基酸相互作用/结合，甚至更特别地与人TDP-43(SEQ ID NO：1)的第183至188位、第203至213位、第204至208位、第204至211位、第205至210位、第316至323位、第358至361位、第400至405位、第400至406位或第400至412位氨基酸残基中的至少两个氨基酸相互作用/结合。
术语“泛TDP-43抗体”是指与错折叠的聚集TDP-43和非聚集生理性TDP-43，包括单体TDP-43、寡聚TDP-43、经翻译后修饰的TDP-43(例如磷酸化、泛素化、乙酰化、类泛素化和/或甲基化)、聚集TDP-43和截短TDP-43结合的抗体。
根据本发明使用的术语“特异性相互作用”意指本发明的抗体或其抗原结合片段不与或基本上不与具有相似结构的(多)肽交叉反应。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段与由人TDP-43(SEQ ID NO：1)的第181至195位、第199至213位、第307至321位、第352至366位、第389至411位、第397至411位和第140至200位氨基酸残基中特定氨基酸序列形成的TDP-43结构特异性结合/相互作用，更特别地，与由人TDP-43(SEQ ID NO：1)的第183至188位、第203至213位、第204至208位、第204至211位、第205至210位、第316至323位、第358至361位、第400至405位、第400至406位或第400至412位氨基酸残基中特定氨基酸序列形成的TDP-43结构结合/相互作用。
正在研究的抗原结合分子、特别是抗体或其抗原结合片段的组的交叉反应性可例如通过以下来测试：评估在常规条件下(参见例如Harlow and Lane，Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988)和UsingAntibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1999))抗体或其抗原结合片段的所述组与目的(多)肽以及与许多或多或少(结构上和/或功能上)紧密相关的(多)肽的结合。只有与如本文中定义的某些TDP-43结构，例如如本文中定义的TDP-43的特定表位或(多)肽/蛋白质结合但不与或基本上不与同一TDP-43的任何其他表位或(多)肽结合的那些构建体(即抗体、其抗原结合片段等)被认为对目的表位或(多)肽/蛋白质具有特异性，并选择用以根据本文中提供的方法进行进一步研究。这些方法尤其可包括与结构和/或功能上密切相关的分子的结合研究、阻断和竞争研究。这些结合研究还包括FACS分析、表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR，例如用BIACORETM进行)、分析型超离心、等温滴定量热法、荧光各向异性、荧光光谱术或通过经放射性标记配体结合测定。
因此，特异性可通过本领域中已知的方法和如本文中所述的方法通过实验确定。这样的方法包括但不限于Western印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-测试和肽扫描。
本文中使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质抗体的群体中获得的抗体，即，除可能以少量存在的可能天然存在的突变之外，构成该群体的单独抗体是相同的。单克隆抗体具有高度特异性，针对单一抗原位点。单克隆抗体的优点在于：其可通过杂交瘤培养物合成，基本上不受其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”指示该抗体在基本上同质的抗体群体中的特征，并且不应解释为要求该抗体通过任何特定方法来产生。如上所述，根据本发明使用的单克隆抗体可通过由Kohler，Nature 256(1975)，495描述的杂交瘤方法来制备。
本文中使用的术语“多克隆抗体”是指在一种或更多种其他不同抗体之中或者在存在一种或更多种其他不同抗体的情况下产生的抗体。一般而言，多克隆抗体由B淋巴细胞在存在数种产生不同抗体的其他B淋巴细胞的情况下产生。通常，多克隆抗体从经免疫接种的动物中直接获得。
本文中使用的术语“完全人抗体”是指仅包含人免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。如果在小鼠中、小鼠细胞中或来源于小鼠细胞的杂交瘤中产生，则完全人抗体可包含鼠糖链。类似地，“小鼠抗体”或“鼠抗体”是指仅包含小鼠/鼠免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。或者，如果在大鼠中、大鼠细胞中、来源于大鼠细胞的杂交瘤中产生，则“完全人抗体”可包含大鼠糖链。类似地，术语“大鼠抗体”是指仅包含大鼠免疫球蛋白序列的抗体。完全人抗体也可例如通过噬菌体展示来产生，噬菌体展示是广泛使用的筛选技术，其能够产生和筛选完全人抗体。噬菌体抗体也可用于本发明的背景。噬菌体展示方法描述于例如US 5,403,484、US5,969,108和US 5,885,793中。能够开发完全人抗体的另一项技术涉及对小鼠杂交瘤技术的改进。对小鼠进行转基因以包含人免疫球蛋白基因座，以交换其自身的小鼠基因(参见，例如，US 5,877,397)。
术语“嵌合抗体”是指包含与来自另一、人或非人物种(例如，小鼠、马、兔、狗、牛、鸡)的抗体区域(例如，恒定区)融合或嵌合的本发明的可变区的抗体。
术语抗体还涉及重组人抗体、异源抗体和异杂合抗体。术语“重组(人)抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人序列抗体，例如从针对人免疫球蛋白基因进行转基因的动物(例如，小鼠)中分离的抗体；使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体；从重组、组合人抗体文库中分离的抗体；或者通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如果存在的话)。然而，这样的抗体可进行体外诱变(或，当使用针对人Ig序列转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列：其尽管来源于人种系VH和VL序列并且与之相关但在体内人抗体种系库中可能非天然存在。
“异源抗体”相对于产生这样的抗体的转基因非人生物体进行定义。该术语是指具有与存在于不由转基因非人动物组成的生物体中的氨基酸序列或编码核酸序列对应的氨基酸序列或编码核酸序列的抗体，并且该生物体通常来自除转基因非人动物的物种之外的物种。
术语“异杂合抗体”是指具有不同生物体来源的轻链和重链的抗体。例如，具有与鼠轻链缔合的人重链的抗体是异杂合抗体。异杂合抗体的一些实例包括嵌合抗体和人源化抗体。
本发明特别地涉及人源化抗体。“人源化”形式的非人(例如，鼠或兔)抗体是包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链，或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或者抗体的其他抗原结合子序列)。通常，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受体抗体)，其中来自接受体的互补决定区(complementary determining region，CDR)的残基被具有所期望的特异性、亲和力和能力的来自非人物种(供体抗体)(例如小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基替换。因此，当本文中提及特定的人框架序列，例如IGHV1-3 VH框架序列时，这旨在不仅涵盖种系序列而且还涵盖突变形式。此外，人源化抗体可包含在接受体抗体中或导入的CDR或框架序列中均未发现的残基。进行这些修饰是为了进一步完善和优化抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个，并且通常两个可变结构域中的基本全部，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常是人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。对于另外的细节，参见：Jones et al.，Nature 321(1986)，522-525；Reichmann Nature 332(1998)，323-327和Presta Curr Op Struct Biol 2(1992)，593-596。可参考实施例14以描述可根据本发明使用的抗体人源化方法，包括特定突变。
用于抗体人源化的流行方法涉及CDR接枝，其中将来自非人“供体”抗体的功能性抗原结合位点接枝到人“接纳体”抗体上。CDR接枝方法是本领域中已知的，并且描述于例如US 5,225,539、US 5,693,761和US 6,407,213中。另一相关方法是从转基因动物中产生人源化抗体，该动物经遗传改造以包含能够进行基因重排和基因转换的一个或更多个人源化免疫球蛋白基因座(参见，例如，US 7,129,084)。
因此，在本发明的上下文中，术语“抗体”涉及完整的免疫球蛋白分子以及这样的免疫球蛋白分子的部分(即，“其抗原结合片段”)。此外，如上所述，该术语涉及经修饰和/或经改变的抗体分子。该术语还涉及重组或合成产生/合成的抗体。该术语还涉及完整的抗体及其抗体片段，例如分离的轻链和重链、Fab、Fv、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2。术语抗体还包括但不限于完全人抗体、嵌合抗体、人源化抗体、CDR接枝的抗体和抗体构建体，例如单链Fv(scFv)或抗体融合蛋白。
在本发明的上下文中，“单链Fv”或“scFv”抗体片段具有抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，scFv多肽还在VH与VL结构域之间包含多肽接头，其使scFv能够形成所期望的抗原结合结构。描述用于产生单链抗体的技术描述于例如Plückthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，Rosenburg and Mooreeds.Springer-Verlag，N.Y.(1994)，269-315中。
本文中使用的“Fab片段”包含一条轻链，以及一条重链的CH1和可变区。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。
“Fc”区包含两个含有抗体的CH2和CH3结构域的重链片段。两个重链片段通过两个或更多个二硫键以及通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。
“Fab’片段”包含一条轻链，以及一条重链的一部分，所述一条重链的一部分包含VH结构域和CH1结构域以及还具有在CH1与CH2结构域之间的区域，使得可在两个Fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’)2分子。
“F(ab’)2片段”包含两条轻链和两条重链，所述重链包含在CH1与CH2结构域之间的恒定区的一部分，使得在两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab’)2片段由通过两条重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab’片段构成。
“Fy区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
根据本发明使用的人源化抗体、人源化抗体构建体、人源化抗体片段、人源化抗体衍生物(全部是Ig来源的)，或其相应的免疫球蛋白链可使用本领域中已知的常规技术进一步修饰，例如通过单独或组合使用氨基酸缺失、***、替换、添加和/或重组和/或本领域中已知的任何其他修饰。用于在以免疫球蛋白链的氨基酸序列为基础的DNA序列中引入这样的修饰的方法是本领域技术人员公知的；参见，例如，Sambrook et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版(1989)和第3版(2001)。术语“Ig来源的结构域”特别地涉及包含至少一个CDR的(多)肽构建体。所列举的Ig来源的结构域的片段或衍生物定义以下(多肽)肽，其是以上抗体分子的一部分和/或通过化学/生物化学或分子生物学方法进行修饰。相应的方法是本领域中已知的，并且尤其描述于实验室手册(参见，Sambrook et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版(1989)和第3版(2001)；Gerhardtet al.，Methods for General and Molecular Bacteriology ASM Press(1994)；Lefkovits，Immunology Methods Manual：The Comprehensive Sourcebook ofTechniques；Academic Press(1997)；Golemis，Protein-Protein Interactions：AMolecular Cloning Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press(2002))中。
本文中使用的术语“CDR”涉及“互补决定区”，其是本领域中公知的。CDR是免疫球蛋白的一部分，其决定所述分子的特异性并且与特定配体接触。CDR是所述分子的最可变的部分，并且有助于这些分子的多样性。每个V结构域中均存在三个CDR区：CDR1、CDR2和CDR3。CDR-H示出了可变重链的CDR区，而CDR-L涉及可变轻链的CDR区。VH意指可变重链，VL意指可变轻链。Ig来源区域的CDR区可如Kabat“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”，第5版.NIH出版物no.91-3242 U.S.Department of Health and HumanServices(1991)中所述确定。本文中提供的CDR序列根据Kabat进行定义。然而，技术人员将理解，本发明旨在涵盖其中根据任何有用的标识/编号方案定义CDR序列的结合分子。例如，可采用以下编号方案以定义CDR：Chothia(Canonical structures for thehypervariable regions of immunoglobulins.Chothia C，Lesk AM.J Mol Biol.1987Aug 20；196(4)：901-17)；IMGT(IMGT，the international ImMunoGeneTicsdatabase.Giudicelli V，Chaume D，Bodmer J，Müller W，Busin C，Marsh S，Bontrop R，Marc L，Malik A，LefrancMP.Nucleic Acids Res.1997 Jan 1；25(1)：206-11和Uniquedatabase numbering system for immunogenetic analysis.Lefranc MP.ImmunolToday.1997 Nov；18(11)：509)；MacCallum(MacCallum RM，Martin AC，Thornton JM，J MolBiol.1996 Oct 11；262(5)：732-45)以及Martin(Abhinandan KR，Martin ACR.Analysisand improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibodyvariable domains.Mol Immunol.(2008)45：3832-9.10.1016/j.molimm.2008.05.022)。
因此，在本发明的上下文中，本文中以上所述的人源化抗体分子选自完整抗体(免疫球蛋白，例如IgG1、IgG2、IgA1、IgGA2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgD或IgE)、F(ab)-、Fab’-SH-、Fv-、Fab’-、F(ab’)2-片段、嵌合抗体、CDR接枝抗体、完全人抗体、二价抗体构建体、抗体融合蛋白、合成抗体、二价单链抗体、三价单链抗体和多价单链抗体。
“人源化方法”在本领域中是公知的，并且特别针对抗体分子，例如Ig来源的分子来描述。术语“人源化”是指包含来源于非人抗体的序列的一些部分的非人(例如，鼠)抗体或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)、scFv或抗体的其他抗原结合部分序列)的人源化形式。人源化抗体包括人免疫球蛋白，其中来自人免疫球蛋白互补决定区(CDR)的残基被具有所期望结合特异性、亲和力和能力的来自非人物种(例如小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基替换。一般而言，人源化抗体将包含至少一个，并且通常两个可变结构域中的基本全部，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。最佳地，人源化抗体还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常是人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分；尤其参见：Jones et al.，Nature 321(1986)，522-525，Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2(1992)，593-596。用于使非人抗体人源化的方法是本领域中公知的。通常，人源化抗体具有从非人来源中引入其中的一个或更多个氨基酸，仍保留了该抗体的原始结合活性。用于使抗体/抗体分子人源化的方法还详述于Jones etal.，Nature 321(1986)，522-525；Reichmann et al.，Nature 332(1988)，323-327；以及Verhoeyen et al.，Science 239(1988)，1534-1536中。人源化抗体的一些具体实例，例如针对EpCAM的抗体在本领域中是已知的(参见例如LoBuglio，Proceedings of theAmerican Society of Clinical Oncology Abstract(1997)，1562和Khor，Proceedingsof the American Society of Clinical Oncology Abstract(1997)，847)。
因此，在本发明的上下文中，提供了抗体分子或其抗原结合片段，其是人源化的并且可成功地用于药物组合物中。
本发明的人源化抗体或抗原结合片段的特异性不仅可由如上定义的该人源化抗体或抗原结合片段的氨基酸序列的性质来表示，而且还可由该抗体能够结合的表位来表示。因此，在一个实施方案中，本发明涉及与本发明的抗体识别相同表位的抗错折叠人源化TDP-43抗体或其抗原结合片段。
本领域技术人员可理解，表位可以包含在TDP-43蛋白中，但是也可包含在其降解产物中或者可以是化学合成的肽。仅指出氨基酸位置是为了显示相应氨基酸序列在TDP-43蛋白序列中的位置。本发明涵盖所有包含表位的肽。所述肽可以是长度大于100个氨基酸的多肽的一部分，或者可以是小于100个，优选小于50个，更优选小于25个氨基酸，甚至更优选小于16个氨基酸的小肽。这样的肽的氨基酸可以是天然氨基酸或非天然氨基酸(例如，β氨基酸、γ氨基酸、D-氨基酸)或其组合。此外，本发明可涵盖表位的相应逆反肽(retro-inverso peptide)。所述肽可以是未结合的或结合的。其可与例如小分子(例如，药物或荧光团)、高分子量聚合物(例如，聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、聚乙烯亚胺(polyethylene imine，PEI)、甲基丙烯酸羟丙酯(hydroxypropylmethacrylate，HPMA)等)或蛋白质、脂肪酸、糖部分结合或者可***膜中。
为了测试所讨论的抗体和本发明的抗体是否识别相同的表位，可进行以下竞争研究：将以3种MOI(感染复数)感染的Vero细胞在20小时之后与不同浓度的作为竞争者的所讨论抗体孵育l小时。在第二孵育步骤中，以100nM的恒定浓度施加本发明的抗体，并使用针对本发明抗体的恒定结构域的荧光标记抗体，通过流式细胞术检测其结合。以与所讨论的抗体的浓度成反比例(成反比)进行结合指示两种抗体识别相同表位。然而，可使用本领域中已知的许多其他测定。
本发明还涉及针对TDP-43的天然多肽和重组多肽的特异性抗体的产生。该产生例如基于动物如小鼠的免疫接种。然而，在本发明中还设想了用于产生抗体/抗血清的其他动物。例如，单克隆抗体和多克隆抗体可由兔、小鼠、山羊、驴等产生。可将编码TDP-43的相应选择的多肽的多核苷酸亚克隆到合适的载体中，其中使重组多肽在能够表达的生物体，例如在细菌中表达。因此，可将表达的重组蛋白腹膜内注射到小鼠中，并且所得特异性抗体可例如从通过心脏内血液穿刺提供的小鼠血清中获得。本发明还设想通过使用如所附实施例中例示的DNA疫苗策略来产生针对天然多肽和重组多肽的特异性抗体。DNA疫苗策略是本领域中公知的，并且涵盖脂质体介导的递送、通过基因枪或喷射注射以及肌内或皮内注射。因此，针对TDP-43的多肽或蛋白质或表位，特别是本文中提供的抗体表位的抗体可通过肌内直接注射表达TDP-43的所期望多肽或蛋白质或表位的载体对动物直接进行免疫接种来获得，所述表位特别地是以下本发明抗体表位，其位于SEQ ID NO：1的第397至411位氨基酸残基中；更特别地是以下本发明抗体表位，其位于SEQ ID NO：1的第400至405位氨基酸残基中。可使用ELISA对获得的特异性抗体的量进行定量，这也在下文中描述。用于产生抗体的另外的方法是本领域中公知的，参见，例如Harlow and Lane，“Antibodies，A LaboratoryManual”，CSH Press，Cold Spring Harbor，1988。
因此，在指定的测定条件下，特定的抗体与TDP-43的相应表位彼此结合，而不与样品中存在的其他组分以显著量结合。在这样的条件下与靶分析物的特异性结合可需要结合部分，该结合部分针对其对特定靶分析物的特异性进行选择。可使用多种免疫测定形式来选择与特定抗原特异性反应的抗体。例如，常规地使用固相ELISA免疫测定来选择与分析物特异性免疫反应的单克隆抗体。参见Shepherd and Dean(2000)，Monoclonal Antibodies：A Practical Approach，Oxford University Press and/or Howard and Bethell，对可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述。通常来说，特异性或选择性反应将是背景信噪比的至少两倍，并且更通常是背景的超过10至100倍大。本领域技术人员能够提供和产生针对新多肽的特异性结合分子。对于特异性结合测定，其可容易地用于避免不期望的交叉反应性，例如，可通过已知方法容易地纯化和选择多克隆抗体(参见Shepherdand Dean，loc.cit.)。
抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。抗体存在五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的数种可进一步划分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
在某些实施方案中，考虑了本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可期望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或通过肽合成来制备。这样的修饰包括，例如，抗体氨基酸序列中残基的缺失和/或其中的***和/或其替换。可进行缺失、***和替换的任意组合以获得最终的构建体，前提是最终的构建体具有所期望的特征，例如抗原结合。
在某些实施方案中，提供了具有一个或更多个氨基酸替换的抗体变体。替换型诱变的目的位点包括CDR和FR。保守替换示于表1中“优选替换”的标题下。更多的替换型变化提供于表1中“示例性替换”的标题下，并且如以下参考氨基酸侧链类别进一步描述的。可将氨基酸替换引入目的抗体中，并针对所期望活性，例如，保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC筛选产物。
表1
原始残基 示例性替换 优选替换
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn L)s
Asn(N) Gln；His；Asp，Lys；Arg Gin
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gin(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；an；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；Norleucine Leu
Leu(L) Norleucine；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；ne；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phc；Ala；Norleucine Leu
氨基酸可根据共同的侧链特性进行分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Glv、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守替换将需要将这些类别之一的成员更换为另一类别。
一种类型的替换型变体涉及替换亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或更多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体在某些生物学特性方面具有改进(例如，改善)(例如，提高的亲和力、降低的免疫原性)和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。一种示例性替换型变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，例如本文中所述的那些方便地产生。简言之，使一个或更多个CDR残基突变，将变体抗体展示在噬菌体上并针对特定的生物活性(例如，结合亲和力)进行筛选。
可在CDR中进行改变(例如，替换)，例如以提高抗体亲和力。这样的改变可在CDR“热点”，即由在体细胞成熟过程期间以高频率发生突变的密码子编码的残基(参见，例如，Chowdhury，Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)中进行，并测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建二级文库和从二级文库中再选择而进行的亲和力成熟已描述于例如Hoogenboom et al.，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brienet al.，ed.，Human Press，Totowa，NJ，(2001))中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链混编或寡核苷酸定向诱变)中的任一种将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建二级文库。然后筛选该文库以鉴定具有所期望亲和力的任何抗体变体。用于引入多样性的另一方法涉及CDR指导的方法，其中数个CDR残基(例如，一次4至6个残基)是随机化的。涉及抗原结合的CDR残基可例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特别地鉴定。特别地，CDR-H3和CDR-L3通常被靶向。
在某些实施方案中，替换、***或缺失可在一个或更多个CDR中发生，只要这样的改变基本上不降低抗体结合抗原的能力即可。例如，可在CDR中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文中提供的保守替换)。这样的改变可在CDR“热点”或SDR之外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个CDR是未经改变的，或包含不超过一个、两个或三个氨基酸替换。
用于鉴定抗体的可靶向诱变的残基或区域的可用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham and Wells(1989)Science，244：1081-1085所述。在该方法中，鉴定残基或靶残基组(例如，带电荷的残基，例如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并将其用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)进行替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在氨基酸位置引入另外的替换，显示对初始替换的功能敏感性。作为替代或补充，抗原-抗体复合体的晶体结构用于鉴定抗体与抗原之间的接触点。这样的接触残基和邻近残基可作为替换的候选物被靶向或消除。可对变体进行筛选以确定其是否包含所期望的特性。
氨基酸序列***包括长度为一个残基至包含100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的一些实例包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的另一些***型变体包括抗体的N或C端与提高抗体的血清半衰期的酶(例如，对于ADEPT)或多肽的融合体。
在某些实施方案中，本文中提供的抗体被改变以提高或降低抗体被糖基化的程度。针对抗体的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列使得产生或去除一个或更多个糖基化位点而方便地实现。
当抗体包含Fc区时，与其连接的碳水化合物可被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含通常通过N键与Fc区之CH2结构域的Ash297连接的分支的双触角寡糖。参见，例如，Wright et al.，TIBTECH 15：26-32(1997)。寡糖可包括多种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在双触角寡糖结构的“茎(stem)”中与GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可对本发明的抗体中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供了具有缺少与Fc区(直接或间接)连接的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。例如，这样的抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％、或20％至40％。岩藻糖的量通过计算在Asn297的糖链中岩藻糖的平均量来确定，这相对于与Asn 297连接的所有糖结构(例如，复合、杂合和高甘露糖结构)的总和进行，如通过MALDI-TOF质谱测量的，例如，如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中约第297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的Eu编号；参见Edelman，G.M.et al.，Proc.Natl.Acad.USA，63，78-85(1969))；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位与第300位处。这样的岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见，例如，美国专利公开No.US 2003/0157108(Presta，L.)；US 2004/0093621(KyowaHakko Kogyo Co.，Ltd)。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体有关的出版物的一些实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki et al.，J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki et al.，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的一些实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷型Lecl3CHO细胞(Ripka et al.，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请No US 2003/0157108 A1，Presta，L；以及WO 2004/056312 A1，Adams et al.，尤其在实施例11)，以及敲除细胞系，例如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki et al.，Bioteeh.Bioeng.87：614(2004)；Kanda，Y.et al.，Bioteehnol.Bioeng.，94(4)：680-688(2006)；以及WO2003/085 l07)。
还提供了具有二等分的寡糖的抗体变体，例如，其中与抗体的Fc区连接的双触角寡糖被GlcNAc二等分。这样的抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。这样的抗体变体的一些实例描述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet et al.)；美国专利No.6,602,684(Umana et al.)；以及US 2005/0123546(Umana et al.)中。还提供了在与Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这样的抗体变体可具有改善的CDC功能。这样的抗体变体描述于例如WO 1997/30087(Patel et al.)；WO 1998/58964(Raju，S.)；以及WO 1999/22764(Raju，S.)中。
在某些实施方案中，可将一种或更多种氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，从而产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一个或更多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如，替换)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
在某些实施方案中，本发明考虑了以下抗体变体，其具有一些但并非全部效应物功能，这使其成为其中抗体的体内半衰期是重要的而某些效应物功能(例如补体激活和ADCC)是不必要或有害的应用的所期望候选物。可进行体外和/或体内细胞毒性测定，以确定CDC和/或ADCC活性的降低/耗尽。例如，可进行Fc受体(Fc receptor，FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞和小胶质细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达概述于Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)的第464页的表3中。评估目的分子的ADCC活性的体外测定的一些非限制性实例描述于美国专利No.5,500,362(参见，例如，Hellstrom，I.et al.，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))和Hellstrom，I et al.，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；5,821，337(参见Bruggemann，M.et al.，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))中。
或者，可采用非放射性测定方法(参见，例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA)；以及CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI))。用于这样的测定的可用效应细胞包括外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。
作为替代或补充，可在体内，例如在动物模型例如公开于Clynes et al.，Proc.Nat’l Acad.sci.USA 95：652-656(1998)的动物模型中评估目的分子的ADCC活性。也可进行C1q结合测定以确定抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。参见，例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可进行CDC测定(参见，例如，Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg，M.S.etal.，Blood 101：1045-1052(2003)；以及Cragg，M.S.and M.J.Glennie，Blood 103：2738-2743(2004))。还可使用本领域中已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期的确定(参见，例如，Petkova，S.B.et al.，Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
具有降低的效应物功能的抗体包括Fc区第234位、第235位、第238位、第265位、第269位、第270位、第297位、第327位和第329位残基中的一个或更多个被替换的抗体(美国专利No.6,737,056)。描述了与FcR的结合增强或减弱的某些抗体变体。(参见，例如，美国专利No.6,737,056；WO 2004/056312，和Shields et al.，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。这样的Fc突变体包括在第265位、第269位、第270位、第297位和第327位氨基酸中的两个或更多个处进行替换的Fc突变体，包括第265位和第297位残基被替换为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)，或者第265位残基被替换为丙氨酸以及第297位残基被替换为甘氨酸的所谓的“DANG”FC突变体。或者，具有降低的效应物功能的抗体包括Fc区第234位、第235位和第329位残基中的一个或更多个被替换的抗体，即第234位和第235位残基被替换为丙氨酸以及第329位被替换为甘氨酸的所谓的“PG-LALA”Fc突变体(Lo，M.et al.，Journal of Biochemistry，292，3900-3908)。可使用在第234位、第235位和第321位的其他已知突变，即在CH2结构域中包含突变L234F/L235E/P331S的所谓的TM突变体(Oganesyan et al.Acta Cryst.D64，700-704.(2008))。来自人IgG4同种型的抗体包含突变S228P/L235E以使铰链稳定并降低FgR结合(Schlothauer et al，PEDS，29(10)：457-466)。
另一些Fc变体包括在以下Fc区残基中的一个或更多个处进行替换的Fc变体：第238位、第256位、第265位、第272位、第286位、第303位、第305位、第307位、第311位、第312位、第317位、第340位、第356位、第360位、第362位、第376位、第378位、第380位、第382位、第413位、第424位或第434位，例如Fc区第434位残基被替换的Fc变体(美国专利No.7,371,826)。还参见Duncan&Winter，Nature 322：738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821。
在某些实施方案中，Fc区进行突变以提高其在pH 6.0下对FcRn的亲和力并因此延长抗体半衰期。对FcRn具有增强的亲和力的抗体包括以下Fc区残基中的一个或更多个被替换的那些：第252位、第253位、第254位、第256位、第428位、第434位，包括具有替换M252Y/S254T/T256E的所谓的YTE突变(Dall’Acqua et al，J Immunol.169：5171-5180(2002))或LS突变M428L/N434S(Zalevsky et al，Nat Biotechnol.28(2)：157-159(2010))。
在某些实施方案中，可期望产生半胱氨酸改造抗体，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或更多个残基被半胱氨酸残基替换。在一些具体实施方案中，所替换的残基出现在抗体的可及位点。通过用半胱氨酸替换这些残基，反应性巯基由此位于抗体的可及位点，并且可用于将抗体与其他部分，例如药物部分或接头-药物部分缀合，以产生免疫缀合物，如本文中进一步所述。在某些实施方案中，以下残基中的任意一个或更多个可被半胱氨酸替换：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸改造抗体可如例如美国专利No.7,521,541中所述产生。
在某些实施方案中，本文中提供的抗体还可被修饰以包含本领域中已知且容易获得的另外的非蛋白质性部分。适合于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的一些非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚1，3，6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和右旋糖酐或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇，及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中稳定而在制造中可具有优势。该聚合物可具有任意分子量，并且可以是支链或非支链的。与抗体连接的聚合物的数目可变化，并且如果连接多于一个聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。一般而言，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可基于以下考虑因素来确定，所述考虑因素包括但不限于待改进抗体的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于以下限定条件下的治疗中，等。
在另一个实施方案中，提供了抗体与可通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质性部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性部分是碳纳米管(Kam et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长，包括但不限于不损害普通细胞但将非蛋白质性部分加热至杀伤邻近抗体-非蛋白质性部分的细胞的温度的波长。
可使用重组方法和组合物产生抗体，例如，如美国专利No.4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供了编码本文中所述的抗错折叠TDP-43抗体的分离的核酸。这样的核酸可编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在另一个实施方案中，提供了包含这样的核酸的一种或更多种载体(例如，表达载体)。在另一个实施方案中，提供了包含这样的核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含以下(例如，已经用以下转化)：(1)载体，其包含编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列的核酸；或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含抗体VL的氨基酸序列的核酸，所述第二载体包含编码包含抗体VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如，中国仓鼠卵巢(Chinese HamsterOvary，CHO)细胞或淋巴样细胞(例如YO、NSO、Sp20)。在一个实施方案中，提供了制备抗错折叠TDP-43抗体的方法，其中该方法包括：在适合于表达抗体的条件下，培养如上所提供的包含编码抗体的核酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收抗体。
对于重组产生抗错折叠TDP-43抗体，分离例如如上所述的编码抗体的核酸，并将其***一个或更多个载体中，以进一步克隆和/或在宿主细胞或无细胞表达***中表达。这样的核酸可容易地使用常规操作分离和测序(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针来进行)。
用于克隆或表达抗体编码载体的合适宿主细胞包括本文中所述的原核或真核细胞。例如，可在细菌中产生抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应物功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见，例如，美国专利No.5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还参见Charlton，Methods in Molecular Biology，Val.248(B.K.C.Lo，ed.，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，pp.245-254，描述了抗体片段在大肠杆菌(E.coli)中的表达)。在表达之后，可从细菌细胞糊中分离在可溶性级分中的抗体，并可将其进一步纯化。
除原核生物之外，真核微生物例如丝状真菌或酵母也是适合于抗体编码载体的克隆或表达宿主，包括其中糖基化途径已被“人源化”从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gemgross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)以及Liet al.，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也来源于多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的一些实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定出许多杆状病毒株，其可与昆虫细胞结合使用，特别地用于转染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利No 5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，可使用适于悬浮培养的哺乳动物细胞系。可用的哺乳动物宿主细胞系的另一些实例是由SV40转化的猕猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾细胞系(293或293细胞，如描述于例如Graham et al.，J.Gen Viral.36：59(1977)中)；幼仓鼠肾细胞(baby hamster kidney cell，BHK)；小鼠塞托利细胞(TM4细胞，如描述于例如Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980)中)；猕猴肾细胞(CV 1)；非洲绿猕猴肾细胞(VER0-76)；人***细胞(HeLa)；犬肾细胞(MDCK；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(Wl38)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如描述于例如Mather et al.，AnnalsN.Y Aead.Sei.383：44-68(1982)中；MRC 5细胞；以及FS4细胞。另一些可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR CHO细胞(Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.cii.USA 77：4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，例如YO、NSO和Sp2/0。对于适合于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki and Wu，Methodsin Molecular Biology，Val.248(B.K.C.Lo，ed.，Humana Press，Totowa，NJ)，pp.255-268(2003)。
对于递送分子穿过血脑屏障(blood brain barrier，BBB)，存在数种本领域已知的方法，例如施用途径的改变、对BBB的破坏及其通透性的改变、纳米粒递送、特洛伊木马方法(Troian horse approach)、受体介导的转运以及细胞和基因治疗。
施用途径的改变可通过以下来实现：直接注射到脑中(参见，例如，Papanastassiou et al.，Gene Therapy 9：398-406(2002))，在脑中植入递送装置(参见，例如，Gillet al.，Nature Med.9：589-595(2003)；和Gliadel WafersTM，GuildfordPharmaceutical)，以及绕过BBB的鼻内施用(Mittal et al，Drug Deliv.21(2)：75-86.(2014))。
屏障破坏的方法包括但不限于：超声(参见，例如，美国专利公开No.2002/0038086)；渗透压(例如，通过施用高渗甘露醇(Neuwelt，E.A.，Implication of theBlood-Brain Barrier and its Manipulation，Vols 1&2，Plenum Press，N.Y.(1989)))；透化，通过例如缓激肽或透化剂A-7(参见，例如，美国专利No.5,112,596、5,268,164、5,506,206和5,686,416)。
改变BBB通透性的方法包括但不限于：使用糖皮质激素阻断剂来提高血脑屏障的通透性(参见，例如，美国专利申请公开No.2002/0065259、2003/0162695和2005/0124533)；激活钾通道(参见，例如，美国专利申请公开No.2005/0089473)；以及抑制ABC药物转运蛋白(参见，例如，美国专利申请公开No.2003/0073713)。
递送人源化抗体或其人源化抗体片段穿过血脑屏障的特洛伊木马递送方法包括但不限于：使抗体阳离子化(参见，例如，美国专利No.5,004,697)，以及使用细胞穿透肽例如Tat肽以得以进入CNS。(参见，例如，Dietz et al.，J.Neurochem.104：757-765(2008))。
递送人源化抗体或其抗原结合片段穿过血脑屏障的纳米粒递送方法包括但不限于：将抗体或其抗原结合片段包封在脂质体或胞外囊泡例如外泌体中，所述脂质体或胞外囊泡与与血脑屏障的血管内皮上的受体结合的抗体或抗原结合片段或作为替代的肽偶联(不限于此)(参见，例如，美国专利申请公开No.20020025313)；以及将抗体或其抗原结合片段包被在低密度脂蛋白颗粒中(参见，例如，美国专利申请公开No.20040204354)或包被在载脂蛋白E中(参见，例如，美国专利申请公开No.20040131692)。
本发明的人源化抗体可被另外修饰以增强血脑屏障穿透。
本发明的人源化抗体或其抗原结合片段可与与血脑屏障受体结合的多肽融合。BBB受体包括但不限于运铁蛋白受体、胰岛素受体或低密度脂蛋白受体。多肽可以是肽、受体配体、单结构域抗体(VHH)、scFv或Fab片段。
本发明的人源化抗体也可作为编码所述人源化抗体的相应核酸递送。这样的核酸分子可以是用于靶向递送至血脑屏障或CNS中的任何其他细胞类型的病毒载体的一部分。病毒载体可以是选自本领域已知的任何AAV血清型(包括但不限于AAVl至AAV12)的重组腺相关病毒载体(recombinant adeno-associated viral vector，rAAV)，以使得人源化抗体或人源化抗体片段或人源化抗体衍生物能够在细胞内表达或在脑实质中表达。
递送本发明的人源化抗体或人源化抗体片段或人源化抗体衍生物穿过血脑屏障的细胞治疗方法包括但不限于：使用用我们具有所有权的载体离体转染的内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cell，EPC)的归巢能力，以及通过这些细胞分泌抗体或抗体片段并向脑递送所述抗体或抗体片段，以克服血脑屏障的强大过滤活动(参见，例如，Hellerand al.，J Cell Mol Med.00：1-7(2020))；或者使用装载有经遗传改造细胞的聚合物细胞植入装置来分泌抗体或抗体片段(参见，例如Marroquin Belaunzaran et al.PLoS ONE 6(4)：e18268(2011))。
可药用载体、稀释剂、辅料和赋形剂是制药领域公知的，并且在例如Remington’sPharmaceutical Scienc中描述。可药用载体、稀释剂、辅料和赋形剂是制药领域公知的，并且在例如以下中描述：Remington’s Pharmaceutical Sciences，第15版或第18版.(Alfonso R.Gennaro，ed.；Mack Publishing Company，Easton，PA，1990)；Remington：theScience and Practice of Pharmacy第19版.(Lippincott，Williams&Wilkins，1995)；Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版.(Arthur H.Kibbe，ed.；Amer.Pharmaceutical Assoc，1999)；Pharmaceutical Codex：Principles and Practiceof Pharmaceutics第12版.(Walter Lund ed.；Pharmaceutical Press，London，1994)；TheUnited States Pharmacopeia：The National Formulary(United States PharmacopeialConvention)；Fiedler’s“Lexikon der Hilfstoffe”第5版.，Edition Cantor VerlagAulendorf 2002；“The Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第4版.，AmericanPharmaceuticals Association，2003；以及Goodman and Gilman’s：the PharmacologicalBasis of Therapeutics(Louis S.Goodman and Lee E.Limbird，eds.；McGraw Hill，1992)，其公开内容在此通过引用并入。
载体、稀释剂、辅料和药用赋形剂可根据预期的施用途径和标准药学实践进行选择。这些化合物必须是在对其接受者无害的意义上可接受的。参见Remington’sPharmaceutical Sciences，第15版或第18版.(Alfonso R.Gennaro，ed.；Mack PublishingCompany，Easton，PA，1990)；Remington：the Science and Practice of Pharmacy第19版.(Lippincott，Williams&Wilkins，1995)；Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版.(Arthur H.Kibbe，ed.；Amer.Pharmaceutical Assoc，1999)；Pharmaceutical Codex：Principles and Practice of Pharmaceutics第12版.(Walter Lund ed.；Pharmaceutical Press，London，1994)；The United States Pharmacopeia：The NationalFormulary(United States Pharmacopeial Convention)；Fiedler’s“Lexikon derHilfstoffe”第5版.，Edition Cantor Verlag Aulendorf 2002；“The Handbook ofPharmaceutical Excipients”，第4版.，American Pharmaceuticals Association，2003；以及Goodman and Gilman’s：the Pharmacological Basis of Therapeutics(LouisS.Goodman and Lee E.Limbird，eds.；McGraw Hill，1992)，其公开内容在此通过引用并入。
载体、稀释剂、辅料和药用赋形剂可根据预期的施用途径和标准药学实践进行选择。这些化合物必须是在对其接受者无害的意义上可接受的。
待施用于对象的化合物的“有效量”是根据合理的医学判断适合于治疗、预防或减轻疾病、障碍或异常的剂量。具体的剂量水平和剂量频率可取决于例如多种因素，包括：所用特定化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时长、施用方式和时间。待施用于对象的化合物的“有效量”是根据合理的医学判断适合于治疗、预防或减轻病症、疾病、障碍或异常的剂量。具体的剂量水平和剂量频率可取决于例如多种因素，包括：所用特定化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时长、施用方式和时间、***速率和药物组合。患者特异性的因素，例如年龄、体重、一般健康、性别、饮食以及特定病症的严重程度，也会影响待施用的量。患者特异性的因素，例如年龄、体重、一般健康、性别、饮食以及特定病症的严重程度，也会影响待施用的量。
XI.TDP-43特异性结合分子的一些发明性实施方案
在一些实施方案中，提供了人源化TDP-43结合分子，特别是人源化TDP-43抗体或其抗原片段，其包含：
a)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1包含SEQ ID NO：202的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或
b)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDRl；包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或
c)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：172的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或
d)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDRl；包含SEQ ID NO：182的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或
e)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：192的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或
f)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDRl；包含SEQ ID NO：212的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或
g)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：222的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或
h)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：382的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3。
在一些实施方案中，提供了人源化TDP-43结合分子，特别是人源化TDP-43抗体或其抗原片段，其包含：
a)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或
b)包含SEQ ID NO：175的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或
c)包含SEQ ID NO：185的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或
d)包含SEQ ID NO：195的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或
e)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：206的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或
f)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：216的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或
g)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：227的氨基酸序列的VL-CDR3；或
h)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3；或
i)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：247的氨基酸序列的VL-CDR3；或
j)包含SEQ ID NO：265的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或
k)包含SEQ ID NO：195的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3；或
1)包含SEQ ID NO：305的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3；或
m)包含SEQ ID NO：305的氨基酸序列的VL-CDR1包含SEQ ID NO：216的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3；或
n)包含SEQ ID NO：195的氨基酸序列的VL-CDR1包含SEQ ID NO：216的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3。
在一些实施方案中，提供了人源化TDP-43结合分子，特别是人源化TDP-43抗体或其抗原片段，其包含：
a)重链可变区(VH)，其包含：
i.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：202的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
ii.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
iii.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：172的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
iv.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：182的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
v.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：192的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
vi.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：212的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
vii.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：222的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3：或者
viii.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1包含SEQ ID NO：382的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；和
b)轻链可变区(VH)，其包含：
i.包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
ii.包含SEQ ID NO：175的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
iii.包含SEQ ID NO：185的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3或者
iv.包含SEQ ID NO：195的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
V.包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：206的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
vi.包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：216的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
vii.包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：227的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
Viii.包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
ix.包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：247的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
x.包含SEQ ID NO：265的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
xi.包含SEQ ID NO：195的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
xii.包含SEQ ID NO：305的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3；或
xiii.包含SEQ ID NO：305的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：216的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
xiv.包含SEQ ID NO：195的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：216的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3。
在一些实施方案中，提供了人源化TDP-43结合分子，特别是人源化TDP-43抗体或其抗原片段，其包含：
a)重链可变区(VH)，其包含：
i.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1或包含与SEQ ID NO：21具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：202的氨基酸序列的VH-CDR2或包含与SEQ ID NO：202具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
ii.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1或包含与SEQ ID NO：21具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VH-CDR2或包含与SEQ ID NO：22具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
iii.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1或包含与SEQ ID NO：21具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：172的氨基酸序列的VH-CDR2或包含与SEQ ID NO：172具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
i V.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1或包含与SEQ ID NO：21具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：182的氨基酸序列的VH-CDR2或包含与SEQ ID NO：182具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
v.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1或包含与SEQ ID NO：21具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：192的氨基酸序列的VH-CDR2或包含与SEQ ID NO：192具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR1；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
vi.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1或包含与SEQ ID NO：21具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：212的氨基酸序列的VH-CDR2或包含与SEQ ID NO：212具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
vii.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1或包含与SEQ ID NO：21具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：222的氨基酸序列的VH-CDR2或包含与SEQ ID NO：222具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
viii.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1或包含与SEQ ID NO：21具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：382的氨基酸序列的VH-CDR2或包含与SEQ ID NO：382具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；以及
b)轻链可变区(VH)，其包含：
i.包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1或包含与SEQ ID NO：25具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含与SEQ ID NO：16具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3或包含与SEQ ID NO：27具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
ii.包含SEQ ID NO：175的氨基酸序列的VL-CDR1或包含与SEQ ID NO：175具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含与SEQ ID NO：16具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3或包含与SEQ ID NO：27具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；或者
iii.包含SEQ ID NO：185的氨基酸序列的VL-CDR1或包含与SEQ ID NO：185具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含与SEQ ID NO：16具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3或包含与SEQ ID NO：27具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
iv.包含SEQ ID NO：195的氨基酸序列的VL-CDR1或包含与SEQ ID NO：195具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含与SEQ ID NO：16具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3或包含与SEQ ID NO：27具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
v.包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1或包含与SEQ ID NO：25具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：206的氨基酸序列的VL-CDR2或包含与SEQ ID NO：206具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3或包含与SEQ ID NO：27具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
vi.包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1或包含与SEQ ID NO：25具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：216的氨基酸序列的VL-CDR2或包含与SEQ ID NO：216具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3或包含与SEQ ID NO：27具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
vii.包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1或包含与SEQ ID NO：25具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含与SEQ ID NO：16具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：227的氨基酸序列的VL-CDR3或包含与SEQ ID NO：227具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
viii.包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1或包含与SEQ ID NO：25具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含与SEQ ID NO：16具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3或包含与SEQ IDNO：237具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
ix.包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1或包含与SEQ ID NO：25具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含与SEQ ID NO：16具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：247的氨基酸序列的VL-CDR3或包含与SEQ ID NO：247具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
x.包含SEQ ID NO：265的氨基酸序列的VL-CDR1或包含与SEQ ID NO：265具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含与SEQ ID NO：16具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3或包含与SEQ ID NO：27具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
xi.包含SEQ ID NO：195的氨基酸序列的VL-CDR1或包含与SEQ ID NO：195具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含与SEQ ID NO：16具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3或包含与SEQ IDNO：237具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
xii.包含SEQ ID NO：305的氨基酸序列的VL-CDR1或包含与SEQ ID NO：305具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含与SEQ ID NO：16具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3或包含与SEQ IDNO：237具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
xiii.包含SEQ ID NO：305的氨基酸序列的VL-CDR1或包含与SEQ ID NO：305具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：216的氨基酸序列的VL-CDR2或包含与SEQ ID NO：216具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3或包含与SEQID NO：237具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
xiv.包含SEQ ID NO：195的氨基酸序列的VL-CDR1或包含与SEQ ID NO：195具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：216的氨基酸序列的VL-CDR2或包含与SEQ ID NO：216具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3。
在一些实施方案中，提供了人源化TDP-43结合分子，特别是人源化TDP-43抗体或其抗原片段，其包含：
a)重链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1或包含与SEQ ID NO：21具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：202的氨基酸序列的VH-CDR2或包含与SEQ ID NO：202具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3：或者
b)重链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1或包含与SEQ ID NO：21具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：382的氨基酸序列的VH-CDR2或包含与SEQ ID NO：382具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
c)轻链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO：195的氨基酸序列的VL-CDR1或包含与SEQ ID NO：195具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含与SEQ ID NO：16具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3或包含与SEQ ID NO：237具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
d)轻链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1或包含与SEQ ID NO：25具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含与SEQ ID NO：16具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3或包含与SEQ ID NO：27具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3。
更特别地，在一些实施方案中，提供了人源化TDP-43结合分子，特别是人源化TDP-43抗体或其抗原片段，其包含：
a)重链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1或包含与SEQ ID NO：21具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：202的氨基酸序列的VH-CDR2或包含与SEQ ID NO：202具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；以及
b)轻链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO：195的氨基酸序列的VL-CDR1或包含与SEQ ID NO：195具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含与SEQ ID NO：16具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3或包含与SEQ ID NO：237具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3。
类似地，在一些实施方案中，提供了人源化TDP-43结合分子，特别是人源化TDP-43抗体或其抗原片段，其包含：
a)重链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1或包含与SEQ ID NO：21具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：382的氨基酸序列的VH-CDR2或包含与SEQ ID NO：382具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；和
b)轻链可变区(VH)，其包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1或包含与SEQ ID NO：25具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含与SEQ ID NO：16具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3或包含与SEQ ID NO：27具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3。
在一些实施方案中，人源化TDP-43抗体包含选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；(b)包含SEQ ID NO：202或SEQ ID NO：382的氨基酸序列的VH-CDR2；(c)包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；(d)包含SEQ ID NO：195或SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；(e)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；以及(f)包含SEQID NO：237或SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3。
在一些实施方案中，人源化TDP-43抗体包含选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；(b)包含SEQ ID NO：202的氨基酸序列的VH-CDR2；(c)包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；(d)包含SEQ ID NO：195的氨基酸序列的VL-CDR1；(e)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；以及(f)包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3。
在一些实施方案中，人源化TDP-43抗体包含选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；(b)包含SEQ ID NO：382的氨基酸序列的VH-CDR2；(c)包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；(d)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；(e)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；以及(f)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3。
在另一个实施方案中，人源化TDP-43抗体包含选自以下的重链可变结构域(VH)：SEQ ID NO：160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370和任选地SEQ ID NO：380，包括该序列的翻译后修饰。在一个具体实施方案中，重链可变结构域(VH)包含选自以下的至少一个、两个或三个CDR：(a)包含选自SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1，(b)包含选自SEQ ID NO：12、22、172、182、192、202、212、222和任选地SEQ ID NO：382的氨基酸序列的VH-CDR2，(c)包含氨基酸ES(Glu-Ser)的VH-CDR3。
在另一个实施方案中，人源化TDP-43抗体包含选自以下的轻链可变结构域(VL)：SEQ ID NO：164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344和任选地SEQ ID NO：354，包括该序列的翻译后修饰。在一个具体的实施方案中，轻链可变结构域(VL)包含选自以下的至少一个、两个或三个CDR：(a)包含选自SEQ IDNO：25、175、185、195、265、305的氨基酸序列的VL-CDR1，和(b)包含选自SEQ ID NO：16、206、216的氨基酸序列的VL-CDR2，(c)包含选自SEQ ID NO：27(其与SEQ ID NO：17相同)、227、237、247的氨基酸序列的VL-CDR3。
在一些实施方案中，人源化TDP-43抗体包含：
a.包含SEQ ID NO：300的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：300的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
b.包含SEQ ID NO：310的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：310的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
c.包含SEQ ID NO：320的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：320的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
d.包含SEQ ID NO：340的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：340的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
e.包含SEQ ID NO：350的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：350的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
f.包含SEQ ID NO：380的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：380的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)。
在一些实施方案中，人源化TDP-43抗体包含：
a.包含SEQ ID NO：294的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
b.包含SEQ ID NO：324的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：324的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
c.包含SEQ ID NO：334的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：334的氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
d.包含SEQ ID NO：344的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：344的氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
e.包含SEQ ID NO：354的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：354的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，人源化TDP-43结合分子，特别是人源化TDP-43抗体或抗原片段包含：
a)重链可变区(VH)，其选自：
i.包含SEQ ID NO：160的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：160的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
ii.包含SEQ ID NO：170的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：170的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
iii.包含SEQ ID NO：180的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：180的氨基酸序列具有至少89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
iV.包含SEQ ID NO：190的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：190的氨基酸序列具有至少89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
v.包含SEQ ID NO：200的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：200的氨基酸序列具有至少89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
vi.包含SEQ ID NO：210的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：210的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
vii.包含SEQ ID NO：220的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：220的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
viii.包含SEQ ID NO：230的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：230的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
ix.包含SEQ ID NO：240的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：240的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
x.包含SEQ ID NO：250的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：250的氨基酸序列具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
xi.包含SEQ ID NO：260的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：260的氨基酸序列具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
xii.包含SEQ ID NO：270的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：270的氨基酸序列具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
xiii.包含SEQ ID NO：280的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：280的氨基酸序列具有至少93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
xiv.包含SEQ ID NO：290的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：290的氨基酸序列具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
XV.包含SEQ ID NO：300的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：300的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
XVi.包含SEQ ID NO：310的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：310的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
xvii.包含SEQ ID NO：320的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：320的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
xViii.包含SEQ ID NO：330的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：330的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
xix.包含SEQ ID NO：340的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：340的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
XX.包含SEQ ID NO：350的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：350的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
xxi.包含SEQ ID NO：360的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：360的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
xXii.包含SEQ ID NO：370的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：370的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
xXiii.包含SEQ ID NO：380的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：380的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；和
b)轻链可变区(VL)，其选自：
i.包含SEQ ID NO：164的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：164的氨基酸序列具有至少97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
ii.包含SEQ ID NO：174的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：174的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
iii.包含SEQ ID NO：184的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：184的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
iv.包含SEQ ID NO：194的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：194的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
v.包含SEQ ID NO：204的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：204的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
vi.包含SEQ ID NO：214的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：214的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
vii.包含SEQ ID NO：224的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：224的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
viii.包含SEQ ID NO：234的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：234的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
ix.包含SEQ ID NO：244的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：244的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
x.包含SEQ ID NO：254的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：254的氨基酸序列具有至少97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
xi.包含SEQ ID NO：264的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：264的氨基酸序列具有至少97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
xii.包含SEQ ID NO：274的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：274的氨基酸序列具有至少98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
xiii.包含SEQ ID NO：284的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：284的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
xiv.包含SEQ ID NO：294的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
XV.包含SEQ ID NO：304的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：304的氨基酸序列具有至少97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
xvi.包含SEQ ID NO：314的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：314的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
xvii.包含SEQ ID NO：324的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：324的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
xviii.包含SEQ ID NO：334的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：334的氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
xix.包含SEQ ID NO：344的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：344的氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
Xx.包含SEQ ID NO：354的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：354的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，人源化TDP-43结合分子，特别是人源化TDP-43抗体或其抗原片段包含：
a.包含SEQ ID NO：300的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：300的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；和包含SEQ ID NO：294的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
b.包含SEQ ID NO：310的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：310的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；和包含SEQ ID NO：294的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
c.包含SEQ ID NO：320的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：320的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；和包含SEQ ID NO：294的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
d.包含SEQ ID NO：340的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：340的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；和包含SEQ ID NO：294的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
e.包含SEQ ID NO：350的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：350的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；和包含SEQ ID NO：294的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
f.包含SEQ ID NO：340的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：340的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；和包含SEQ ID NO：324的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：324的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
g.包含SEQ ID NO：340的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：340的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；和包含SEQ ID NO：334的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：334的氨基酸序列具有至少94％、95％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
h.包含SEQ ID NO：340的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：340的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；和包含SEQ ID NO：344的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：344的氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
i.包含SEQ ID NO：350的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：350的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；和包含SEQ ID NO：334的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：334的氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
j.包含SEQ ID NO：350的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：350的氨基酸序列具有至少90％、91％、92、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；和包含SEQ ID NO：344的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：344的氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
k.包含SEQ ID NO：300的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：300的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；和包含SEQ ID NO：334的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：334的氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
1.包含SEQ ID NO：380的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：380的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；和包含SEQ ID NO：354的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：354的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，人源化TDP-43抗体包含：
a.包含SEQ ID NO：300的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：294的序列的轻链可变区(VL)；或
b.包含SEQ ID NO：310的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：294的序列的轻链可变区(VL)；或
c.包含SEQ ID NO：320的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：294的序列的轻链可变区(VL)；或
d.包含SEQ ID NO：340的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：294的序列的轻链可变区(VL)；或
e.包含SEQ ID NO：350的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：294的序列的轻链可变区(VL)；或
f.包含SEQ ID NO：340的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：324的序列的轻链可变区(VL)；或
g.包含SEQ ID NO：340的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：334的序列的轻链可变区(VL)；或
h.包含SEQ ID NO：340的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：344的序列的轻链可变区(VL)；或
i.包含SEQ ID NO：350的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：334的序列的轻链可变区(VL)；或
j.包含SEQ ID NO：350的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：344的序列的轻链可变区(VL)；或
k.包含SEQ ID NO：300的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：334的序列的轻链可变区(VL)；或
l.包含SEQ ID NO：380的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：354的序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，人源化TDP-43抗体包含：
a.包含SEQ ID NO：310的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：294的序列的轻链可变区(VL)；或
b.包含SEQ ID NO：340的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：334的序列的轻链可变区(VL)；或
c.包含SEQ ID NO：340的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：344的序列的轻链可变区(VL)；或
d.包含SEQ ID NO：350的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：334的序列的轻链可变区(VL)；或
e.包含SEQ ID NO：350的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：344的序列的轻链可变区(VL)；或
f.包含SEQ ID NO：300的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：334的序列的轻链可变区(VL)；或
g.包含SEQ ID NO：380的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：354的序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，本发明涉及选自以下的人源化TDP-43结合分子：hACI-7069-633B12-Ab1_H15L14、hACI-7069-633B12-Ab1_H16L14、hACI-7069-633B12-Ab1_H17L14、hACI-7069-633B12-Ab1_H19L14、hACI-7069-633B12-Ab1_H20L14、hACI-7069-633B12-Ab1_H19L17、hACI-7069-633B12-Ab1_H19L18、hACI-7069-633B12-Ab1_H19L19、hACI-7069-633B12-Ab1_H20L18、hACI-7069-633B12-Ab1_H20L19、hACI-7069-633B12-Ab1_H15L18或hACI-7069-633B12-Ab1_H23L20。
优选地，人源化TDP-43结合分子选自hACI-7069-633B12-Ab1_H16L14、hACI-7069-633B12-Ab1_H19L18、hACI-7069-633B12-Ab1_H19L19、hACI-7069-633B12-Ab1_H20L18或hACI-7069-633B12-Ab1_H20L19、hACI-7069-633B12-Ab1_H15L18或hACI-7069-633B12-Ab1_H23L20。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中(分离的)核酸编码本文中所述的人源化TDP-43结合分子，特别是人源化TDP-43抗体及其片段。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：168。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：169。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：178。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：179。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：188。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：189。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：198。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：199。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：208。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：209。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：218。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：219。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：228。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：229。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：238。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：239。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：248。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：249。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：258。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：259。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：268。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：269。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：278。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：279。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：288。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：289。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：298。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：299。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：308。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：309。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：318。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：319。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：328。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：329。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：338。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：339。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：348。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：349。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：358。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：359。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：368。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：378。
在一些实施方案中，提供了(分离的)核酸，其中该(分离的)核酸包含编码人源化抗TPD-43抗体的SEQ ID NO：398。
XII.组合物和方法
本发明还涉及包含如本文中所述的本发明人源化TDP-43结合分子，特别是人源化抗体或其抗原结合片段以及可药用载体和/或赋形剂和/或稀释剂的药物组合物。
在一些实施方案中，提供了药物组合物，其包含本文中所述的(分离的)人源化抗体和可药用载体。
在一些实施方案中，提供了包含以下的缀合的结合分子，特别是抗体或其抗原结合片段：本文中所述的结合分子，特别是抗体或其抗原结合片段，和缀合分子。本发明的缀合物可被称为免疫缀合物。根据本发明可使用任何合适的缀合分子。一些合适的实例包括但不限于：酶(例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)、亲和素、链霉亲和素、生物素、蛋白A/G、磁珠、荧光团、放射性同位素(即放射性缀合物)、核酸分子、可检测标记、治疗剂、毒素和血脑屏障穿透部分。缀合方法是本领域公知的，并且用于使抗体与标记或其他分子缀合的数种技术是可商购的。缀合通常是通过包含在本发明结合分子内的氨基酸残基(例如赖氨酸、组氨酸或半胱氨酸)的。它们可依赖于例如NHS(琥珀酰亚胺)酯法、异硫氰酸酯法、碳二亚胺法和高碘酸盐法的方法。缀合可通过例如产生融合蛋白来实现。这在结合分子与另一蛋白质分子缀合的情况下是合适的。因此，可形成合适的遗传构建体，其允许本发明的结合分子与标记或其他分子的融合体的表达。缀合可以是通过合适的接头部分的，以确保抗体与缀合分子(例如可检测标记)的合适空间分离。但是，并非在所有情况下都需要接头。在一些实施方案中，本发明的人源化TDP-43特异性结合分子与可检测标记连接。
本发明还涉及包含与一种或更多种治疗剂缀合的本文中提供的人源化TDP-43结合分子的免疫缀合物，所述治疗剂例如：化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的蛋白质毒素、酶活性毒素，或其片段)、放射性同位素(即放射性缀合物)、血脑屏障穿透部分或可检测标记。存在多种用于改善如本文中所讨论的穿过血脑屏障(BBB)的药物递送的技术，该讨论加以必要的修改应用。非侵入性技术包括所谓的“特洛伊木马方法”，其中缀合分子通过与BBB受体结合并介导转运来递送本发明的结合分子。合适的分子可包含内源性配体或抗体，特别是单克隆抗体，其结合BBB受体上的特定表位。
在一些实施方案中，提供了免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含本文中所述的(分离的)人源化抗体和治疗剂。在一些实施方案中，提供了经标记人源化抗体，其包含本文中所述的人源化抗体和可检测标记。
在一些实施方案中，人源化TDP-43特异性结合分子是其中人源化TDP-43特异性结合分子与另一合适的治疗剂共价连接的免疫缀合物的一部分。
在一些实施方案中，人源化TDP-43特异性结合分子或包含其的免疫缀合物作为包含人源化TDP-43特异性结合分子的组合物存在。
在一些实施方案中，人源化TDP-43特异性结合分子是包含与可药用载体和/或赋形剂和/或稀释剂组合的以下的药物组合物的一部分：人源化TDP-43特异性结合分子，或其中人源化TDP-43特异性结合分子与另一合适的治疗剂共价连接的免疫缀合物，或包含人源化TDP-43特异性结合分子的组合物。
在一些实施方案中，人源化TDP-43特异性结合分子是包含以下的检测和/或诊断试剂盒的一部分：人源化TDP-43特异性结合分子，或其中人源化TDP-43特异性结合分子与另一合适的治疗剂共价连接的免疫缀合物，或包含人源化TDP-43特异性结合分子的组合物。
还提供了包含本发明的人源化结合分子的试剂盒。特别地，这样的试剂盒可用于进行本发明的诊断方法(其包括分类、监测和治疗选择方法)。因此，提供了用于诊断与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病或者用于本发明方法的试剂盒，其包含本发明的人源化TDP-43特异性结合分子。这样的试剂盒可包含用于进行本文中提供的方法的所有必要组分。通常来说，每种组分单独储存在单个整体包装中。包含在试剂盒中的合适的另外的组分是例如缓冲剂、可检测染料、实验室设备、反应容器、说明书，等。使用说明书可针对待使用试剂盒的具体方法进行定制。还提供了经适当标记的本发明的人源化TDP-43结合分子，其可包含在这样的试剂盒中。
在一些实施方案中，人源化TDP-43特异性结合分子用于用于预防、诊断或治疗TDP-43蛋白质病的免疫诊断方法中。
在一些实施方案中，向有此需要的对象施用人源化TDP-43特异性结合分子，或其中人源化TDP-43特异性结合分子与另一合适的治疗剂共价连接的免疫缀合物，或包含人源化TDP-43特异性结合分子的组合物，用于诊断、预防、减轻或治疗包括但不限于以下的与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病：额颞痴呆(FTD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、慢性创伤性脑病(CTE)、边缘主导年龄相关性TDP-43脑病(IATE)。
在一些实施方案中，向有此需要的对象施用人源化TDP-43特异性结合分子，或其中人源化TDP-43特异性结合分子与另一合适的治疗剂共价连接的免疫缀合物，或包含人源化TDP-43特异性结合分子的组合物，用于诊断或监测选自以下的与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病的方法中：额颞痴呆(FTD，例如散发性或家族性、伴有或不伴有运动神经元病(MND)、有颗粒蛋白前体(GRN)突变、有C9orf72突变、有TARDBP突变、有含缬酪肽蛋白(VCP)突变、与染色体9p相关、皮质基底节变性、有泛素阳性TDP-43包涵体的额颞叶变性(FTLD)(FTLD-TDP)、嗜银颗粒病、皮克病、语义变异型原发性进行性失语(svPPA)、行为变异型FTD(bvFTD)、非流利性变异型原发性进行性失语(nfvPPA)，等)、肌萎缩侧索硬化(ALS，例如散发性ALS、有TARDBP突变、有血管生成蛋白(ANG)突变)、亚历山大病(AxD)、边缘主导年龄相关性TDP-43脑病(LATE)、慢性创伤性脑病、佩里综合征、阿尔茨海默病(AD，包括散发性和家族性形式的AD)、唐氏综合征、家族性英国型痴呆、多聚谷氨酰胺病(亨廷顿病和脊髓小脑共济失调3型(SCA3；也称为马-约病))、海马硬化性痴呆和肌病(散发性包涵体肌炎；包涵体肌病，有含缬酪肽蛋白突变(VCP；以及佩吉特骨病和额颞痴呆)；有镶边空泡的眼咽肌营养不良；有肌收缩蛋白(MYOT)基因突变或编码结蛋白(DES)之基因的突变的肌原纤维肌病))、创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(DLB)或帕金森病(PD)。
在另一些实施方案中，本发明涉及用于检测、诊断或监测选自以下的与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病的任何方法：额颞痴呆(FTD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、慢性创伤性脑病(CTE)和边缘主导年龄相关性TDP-43脑病(LATE)。
优选地，与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病选自肌萎缩侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病(AD)和额颞痴呆(FTD)。更优选地，与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病是肌萎缩侧索硬化(ALS)。更优选地，与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病是阿尔茨海默病(AD)。更优选地，与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病是额颞痴呆(FTD)。
在一些实施方案中，人源化TDP-43特异性结合分子用于这样的方法中：其用于诊断症状前疾病或用于监测疾病进展和治疗效力，或用于预测响应性，或用于选择可能对用人源化TDP-43特异性结合分子进行的治疗作出响应的对象。所述方法优选地使用人血液或尿的样品进行。最优选地，所述方法涉及基于ELISA的测定或表面适应测定。
在一些实施方案中，人源化TDP-43特异性结合分子用于其中使本发明的人源化TDP-43特异性结合分子与样品(例如，血液、脑脊液、组织间液(ISF)或脑组织)接触以检测、诊断或监测以下的方法中：额颞变性(FTD)或肌萎缩侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病(AD)、慢性创伤性脑病、佩里综合征、边缘主导年龄相关性TDP-43脑病(LATE)和/或帕金森病(PD)。
在一些实施方案中，人源化TDP-43特异性结合分子用于其中使本发明的人源化TDP-43特异性结合分子与样品(例如，血液、脑脊液、组织间液(ISF)或脑组织)接触以检测、诊断或选自以下的疾病的方法中：额颞痴呆(FTD，例如散发性或家族性、伴有或不伴有运动神经元病(MND)、有颗粒蛋白前体(GRN)突变、有C9orf72突变、有TARDBP突变、有含缬酪肽蛋白(VCP)突变、与染色体9p相关、皮质基底节变性、有泛素阳性TDP-43包涵体的额颞叶变性(FTLD)(FTLD-TDP)、嗜银颗粒病、皮克病、语义变异型原发性进行性失语(svPPA)、行为变异型FTD(bvFTD)、非流利性变异型原发性进行性失语(nfvPPA)，等)、肌萎缩侧索硬化(ALS，例如散发性ALS，有TARDBP突变、有血管生成蛋白(ANG)突变)、亚历山大病(AxD)、边缘主导年龄相关性TDP-43脑病(LATE)、慢性创伤性脑病、佩里综合征、阿尔茨海默病(AD，包括散发性和家族性形式的AD)、唐氏综合征、家族性英国型痴呆、多聚谷氨酰胺病(亨廷顿病和脊髓小脑共济失调3型(SCA3；也称为马-约病))、海马硬化性痴呆和肌病(散发性包涵体肌炎；包涵体肌病，有含缬酪肽蛋白突变(VCP；以及佩吉特骨病和额颞痴呆)；有镶边空泡的眼咽肌营养不良；有肌收缩蛋白(MYOT)基因突变或编码结蛋白(DES)之基因的突变的肌原纤维肌病))、创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(DLB)或帕金森病(PD)。
在一些实施方案中，向有此需要的对象施用人源化TDP-43特异性结合分子，或其中人源化TDP-43特异性结合分子与另一合适的治疗剂共价连接的免疫缀合物，或包含人源化TDP-43特异性结合分子的组合物，用于预防、减轻或治疗与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病、或额颞变性(FTD)或肌萎缩侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病(AD，包括散发性和家族性形式的AD)、慢性创伤性脑病、佩里综合征和边缘主导年龄相关性TDP-43脑病(LATE)和/或帕金森病(PD)。
在一些实施方案中，向有此需要的对象施用人源化TDP-43特异性结合分子，或其中人源化TDP-43特异性结合分子与另一合适的治疗剂共价连接的免疫缀合物，或包含人源化TDP-43特异性结合分子的组合物，用于治疗选自以下的疾病：额颞痴呆(FTD，例如散发性或家族性、伴有或不伴有运动神经元病(MND)、有颗粒蛋白前体(GRN)突变、有C9orf72突变、有TARDBP突变、有含缬酪肽蛋白(VCP)突变、与染色体9p相关、皮质基底节变性、有泛素阳性TDP-43包涵体的额颞叶变性(FTLD)(FTLD-TDP)、嗜银颗粒病、皮克病、语义变异型原发性进行性失语(svPPA)、行为变异型FTD(bvFTD)、非流利性变异型原发性进行性失语(nfvPPA)，等)、肌萎缩侧索硬化(ALS，例如散发性ALS、有TARDBP突变、有血管生成蛋白(ANG)突变)、亚历山大病(AxD)、边缘主导年龄相关性TDP-43脑病(LATE)、慢性创伤性脑病、佩里综合征、阿尔茨海默病(AD，包括散发性和家族性形式的AD)、唐氏综合征、家族性英国型痴呆、多聚谷氨酰胺病(亨廷顿病和脊髓小脑共济失调3型(SCA3；也称为马-约病))、海马硬化性痴呆和肌病(散发性包涵体肌炎；包涵体肌病，有含缬酪肽蛋白突变(VCP；以及佩吉特骨病和额颞痴呆)；有镶边空泡的眼咽肌营养不良；有肌收缩蛋白(MYOT)基因突变或编码结蛋白(DES)之基因的突变的肌原纤维肌病))、创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(DLB)或帕金森病(PD)。优选地，所述疾病治疗有助于保持或提高心理认知，和/或降低脑中TDP-43聚集体的水平。
在一些实施方案中，向有此需要的对象施用人源化TDP-43特异性结合分子，或其中人源化TDP-43特异性结合分子与另一合适的治疗剂共价连接的免疫缀合物，或包含人源化TDP-43特异性结合分子的组合物，用于制造用于治疗以下的药物：与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病、或额颞变性(FTD)或肌萎缩侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病(AD，包括散发性和家族性形式的AD)、慢性创伤性脑病、佩里综合征和边缘主导年龄相关性TDP-43脑病(LATE)和/或帕金森病(PD)。
如本文中所述的人源化抗TDP-43抗体(TDP-43特异性结合分子的优选类型)或免疫缀合物的药物制剂通过将具有所期望纯度的这样的人源化抗体或免疫缀合物与一种或更多种任选的可药用载体和/或赋形剂和/或稀释剂(Remington’s PharmaceuticalSciences第16版，Osol，A.Ed.(1980))混合来制备。通常来说，抗体或其片段被制备为冻干制剂或水溶液。可药用载体通常在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，例如钠；金属络合物(例如Zn蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性可药用载体还包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(solubleneutral-active hyaluronidase glycoprotein，sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(Baxter International，Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公开No.2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面中，将sHASEGP与一种或更多种另外的糖胺聚糖酶(glycosaminoglycanase)例如软骨素酶组合。可用于配制组合物的可药用赋形剂包括但不限于：离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白例如人血清白蛋白、缓冲物质例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质，例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质(例如羧甲基纤维素钠)、聚乙二醇、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。稀释剂可以是缓冲剂。其可包含选自磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和酒石酸盐的盐，和/或其中缓冲剂包含组氨酸、甘氨酸、TRIS甘氨酸、Tris或其混合物。在本发明的上下文中进一步设想稀释剂是选自磷酸钾、乙酸/乙酸钠、柠檬酸/柠檬酸钠、琥珀酸/琥珀酸钠、酒石酸/酒石酸钠、和组氨酸/组氨酸HCl或其混合物的缓冲剂。
示例性的冻干抗体或免疫缀合物制剂描述于美国专利No.6,267,958中。水性抗体或免疫缀合物制剂包括描述于美国专利No.6,171,586和W02006/044908中的那些，后者的制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
针对所治疗的特定适应证，本文中的制剂必要时还可包含多于一种的活性成分，优选具有不彼此不利影响的互补活性的那些。
可将活性成分包封在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微囊，例如分别羟甲基纤维素或明胶微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊中；在胶体药物递送***(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米粒和纳米囊)中；或在粗乳剂(macroemulsion)中。这样的技术公开于Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.Ed.(1980)中。
可制备缓释制剂。缓释制剂的一些合适实例包括包含抗体或免疫缀合物的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质为成型制品的形式，例如，膜或微囊。用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌可例如通过经由无菌滤膜进行过滤容易地实现。
本文中提供的任何人源化抗原结合分子、人源化抗TDP-43抗体或免疫缀合物可用于方法，例如治疗方法中。
在另一个方面中，提供了用作药物的人源化抗TDP-43抗体(人源化TDP-43特异性结合分子的优选类型)或免疫缀合物。在另外的方面中，提供了用于治疗方法中的抗错折叠人源化TDP-43抗体(人源化TDP-43特异性结合分子的优选类型)或免疫缀合物。在某些实施方案中，提供了用于预防、诊断和/或治疗TDP-43蛋白质病的人源化抗TDP-43抗体(人源化TDP-43特异性结合分子的优选类型)或免疫缀合物。在本发明的一个优选实施方案中，提供了人源化抗TDP-43抗体(人源化TDP-43特异性结合分子的优选类型)或免疫缀合物，用于预防、诊断和/或治疗包括但不限于以下的与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病：额颞痴呆(FTD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、慢性创伤性脑病(CTE)和/或边缘主导年龄相关性TDP-43脑病(LATE)。
在另一个方面中，本发明提供了人源化抗TDP-43抗体(人源化TDP-43特异性结合分子的优选类型)或免疫缀合物在制造或制备药物中的用途。在一个这样的实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如下所述。
根据一些实施方案中的任一个，“对象”或“个体”可以是动物，哺乳动物，优选人。
在另一个方面中，本发明提供了例如用于治疗方法中任一种的包含本文中提供的任何人源化抗TDP-43抗体(人源化TDP-43特异性结合分子的优选类型)或免疫缀合物的药物制剂。在一个实施方案中，药物制剂包含本文中提供的任何人源化抗TDP-43抗体(人源化TDP-43特异性结合分子的优选类型)或免疫缀合物，以及可药用载体和/或赋形剂和/或稀释剂(如在本文中其他部分讨论的)。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文中提供的任何人源化抗TDP-43抗体(人源化TDP-43特异性结合分子的优选类型)或免疫缀合物，以及至少一种另外的治疗剂，例如如下所述。
本发明的人源化抗体或免疫缀合物在治疗中可单独使用或与其他药剂组合使用。例如，本发明的人源化抗体(人源化TDP-43特异性结合分子的优选类型)或免疫缀合物可与靶向α-突触核蛋白、BACEl、Tau、β-淀粉样蛋白、TDP-43或神经炎症蛋白的至少一种另外的治疗剂共施用。
例如，本发明的人源化抗体(人源化TDP-43特异性结合分子的优选类型)或免疫缀合物可与至少一种另外的治疗剂共施用，所述治疗剂选自但不限于神经药物、抗-β淀粉样蛋白抗体、抗Tau抗体、Tau聚集抑制剂(包括小分子)、β-淀粉样蛋白聚集抑制剂(包括小分子)、抗BACEl抗体、BACEl抑制剂、抗α-突触核蛋白抑制剂、抗α-突触核蛋白抗体和神经炎症抑制剂。
以上所述的这样的组合治疗涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在同一或分开的制剂中)和分开施用，在分开施用的情况下，本发明的人源化抗体(人源化TDP-43特异性结合分子的优选类型)或免疫缀合物的施用可在施用另外的治疗剂和/或辅助剂之前、同时和/或之后发生。本发明的人源化抗体(人源化TDP-43特异性结合分子的优选类型)或免疫缀合物也可与放射治疗组合使用。
本发明的人源化抗体(人源化TDP-43特异性结合分子的优选类型)或免疫缀合物(和任何另外的治疗剂)可通过任何合适的手段施用，包括肠胃外、肺内和鼻内、以及如果需要的话，进行局部治疗、病灶内、子宫内或膀胱内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可通过任何合适的途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射来进行，这部分取决于短暂还是长期施用。本文中考虑了多种给药方案，包括但不限于单次施用或在不同时间点内的多次施用、推注施用(bolus administration)和脉冲输注。
本发明的人源化抗体(人源化TDP-43特异性结合分子的优选类型)或免疫缀合物可以以与良好医学实践一致的方式配制、给药和施用。在该情况下考虑的因素包括：治疗的与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的特定疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病；治疗的特定哺乳动物；个体对象的临床状况；与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病的原因；药剂的递送部位；施用方法；施用方案；以及医学实践者已知的其他因素。人源化抗体或免疫缀合物不需要但任选地与目前用于预防或治疗所讨论的与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病的一种或更多种药剂一起配制。这样的其他药剂的有效量取决于存在于制剂中的人源化抗体或免疫缀合物的量；与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病的类型；或者治疗，以及上述其他因素。这些通常以与如本文中所述的相同的剂量和施用途径，或以本文中所述剂量的约1％至99％，或以凭经验/在临床上确定合适的任何剂量和任何途径使用。
对于预防或治疗疾病，本发明的人源化抗体(人源化TDP-43特异性结合分子的优选类型)或免疫缀合物(当单独地或与一种或更多种其他另外的治疗剂组合使用时)的合适剂量将取决于待治疗的疾病类型、抗体或免疫缀合物的类型、疾病的严重程度和原因、是出于预防目的还是治疗目的施用抗体或免疫缀合物、先前治疗、对象的临床史和对抗体或免疫缀合物的响应，以及主治医师的判断。将人源化抗体(人源化TDP-43特异性结合分子的优选类型)或免疫缀合物适当地一次或通过一系列治疗施用于对象。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg至10mg/kg)的人源化抗体(人源化TDP-43特异性结合分子的优选类型)或免疫缀合物可以是用于向对象施用的初始候选剂量，无论例如是通过一次或更多次分开的施用，还是通过连续输注。根据上述因素，一种典型的日剂量可以是约1μg/kg至100mg/kg或更高。对于在数天或更长时间内的重复施用，根据病症，通常将持续治疗直至出现所期望的疾病症状抑制。人源化抗体或免疫缀合物的一个示例性剂量是约0.05mg/kg至约10mg/kg。因此，可向对象施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg的一个或更多个剂量(或其任意组合)。这样的剂量可间歇地施用，例如，每周或每三周(例如，使对象接受约2至约20，或例如约6个剂量的抗体)。可施用较高的初始负荷剂量，随后施用一个或更多个较低的剂量。然而，可使用其他剂量方案。该治疗的进展通过常规技术和测定容易地监测。
应当理解，任何以上制剂或治疗方法可使用本发明的免疫缀合物和人源化抗TDP-43抗体(人源化TDP-43特异性结合分子的优选类型)二者来进行。
在本发明的另一个方面中，提供了包含上述可用于治疗、预防和/或诊断与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍或异常、或TDP-43蛋白质病的材料的制品。该制品包含容器以及在容器上或与容器相联接的标记或包装***物。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由多种材料，例如玻璃或塑料形成。容器容纳单独地或与另一组合物组合有效治疗、预防和/或诊断与TDP-43相关、特别是与TDP-43聚集体相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病的组合物，并且可具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可通过皮下注射针刺穿的塞的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的人源化抗体或免疫缀合物。标记或包装***物指示所述组合物用于治疗所选择的病症。
此外，该制品可包含：(a)第一容器，其中包含组合物，其中所述组合物包含本发明的人源化抗体(人源化TDP-43特异性结合分子的优选类型)或免疫缀合物；以及(b)第二容器，其中包含组合物，其中所述组合物包含另外的治疗剂。在本发明的该实施方案中的制品可还包含指示所述组合物可用于治疗特定病症的包装***物。作为替代或补充，该制品可还包含第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含可药用缓冲剂，例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸缓冲盐水、林格溶液或右旋糖溶液。其还可包含从商业和使用者的角度来看所期望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针和注射器。
在另一个实施方案中，本发明涉及在对象中保持或提高认知记忆能力、运动和语言功能或者预防和/或减慢认知记忆能力、运动和语言功能的衰退的方法，其包括施用本发明的人源化结合分子、本发明的免疫缀合物、本发明的组合物或本发明的药物组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及降低TDP-43水平的方法，其包括施用本发明的人源化结合分子、本发明的免疫缀合物、本发明的组合物或本发明的药物组合物。
本发明的方法可包括施用至少一种另外的治疗，优选地其中所述另外的治疗选自但不限于：靶向α-突触核蛋白、BACE1、tau、β-淀粉样蛋白、TDP-43或神经炎症蛋白的抗体或小分子，特别是神经药物、抗β-淀粉样蛋白抗体、抗Tau抗体、Tau聚集抑制剂、β-淀粉样蛋白聚集抑制剂、抗BACE1抗体、BACE1抑制剂、抗α-突触核蛋白抗体和神经炎症抑制剂。
本发明还涉及检测TDP-43的方法，其包括使样品与本发明的人源化结合分子，优选本发明的人源化抗体接触，其中所述样品是脑样品、脑脊液样品、尿样品或血液样品。
在某些实施方案中，如本文中提供的人源化TDP-43结合分子，特别是人源化TDP-43抗体及其片段的解离常数(dissociation constant，KD)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)，特别是关于结合TDP-43，特别是可溶性TDP-43。例如，本发明的人源化TDP-43结合分子对于可溶性全长TDP-43的KD可以为2nM或更小，在一些具体实施方案中为1nM或更小，在一些更具体的实施方案中，对于可溶性全长TDP-43的KD为700pM或更小。参考表13，在实施例14中对本发明的人源化TDP-43结合分子证明了这一点。
在一个实施方案中，对全长(full length，FL)TDP-43的结合亲和力可通过使用表面等离激元共振(surface plasmon resonance，SPR；Biacore 8K，GE Healthcare LifeSciences)测定解离常数(KD)来评价。对于可采用的合适SPR方法的详细描述，可参考实施例14。
本发明的人源化TDP-43结合分子对于TP-51肽的KD可为15nM或更小，在一些具体实施方案中为10nM或更小。参考表13，在实施例14中对本发明的人源化TDP-43结合分子也证明了这一点。
附图说明
图1：来自患有具有A型病理的额颞痴呆(FTD)的对象的组织切片中TDP-43的检测。使用用于检测的经荧光标记的二抗对来自具有A型病理的FTD对象的额皮质的10μm厚冷冻切片进行免疫组织化学。使用以下抗体作为对照：用于检测病理性包涵体和生理性细胞核TDP-43的兔多克隆泛TDP-43抗体(Proteintech，10782-2-AP)；用于检测病理性聚集和磷酸化TDP-43的兔单克隆磷酸化TDP-43p409/410抗体(Cosmobio，TIP-PTD-P02)。箭头指示TDP-43聚集体；粗箭头指示细胞核中的生理性TDP-43(细胞核通过DAPI染色可视化)。杂交瘤名称或商业抗体来源示出于每个图像的左上角。
图2：从FTD A型死后脑组织(额皮质)获得的洗涤剂(sarkosyl)可溶性和不溶性级分中的TDP-43检测。在与N端区域(A，B)或C端区域(C)结合的商业抗体的情况下的免疫印迹显示在sarkosyl可溶性(泳道1)和不溶性(泳道2)级分中存在TDP-43。表位在TDP-43的N端区域的在该研究中产生的针对TDP-43的mAb的免疫印迹(D至I)。在TDP-43的C端区域结合的针对TDP-43的mAb的免疫印迹(J至N)。针对TDP-43的所有mAb均特异性识别全长TDP-43。另外，一些mAb(K、M、N)识别病变状态的病理特征，例如不溶性级分中的C端片段。
图3：示出了针对经载剂(n＝30，灰色条)和经ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)(n＝25，带点的灰色条)处理的小鼠的两个脑区域：纹状体(A)和大脑皮质(B)所测量的pTDP-43免疫反应物体的密度。(C)经载剂(n＝30)和经ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)(n＝25)处理的组中针对总TDP-43对从左脑半球的皮质中获得的不溶性级分进行定量(*p＜0.05，**p＜0.01，****p＜0.0001)。
图4：在30小时之后通过600nm处的浊度测量在存在ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)或同种型对照的情况下通过TEV切割诱导的TDP-43聚集。将30小时之后的终点相对于同种型对照(灰色条)归一化，并针对ACI-7069-633B12-Ab1(带点的灰色条)计算聚集TDP-43(％)。示出了三个独立实验的平均值±SD，并且通过Welch t检验分析同种型对照与ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)之间的统计学差异(***p＜0.001)。
图5：(A)示出了针对经载剂(n＝16，灰色条)和经ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)(n＝16，带点的灰色条)处理的小鼠的脑皮质所测量的Iba1阳性免疫反应面积。误差棒表示平均值的标准误差(SEM)。(B至C)示出了针对经载剂(n＝16，灰色条)和经ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)(n＝16，带点的灰色条)处理的小鼠的脑皮质所测量的平均小胶质细胞尺寸。小胶质细胞基于其形态分类为三类：(B)大肥大性(large hypertrophic)，(C)小分枝(small ramifying)和(D)分枝静息(ramified resting)。通过t检验分析载剂对照与ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)之间的统计学差异(*p＜0.05)。
图6：使用AlphaLISA测定使用ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)和ACI-7071-809F12-Ab1(IgG2a变体)，对多个FTLD-TDP患者与健康对照的CSF中TDP-43水平进行定量。对多个CSF样品(x轴)获得总TDP-43的原始AlphaLISA计数(y轴)。使用组、实验、性别和年龄作为固定因素，并将个体作为随机因素用来自三个独立实验的数据使用线性混合模型对原始计数进行统计学分析(**p＜0.01)。
图7：来自从FTD A型死后脑组织中获得的洗涤剂(sarkosyl)不溶性级分的通过抗体ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)(1)、ACI-7069-642D12-Ab1(IgG2a变体)(2)和小鼠IgG2a对照(3)的TDP-43和pTDP-43的免疫耗竭。使用TDP-43或pTDP-43特异性检测抗体，通过Western印迹对经免疫耗竭级分1至3进行分析。IN是指输入材料(在免疫耗竭之前)。
图8：(A)IgG4同种型的ACI-7069-633B12-Ab1人源化变体对TDP-43从头聚集的抑制。(B)IgG1同种型的ACI-7069-633B12-Ab1人源化变体对TDP-43从头聚集的抑制。将曲线下面积(AUC)相对于同种型对照归一化，并将数据以TDP-43聚集的百分比抑制表示。将数据以三个独立重复的平均值+SD表示。
图9：来自从FTD A型死后脑组织中获得的洗涤剂(sarkosyl)不溶性级分的通过抗体hACI-7069-633B12-Ab1_H19L18(hIgG1同种型)和人IgG1同种型对照的TDP-43和pTDP-43的免疫耗竭和免疫沉淀。使用TDP-43或pTDP-43特异性检测抗体通过Western印迹对经免疫耗竭级分(泳道2至3)和经免疫沉淀级分(泳道4至5)进行分析。泳道1显示输入材料(在免疫耗竭和免疫沉淀之前)。
实施例
实施例1：TDP-43疫苗组合物的制备
基于脂质体的疫苗根据公布于WO2012/055933中的方案进行制备。包含全长TDP-43(FL TDP-43)蛋白作为抗原(表2，SEQ ID NO：1)的疫苗用于抗体产生。
表2：TDP-43蛋白和肽抗原描述
实施例2：抗TDP-43抗体的产生
A.小鼠免疫接种
在9周龄时接受雌性C57BL/6JOlaHsd(C57BL/6)和BALB/c OlaHsd(BALB/c)野生型小鼠(Harlan，USA)。疫苗接种开始于10周时。在存在作为佐剂的单磷酰基六酰基脂质A，3-脱酰基(合成)(3D-(6-酰基))的情况下，用存在于脂质体表面上的全长TDP-43蛋白对小鼠进行疫苗接种。
在第0、4、8、21、35和60天通过皮下注射(s.c.)对小鼠进行疫苗接种。在免疫接种之前7天(免疫前血浆)和在第一次免疫接种之后第14、28、42、81和121天对小鼠采血并制备肝素化血浆。另外，通过在无佐剂的情况下按照i.p.注射进行TDP-43蛋白的每天三次加强注射对用于骨髓瘤融合的小鼠进行疫苗接种。
在小鼠血浆中测量疫苗应答。来自经免疫接种小鼠的血浆来源抗体与固定化重组全长(FL)TDP-43的结合指示抗体针对TDP-43的高效价。
B.杂交瘤的产生和对亚克隆的选择
对小鼠进行安乐死，并使用来自四只单个小鼠的脾细胞进行与骨髓瘤细胞的融合。从成功融合的杂交瘤细胞系中筛选抗体如下进行。使用基于Luminex珠的多重测定(Luminex，The Netherlands)分析经稀释的(1：32)细胞培养上清液。将Luminex珠与FLTDP-43缀合，并用对IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgG3亚类具有特异性的抗小鼠IgG-Fc抗体(Jackson Immunoresearch，USA)捕获IgG。与与FL TDP-43缀合的珠的结合鉴定出来源于用FL TDP-43脂质体疫苗免疫接种的小鼠的386个命中物(hit)。
使用含血清的选择培养基培养活杂交瘤。选择与人FTD脑中TDP-43包涵体优先结合的克隆和与TDP-43的C端结合的克隆进行进一步亚克隆。在有限稀释之后，将克隆杂交瘤在含低免疫球蛋白的培养基中培养，并选择稳定的集落进行抗体筛选和选择。示于表3中的抗体是从该筛选中鉴定出的。
实施例3：结合效力(EC50)的确定
如前所述，进行在抗体的系列稀释情况下的Luminex测定，以确定抗体与FL TDP-43结合的半最大效应浓度(EC50)。所有的EC50值概述于表3中。总之，所有受试抗体均以高亲和力与全长TDP-43结合。
表3：通过Luminex测定确定的EC50值
实施例4：与人FL TDP-43结合的抗体
与人FL TDP-43结合的抗体使用间接ELISA确定。在4℃下于碳酸盐缓冲液中用1μg/ml人FL TDP-43进行ELISA板包被过夜。将板用0.05％吐温20/PBS洗涤，并且然后用0.05％吐温20/PBS中的1％牛血清白蛋白(BSA)在37℃下封闭1小时。然后，以3倍系列稀释度(起始于1lμg/ml)添加从杂交瘤上清液中纯化的抗体，并在37℃下孵育2小时，在此之后将板洗涤。在37℃下，以0.05％吐温20/PBS中的1/1000稀释度添加AP缀合的抗小鼠IgG二抗(Jackson Immunoresearch Laboratories，United Kingdom)，持续1小时。在最后洗涤之后，将板与pNPP(Sigma-Aldrich，Switzerland)磷酸酶底物溶液一起孵育，并使用ELISA读板仪(Tecan，Switzerland)在405nm处读取。所有受试克隆均与全长TDP-43结合，其不同EC50值为10至1567ng/ml(表4)。
表4：通过ELISA的EC50值
实施例5：通过ELISA和肽阵列进行的表位作图
使用40-66aa线性肽或者在N端生物素化且以9aa偏移(offset)和6aa重叠(overlap)覆盖整个TDP-43序列的15-mer肽的文库，通过间接ELISA测定筛选从无血清杂交瘤上清液中纯化的抗体，以确定结合区。肽序列提供于表5中。
将96孔板在4℃下于碳酸盐缓冲液中用5μg/ml非生物素化肽包被过夜。将板用0.05％吐温20/PBS洗涤，并且然后用0.05％吐温20/PBS中的1％牛血清白蛋白(BSA)在37℃下封闭1小时。然后以1μg/ml添加从杂交瘤上清液中纯化的抗体，并在37℃下孵育2小时，在此之后将板洗涤。在37℃下，以0.05％吐温20/PBS中的1/1000稀释度添加AP缀合的抗小鼠IgG二抗(Jackson Immunoresearch Laboratories，United Kingdom)，持续1小时。在最后洗涤之后，将板与pNPP(Sigma-Aldrich，Switzerland)磷酸酶底物溶液一起孵育，并使用ELISA读板仪(Tecan，Switzerland)在405nm处读取。
对于生物素化肽，将96孔经链霉亲和素包被的ELISA板与5μg/mL的生物素化1S-mer肽一起孵育。将板用0.05％吐温20/PBS洗涤3次，并且然后用0.05％吐温20/PBS中的1％牛血清白蛋白(BSA)在37℃下封闭1小时。然后以1μg/ml添加从杂交瘤上清液中纯化的抗体，并在37℃下孵育2小时，在此之后将板洗涤。在37℃下，以0.05％吐温20/PBS中的1/1000稀释度添加AP缀合的抗小鼠IgG二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories，UnitedKingdom)，持续1小时。在最后洗涤之后，将板与pNPP(Sigma-Aldrich，Switzerland)AP底物溶液一起孵育，并使用ELISA读板仪(Tecan)在405nm处读取。确定的结合区提供于表6中。发现受试抗体与以下肽结合：分别对应于SEQ ID NO：1的第181至195位、第199至213位、第307至321位、第352至366位、第389至411位、第140至200位区域的TP-21、TP-23、TP-35、TP-40、TP-48、TDP-6。
更确切的线性表位使用直接在固体支持物上合成并且以1aa偏移和14aa重叠覆盖根据SEQ ID NO：1的整个TDP-43序列的15-mer肽的文库(Pepscan，Netherlands)进行作图。将肽阵列用马血清和卵清蛋白进行封闭，并在4℃下与浓度为0.75至5μg/ml的经纯化抗体溶液孵育过夜。在洗涤之后，将肽阵列与1/1000稀释度的兔抗小鼠IgG(H+L)HRP缀合物(Southem Biotech，USA)在25℃下孵育1小时。在洗涤之后，添加过氧化物酶底物2，2’-叠氮基-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐(ABTS)和20μl/ml的3％H2O2。在一个小时之后，用电荷耦合器件(charge coupled device，CCD)-相机和图像处理***对显色进行定量。这些结合区通过表位作图确定，并且鉴定了以下表位(提供于表6中)：SEQ ID NO：1的第183至188位、第203至213位、第204至208位、第204至211位、第205至210位、第316至323位、第358至361位、第400至405位、第400至406位、第400至412位氨基酸。
表5：用于通过ELISA确定结合区的肽
表6：受试抗体的结合区和表位
杂交瘤克隆名称 结合区，aa 表位，aa
631B2A2 397-411 400-406
633B12C8 397-411 400-405
634H10H7 140-200 183-188
636E5B8 352-366 358-361
641H1E7 199-213 204-211
642A10B11 389-411 400-412
642D1284 181-195 183-188
646B7F7 199-213 205-210
712A6B10 307-321 316-323
809D9C2 199-213 203-213
809F12D8 199-213 204-208
实施例6：通过免疫组织化学的来自FTD/ALs对象的脑组织中TDP-43的检测
在来自FTD对象脑的组织的免疫组织化学实验中评价靶标接合。人FTD脑组织从荷兰脑库(The Netherlands Brain Bank)、荷兰神经***科学协会(Netherlands Institutefor Neuroscience)(Amsterdam)(开放访问：www.brainbank.nl)和皇后广场神经病脑库(Queen Square Brain Bank for Neurological Disorders)(UCL)获得。所有材料均从捐赠者中收集，脑库已从所述捐赠者获得关于脑尸检以及出于研究目的使用材料和临床信息的书面知情同意。使用用于检测的经荧光标记的二抗对10μm厚冷冻切片进行免疫组织化学。使用以下抗体作为对照：用于检测病理性包涵体和生理性细胞核TDP-43的兔多克隆泛TDP-43抗体(Proteintech，10782-2-AP)；用于检测病理性聚集和磷酸化TDP-43的兔单克隆磷酸化TDP-43p409/410抗体(Cosmobio，TIP-PTD-P02)；以及用于检测非特异性背景的无一抗的二抗(无1°Ab)。
本发明的所有抗体均与细胞核TDP-43、非聚集TDP-43以及聚集TDP-43结合。本发明的一些抗体优先与A型病理中细胞质中的聚集TDP-43结合(图1)。对结合特征的详细评价概述于表7中。
表7：来自FTD对象的脑组织中TDP-43的检测
抗体名称 聚集TDP-43的IHC检测 细胞核非聚集TDP-43的IHC检测
ACI-7069-631B2-Ab1 +++ +++
ACI-7069-633B12-Ab1 +++ +++
ACI-7069-634H10-Ab2 ++ ++
ACI-7069-636E5-Ab1 +/- +++
ACI-7069-641H1-Ab2 +++ +
ACI-7069-642A10-ab1 +++ +
ACI-7069-642D12-Ab1 ++ +
ACI-7069-646B7-Ab1 +++ +++
ACI-7071-712A6-Ab1 ++ +
ACI-7071-809D9-Ab2 +++ +++
ACI-7071-809F12-Ab1 +++ +++
NA：数据不可用；-：不存在；+/-：不清楚；+：弱；++：中等；+++：丰富
实施例7：通过Western印迹的来自FTD/ALS对象的脑组织中TDP-43的检测
使用precellys使用CK混合匀化管(Labgene，BER0092)，在4℃下于匀化-增溶缓冲液(HS缓冲液)中，以1∶4(w/v)比例使脑组织区域(额皮质)匀化。以下顺序用于匀化：3个以5000rpm进行30秒的循环(每个循环之间具有15秒的停顿)。将经匀化的样品等分，并在-80℃下于1.5ml低蛋白质结合管(Axygen MCT-175-L-C)中储存。
·HS缓冲液-10mM Tris.HCl pH 7.5、150mM NaCl、0.1mM EDTA、1mM DTT、完全无EDTA蛋白酶抑制剂(Roche，32524300)和PhosSTOP磷酸酶抑制剂(Roche，4906837001)。
将脑匀浆在冰上解冻，并重悬于HS缓冲液中，以获得2％Sarkosyl、1单位/μLBenzonase和1mM MgCl2的最终浓度。然后，将样品在热混合器上于37℃下以600rpm的恒定摇动孵育45分钟。将上清液收集在新管中。将沉淀重悬于1000μl的髓磷脂浮选缓冲液中，并在台式离心机上于4℃下以20,000g离心60分钟。小心地去除上清液以去除所有的漂浮脂质。如果无法在单个步骤中去除所有脂质，则重复该步骤。随后将沉淀用PBS洗涤，并在台式离心机上于4℃下离心30分钟。将最终沉淀重悬于200μl PBS中，并在-80℃下储存。在变性条件下通过免疫印迹分析样品。
·含有Sarkosyl、Benzonase和MgCl2的HS缓冲液-10mM Tris.HCl pH 7.5、150mMNaCl、0.1mM EDTA、1mM DTT、4％Sarkosyl、1单位/μL Benzonase(Novagen 70746-4)、4mMMgCl2、完全无EDTA蛋白酶抑制剂(Roche)和PhosSTOP磷酸酶抑制剂(Roche)。
·髓磷脂浮选缓冲液-含有1％Triton X-100和30％蔗糖的HS缓冲液
使用MES SDS运行缓冲液(Thermofisher)在Bolt 12％Bis-Tris Plus凝胶1.0mm(Thermofisher)上进行Western印迹。一旦在PBS中稀释，将样品(30μl/样品)装载到凝胶上，装载缓冲液(1×，Licor，928-40004)包含100mM的DTT。使蛋白质在100V的恒定电压下分解1小时。在电泳之后，使用iBLOT(Thermofisher，IB21001)以20伏特将蛋白质转移到硝化纤维素膜(Thermofisher，IB23001)上，持续7分钟。在蛋白质转移之后，将膜在以1∶3在PBS中稀释的Licor封闭缓冲液(Odyssey封闭缓冲液927-40000)中封闭1小时。将膜与以下一抗孵育过夜：总TDP-43(Proteintech，60019-2-Ig或10782-2-AP)、pTDP-43(Cosmobio，TIP-PTD-M01)。对于一抗，将封闭缓冲液在PBS-T(含有0.4％吐温20的PBS)中以1∶1进行稀释。在用PBS-T(含有0.1％吐温20的PBS)洗涤4次之后，将膜与与LICOR染料偶联的二抗一起孵育。将二抗-驴抗小鼠(目录号926-68072)或山羊抗兔(目录号926-32211)在室温下在用PBS-T(含有0.4％吐温20的PBS)以1∶1稀释的Licor封闭缓冲液中以1∶10000的稀释度使用，持续1小时。将膜再次用PBS-T(含有0.1％吐温20的PBS)洗涤4次，并使用LICOR***进行扫描。图2显示，所有mAb均特异性识别全长TDP-43。另外，一些mAb(K、M、N)识别疾病状态的病理特征，例如不溶性级分中的C端片段和高分子量聚集体。
实施例8A：使用SPR进行的亲合力测量
与可溶性或聚集FL TDP-43的结合亲合力通过使用表面等离子体共振(SPR；Biacore T200，GE Healthcare Life Sciences)确定解离常数(KD)评价。通过胺偶联使重组人可溶性或聚集FL TDP-43固定在CM5 Series S传感器芯片(GE Healthcare LifeSciences)上。可溶性TDP-43以在10mM乙酸钠(pH 4.5)中5μg/ml的浓度在5μl/分钟的流量下固定化，持续420秒，使得固定水平为150RU。聚集TDP-43以在10mM乙酸钠(pH 4.5)中50μg/ml的浓度在5μl/分钟的流量下固定化，持续840秒，使得固定水平为110RU。使生物素化TP-73肽(SEQ ID NO：1的第181至190位氨基酸)以在PBS-P+中5μg/ml的浓度在5μl/分钟的流量下固定在Series S Sensor Chip SA(GE Healthcare Life Sciences)上，持续30秒，使得固定水平为400RU。为了评价KD值，将经纯化抗体和对照抗体(2E2-D3)在PBS-P+中以3倍稀释度开始于333nM并稀释降低至0.15nM进行注射。将抗体以50μl/分钟的流量注射，持续90秒的接触时间和700秒的解离阶段，随后在10mM甘氨酸-HCl pH 1.7下进行三次再生。对于优化的SPR方案，将抗体以起始于300nM并稀释降低至1.2nM进行3倍稀释，并且以30μl/分钟注射持续300秒，随后解离600秒。通过一次注射10mM甘氨酸-HCl pH 1.7使表面再生。从结合动力学获得的结果使用空白流通池和缓冲液循环进行双重参考，并使用带有RI的整体1∶1拟合模型进行评价。11种抗体和两种Fab片段的亲合力示于表8中。本发明的抗体以0.62nM至4.64nM的KD结合聚集TDP-43。另外，与可溶性TDP-43相比，一些抗体显示优先与聚集TDP-43结合。两种Fab片段以2.8nM至21.8nM的KD与可溶性TDP-43结合，并且针对聚集TDP-43显示出类似的KD。使用允许更准确KD确定，尤其是对于解离速率较慢的抗体的经优化SPR方案(具有更长的缔合和解离阶段)，对两种抗体(标有*)进行再分析。两种抗体以0.22nM至3.9nM的KD与可溶性TDP-43结合，并且以0.18nM至0.69nM的KD与聚集TDP-43结合。抗体ACI-7069-642D12-Ab1以3.6nM的KD与TP-73肽结合。
表8：通过SPR进行的结合表征
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NA，不适用，由于可用于拟合的曲线少于三个。
*使用经优化SPR方案对重组产生的IgG2a同种型抗体的结合进行表征。
实施例8B：使用SPR进行的亲合力测量
与可溶性FL TDP-43的结合亲和力通过使用表面等离子体共振(SPR；BiacoreT200，GE Healthcare Life Sciences)确定解离常数(KD)评价。通过胺偶联使山羊抗小鼠捕获抗体固定在CM5Series S传感器芯片(GE Healthcare Life Sciences)上。使抗体以在PBS-P+(GE Healthcare Life Sciences)中2至5μg/ml的浓度在10μl/分钟的流量下捕获，持续120秒，使得捕获水平为350至1000RU。为了评价KD值，将FL TDP-43或TP-51肽(SEQ IDNO：1的第352至414位氨基酸)在PBS-P+中以3倍稀释度起始于1.2nM直至100nM以30μl/分钟的流量以单循环动力学注射，持续300秒接触时间。记录解离持续1小时，随后用10mM甘氨酸-HCl pH 1.7进行一次再生。从结合动力学获得的结果使用空白流通池和缓冲液循环进行双重参考，并使用带有RI的整体1∶1拟合模型进行评价。将3种抗体的结合速率(on-rate)(ka)、解离速率(off-rate)(kd)和亲和力(KD)作为12(ACI-7069-633B12-Ab1)、2(ACI-7069-642D12-Ab1)或3(ACI-7071-809F12-Ab1)个重复的平均值±SD示于表9中。抗体ACI-7069-633B12-Ab1、ACI-7069-642D12-Ab1和ACI-7071-809F12-Ab1分别以15至135pM、226至272pM和389至457pM的亲和力与可溶性TDP-43结合。抗体ACI-7069-633B12-Ab1以1184至1316pM的亲和力与TP-51肽结合。
表9：通过SPR的对可溶性FL TDP-43和TP-51肽的亲和力
实施例9：抗体测序
克隆杂交瘤细胞裂解物用于可变区的基因测序。收获小鼠杂交瘤并使用包含胍盐的裂解缓冲液裂解以使RNase失活。然后通过无RNase的DNase消除基因组DNA，并使用基于二氧化硅的亲和柱采用多次洗涤纯化RNA，并将其使用无RNase水从柱中洗脱。一旦提取RNA，其纯度和浓度通过分光光度法测量。在变性琼脂糖凝胶上评估RNA的完整性，并使用逆转录酶(reverse transcriptase，RT)将RNA逆转录成cDNA。在添加RT反应混合物之前，将RNA加热至70℃持续10分钟以破坏RNA二级结构。将RT产物直接用于PCR扩增。对于cDNA的高保真PCR扩增，将对应于编码抗体的不同基因家族的可变区引物中的每个单独地与VH和VL的恒定引物分开以50μl的总反应体积混合。最初，使用简并引物库(VH为12以及VL为12)，并且根据结果，使用第二库以获得PCR产物。在PCR反应之后，产物通过在经溴化乙锭染色的2％琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳分析。VL和VH的PCR产物单独地使用tris乙酸盐EDTA(TAE)在琼脂糖凝胶上进行纯化。使用与用于PCR的引物相同的引物，使用染料终止剂测序方法对从凝胶切下的经纯化片段进行测序。以两个方向进行测序以提供在两端的重叠。使用多重序列比对(Clustal工具)分析序列，并使用Kabat算法进行注释，如Kabrat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，91-3242(1991)中所述的。重链和轻链可变结构域(VH和VL)的核苷酸序列示于表10中。所选择的重链(VH)和轻链(VL)可变结构域、及其互补决定区(CDR)的翻译蛋白质序列示于表11中。
表10：重链和轻链可变结构域(VH和VL)的核苷酸序列
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表11：重链和轻链可变结构域(VH和VL)及其CDR的氨基酸序列
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实施例10：ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)在TDP-43蛋白质病的转基因小鼠模型中的体内效力
为了评价ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)的体内效力，对ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)在NEFH-tTA x hTDP-43ΔNLS双转基因小鼠(rNLS8小鼠，Walker etal.2015)中降低TDP-43病理状况的能力进行测试。每周用ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)(n＝30)或载剂(n＝30)对rNLS8小鼠进行注射，并且在给药结束时分析分子病理标志物，例如磷酸化TDP-43和/或总不溶性TDP-43。
10.1动物
在开始研究之前，使所有动物适应环境，对其检查，处理和称重，以确保足够健康，并使与实验操作相关的非特异性应激最小化。在饲养期间和在8周龄之前，使小鼠保持包含多西环素(200mg/kg)的食物饮食。在8周龄时，将饮食改变为不包含多西环素(DOX)的食物饮食，以允许转基因表达。在整个该研究中，使光/暗循环(12/12)、室温(20℃至23℃)和相对湿度(约50％)保持恒定。在研究期间随意提供食物饮食和水。当小鼠开始表现出运动困难时，将饮食改变为在笼底上的湿食物和水凝胶。所有行为测试均在动物的光循环阶段期间进行。
10.2.化合物施用
在注射当天，新鲜制备ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)(60mg/kg)和载剂，并在整个研究期间遵循每周给药方案i.p施用。
10.3.脑的收集
将脑分为两个半球。解剖左半球以收集皮质脑区域。将小鼠皮质和剩余的脑组织快速冷冻以进行进一步的生物化学分析。将剩余的右半球在室温下灌注3小时之后直接浸没固定，并收集在新鲜制备的包含4％多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)的1×PBS中。
10.4.免疫组织化学
将浸没固定的右脑半球以均匀、***的随机方案在Leica CM1950低温切片机上以10微米的切片厚度矢状切开。对每只小鼠的***性随机矢状切片集合(来自脑的第2、3、4、6、8、10和11水平的7个切片)进行针对TDP-43和磷酸化TDP-43的免疫染色。进行Iba1染色以对脑中小胶质细胞数目和形态进行定量。使用经荧光标记的二抗使抗体结合可视化。标准阴性对照包括野生型脑切片以及来自未施加一抗的转基因动物的切片。
10.5.免疫反应性的成像和确定
将经封固的切片在由ZEN软件驱动的Axio.Scan Z1玻片扫描器上以10×放大率使用LED(Colibri2)照明和灵敏性Orca Flash 4.0单色相机作为整体进行成像。使用大脑皮质和背侧纹状体中目的区域的单独描绘确定脑尺寸。物体密度(object density，OD)(以每mm2物体的数目计)针对以下确定：所有标志物、经标记面积百分比和相对于第二描绘的目的区域尺寸(不包括任何组织伪影(组织褶皱(tissue fold)等))的OD。
10.6.从脑皮质制备蛋白质样品：
将组织在冰上解冻，并且然后在包含1mM PMSF和蛋白酶-/磷酸酶抑制剂混合物(Roche Applied Science)的5X v/w放射免疫沉淀测定缓冲液(RIPA，50mM Tris，150mMNaCl，1％IGEPAL CA630，5mM EDTA，0.5％脱氧胆酸钠和0.1％SDS，pH 8.0)中进行声处理。将样品在4℃，100,000g下离心30分钟，并且将上清液视为可溶性级分。将沉淀通过用RIPA声处理进行洗涤，并弃去上清液。将RIPA不溶性沉淀在2X v/w尿素缓冲液(7M尿素，2M硫脲，4％CHAPS和30mM Tris，pH8.5)中进行声处理，并在22℃，100,000g下离心30分钟。该上清液被视为RIPA不溶性/尿素可溶性级分。RIPA可溶性级分的蛋白质浓度使用BCA蛋白质测定(Pierce)确定。
10.7.不溶性TDP-43的定量
RIPA不溶性级分中的总TDP-43水平通过商业人TDP-43 AlphaLISA试剂盒(PerkinElmer，AL387HV)分析。
10.8.统计学分析
将IHC和AlphaLISA数据表示为平均值±SEM。经载剂处理的动物与经ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)处理的动物之间的统计学差异通过Welch t检验分析，并通过相应条上方的星号指示(*p＜0.05，**p＜0.01，****p＜0.0001)。组织学测量中的异常值被排除，为组或水平中的格鲁布斯异常值(Grubbs outlier)(单测量)，或者由于技术原因(图像伪影、组织褶皱等)。
10.9.结果
用ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)进行处理降低rNLS8小鼠中的磷酸化TDP-43和不溶性TDP-43
在rNLS8小鼠模型中，K82A/R83A/K84A突变型人TDP-43(hTDP-43ANLS)的DOX可阻遏形式的过表达导致神经元胞质中TDP-43明显积累和聚集。该模型的病理标志是不溶性和磷酸化TDP-43包涵体(pTDP-43)的沉积。这些小的球形胞质包涵体仅存在于转基因动物中，而在WT或单基因转基因tTA对照小鼠中则完全不存在。此外，pTDP-43在不存在DOX的第一周的期间普遍不存在，而在3至4周、去除DOX期间以急剧的进展积累(Walker et al.，2015)。与经载剂处理的小鼠相比，ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)处理导致纹状体和大脑皮质二者中磷酸化TDP-43的密度统计学上显著地降低(图3A至B)，表明其降低TDP-43病理状况的功能效力。选择纹状体和大脑皮质进行定量是由于这些区域中转基因的高表达。
10.10.用ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)进行处理降低rNLS8小鼠中的不溶性TDP-43
为了确定在免疫组织化学读出中观察到的TDP-43病理状况降低，在生物化学分级之后，对脑中总不溶性/聚集TDP-43的量进行定量。由包含不溶性/聚集TDP-43的左脑半球的皮质制备RIPA不溶性级分。与经载剂处理的动物相比，在经ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)处理的小鼠中观察到不溶性TDP-43的量显著降低(图3C)。分子TDP-43病理状况的这种降低与通过免疫组织化学观察到的结果一致，确定了用ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)处理的效力。据我们所知，这是首次在针对TDP-43蛋白质病的体内模型中施用外周抗体改善了TDP-43病理状况的形成。
10.11.rNLS8小鼠中的ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)处理提高小胶质细胞免疫反应面积
在抑制转基因表达之后rNLS8小鼠中的功能恢复涉及小胶质细胞活性的提高。小胶质细胞体面积在该阶段提高，并且导致TDP-43病理状况清除和运动缺陷在功能上恢复，表明在rNLS8小鼠模型中的治疗范例(Spiller K.J et al.，Nature Neuroscience，2018)。
为了评价ACI-7069-633B12-Ab1在rNLS8小鼠中降低TDP-43病理状况的作用模式，评估了其对小胶质细胞活化的作用。通过免疫组织化学进行Iba1染色，以对小鼠大脑皮质中小胶质细胞的数目和状态进行定量。在rNLS8小鼠中在末期(距Dox 5周)发现小胶质细胞增生。与经载剂处理的对照相比，ACI-7069-633B12-Ab1处理显著提高了皮质中Iba1阳性免疫反应面积(图5A)。这种提高可能是由小胶质细胞数目增多或小胶质细胞形态改变而产生。为此，首先评价皮质中Iba1阳性细胞的密度。与经载剂处理的对照相比，ACI-7069-633B12-Ab1处理不影响小胶质细胞密度，代表细胞数。
接下来，评价ACI-7069-633B12-Ab1对小胶质细胞形态的作用。为了使Iba1免疫反应面积的提高与代表形态的小胶质细胞活化状态的变化相关联，将小胶质细胞基于其尺寸和形态分类为三种状态(大肥大性、小分枝和分枝静息)。与经载剂处理的对照相比，在ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)处理中，看到大肥大性小胶质细胞的平均细胞尺寸显著提高(图5B)。在代表较低活化状态的其他两类小胶质细胞中，未发现显著差异(图5C至D)。该分析表明，在ACI-7069-633B12-Ab1处理组群中观察到的总Iba1阳性免疫反应面积的提高是由反映在小胶质细胞尺寸和活化状态提高的形态变化产生。这表明，ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)在该动物模型中至少部分地通过募集小胶质细胞和使其活化来降低TDP-43病理状况。
实施例11：在重组TDP-43聚集测定中ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)的体外功能
为了评价ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)在体外的功能，对ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)抑制TDP-43聚集的能力进行测试。FL TDP-43在C端与被烟草蚀纹病毒(Tobacco Etch Virus，TEV)蛋白酶切割位点分开并且重组产生的麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein，MBP)融合。通过添加TEV蛋白酶(AcTEV，Invitrogen)诱导在存在2.5μM ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)或不与TDP-43结合的同种型对照的情况下在30mM Tris，150mM NaCl，pH 7.4中2.5μM TDP-43-TEV-MBP融合蛋白的聚集，并在30小时内于600nm处在μclear96孔板(Greiner)中监测吸光度。为了进行评价，将终点相对于同种型对照归一化，并针对ACI-7069-633B12-Ab1计算聚集TDP-43的百分比。与同种型对照相比，抗体ACI-7069-633B12-Ab1显著抑制TDP-43聚集，抑制了98％(图4)。
实施例12：使用ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)和ACI-7071-809F12-Ab1(IgG2a变体)的生物流体中TDP-43的检测和定量
方法：使用ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a变体)和ACI-7071-809F12-Ab1(IgG2a变体)建立PerkinElmer基于珠的AlphaLISA免疫测定。对于CSF样品，在掺入回收率实验中建立稀释度线性。然后在经稀释的CSF样品中测量TDP-43的浓度。在白色optiplateTM-384微板中制备样品，并测量615nm处的发射量，作为原始AlphaLISA计数。
结果：在该免疫测定中，对来自健康对照和FTLD-TDP(语义痴呆、C9orf72或GRN)患者的脑脊液(CSF)样品中的总TDP-43进行定量(图6)。在三个独立的实验中，与健康对照相比，来自具有GRN突变的FTLD-TDP患者的多个患者CSF样品的相对TDP-43定量显示出显著更高的TDP-43水平(图6)。在三个独立的实验中，与健康对照相比，来自具有C9orf72突变和语义痴呆的FTLD-TDP患者的多个患者CSF样品的相对TDP-43定量也显示出更高的TDP-43水平(图6)。
实施例13：在FTD脑提取物中通过免疫耗竭评估的与病理性TDP-43的结合
为了评价抗体在特异性结合天然状态下TDP-43聚集体中的效力，进行在富含病理性TDP-43的脑提取物中的免疫耗竭实验。
方法：如实施例7中所述制备来自FTD A型(FTD-A)死后脑的不溶性级分。使用DynabeadsTM磁珠、蛋白G(Thermoscientific 10003D)进行免疫耗竭。在重悬于管中之后，将130μl的珠转移至1.5ml低结合管中。使用磁体将珠用补充有0.05％吐温20的PBS冲洗两次以去除上清液。将珠均分在三个不同的低结合管中。将抗体(ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a同种型)、ACI-7069-642D12-Ab1(IgG2a同种型)、小鼠IgG2a对照)稀释至100μg/ml，并在去除上清液(使用磁体)之后，向每个管中添加100μl。将抗体-珠混合物在室温下孵育1小时。将珠-抗体复合体用500μl PBS-0.05％吐温20洗涤一次，并用PBS洗涤一次，然后重悬于250μl PBS中。将抗体-珠分到两个新管(每管120μl)中。将不溶性级分在冰上解冻，并在冰上以振幅30进行声处理持续30秒。在去除上清液之后，向每个抗体-珠管添加30微克的脑材料，并在4℃下于持续旋转下孵育过夜。将管置于磁体上，并收集上清液作为经免疫耗竭的级分。输入材料和经免疫耗竭的材料通过Western印迹进一步分析。Western印迹如实施例7中所述进行。每个泳道装载20μl的样品。使用以下抗体进行免疫印迹：分别以1∶2000和1∶1000的稀释度使用的总TDP-43(与DyLight680偶联的ACI-7069-633B12-Ab1)、pTDP-43(Biolegend，829901)。以1∶10000的稀释度使用山羊抗大鼠二抗(目录号925-32219)。
结果：与同种型对照抗体相比，ACI-7069-633B12-Ab1和ACI-7069-642D12-Ab1能够特异性结合并且耗竭来自从FTD A型脑组织中获得的sarkosyl不溶性级分的TDP-43和pTDP-43(图7)。该数据确定了这些抗体与人患者中的靶标接合的特性。
实施例14.抗人TDP-43小鼠单克隆抗体的人源化
人源化可变区的设计
使用同源匹配来选择人接纳体框架以接枝ACI-7069-633B12-Ab1CDR。人和小鼠种系可变基因的数据库，例如IMGT数据库(Ehren mann，F et al，(2010)Nucl.Acids Res.，38(S1)：D301-D307)或IgBlast(Ye J.et al，(2013)，Nucleic Acids Res.2013 Jul；41(WebServer issue)：W34-W40)或VBASE2(Retter I et al，(2005)Nucleic Acids Res.33，Database issue D671-D674)可用于鉴定与鼠重链和轻链V区(分别为SEQ ID NO：20和24)最接近的人可变结构域亚家族。
例如，使用IMGT数据库表明了接枝物ACI-7069-633B12-Ab1重链可变(VH)结构域框架与人重链可变结构域亚家族1成员之间的最佳序列同源性。对于种系序列：IGHV1-3、IGHV1-2、IGHV1-46、IGHV1-24，观察到CDR与框架序列二者的最高同源性和同一性，所有这些种系序列对于直至CDR3的整个序列都具有高于65％的序列同一性。IGHV1-3由于其高序列同源性而被选择作为VH框架。
使用相同的方法，ACI-7069-633B12-Ab1轻链可变结构域序列显示出与人轻链可变(VL)结构域K亚家族2成员的最佳序列同源性。对于种系序列：IGKV2-30、IGKV2-29、IGKV2D-29、IGKV2-24，观察到CDR与框架序列二者的最高同源性和同一性，所有这些种系序列对于直至CDR3的整个序列都具有高于70％的序列同一性。IGKV2-30由于其高序列同源性而被选择作为VL框架。
在ACI-7069-633B12-Ab1 CDR序列内鉴定潜在的翻译后修饰位点。在可变重链中，N53、N54和G55被鉴定为两个脱酰胺位点。在可变轻链中，在位置D28和G29处识别出异构化位点，而在位置W89(根据Kabat编号***)处识别出氧化位点。在一些构建体中，包括N53G和/或G55A在内的点突变被引入到VH区，而G29A和/或W89F被引入到VL区以去除CDR L1和L3中的翻译后修饰位点。
作为人源化过程的起点，将鼠CDR接枝到VH和VL区二者的人接纳体框架上。
为了将CDR供应至人接纳体框架上，通过将人残基替换为小鼠残基来修饰关键位置。
为了鉴定可最大影响CDR构象和/或VH/VL取向的残基，使用Abodybuilder服务器(8)通过同源建模生成了人-小鼠杂交VH-VL对的3D模型。模型分析允许选择包括表12中所列位置在内的位置的子集。
表12：ACI-7069-633B12-Ab1的人框架(Kabat编号)中引入的回复突变
可变结构域 位置(Kabat) 小鼠残基 人残基
VH 1 E Q
VH 24 T A
VH 38 K R
VH 41 H P
VH 48 I M
VH 67 A V
VH 69 L I
VH 71 V R
VH 73 K T
VL 24 K R
VL 36 L F
VL 45 K R
VL 57 R G
VL 58 I V
组合来自表12的回复突变以产生分别列于表13和15中的序列。
表13：重链(VH)及其CDR的氨基酸序列
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人源化抗体变体的产生
使用标准分子生物学技术合成重链和轻链可变结构域二者的DNA编码序列并将其克隆到允许在哺乳动物细胞中表达的质粒中。重链可变结构域与含有S228P突变的人免疫球蛋白IgG4恒定结构域融合以防止半分子形成，或者与人IgG1恒定结构域融合，并且轻链可变结构域被克隆到含有恒定K轻链结构域的质粒中。通过使用ExpiFectamineTM 293转染试剂盒(ThermoFischer science，A14524)共转染重链和轻链质粒，嵌合抗体和人源化变体在Expi293F细胞中瞬时表达。转染之后，将细胞维持在37℃下、150rpm搅拌下和8％CO2水平下。在转染之后6天，收获上清液并在预装有1mL MabSelect Sure树脂(GE HealthcareLife Sciences，17543803)的蛋白A柱上纯化。在装载细胞培养物液体之前，将柱用0.1MTris(pH 7.0)平衡。装载之后，将柱用0.1M Tris(pH 7.0)洗涤，随后使用0.1M柠檬酸盐(pH3.5)进行洗脱。然后通过添加0.1M Tris(pH 9.0)来中和洗脱。然后将样品在PBS缓冲液中透析。
通过表面等离激元共振(SPR)对ACI-7069-633B12-Ab1人源化变体进行的表征
通过将可溶性TDP-43固定在CM5系列S传感器芯片(GE Healthcare，BR-1005-30)上来在Biacore 8K仪器(GE Healthcare Life Sciences)上进行测量。
通过SPR进行的针对可溶性TDP-43的KD测定
仪器用运行缓冲液PBS-P+进行准备，并且通道1至8的流动池(Fc)1和2用EDC/NHS(胺偶联试剂盒，两种试剂的比例为1∶1，GE Healthcare Life Sciences，BR-1006-33)的新鲜溶液以10μL/分钟激活，持续420秒。将可溶性TDP-43(Selvita)在乙酸钠pH 4.5中稀释至5μg/mL的终浓度并以5μL/分钟的流量注射到Fc 2上，持续900秒。所有流通池均用1M乙醇胺(GE Healthcare Life Sciences，BR-1006-33)以10μL/分钟淬灭，持续420秒。乙醇胺淬灭之后的固定水平在所有八个通道上均为680RU。在分析之前，运行了两个启动周期。将1.2至100nM的提高的mAb浓度以单循环动力学注射，其由运行缓冲液中的3倍连续稀释来制备，接触时间为300秒，并且解离时间为900秒，流量为30μL/分钟。每个循环之后是一次再生，其使用10mM甘氨酸-HCl pH 1.7以30μL/分钟、以30秒的接触时间进行，随后是300秒的稳定期。从单循环动力学获得的结果使用空白Fc 1和缓冲液循环进行双重参考，并使用Biacore 8K评价软件使用具有RI和整体Rmax的1∶1动力学拟合模型进行评价。获得以下动力学参数：结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)、亲和常数(KD)和饱和响应(Rmax)。
通过SPR进行的针对TP-51肽的KD测定
仪器用运行缓冲液PBS-P+进行准备，并且通道1至8(8K)的Fc 1至2用EDC/NHS(胺偶联试剂盒，两种试剂的比例为1∶1，GE Healthcare Life Sciences，BR-1006-33)的新鲜溶液以10μL/分钟激活，持续420秒，并且山羊抗人抗体(GE Healthcare Life Sciences，29234600)以25μg/mL在10mM乙酸钠pH 5中固定，持续420秒。接下来，所有Fc均用1M乙醇胺(GE Healthcare Life Sciences，BR-1006-33)淬灭，持续420秒。任何非共价结合的抗体均通过两次用10mM甘氨酸-HCl pH 1.7进行的持续30秒的再生来去除。在乙醇胺淬灭之后评价固定水平(所有通道均为10000RU)。
每个循环都以人源化变体的非共价捕获开始，这些人源化变体在运行缓冲液中稀释至2μg/mL的终浓度，并以10μL/分钟的流量注射，持续60秒。TDP-43mAb在通道1至8上被捕获，使Fc 1作为空白Fc。在每次mAb注射之后的120秒稳定期之后，评价捕获水平，并且其范围为300至500RU。
TP-51肽(Pepscan)的注射以单循环动力学进行，其为1.2至100nM的提高的浓度，由连续的3倍稀释来制备。以25μL/分钟的流量以300秒/注射的接触时间进行注射。3600秒的解离阶段在最后一次注射之后。通过以10μL/分钟的流量一次注射10mM甘氨酸-HCl pH1.7120秒来使传感器表面再生，随后是300秒的稳定期。从单循环动力学获得的结果使用空白Fc 1和缓冲液循环进行双重参考，并通过Biacore 8K评价软件用具有RI和整体Rmax的1∶1动力学拟合模型进行评价。获得以下动力学参数：结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)、亲和常数(KD)和饱和响应(Rmax)。
所有参数(Rmax除外)均在表17至18中报告为来自2至8个独立实验的平均值±SD。
表17：ACI-7069-633B12-Ab1人源化变体对可溶性TDP-43和TP-51肽的ka、kd、KD和Rmax值
总体而言，所有人源化变体都保留了对TDP-43和TP-51肽的良好亲和力(表17)，如先前针对鼠抗体所观察到的(表8)。具有最佳亲和力的变体是hACI-7069-633B12-Ab1_H16L14、hACI-7069-633B12-Ab1_H19L18、hACI-7069-633B12-Ab1_H19L19、hACI-7069-633B12-Ab1_H20L18、hACI-7069-633B12-Ab1_H20L19。
重新格式化为人IgG1的人源化变体的靶标结合亲和力的确定。
表18：ACI-7069-633B12-Ab1人源化IgG1变体对可溶性TDP-43和TP-51肽的ka、kd、KD和Rmax值
/>
总体而言，当重新格式化为人IgG1同种型时，所有人源化变体都保留对TDP-43和TP-51肽的相似亲和力(表18)。所有受试变体在pM范围内都显示出对可溶性TDP-43的良好亲和力。
体外重组TDP-43从头聚集测定
测试了人源化抗体抑制TDP-43聚集的能力。在该测定中使用了与被烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点分开的麦芽糖结合蛋白(MBP)融合的TDP-43。使用离心过滤器将储存缓冲液(20mM Tris-Cl pH 8.0、300mM NaCl、5％甘油、1mM DTT)更换为测定缓冲液(30mMTris、150mM NaCl，pH 7.4)，并通过在280nm下的紫外(UV)光谱术(NanoDrop)来确定蛋白质浓度。将TDP-43-MBP在测定缓冲液中稀释至2.5μM的终浓度，并在低结合管中与833nM的人源化变体或者IgG4或IgG1同种型对照混合。通过在96孔板中添加终浓度为10μg/mL的TEV蛋白酶来诱导聚集，每孔终体积为80μL。在24小时内每15分钟通过在孔中心在600nm下的一式三份的吸光度测量来监测聚集，每次测量之前摇晃5秒。将板一直保持在25℃下在读板器中并用箔密封。1.5小时之后，通过Western印迹分析确定TEV切割。
为了进行分析，将24小时内的曲线下面积(AUC)相对于IgG4或IgG1同种型对照归一化，并计算每种mAb的聚集TDP-43百分比。数据表示为三个独立重复的平均值±SD。图8A和8B示出了相对于嵌合抗体(IgG4或IgG1同种型)对一些人源化ACI-7069-633B12-Ab1变体的聚集的抑制的比较。与嵌合抗体相比，所有人源化变体在抑制重组TDP-43聚集中均显示出良好的效力。与嵌合抗体cACI-7069-633B12-Ab1(IgG4或IgG1同种型)相比，在所有受试的人源化变体中，hACI-7069-633B12-Ab1_H16L14、hACI-7069-633B12-Ab1_H19L18、hACI-7069-633B12-Ab1_H19L19、hACI-7069-633B12-Ab1_H20L18、hACI-7069-633B12-Ab1_H20L19、hACI-7069-633B12-Ab1_H15L18和hACI-7069-633B12-Ab1_H23L20在抑制TDP-43聚集中显示出相等的效力。
在FTD脑提取物中通过免疫耗竭评估的与病理性TDP-43结合的人源化变体
为了评价抗体在特异性结合天然状态下TDP-43聚集体中的效力，进行在富含病理性TDP-43的脑提取物中的免疫耗竭和免疫沉淀实验。
如实施例7中所述制备来自FTD A型(FTD-A)死后脑的不溶性级分。使用DynabeadsTM磁珠、蛋白G(Thermoscientific 10003D)进行免疫耗竭。在重悬于管中之后，将珠转移到1.5ml低结合管中。使用磁体将珠用补充有0.05％吐温-20的PBS冲洗两次以去除上清液。将抗体(hACI-7069-633B12-Ab1_H19L18(IgG1同种型)，人IgG1对照)以8微克抗体/毫克珠(珠饱和)的比率添加至珠。将抗体-珠混合物在室温下孵育30分钟。将珠-抗体复合体用1000μl PBS-0.05％吐温-20洗涤3次，并用500μl PBS洗涤一次。将不溶性级分在冰上解冻，并在冰上以振幅30进行声处理，持续30秒，然后在PBS中稀释至100μg/ml。在去除上清液之后，每微克抗体添加10微克脑材料，并在连续旋转下在室温下孵育30分钟。将管置于磁体上，并收集上清液作为免疫耗竭级分。输入材料、经免疫耗竭的材料和经免疫沉淀的材料通过Western印迹进一步分析。Western印迹如实施例7中所述进行。每个泳道装载20μl样品。使用以下抗体进行免疫印迹：分别以1∶2000和1∶1000的稀释度使用的总TDP-43(与DyLight680偶联的ACI-7069-633B12-Ab1)、pTDP-43(Biolegend，829901)。以1∶10000的稀释度使用山羊抗大鼠二抗(目录号925-32219)。
与同种型对照抗体相比，人源化变体hACI-7069-633B12-Ab1_H19L18(IgG1同种型)能够特异性结合并耗竭来自从FTD A型脑组织获得的sarkosyl不溶性级分的TDP-43(图9A)和pTDP-43(图9B)。这些数据确定了这些抗体在人患者样品中与靶标接合的期望特性。
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Claims (74)

1.人源化TDP-43结合分子，特别是人源化TDP-43抗体或其抗原结合片段，其包含：
a.VH-CDR1，其包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列；
b.VH-CDR2，其选自SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：212、SEQ ID NO：222和SEQ ID NO：382的氨基酸序列；
c.VH-CDR3，其包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)；
d.VL-CDR1，其选自SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：265和SEQ ID NO：305的氨基酸序列；
e.VL-CDR2，其选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：206和SEQ ID NO：216的氨基酸序列；和
f.VL-CDR3，其选自SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：237和SEQ ID NO：247的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的人源化TDP-43结合分子，其包含：
a.VH-CDR1，其包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列；
b.VH-CDR2，其包含SEQ ID NO：202的氨基酸序列；
c.VH-CDR3，其包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)；
d.VL-CDR1，其包含SEQ ID NO：195的氨基酸序列；
e.VL-CDR2，其包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列；和
f.VL-CDR3，其包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列；
或者，包含：
i.VH-CDR1，其包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列；
ii.VH-CDR2，其包含SEQ ID NO：382的氨基酸序列；
iii.VH-CDR3，其包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)；
iv.VL-CDR1，其包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列；
v.VL-CDR2，其包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列；和
vi.VL-CDR3，其包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列。
3.权利要求1或2所述的人源化TDP-43结合分子，其包含人重链可变结构域亚家族1框架序列。
4.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其包含IGHV1-3、IGHV1-2、IGHV1-46或IGHV1-24VH框架序列，优选IGHV1-3VH框架序列。
5.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其包含人轻链可变结构域κ亚家族2框架序列。
6.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其包含IGKV2-30、IGKV2-29、IGKV2D-29或IGKV2-24VL框架序列，优选IGKV2-30或IGKV2-29VL框架序列。
7.权利要求6所述的人源化TDP-43结合分子，其包含IGKV2-30VL框架序列，优选IGKV2-30*02VL框架序列。
8.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其包含以下VH突变中的一个或更多个、直至所有：Q1E、A24T、R38K、P41H、M48I、V67A、I69L、R71V、T73K。
9.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其包含以下VL突变中的一个或更多个、直至所有：R24K、F36L、R45K、G57R、V58I。
10.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其包含：
重链可变区(VH)，其选自：
i.包含SEQ ID NO：160的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：160的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
ii.包含SEQ ID NO：170的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：170的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
iii.包含SEQ ID NO：180的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：180的氨基酸序列具有至少89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
iv.包含SEQ ID NO：190的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：190的氨基酸序列具有至少89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
v.包含SEQ ID NO：200的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：200的氨基酸序列具有至少89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
vi.包含SEQ ID NO：210的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：210的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
vii.包含SEQ ID NO：220的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：220的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
viii.包含SEQ ID NO：230的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：230的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
ix.包含SEQ ID NO：240的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：240的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
x.包含SEQ ID NO：250的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：250的氨基酸序列具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
xi.包含SEQ ID NO：260的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：260的氨基酸序列具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
xii.包含SEQ ID NO：270的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：270的氨基酸序列具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
xiii.包含SEQ ID NO：280的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：280的氨基酸序列具有至少93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
xiv.包含SEQ ID NO：290的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：290的氨基酸序列具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
xv.包含SEQ ID NO：300的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：300的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
xvi.包含SEQ ID NO：310的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：310的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
xvii.包含SEQ ID NO：320的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：320的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
xviii.包含SEQ ID NO：330的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：330的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
xix.包含SEQ ID NO：340的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：340的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
xx.包含SEQ ID NO：350的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：350的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
xxi.包含SEQ ID NO：360的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：360的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
xxii.包含SEQ ID NO：370的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：370的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；或者
xxiii.包含SEQ ID NO：380的氨基酸序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：380的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；和
轻链可变区(VL)，其选自：
i.包含SEQ ID NO：164的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：164的氨基酸序列具有至少97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
ii.包含SEQ ID NO：174的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：174的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
iii.包含SEQ ID NO：184的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：184的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
iv.包含SEQ ID NO：194的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：194的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
v.包含SEQ ID NO：204的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：204的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
vi.包含SEQ ID NO：214的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：214的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
vii.包含SEQ ID NO：224的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：224的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
viii.包含SEQ ID NO：234的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：234的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
ix.包含SEQ ID NO：244的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：244的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
x.包含SEQ ID NO：254的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：254的氨基酸序列具有至少97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
xi.包含SEQ ID NO：264的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：264的氨基酸序列具有至少97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
xii.包含SEQ ID NO：274的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：274的氨基酸序列具有至少98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
xiii.包含SEQ ID NO：284的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：284的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
xiv.包含SEQ ID NO：294的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
xv.包含SEQ ID NO：304的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：304的氨基酸序列具有至少97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
xvi.包含SEQ ID NO：314的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：314的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
xvii.包含SEQ ID NO：324的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：324的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
xviii.包含SEQ ID NO：334的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：334的氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
xix.包含SEQ ID NO：344的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：344的氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
xx.包含SEQ ID NO：354的氨基酸序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：354的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)。
11.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其包含：
a.包含SEQ ID NO：300的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：300的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；和包含SEQ ID NO：294的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
b.包含SEQ ID NO：310的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：310的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；和包含SEQ ID NO：294的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
c.包含SEQ ID NO：320的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：320的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；和包含SEQ ID NO：294的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
d.包含SEQ ID NO：340的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：340的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；和包含SEQ ID NO：294的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
e.包含SEQ ID NO：350的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：350的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；和包含SEQ ID NO：294的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
f.包含SEQ ID NO：340的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：340的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；和包含SEQ ID NO：324的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：324的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
g.包含SEQ ID NO：340的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：340的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；和包含SEQ ID NO：334的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：334的氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
h.包含SEQ ID NO：340的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：340的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；和包含SEQ ID NO：344的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：344的氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
i.包含SEQ ID NO：350的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：350的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；和包含SEQ ID NO：334的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：334的氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
j.包含SEQ ID NO：350的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：350的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；和包含SEQ ID NO：344的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：344的氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
k.包含SEQ ID NO：300的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：300的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；和包含SEQ ID NO：334的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：334的氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)；或者
l.包含SEQ ID NO：380的序列的重链可变区(VH)或与SEQ ID NO：380的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区(VH)；和包含SEQ ID NO：354的序列的轻链可变区(VL)或与SEQ ID NO：354的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链可变区(VL)。
12.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其包含：
a.包含SEQ ID NO：300的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：294的序列的轻链可变区(VL)；或
b.包含SEQ ID NO：310的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：294的序列的轻链可变区(VL)；或
c.包含SEQ ID NO：320的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：294的序列的轻链可变区(VL)；或
d.包含SEQ ID NO：340的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：294的序列的轻链可变区(VL)；或
e.包含SEQ ID NO：350的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：294的序列的轻链可变区(VL)；或
f.包含SEQ ID NO：340的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：324的序列的轻链可变区(VL)；或
g.包含SEQ ID NO：340的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：334的序列的轻链可变区(VL)；或
h.包含SEQ ID NO：340的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：344的序列的轻链可变区(VL)；或
i.包含SEQ ID NO：350的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：334的序列的轻链可变区(VL)；或
j.包含SEQ ID NO：350的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：344的序列的轻链可变区(VL)；或
k.包含SEQ ID NO：300的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：334的序列的轻链可变区(VL)；或
l.包含SEQ ID NO：380的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：354的序列的轻链可变区(VL)。
13.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其包含含有SEQ ID NO：310的序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO：294的序列的轻链可变区(VL)。
14.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其包含含有SEQ ID NO：340的序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO：334的序列的轻链可变区(VL)。
15.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其包含含有SEQ ID NO：340的序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO：344的序列的轻链可变区(VL)。
16.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其包含含有SEQ ID NO：350的序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO：334的序列的轻链可变区(VL)。
17.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其包含含有SEQ ID NO：350的序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO：344的序列的轻链可变区(VL)。
18.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其包含含有SEQ ID NO：300的序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO：334的序列的轻链可变区(VL)。
19.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其包含含有SEQ ID NO：380的序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO：354的序列的轻链可变区(VL)。
20.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其结合错折叠的聚集TDP-43和非聚集生理性TDP-43。
21.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其与单体和/或寡聚和/或聚集和/或翻译后修饰和/或截短的TDP-43结合。
22.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其结合错折叠的聚集人TDP-43和非聚集生理性人TDP-43。
23.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其表现出以下特征中的一种或更多种、直至所有：
a.抑制TDP-43蛋白或其片段的聚集，
b.阻断TDP-43细胞间传播，
c.使TDP-43聚集体解聚，
d.阻断TDP-43播种；以及
e.阻断TDP-43扩散。
24.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其减轻体内TDP-43病理状况。
25.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其降低体内聚集TDP-43和/或磷酸化TDP-43的水平。
26.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其与人TDP-43(SEQ ID NO：1)的第397至411位氨基酸残基内的表位结合或与非人TDP-43中的等同表位结合。
27.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其与人TDP-43(SEQ ID NO：1)的第400至405位氨基酸残基内的表位结合或与非人TDP-43中的等同表位结合。
28.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其是抗体或其抗原结合片段。
29.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其是Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2，优选Fab。
30.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，当在体外重组TDP-43从头聚集测定中测量时，其抑制至少60％的TDP-43聚集(例如，如实施例14中所述)。
31.权利要求23所述的人源化TDP-43结合分子，当在体外重组TDP-43从头聚集测定中测量时，其抑制至少90％的TDP-43聚集(例如，如实施例14中所述)。
32.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其对于可溶性TDP-43结合的解离常数(KD)为小于2nM、优选小于700pM。
33.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其对于可溶性TDP-51肽结合的解离常数(KD)为小于15nM、优选小于10nM。
34.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其是IgA、IgD、IgE、IgM、IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体或者其抗原结合片段。
35.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其是IgG1或IgG4抗体或其抗原结合片段。
36.前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其包含Fc突变，优选S228P突变。
37.免疫缀合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的人源化TDP-43结合分子。
38.免疫缀合物，其包含根据权利要求1至36中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其中所述免疫缀合物使用递送载剂或血脑屏障部分穿过血脑屏障。
39.权利要求37或38所述的免疫缀合物，其中所述递送载剂包含脂质体或胞外囊泡。
40.权利要求37或38所述的免疫缀合物，其中所述人源化TDP-43结合分子与血脑屏障部分连接。
41.权利要求40所述的免疫缀合物，其中所述血脑屏障部分是多肽或小分子，优选肽、受体配体、单结构域抗体(VHH)、scFv或Fab片段。
42.权利要求38、40或41所述的免疫缀合物，其中所述血脑屏障部分结合血脑屏障受体。
43.权利要求42所述的免疫缀合物，其中血脑屏障受体包括但不限于运铁蛋白受体、胰岛素受体或低密度脂蛋白受体。
44.经标记结合分子，特别是经标记抗体，其包含根据权利要求1至36中任一项所述的人源化TDP-43结合分子。
45.药物组合物，其包含权利要求1至36中任一项所述的人源化TDP-43结合分子或根据权利要求37至43中任一项所述的免疫缀合物以及可药用载体和/或赋形剂和/或稀释剂。
46.权利要求1至36中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，或根据权利要求37至43中任一项所述的免疫缀合物，或权利要求45所述的药物组合物，其用于人用或兽用药物用途。
47.根据权利要求46中所述应用的人源化TDP-43结合分子或免疫缀合物或药物组合物，其用于预防、减轻、治疗与TDP-43相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病。
48.权利要求1至36中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，或根据权利要求37至43中任一项所述的免疫缀合物，或权利要求45所述的药物组合物，其用于诊断用途。
49.根据权利要求48中所述应用的人源化TDP-43结合分子或免疫缀合物或药物组合物，其用于诊断与TDP-43相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病。
50.权利要求1至36中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，或根据权利要求37至43中任一项所述的免疫缀合物，或权利要求45所述的药物组合物，其用于研究用途，特别是作为分析工具或参考分子。
51.权利要求1至36中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，或根据权利要求37至43中任一项所述的免疫缀合物，或权利要求45所述的药物组合物，其用作监测与TDP-43相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病的诊断工具。
52.根据权利要求47、49或51中任一项所述应用的人源化TDP-43结合分子或免疫缀合物或药物组合物，其中所述与TDP-43相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病是：额颞痴呆(FTD，例如散发性或家族性、伴有或不伴有运动神经元病(MND)、有颗粒蛋白前体(GRN)突变、有C9orf72突变、有TARDBP突变、有含缬酪肽蛋白(VCP)突变、与9p染色体连锁、皮质基底节变性、有泛素阳性TDP-43包涵体的额颞叶变性(FTLD)(FTLD-TDP)、嗜银颗粒病、皮克病、语义变异型原发性进行性失语(svPPA)、行为变异型FTD(bvFTD)、非流利性变异型原发性进行性失语(nfvPPA)，等)、肌萎缩侧索硬化(ALS，例如散发性ALS、有TARDBP突变、有血管生成蛋白(ANG)突变)、亚历山大病(AxD)、边缘主导年龄相关性TDP-43脑病(LATE)、慢性创伤性脑病、佩里综合征、阿尔茨海默病(AD，包括散发性和家族性形式的AD)、唐氏综合征、家族性英国型痴呆、多聚谷氨酰胺病(亨廷顿病和脊髓小脑共济失调3型(SCA3；也称为马-约病))、海马硬化性痴呆和肌病(散发性包涵体肌炎、包涵体肌病，有含缬酪肽蛋白(VCP)突变；以及佩吉特骨病和额颞痴呆)、有镶边空泡的眼咽肌营养不良、有肌收缩蛋白(MYOT)基因突变或编码结蛋白(DES)之基因的突变的肌原纤维肌病、创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(DLB)或帕金森病(PD)。
53.根据权利要求52所述应用的人源化TDP-43结合分子或免疫缀合物或药物组合物，其中所述与TDP-43相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病是：额颞痴呆(FTD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、慢性创伤性脑病(CTE)或边缘主导年龄相关性TDP-43脑病(LATE)。
54.根据权利要求53所述应用的人源化TDP-43结合分子或免疫缀合物或药物组合物，其中所述与TDP-43相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病是肌萎缩侧索硬化(ALS)。
55.根据权利要求53所述应用的人源化TDP-43结合分子或免疫缀合物或药物组合物，其中所述与TDP-43相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病是阿尔茨海默病(AD)。
56.根据权利要求53所述应用的人源化TDP-43结合分子或免疫缀合物或药物组合物，其中所述与TDP-43相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病是额颞痴呆(FTD)。
57.在患有与TDP-43相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病的个体中保持或提高认知记忆能力或减缓记忆丧失的方法，其包括向所述个体施用权利要求1至36中任一项所述的人源化TDP-43结合分子或根据权利要求37至43中任一项所述的免疫缀合物或权利要求45所述的药物组合物。
58.降低个体中聚集TDP-43和/或磷酸化TDP-43水平的方法，其包括向所述个体施用权利要求1至36所述的人源化TDP-43结合分子或根据权利要求37至43中任一项所述的免疫缀合物或权利要求45所述的药物组合物。
59.权利要求57或58所述的方法，其中所述方法包括施用至少一种另外的治疗剂。
60.权利要求59所述的方法，其中所述另外的治疗剂靶向α-突触核蛋白、BACE1、Tau、β-淀粉样蛋白、TDP-43或神经炎症蛋白。
61.核酸分子，其编码权利要求1至36中任一项所述的人源化TDP-43结合分子。
62.核酸，其包含SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：179、SEQID NO：188、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：219、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：238、SEQID NO：239、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：278、SEQ ID NO：279、SEQ ID NO：288、SEQ ID NO：289、SEQID NO：298、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：318、SEQ ID NO：319、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：338、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：348、SEQID NO：349、SEQ ID NO：358、SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：368、SEQ ID NO：378或SEQ ID NO：398中提供的核苷酸序列。
63.核酸分子，其包含以下所示的核苷酸序列：
a.SEQ ID NO：308中提供的重链可变区(VH)和SEQ ID NO：299中提供的轻链可变区(VL)；或
b.SEQ ID NO：318中提供的重链可变区(VH)和SEQ ID NO：299中提供的轻链可变区(VL)；或
c.SEQ ID NO：328中提供的重链可变区(VH)和SEQ ID NO：299中提供的轻链可变区(VL)；或
d.SEQ ID NO：348中提供的重链可变区(VH)和SEQ ID NO：299中提供的轻链可变区(VL)；或
e.SEQ ID NO：358中提供的重链可变区(VH)和SEQ ID NO：299中提供的轻链可变区(VL)；或
f.SEQ ID NO：348中提供的重链可变区(VH)和SEQ ID NO：329中提供的轻链可变区(VL)；或
g.SEQ ID NO：348中提供的重链可变区(VH)和SEQ ID NO：339中提供的轻链可变区(VL)；或
h.SEQ ID NO：348中提供的重链可变区(VH)和SEQ ID NO：349中提供的轻链可变区(VL)或
i.SEQ ID NO：358中提供的重链可变区(VH)和SEQ ID NO：339中提供的轻链可变区(VL)；或
j.SEQ ID NO：358中提供的重链可变区(VH)和SEQ ID NO：349中提供的轻链可变区(VL)；或
k.SEQ ID NO：308中提供的重链可变区(VH)和SEQ ID NO：339中提供的轻链可变区(VL)；或
l.SEQ ID NO：398中提供的重链可变区(VH)和SEQ ID NO：359中提供的轻链可变区(VL)。
64.核酸分子，其包含以下所示的核苷酸序列：
a.由SEQ ID NO：318编码的重链可变区(VH)和由SEQ ID NO：299编码的轻链可变区(VL)；或
b.由SEQ ID NO：348编码的重链可变区(VH)和由SEQ ID NO：339编码的轻链可变区(VL)；或
c.由SEQ ID NO：348编码的重链可变区(VH)和由SEQ ID NO：349编码的轻链可变区(VL)或
d.由SEQ ID NO：358编码的重链可变区(VH)和由SEQ ID NO：339编码的轻链可变区(VL)；或
e.由SEQ ID NO：358编码的重链可变区(VH)和由SEQ ID NO：349编码的轻链可变区(VL)；或
f.由SEQ ID NO：308编码的重链可变区(VH)和由SEQ ID NO：339编码的轻链可变区(VL)；或
g.由SEQ ID NO：398编码的重链可变区(VH)和由SEQ ID NO：359编码的轻链可变区(VL)。
65.核酸，其编码根据权利要求1至36中任一项所述的人源化TDP-43结合分子，其中所述核酸是用于靶向递送至血脑屏障或CNS中的任何其他细胞类型的病毒载体的一部分。
66.根据权利要求61至64中任一项所述的核酸，其中所述核酸是用于靶向递送至血脑屏障或CNS中的任何其他细胞类型的病毒载体的一部分。
67.根据权利要求65或66所述的核酸，其中所述病毒载体是重组腺相关病毒载体(rAAV)，优选是选自AAV1至AAV12的重组腺相关病毒载体。
68.重组表达载体，其包含权利要求61至67中任一项所述的核酸。
69.宿主细胞，其包含权利要求61至67中任一项所述的核酸和/或权利要求68所述的载体。
70.宿主细胞，其表达根据权利要求1至36中任一项所述的人源化TDP-43结合分子。
71.无细胞表达***，其包含权利要求68所述的重组表达载体。
72.用于产生人源化TDP-43结合分子、特别是人源化抗体或其抗原结合片段的方法，其包括以下步骤：
a.在适合产生所述人源化TDP-43结合分子、特别是所述人源化抗体或其抗原结合片段的条件下培养权利要求69或70所述的宿主细胞或权利要求71所述的无细胞表达***；以及
b.分离所述人源化TDP-43结合分子，特别是所述人源化抗体或其抗原结合片段。
73.对从对象获得的样品中的TDP-43进行检测和/或定量的方法，所述方法包括使所述样品与根据权利要求1至36中任一项所述的人源化TDP-43结合分子接触，以及将所述样品中的TDP-43水平与对照样品中的TDP-43水平进行比较。
74.试剂盒，其用于诊断与TDP-43相关的疾病、障碍和/或异常、或TDP-43蛋白质病，或根据权利要求46至56中任一项所述应用，或用于权利要求57至60中任一项所述的方法，所述试剂盒包含根据权利要求1至36中任一项所述的人源化TDP-43结合分子。
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