CN116524999B - 一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法及其检测*** - Google Patents

一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法及其检测*** Download PDF

Info

Publication number
CN116524999B
CN116524999B CN202310799873.2A CN202310799873A CN116524999B CN 116524999 B CN116524999 B CN 116524999B CN 202310799873 A CN202310799873 A CN 202310799873A CN 116524999 B CN116524999 B CN 116524999B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mutation
colorectal cancer
gene
target
target set
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202310799873.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116524999A (zh
Inventor
顾凯丽
宋文惠
鲍远亮
王兆利
蒋泽宇
王方杰
张亚飞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Meijie Transformation Medical Research Suzhou Co ltd
Original Assignee
Meijie Transformation Medical Research Suzhou Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Meijie Transformation Medical Research Suzhou Co ltd filed Critical Meijie Transformation Medical Research Suzhou Co ltd
Priority to CN202310799873.2A priority Critical patent/CN116524999B/zh
Publication of CN116524999A publication Critical patent/CN116524999A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116524999B publication Critical patent/CN116524999B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/20—Allele or variant detection, e.g. single nucleotide polymorphism [SNP] detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/50—Mutagenesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法及其检测***。所述靶标集合在数据模拟中能够覆盖99%患者，对超过90%结直肠癌患者有4个以上突变，适用性广。采用所述靶标集合定制的探针形成固定化基因组合及试剂盒，以肿瘤不知情分析策略对不同结直肠癌样本的微小残留病灶状态进行监测，毋需对每个患者进行定制，容易标准化。同时靶标集合的区域精简，仅291 kb，在数万乘测序深度下，所需测序数据量较少，成本低。检测灵敏度高，能准确反映微小残留病状态，对患者的分子缓解状态进行持续跟踪，从而对根治性治疗的疗效进行评估，***复发，对结直肠癌患者的术后临床管理具有重大意义。

Description

一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法 及其检测***
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法及其检测***。
背景技术
微小残留病灶（Minimal residual disease，MRD）被认为是疾病复发的主要来源，目前临床常用的随访监测手段为血癌胚抗原和PET/CT等影像学手段，但往往不能灵敏地反映微小残留病灶，对于患者的复发监测效果灵敏度较低。因此，近年来出现了基于血浆中肿瘤游离核酸（Circulating tumor DNA，ctDNA）为微小残留病灶的复发监测手段。
对于基于血浆中肿瘤游离核酸ctDNA的MRD检测，主流的检测技术包括肿瘤知情分析（Tumor-informed）和肿瘤不知情分析（Tumor-agnostic）两种路线。肿瘤知情分析路线通常先进行组织全外显子WES检测，用配对血检测精准地排除非肿瘤来源的变异，然后针对组织检测结果定制个性化的基因组合（panel）进行超高深度测序进行肿瘤变异的监控；肿瘤不知情分析路线一般是对血液进行固定基因组合检测，仅凭血液检测获得最高的敏感性。其中肿瘤知情分析路线需要针对每个患者设计个性化的追踪基因组合，但难以解决肿瘤发生发展过程中的时空异质性问题，无法追踪新发突变，并且很难标准化，且成本较高。与之相对比的是，肿瘤不知情分析路线通常采用已经设计好的固定化基因组合来进行检测，可以获取更多变异信息，流程可标准化，同时可研究克隆演化。但固定化基因组合的难点在于靶标集合针对哪些位点，将直接影响到可追踪的患者比例，并且对检测技术灵敏度要求较高。
综上所述，提供一种能够将可追踪患者比例最大化的固定化基因组合用于结直肠癌样本的微小残留病灶MRD监测，同时控制基因组合大小，压缩测序量，降低患者的检测经济负担，并达到较高的灵敏度，对结直肠癌患者的术后临床管理具有重大意义。
中国发明专利，公开号为CN113284554公开了一种筛查结直肠癌术后微小残留病灶及预测复发风险的循环肿瘤DNA检测***及应用，但它需要获取患者原发肿瘤组织先进行425基因组合检测，再对患者血浆进行监测。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法及其检测***。所述靶标集合的筛选方法用于固定化基因组合检测MRD的策略，可用于超过99%的结直肠癌患者MRD检测，无须患者肿瘤组织，适用性广，且容易标准化。灵敏度高，单点突变检测灵敏度达0.05%，MRD检测灵敏度达0.005%，基因组合的数量小，仅291 kb，测序数据量要求较低，相应地，患者的经济负担较低。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法，所述筛选方法包括如下步骤：
（1）收集结直肠癌相关的高频突变基因及相应的突变区域，记为起始靶标集合P0；
（2）分析公共数据库中结直肠癌肿瘤样本数据；过滤掉公共数据库中注释的所有的良性变异或疑似良性变异；统计起始靶标集合P0区域发生变异的患者集合记为PT0；
（3）统计公共数据库中结直肠癌样本中出现的所有突变对应的基因，计算每个基因的群体突变频率；
（4）筛选群体突变频率≥10%的基因，记为集合FG；计算集合FG中基因的每个外显子的突变指数MI；根据MI值进行判断，将对应的外显子纳入起始靶标集合P0；补充后的靶标集合为P1，在上述区域发生变异的患者集合为PT1；
（5）筛选群体突变频率<10%的基因，记为集合LFG；计算集合LFG中基因的每个外显子的突变指数MI；根据MI值进行判断，将对应的外显子纳入靶标集合P1；补充后的靶标集合为P2，在该区域发生变异的患者集合为PT2；
（6）计算潜在驱动基因的每个外显子的突变指数MI；挑选MI≥20的外显子，分别做以下判断：在靶标集合P2中加入所述外显子，重新统计相应的靶标集合区域发生变异的患者集合PT，若PT相对于PT2至少增加1个患者，则保留所述外显子，相应的靶标集合则更新为靶标集合P3，在所述靶标集合对应区域发生变异的患者集合为PT3；否则所述外显子不纳入靶标集合P2；
（7）对靶标集合P3进行精简，精简后相应的靶标集合则更新为靶标集合P4，在靶标集合P4对应区域发生变异的患者集合为PT4；
（8）对于靶标集合P4中的克隆性造血基因突变进行过滤；过滤后相应的靶标集合则更新为靶标集合P5，在靶标集合P5对应区域发生变异的患者集合为PT5。
本发明中，对于群体突变频率≥10%的基因，通过分析每个外显子的突变指数MI的分布，对于MI值较突出的外显子纳入靶标集合，对于MI值分布较平缓，即基因可能无突变热点，则将该基因所有外显子均纳入靶标集合。
本发明中，对于群体突变率<10%的基因，则挑选MI≥20的外显子纳入靶标集合。当MI筛选标准更低，例如筛选MI≥10的外显子，筛选得到的靶标集合中的外显子区段的数目更多，会使得基因靶标集合范围更大，增加检测成本。当筛选标准更高，例如筛选MI≥30的外显子，筛选得到的靶标集合中的外显子区段的数目更少，会使得基因靶标集合范围更小，虽然检测成本会一定程度上降低，但是所得靶标集合对有的肿瘤患者可能无法覆盖其所含的突变，即该靶标集合覆盖的肿瘤患者比例可能降低，影响最终的临床使用。
进一步地，以MI为标准，对潜在的驱动基因部分外显子也纳入靶标集合，进一步扩大靶标集合覆盖的患者比例。同时对于长度较长的外显子，通过细分120bp区段，将其进行更细致的分析，仅纳入能够扩大覆盖患者数目的区段，将靶标集合进行精简。
本发明中，在筛选靶标集合时，还剔除了克隆性造血基因突变、已及良性变异，进一步精简了靶标集合中与结直肠癌微小残留病灶无关的基因突变位点，使得所述靶标集合更合理，增加其应用时的准确度。
本发明所述筛选方法可适用于任意癌种的微小残留病灶靶标集合的筛选，在覆盖患者变异数目最大化的同时压缩靶标集合的区域范围，以达到节约成本的目的，同时不牺牲检测性能。
优选地，步骤（1）中，所述靶标集合包括下表（表1）所示区域。
表1
。
优选地，步骤（2）中，所述公共数据库为COSMIC数据库和TCGA数据库。
公共数据库中信息分析两个维度：1）相应结直肠癌患者的基因变异情况，包括具体的基因、变异位点等信息；2）对特定基因变异集合，分析具有至少一个集合内的变异位点的患者数目及对应的比例。通过分析维度1的数据确定待考量的外显子信息，再通过分析维度2的数据，计算出相应的外显子突变指数MI及患者集合的变化情况，判定是否纳入相应的外显子。
优选地，步骤（2）中，所述良性变异或疑似良性变异对应的数据库为Clinvar数据库和COSMIC数据库。
优选地，步骤（3）中，所述群体突变频率=在所述基因发生变异的患者样本数目/肿瘤患者样本总数。
优选地，步骤（4）中，所述突变指数MI为每个外显子每1000 bp区域上发生变异的结直肠癌患者数量。
优选地，步骤（4）中，所述根据MI值进行判断的标准为：
（a）若所述基因外显子的突变指数MI值集合中最大值>2*平均值，则将该集合中>2*平均值的MI对应的外显子纳入起始靶标集合P0；
（b）若所述基因外显子的突变指数MI值集合中最大值<2*平均值，则将该基因所有的外显子纳入起始靶标集合P0。
优选地，步骤（5）中，所述根据MI值进行判断的标准为：筛选突变指数MI≥20的外显子，将所述外显子纳入起始靶标集合P1。
优选地，步骤（6）中，所述潜在驱动基因包括：ACVR2A、AMER1、ARAF、B2M、CTNNB1、HRAS、MAP2K1、MDM2、MDM4、MED12、MSH6、MYC、NCOA4、NOTCH1、NOTCH2、PMS2、POLE、PRDM2、PTEN、PTPN11、PTPRD、RNF43、SOX9、STAT3、TCF7L2、TGFBR2或ZNRF3中的一种或至少两种的组合。
优选地，步骤（7）中，所述精简的标准包括：
针对靶标集合P3中长度>2 kb的外显子，将所述外显子以120 bp为区段进行分割，将靶标集合P3中每个120 bp区段进行去除后，分析PT3中患者数目是否减少；若减少，则所述120 bp保留；若未减少，则所述120 bp区段从靶标集合P3中去除。
优选地，步骤（8）中，所述克隆性造血基因突变对应的基因包括：DNMT3A、TET2、ASXL1、PPM1D、SF3B1、CBL、CREBBP、TNR、TG、SPHKA、MUC5B、HERC2、DNAH8或ASTN1中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合，所述靶标集合由第一方面所述的筛选方法筛选得到。
优选地，所述靶标集合包括177个基因中的426个外显子区段，所述靶标集合具体区域如下表（表2）所示；
表2
/>
。
本发明中，所述靶标集合包括177个基因，总共包括426个外显子区段，所述靶标集合的区域大小为291 kb。所述靶标集合的区域精简，所需测序数据量较少，成本低。检测灵敏度高，能准确反映微小残留病状态，对患者的分子缓解状态进行持续跟踪，从而对根治性治疗的疗效进行评估，***复发，对结直肠癌患者的术后临床管理具有重大意义。
第三方面，本发明提供一种第二方面所述的靶标集合对应的检测结直肠癌微小残留病灶的探针，所述探针的长度为110-130 bp，并以头尾相接的形式覆盖第二方面所述的靶标集合。
本发明中，所述单个探针的长度为110-130 bp，优选为120 bp。本发明中的探针能够高效地捕获出靶标集合对应的分子片段，捕获效率＞70%。
第四方面，本发明提供一种检测结直肠癌微小残留病灶的试剂盒，所述试剂盒包括第三方面所述的检测结直肠癌微小残留病灶的探针。
优选地，所述试剂盒还包括：基因组预文库构建试剂、接头、杂交捕获试剂或杂交产物扩增试剂中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述接头为带有分子标签的接头。
第五方面，本发明提供一种结直肠癌微小残留病灶MRD的检测***，所述检测***包括：
（1）血浆突变筛查模块：所述血浆突变筛查模块用于对血浆进行样本提取、建库、上机测序及突变分析；所述血浆包括基线血浆和监测血浆，所述基线血浆为结直肠癌患者根治性治疗前血浆，所述监测血浆为结直肠癌患者根治性治疗后血浆；所述血浆突变筛查模块包括如下单元：
（a）外周血样本核酸提取单元：收集外周血作为基线样本或监测样本，分别从样本中提取血细胞gDNA及血浆样本中的cfDNA；
（b）基因组预文库制备单元：利用所得DNA样本制备基因组预文库，所述基因组预文库包括gDNA预文库和cfDNA预文库；
（c）杂交捕获单元：利用第三方面所述的探针与所述基因组预文库进行杂交捕获，得到靶标DNA片段；
（d）扩增测序单元：以所述靶标DNA片段为模板进行扩增得到靶向捕获文库，所述靶向捕获文库包括cfDNA靶向捕获文库和gDNA靶向捕获文库；对靶向捕获文库进行双端测序；
（e）分析单元：对测序序列进行质控评价，以白细胞DNA文库测序数据作为对照，进行对比识别血浆cfDNA杂交捕获文库中的基因突变；
（f）突变过滤单元：对于基线样本或监测样本中的基因突变进行过滤；基线血浆基因突变集合记为LP1；监测血浆基因突变集合记为LP2；
（2）结直肠癌患者微小残留病MRD状态判断模块：比较LP1及LP2，若LP1中任意一个突变存在于LP2，和/或LP2中突变数目≥5%*LP1中突变数目，则判定为MRD阳性；否则为MRD阴性。
优选地，所述基因组预文库制备单元中，对所得样本DNA进行酶切、末端修复、加腺嘌呤A，连接接头后，磁珠纯化，PCR扩增富集，通过Qubit荧光计对文库进行定量和通过安捷伦2100生物分析仪进行质控检测后，得到血细胞gDNA基因组预文库和cfDNA预文库。
优选地，所述杂交捕获单元中，血细胞gDNA预文库与cfDNA预文库杂交投入量为1:(4-6)。
优选地，所述杂交捕获单元中，血细胞gDNA预文库与cfDNA预文库杂交投入量为1:5。
优选地，所述扩增测序单元中，cfDNA靶向捕获文库的测序深度为30000~50000×，gDNA靶向捕获文库的测序深度为5000~10000×。
优选地，所述突变过滤单元中，对基线血浆中的基因突变进行过滤的步骤包括：
（I）在dbSNP、gnomeAD和1000genomes数据库中的出现频率大于1%的基因突变过滤掉；
（II）对于在COSMIC数据库中记录频数≥20次的常见基因突变，要求基因突变等位基因频率VAF≥0.1%，支持所述基因突变的带有独特分子标签的测序读数≥2；对于在COSMIC数据库中记录频数<20次的变异，要求基因突变等位基因频率VAF≥0.25%，支持所述基因突变的带有独特分子标签的测序读数≥5；否则过滤掉所述基因突变；
（III）以健康人的血浆游离DNA进行建库测序作为背景，患者的基因突变频率高于背景中的最大突变频率的1.5倍，则认定所述基因突变为存在于所述患者的血浆游离DNA中的真实基因突变，否则将其从患者基因突变列表中过滤掉；
经过（I）、（II）和（III）的过滤，最终所得基线血浆基因突变集合记为LP1。
优选地，所述突变过滤单元中，对监测血浆中的基因突变进行过滤的步骤包括：
对于存在于LP1集合中的基因突变，要求支持所述基因突变的带有独特分子标签的测序读数≥1即可保留；对于不在LP1集合中的突变，进行突变过滤，所述突变过滤的步骤参照对基线血浆中的基因突变进行过滤的步骤，最终所得监测血浆突变集合记为LP2。
第六方面，本发明提供第一方面所述的用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法、第二方面所述的用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合、第三方面所述的检测结直肠癌微小残留病灶的探针、第四方面所述的检测结直肠癌微小残留病灶的试剂盒或第五方面所述的结直肠癌微小残留病灶MRD的检测***在制备结直肠癌微小残留病灶检测产品中的应用，和/或在制备结直肠癌患者复发预测产品中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明所述靶标集合在数据模拟中能够覆盖99%患者（≥1个突变），对于超90%结直肠癌患者组织样本能覆盖4个以上突变。
（2）可以采用固定化基因组合实现对不同结直肠癌患者的微小残留病状态进行监测，毋需对每个患者进行定制，容易标准化。
（3）本发明所述靶标集合及其试剂盒能够覆盖结直肠癌患者根治性治疗前血浆平均6个突变，通过监测突变数量的增加，能够显著提高MRD检测灵敏度。
（4）本发明所述检测***无须对肿瘤组织进行检测，对于肿瘤组织无法获得的患者也具有适用性，应用范围更广。
（5）由于治疗后ctDNA含量极低，因此在ctDNA-MRD检测场景下通常需要30000×~100000×测序深度。本发明所述靶标集合的区域精简，仅291 kb，所需测序数据量较少，成本低，具有经济性。
（6）本发明所述试剂盒检测灵敏度高，对单个点突变的检测灵敏度达0.05%，在样本层面微小残留病灶状态的检测灵敏度高达0.005%，能够准确反映微小残留病状态，应用前景广阔。
附图说明
图1是检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法流程图。
图2是结直肠癌微小残留病灶检测***流程图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
材料：
基因组DNA提取试剂购自迈杰转化医学研究（苏州）有限公司，货号N019C01；
游离核酸cfDNA提取试剂购自迈杰转化医学研究（苏州）有限公司，货号N067A01；
游离核酸cfDNA定量试剂购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司，货号12642ES76；
游离核酸cfDNA预文库构建试剂购自QIAGEN的DNA建库试剂盒（商品名称FX DNALibrary Kit，货号180475）；
接头购自IDT的双端接头（商品名称xGen CS Adapter - Tech Access，货号：1080799）；
杂交捕获试剂购自Twist，分别为快速清洗缓冲液（商品名称Twist Fast WashBuffers，货号：100972）、结合及纯化磁珠（商品名称Twist Binding and PurificationBeads，货号：100984）；快速杂交试剂（商品名称Twist Fast Hybridization Reagent，货号：100968）和通用封闭剂（商品名称Twist Universal Blockers，货号：100767）；
杂交产物扩增试剂购自KAPA的文库扩增试剂盒（商品名称KAPA LibraryAmplification Kits for Illumina platforms，货号：KK2621）；
纯化磁珠购自Beckman纯化磁珠（商品名称AMPure XP beads，货号：A63882）；
低频突变标准品购自Seracare（商品名称Seraseq ctDNA MRD Panel Mix，货号：0710-2146）；
游离核酸cfDNA样本来自临床合作单位。
实施例1
本实施例提供一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法，检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法流程图如图1所示，所述筛选方法包括如下步骤：
（1）收集结直肠癌相关的高频突变基因及相应的突变区域，记为起始靶标集合P0；所述靶标集合包括表1所示区域。
（2）分析公共数据库中结直肠癌肿瘤样本数据，所述公共数据库为COSMIC数据库及TCGA数据库；过滤掉公共数据库中注释的所有的良性变异或疑似良性变异，所述良性变异或疑似良性变异的数据库为Clinvar数据库和COSMIC数据库；统计起始靶标集合P0区域发生变异的患者集合记为PT0。
（3）统计公共数据库中结直肠癌样本中出现的所有突变对应的基因，计算每个基因的群体突变频率；所述群体突变频率=在所述基因发生变异的患者样本数目/肿瘤患者样本总数。
（4）筛选群体突变频率≥10%的基因，记为集合FG；计算集合FG中基因的每个外显子的突变指数MI；根据MI值进行判断：
（a）若该基因外显子的突变指数MI值集合中最大值>2*平均值，则将该集合中>2*平均值的MI对应的外显子纳入起始靶标集合P0；
（b）若该基因外显子的突变指数MI值集合中最大值<2*平均值，则将该基因所有的外显子纳入起始靶标集合P0。
补充后的靶标集合为P1，在上述区域发生变异的患者集合为PT1。
（5）筛选群体突变频率<10%的基因，记为集合LFG；计算集合LFG中基因的每个外显子的突变指数MI；根据MI值进行判断：筛选突变指数MI≥20的外显子，将所述外显子纳入靶标集合P1。
补充后的靶标集合为P2，在该区域发生变异的患者集合为PT2。
（6）计算潜在驱动基因的每个外显子的突变指数MI；挑选MI≥20的外显子，分别做以下判断：在靶标集合P2中加入所述外显子，重新统计相应的靶标集合区域发生变异的患者集合PT，若PT相对于PT2至少增加1个患者，则保留所述外显子，相应的靶标集合则更新为P3，在所述靶标集合对应区域发生变异的患者集合为PT3；否则所述外显子不纳入靶标集合P2。
所述潜在驱动基因包括：ACVR2A、AMER1、ARAF、B2M、CTNNB1、HRAS、MAP2K1、MDM2、MDM4、MED12、MSH6、MYC、NCOA4、NOTCH1、NOTCH2、PMS2、POLE、PRDM2、PTEN、PTPN11、PTPRD、RNF43、SOX9、STAT3、TCF7L2、TGFBR2和ZNRF3。
（7）对靶标集合P3进行精简，所述精简的标准包括：针对靶标集合P3中长度>2 kb的外显子，将所述外显子以120 bp为区段进行分割，将P3中每个120 bp区段进行去除后，分析PT3中患者数目是否减少；若减少，则该120 bp保留；若未减少，则该120 bp区段从P3中去除。
精简后相应的靶标集合则更新为P4，在该区域发生变异的患者集合为PT4。
（8）对于靶标集合P4中的克隆性造血基因突变进行过滤；所述克隆性造血基因突变对应的基因包括：DNMT3A、TET2、ASXL1、PPM1D、SF3B1、CBL、CREBBP、TNR、TG、SPHKA、MUC5B、HERC2、DNAH8和ASTN1。
过滤后相应的靶标集合则更新为P5，在该区域发生变异的患者集合为PT5。
本实施例中，在筛选靶标集合时，还剔除了克隆性造血基因突变、已及良性变异，进一步精简了靶标集合中与结直肠癌微小残留病灶无关的基因突变位点，使得所述靶标集合更合理，增加其应用时的准确度。
实施例2
一种检测结直肠癌微小残留病MRD的靶标集合，所述靶标集合包括177个基因中的426个外显子区段，所述靶标集合具体区域如表2所示。
所述用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合覆盖了文献已报道结直肠癌高频变异区域以及从公共数据库通过突变指数筛选出的高频变异所在基因外显子，对于较长的外显子，又进一步通过划分120 bp窗口细致地筛选能够扩大覆盖患者范围的靶标区段，在最大化覆盖患者比例的同时压缩靶标集合区域大小，使得靶标集合区域精简，所需测序数据量较少，成本低。同时去除已知的克隆性造血突变及良性或疑似良性变异，减少可能的信号噪音，进一步提升检测的准确度。
实施例3
将所述靶标集合应用于公共数据库中数据进行模拟，分析对不同结直肠癌样本可能检测到的突变数目，进一步验证该靶标集合的覆盖患者的比例。数据模拟如表3所示，该靶标集合可以覆盖99.2%的患者至少1个突变，覆盖98.7%的患者至少2个突变，以此类推，其中，对于超过90%患者都能覆盖4个以上突变，覆盖患者的突变数目平均值为6个突变。表明该靶标集合能够覆盖的患者比例高，覆盖的变异数目较多，应用性广。
表3
实施例4
一种检测结直肠癌微小残留病灶的探针，所述探针的长度为120 bp、并以头尾相接的形式覆盖实施例2所述的靶标集合。
所述探针能够高效地捕获出靶标集合对应的分子片段，捕获效率＞70%。
实施例5
一种检测结直肠癌微小残留病MRD的试剂盒，所述试剂盒包括实施例4所述的检测结直肠癌微小残留病灶的探针和基因组预文库构建试剂、接头、杂交捕获试剂、杂交产物扩增试剂、链霉素亲和磁珠。
实施例6
本实施例提供一种结直肠癌微小残留病灶MRD的检测***，结直肠癌微小残留病灶检测***流程图如图2所示，所述检测***包括：
（1）血浆突变筛查模块：所述血浆包括基线血浆和监测血浆，所述基线血浆为结直肠癌患者根治性治疗前血浆，所述监测血浆为结直肠癌患者根治性治疗后血浆；所述血浆突变筛查模块用于对血浆进行样本提取、建库、上机测序及突变分析。
所述血浆突变筛查模块包括如下单元：
（a）外周血样本核酸提取单元：收集外周血作为基线样本或监测样本，分别从样本中提取血细胞gDNA及血浆样本中的cfDNA；
（b）基因组预文库制备单元：对所得样本DNA进行酶切、末端修复、加腺嘌呤A，连接接头后，磁珠纯化，PCR扩增富集，通过Qubit荧光计对文库进行定量和通过安捷伦2100生物分析仪进行质控检测后，得到血细胞gDNA基因组预文库和cfDNA预文库。
（c）杂交捕获单元：利用实施例4所述的探针与所述基因组预文库进行杂交捕获，血细胞gDNA预文库与cfDNA预文库杂交投入量为1:5，杂交捕获后得到靶标DNA片段。
（d）扩增测序单元：以所述靶标DNA片段为模板进行扩增得到靶向捕获文库，所述靶向捕获文库包括cfDNA靶向捕获文库和gDNA靶向捕获文库；对靶向捕获文库进行双端测序，cfDNA靶向捕获文库测序深度为30000~50000×，gDNA靶向捕获文库测序深度为5000~10000×。
（e）分析单元：对测序序列进行质控评价，以白细胞DNA文库测序数据作为对照，进行对比识别血浆cfDNA靶向捕获文库中的基因突变。
（f）突变过滤单元：对于基线样本或监测样本中的基因突变进行过滤；基线血浆基因突变集合记为LP1；监测血浆基因突变集合记为LP2。
对基线血浆中的基因突变进行过滤的步骤包括：
（I）在dbSNP、gnomeAD和1000genomes数据库中的出现频率大于1%的基因突变过滤掉；
（II）对于在COSMIC数据库中记录频数≥20次的常见基因突变，要求基因突变等位基因频率VAF≥0.1%，支持所述基因突变的带有独特分子标签的测序读数≥2；对于在COSMIC数据库中记录频数<20次的变异，要求基因突变等位基因频率VAF≥0.25%，支持所述基因突变的带有独特分子标签的测序读数≥5；否则过滤掉所述基因突变；
（III）以健康人的血浆游离DNA进行建库测序作为背景，患者的基因突变频率高于背景中的最大突变频率的1.5倍，则认定所述基因突变为存在于所述患者的血浆游离DNA中的真实基因突变，否则将其从患者基因突变列表中过滤掉；
经过（I）、（II）和（III）的过滤，最终所得基线血浆基因突变集合记为LP1。
对监测血浆中的基因突变进行过滤的步骤包括：
对于存在于LP1集合中的基因突变，要求支持所述基因突变的带有独特分子标签的测序读数≥1即可保留；对于不在LP1集合中的突变，进行突变过滤，所述突变过滤的步骤参照对基线血浆中的基因突变进行过滤的步骤，最终所得监测血浆突变集合记为LP2。
（2）结直肠癌患者微小残留病MRD状态判断模块：比较LP1及LP2，若LP1中任意一个突变存在于LP2，和/或LP2中突变数目≥5%*LP1中突变数目，则判定为MRD阳性；否则为MRD阴性。
实施例7
本实施例提供一种结直肠癌微小残留病灶MRD的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
（1）预文库构建
本实施例从临床合作单位收集未经治疗的结直肠癌患者游离核酸cfDNA样本及对应的gDNA样本，采用实施例5所述试剂盒进行检测相关的变异。
1. 利用Thermo Life Qubit 3.0测定10例游离核酸cfDNA样本及对应的gDNA样本浓度如下表4。
表4
2. cfDNA文库制备
2.1 DNA修复
2.1.1 分别取30 ng cfDNA样本及100 ng gDNA按照表5所示体系配制PCR反应体系，用枪头吹打混匀，瞬时离心。
表5
2.1.2 将上述步骤2.1.1反应体系放至PCR仪中，运行下表程序，设置热盖温度为70℃。
2.2 接头连接
2.2.1 按照表6将各组分依次加入步骤2.1.2中所得的PCR混合液中，枪头吹打混匀，瞬时离心，其中5×连接缓冲液使用前需枪头吹打混匀8-10次，所使用试剂购自天根生化科技有限公司，货号NG101-02。
表6
2.2.2 将步骤2.2.1中PCR混合液放至PCR仪中，20℃孵育15分钟，关闭热盖温度。
2.3 纯化
2.3.1 提前将纯化磁珠从4℃冰箱拿出，涡旋混匀，室温放置30分钟。
2.3.2 震荡混匀纯化磁珠，取100 μL磁珠加入步骤2.2.2连接产物中，使用移液器温和反复吹打10次，使其充分混匀，室温孵育5-10分钟。
2.3.3 将离心管放置磁力架上静置5分钟，待溶液澄清后移弃170 μL上清液，保留磁珠。
2.3.4 保持离心管在磁力架上，在反应管中加入200 μL新配制的80%的乙醇，静置30 s后吸弃所有上清，保留磁珠。
2.3.5 重复上述步骤一次。
2.3.6 将离心管中残留的乙醇尽可能去除，放置在磁力架上静置3-5分钟至磁珠干燥完全。
2.3.7 向每个样本中加入22 μL无核酸酶水，枪头吹打混匀，瞬时离心，室温孵育5-10分钟。
2.3.8 将离心管放在磁力架上2-3分钟，待溶液澄清。
2.3.9 小心吸取20 μL上清至一新的200 μL PCR管中，丢弃磁珠，冰上放置备用。
2.4 PCR扩增
2.4.1 按照表7冰上融化并配制反应液，加样完涡旋振荡混匀，短暂离心1次将管盖上液体离心至管底。
表7
2.4.2 将步骤2.4.1中配制的反应液加入步骤2.3.9产物中，枪头吹打混匀，瞬时离心。
2.4.3 将上述步骤2.4.2反应体系放至PCR仪中，运行表8程序：
表8
2.5 PCR扩增产物纯化
2.5.1 提前将纯化磁珠从4℃冰箱拿出，放至室温平衡30分钟。
2.5.2 震荡纯化磁珠至其充分重悬，取50 μL的纯化磁珠加入上述步骤2.4.3中PCR管中，然后使用移液器温和反复吹打10次，使其充分混匀。室温孵育5-10分钟。
2.5.3 将离心管放置磁力架上静置3-5分钟，待溶液澄清后移弃80 μL上清液，保留磁珠。
2.5.4 保持离心管在磁力架上，在反应管中加入200 μL新配制的80%的乙醇，静置30 s后吸弃所有上清，保留磁珠。
2.5.6 重复上述步骤一次。
2.5.7 将离心管中残留的乙醇尽可能去除，放置在磁力架上静置3-5分钟至磁珠干燥完全。
2.5.8 向每个样本中加入32 μL无核酸酶水，涡旋混匀，短暂离心，室温孵育5-10分钟。
2.5.9 将离心管放在磁力架上2-3分钟，待溶液澄清。
2.5.10 小心吸取30 μL上清至一新的1.5 mL管中，丢弃磁珠。
2.5.11 分别采用Thermo Life Qubit 3.0测定每个预文库的浓度，每对样本分别取cfDNA预文库300 ng，gDNA预文库60 ng进行混合，5对样本为一组，混合为两组。
（2）预文库进行目的片段捕获
具体步骤如下所示：
1. 向混合后的预文库中加入8 μL封闭剂、5 μL阻断剂和4 μL本发明的探针组合物，置于真空浓缩仪中45℃蒸干，在此期间可将链霉亲和素磁珠和纯化磁珠取出，室温平衡30分钟。
2. 将快速杂交预混液放置在65℃金属浴中孵育10分钟至沉淀溶解，迅速涡旋后取20 μL加入蒸干的样本中，指尖轻弹混匀，室温静置5分钟。
3. 将上步反应液快速离心去除气泡后，加入30 μL杂交增强剂至表面进行油封，放入PCR仪杂交，PCR仪程序设置为95℃保温，95℃、5分钟，60℃、4 h，60℃保温。
4. 将快速结合缓冲液、快速洗脱缓冲液1、快速洗脱缓冲液2放置48℃恒温金属浴上加热至溶解。
5. 试剂预热：按照实际要求量分装快速洗脱缓冲液1，快速洗脱缓冲液2，并将其分别置于68℃和48℃中预热。
6. 充分混匀链霉亲和素磁珠，取100 μL至1.5 mL离心管中，加入200 μL快速结合缓冲液，用枪头吹打混匀，置于磁力架至澄清，弃上清；重复加入并弃上清2次，最后加入200μL快速结合缓冲液重悬磁珠。
7. 杂交4 h结束后，将清洗后的链霉亲和素磁珠拿到杂交管旁，迅速将50 μL杂交液转移至磁珠中，振荡混匀后置于振荡器上室温充分混匀30分钟。
8. 向上步混合物中加入200 μL预热的快速洗脱缓冲液1，点震混匀，68℃孵育5分钟，置于磁力架至液体澄清，弃上清，重复1次，将液体转移至新的1.5 mL离心管中，置于磁力架至液体澄清，弃上清。
9. 向离心管中加入200 μL预热的快速洗脱缓冲液2，点震混匀，48℃孵育5分钟，置于磁力架至液体澄清，弃上清；重复2次，并用小枪将残液吸取干净，加入45 μL水，混匀备用。
10. 取22.5 μL的杂交产物，并加入27.5 μL的扩增试剂混合物，配制成总体积50μL的PCR扩增体系，PCR程序为98℃预变性45 sec，98℃变性15 sec，60℃退火30 sec，72℃延伸30 sec，扩增9个循环，72℃完全延伸1分钟，4℃保温，热盖105℃。
11. 向扩增产物中加入1.8×的纯化磁珠，充分混匀后室温孵育5分钟，上磁力架至液体澄清，弃上清，加入200 μL 80%乙醇，1分钟后弃上清，重复清洗一次，在室温下将磁珠干燥4分钟，晾干后用32 μL水重悬磁珠，室温下孵育5分钟，上磁力架至液体澄清，转移30μL上清液，即为探针捕获文库（即为靶标DNA片段）。
（3）扩增测序
以所述靶标DNA片段为模板进行扩增得到靶向捕获文库；通过Qubit荧光计对文库进行定量和通过安捷伦2100生物分析仪进行质检，质控合格后，采用Illumina测序平台测序仪进行上机测序，测序实验操作按照制造商提供的操作说明书进行上机测序操作。
（3）样本数据进行MRD分析
检出突变个数如表9所示。结果表明，本试剂盒能够有效检出结直肠癌cfDNA样本中的突变，检出阳性率为100%（10/10），同时超过90%患者具有≥5个变异可用于后续MRD追踪。
表9
实施例8
本实施例采用外购的低频突变标准品，该参考品包括下表所示突变位点，原始突变频率预期为0.5%，将该参考品用对应的阴性参考品进行梯度混合，稀释至目标突变频率分别为0.1%，0.05%及0.005%，将不同目标突变频率水平的样本分别采用本试剂盒进行检测，每种样本做3次重复检测，检测结果如表10。结果表明：
1）预期突变频率为0.5%~0.05%的原始参考品相应的突变位点在3次重复中完全检出，即本试剂盒检测0.05%以上频率的突变位点检出率为100%，换言之，本试剂盒检测突变灵敏度可达0.05%；
2）以该位点集合模拟患者的基线突变集合LP1，稀释为0.1%~0.005%水平模拟患者在接受治疗后突变位点的频率逐渐降低。依据本申请所述MRD判断方法，LP1中任意一个突变支持的独特分子标签读序≥1即可判定为MRD阳性，即在样本水平检测MRD的灵敏度可达0.005%。
表10
实施例9
本实施例对实施例7中所述样本1患者不同治疗时间的游离核酸样本分别进行检测，检测结果如表11所示。结果表明，本试剂盒能够对游离核酸中的变异进行有效追踪，准确判别微小残留病MRD状态。
表11
表11的标注：“核苷酸变化”是指突变位点的碱基变化；“氨基酸变化”是指该突变引起多基因编码蛋白的氨基酸变化；N.D.是指未检测到该突变。
从表11可知，该患者三次MRD监测结果分别为阳性、阳性及阴性，其中检测样本为患者术前血液，术后一个月血液及术后六个月血液。相应地，临床随访结果表明患者术后影像学观察到无残留肿瘤组织，并且截止目前未复发，表明本发明能够准确反映MRD状态，并且预测患者的复发情况。
综上所述，本发明提供了一种检测结直肠癌微小残留病MRD的靶标集合筛选方法及其检测***，所述靶标集合能够对结直肠癌患者的MRD状态进行准确评估；所述检测***使用方便，具有良好的目标区域覆盖度和捕获效率，灵敏度高，重复性好，能够对患者的分子缓解状态进行持续跟踪，从而对根治性治疗的疗效进行评估，***复发，具有广阔的应用前景。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (11)

1.一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括如下步骤：
（1）收集结直肠癌相关的高频突变基因及相应的突变区域，记为起始靶标集合P0；
（2）分析公共数据库中结直肠癌肿瘤样本数据；过滤掉公共数据库中注释的所有的良性变异或疑似良性变异；统计起始靶标集合P0区域发生变异的患者集合记为PT0；
（3）统计公共数据库中结直肠癌样本中出现的所有突变对应的基因，计算每个基因的群体突变频率；
（4）筛选群体突变频率≥10%的基因，记为集合FG；计算集合FG中基因的每个外显子的突变指数MI；根据MI值进行判断，将对应的外显子纳入起始靶标集合P0；补充后的靶标集合为P1，在上述区域发生变异的患者集合为PT1；
（5）筛选群体突变频率<10%的基因，记为集合LFG；计算集合LFG中基因的每个外显子的突变指数MI；根据MI值进行判断，将对应的外显子纳入靶标集合P1；补充后的靶标集合为P2，在该区域发生变异的患者集合为PT2；
（6）计算潜在驱动基因的每个外显子的突变指数MI；挑选MI≥20的外显子，分别做以下判断：在靶标集合P2中加入所述外显子，重新统计相应的靶标集合区域发生变异的患者集合PT，若PT相对于PT2至少增加1个患者，则保留所述外显子，相应的靶标集合则更新为靶标集合P3，在靶标集合P3对应区域发生变异的患者集合为PT3；否则所述外显子不纳入靶标集合P2；
（7）对靶标集合P3进行精简，精简后相应的靶标集合则更新为靶标集合P4，在靶标集合P4对应区域发生变异的患者集合为PT4；
（8）对于靶标集合P4中的克隆性造血基因突变进行过滤；过滤后相应的靶标集合则更新为靶标集合P5，在靶标集合P5对应区域发生变异的患者集合为PT5。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤（1）中，所述靶标集合包括下表所示区域；
。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤（2）中，所述公共数据库为COSMIC数据库及TCGA数据库；
步骤（2）中，所述良性变异或疑似良性变异对应的数据库为Clinvar数据库和COSMIC数据库；
步骤（3）中，所述群体突变频率=在所述基因发生变异的患者样本数目/肿瘤患者样本总数；
步骤（4）中，所述突变指数MI为每个外显子每1000 bp区域上发生变异的结直肠癌患者数量；
步骤（4）中，所述根据MI值进行判断的标准为：
（a）若所述基因外显子的突变指数MI值集合中最大值>2*平均值，则将该集合中>2*平均值的MI对应的外显子纳入起始靶标集合P0；
（b）若所述基因外显子的突变指数MI值集合中最大值<2*平均值，则将该基因所有的外显子纳入靶标集合P0；
步骤（5）中，所述根据MI值进行判断的标准为：筛选突变指数MI≥20的外显子，将所述外显子纳入靶标集合P1。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤（6）中，所述潜在驱动基因包括：ACVR2A、AMER1、ARAF、B2M、CTNNB1、HRAS、MAP2K1、MDM2、MDM4、MED12、MSH6、MYC、NCOA4、NOTCH1、NOTCH2、PMS2、POLE、PRDM2、PTEN、PTPN11、PTPRD、RNF43、SOX9、STAT3、TCF7L2、TGFBR2或ZNRF3中的一种或至少两种的组合；
步骤（7）中，所述精简的标准包括：
针对靶标集合P3中长度>2 kb的外显子，将所述外显子以120 bp为区段进行分割，将靶标集合P3中每个120 bp区段进行去除后，分析PT3中患者数目是否减少；若减少，则所述120bp保留；若未减少，则所述120 bp区段从靶标集合P3中去除；
步骤（8）中，所述克隆性造血基因突变对应的基因包括：
DNMT3A、TET2、ASXL1、PPM1D、SF3B1、CBL、CREBBP、TNR、TG、SPHKA、MUC5B、HERC2、DNAH8或ASTN1中的任意一种或至少两种的组合。
5.一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合，其特征在于，所述靶标集合中的基因为采用权利要求1-4中任一项所述的筛选方法筛选得到；
所述靶标集合包括177个基因中的426个外显子区段，所述靶标集合具体区域如下表所示；
。
6.一种权利要求5所述的靶标集合对应的检测结直肠癌微小残留病灶的探针，其特征在于，所述探针的长度为110-130 bp，并以头尾相接的形式覆盖权利要求5所述的靶标集合。
7.一种检测结直肠癌微小残留病灶的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求6所述的检测结直肠癌微小残留病灶的探针；
所述试剂盒还包括：基因组预文库构建试剂、接头、杂交捕获试剂或杂交产物扩增试剂中的任意一种或至少两种的组合；
所述接头为带有分子标签的接头。
8.一种结直肠癌微小残留病灶MRD的检测***，其特征在于，所述检测***包括：
（1）血浆突变筛查模块：所述血浆突变筛查模块用于对血浆进行样本提取、建库、上机测序及突变分析；所述血浆包括基线血浆和监测血浆，所述基线血浆为结直肠癌患者根治性治疗前血浆，所述监测血浆为结直肠癌患者根治性治疗后血浆；所述血浆突变筛查模块包括如下单元：
（a）外周血样本核酸提取单元：收集外周血作为基线样本或监测样本，分别从样本中提取血细胞gDNA及血浆样本中的cfDNA；
（b）基因组预文库制备单元：利用所得DNA样本制备基因组预文库，所述基因组预文库包括gDNA预文库和cfDNA预文库；
（c）杂交捕获单元：利用权利要求6所述的探针与所述基因组预文库进行杂交捕获，得到靶标DNA片段；
（d）扩增测序单元：以所述靶标DNA片段为模板进行扩增得到靶向捕获文库，所述靶向捕获文库包括cfDNA靶向捕获文库和gDNA靶向捕获文库；对靶向捕获文库进行双端测序；
（e）分析单元：对测序序列进行质控评价，以白细胞DNA文库测序数据作为对照，进行对比识别血浆cfDNA靶向捕获文库中的基因突变；
（f）突变过滤单元：对于基线样本或监测样本中的基因突变进行过滤；基线血浆基因突变集合记为LP1；监测血浆基因突变集合记为LP2；
（2）结直肠癌患者微小残留病灶MRD状态判断模块：比较LP1及LP2，若LP1中任意一个突变存在于LP2，和/或LP2中突变数目≥5%*LP1中突变数目，则判定为MRD阳性；否则为MRD阴性。
9.根据权利要求8所述的结直肠癌微小残留病灶MRD的检测***，其特征在于，所述基因组预文库制备单元中，对所得样本DNA进行酶切、末端修复、加腺嘌呤A，连接接头后，磁珠纯化，PCR扩增富集，通过Qubit荧光计对文库进行定量和通过安捷伦2100生物分析仪进行质控检测后，得到血细胞gDNA基因组预文库和cfDNA预文库；
所述杂交捕获单元中，血细胞gDNA预文库与cfDNA预文库杂交投入量为1:(4-6)；
所述扩增测序单元中，cfDNA靶向捕获文库的测序深度为30000~50000×，gDNA靶向捕获文库的测序深度为5000~10000×；
所述突变过滤单元中，对基线血浆中的基因突变进行过滤的步骤包括：
（I）在dbSNP、gnomeAD和1000genomes数据库中的出现频率大于1%的基因突变过滤掉；
（II）对于在COSMIC数据库中记录频数≥20次的常见基因突变，要求基因突变等位基因频率VAF≥0.1%，支持所述基因突变的带有独特分子标签的测序读数≥2；对于在COSMIC数据库中记录频数<20次的变异，要求基因突变等位基因频率VAF≥0.25%，支持所述基因突变的带有独特分子标签的测序读数≥5；否则过滤掉所述基因突变；
（III）以健康人的血浆游离DNA进行建库测序作为背景，患者的基因突变频率高于背景中的最大突变频率的1.5倍，则认定所述基因突变为存在于所述患者的血浆游离DNA中的真实基因突变，否则将其从患者基因突变列表中过滤掉；
经过（I）、（II）和（III）的过滤，最终所得基线血浆基因突变集合记为LP1；
所述突变过滤单元中，对监测血浆中的基因突变进行过滤的步骤包括：
对于存在于LP1集合中的基因突变，要求支持所述基因突变的带有独特分子标签的测序读数≥1即可保留；对于不在LP1集合中的突变，进行突变过滤，所述突变过滤的步骤参照对基线血浆中的基因突变进行过滤的步骤，最终所得监测血浆突变集合记为LP2。
10.权利要求5所述的用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合、权利要求6所述的检测结直肠癌微小残留病灶的探针或权利要求7所述的检测结直肠癌微小残留病灶的试剂盒中任一项在制备结直肠癌微小残留病灶检测产品中的应用。
11.权利要求5所述的用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合、权利要求6所述的检测结直肠癌微小残留病灶的探针或权利要求7所述的检测结直肠癌微小残留病灶的试剂盒中任一项在制备结直肠癌患者复发预测产品中的应用。
CN202310799873.2A 2023-07-03 2023-07-03 一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法及其检测*** Active CN116524999B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310799873.2A CN116524999B (zh) 2023-07-03 2023-07-03 一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法及其检测***

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310799873.2A CN116524999B (zh) 2023-07-03 2023-07-03 一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法及其检测***

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116524999A CN116524999A (zh) 2023-08-01
CN116524999B true CN116524999B (zh) 2023-09-19

Family

ID=87406729

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310799873.2A Active CN116524999B (zh) 2023-07-03 2023-07-03 一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法及其检测***

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116524999B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106570349A (zh) * 2016-10-28 2017-04-19 深圳华大基因科技服务有限公司 用于目标区域捕获高通量测序的特异性肿瘤探针区域设计方法和装置以及探针
WO2019071261A1 (en) * 2017-10-08 2019-04-11 Peyman Gholam A METHODS OF TREATING CANCER USING ENHANCED THERMOTHERAPY AND / OR IMMUNOTHERAPY
CN113284554A (zh) * 2021-04-28 2021-08-20 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 一种筛查结直肠癌术后微小残留病灶及预测复发风险的循环肿瘤dna检测***及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106570349A (zh) * 2016-10-28 2017-04-19 深圳华大基因科技服务有限公司 用于目标区域捕获高通量测序的特异性肿瘤探针区域设计方法和装置以及探针
WO2019071261A1 (en) * 2017-10-08 2019-04-11 Peyman Gholam A METHODS OF TREATING CANCER USING ENHANCED THERMOTHERAPY AND / OR IMMUNOTHERAPY
CN113284554A (zh) * 2021-04-28 2021-08-20 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 一种筛查结直肠癌术后微小残留病灶及预测复发风险的循环肿瘤dna检测***及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN116524999A (zh) 2023-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210095341A1 (en) Multiplex 5mc marker barcode counting for methylation detection in cell free dna
Mi et al. Circular RNA detection methods: A minireview
JP4435259B2 (ja) 微量胃癌細胞の検出法
CN114566285B (zh) 一种膀胱癌早期筛查模型及其构建方法、试剂盒及其使用方法
CN115786459B (zh) 一种应用于高通量测序检测实体瘤微小残留病的方法
CN114317762B (zh) 用于检测早期肝癌的三标记物组合物及其试剂盒
CN112011615A (zh) 用于人甲状腺癌基因融合试剂盒及检测方法
CN111748628B (zh) 一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异的引物及试剂盒
CN107630093B (zh) 用于诊断肝癌的试剂、试剂盒、检测方法及用途
CN114574587A (zh) 一种用于结直肠癌检测的标记物组合物及其应用
JP4317854B2 (ja) 微量胃癌細胞の検出法
CN112259165B (zh) 用于检测微卫星不稳定性状态的方法及***
CN116524999B (zh) 一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法及其检测***
CN115717167B (zh) 一种新型多靶点肝癌早期检测的标志物组合和试剂盒
CN114438210B (zh) 一种基于高通量测序子宫内膜癌分子分型的文库构建方法
CN114657247B (zh) 用于早期肝癌检测的dna甲基化生物标记物或组合及其应用
CN111394434B (zh) 一种TaqMan探针法的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒及其应用
CN114250269A (zh) 一种探针组合物、基于该探针组合物的二代测序文库及其应用
CN114657248B (zh) 用于检测早期结直肠癌的血浆游离dna甲基化生物标记物或其组合物、应用及试剂盒
CN117821596B (zh) 用于高灵敏度甲状腺结节良恶性辅助诊断的ngs检测方法
CN108374041A (zh) 用于fbxo32基因启动子甲基化检测的引物、检测方法及其应用
JP7232438B2 (ja) メチル含有基修飾核酸を精製、分離または濃縮する方法
CN117512116A (zh) 一种用于胆管癌检测的生物标志物及其应用
Cai et al. P731: TERT gene promoter region mutation analysis in glioma using multiplex SNaPshot method
Dai et al. Ultrasensitive amplification-free quantification of a methyl CpG-rich cancer biomarker by single-molecule kinetic fingerprinting

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant