CN116507739A - 使用多个孔确定生物样品中分析物位置的方法 - Google Patents

使用多个孔确定生物样品中分析物位置的方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了确定生物样品中分析物位置的方法和包括多个孔的装置，其中多个孔的孔包括包含多个捕获探针的表面。

Description

使用多个孔确定生物样品中分析物位置的方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2020年9月16日提交的美国专利申请序列号63/079,153的优先权，该申请的全部内容通过引用纳入本文。
背景技术
对象组织内的细胞由于不同细胞内的不同分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)而在细胞形态和/或功能上存在差异。细胞在组织内的特定位置(例如，细胞相对于邻近细胞的位置或细胞相对于组织微环境的位置)可以影响，例如，细胞的形态、分化、命运、活力、增殖、行为以及与组织中其它细胞的信号转导和串扰。
空间异质性先前被研究过，所述研究使用的技术仅提供完整组织或部分组织中的少量分析物的数据，或提供单细胞的大量分析物数据，但无法提供有关单细胞在亲本生物样品(例如，组织样品)中位置的信息。
单一的空间条码化阵列的使用可以确定来自亲本生物样品的单细胞的位置和内容物。样品透化后，细胞的生物内容物自由地流入周边溶液，并可以被动或主动地迁移到下面的空间条码化阵列。然而，阵列的空间分辨率可能受到透化后样品内容物的热力学扩散的限制。主动迁移法(例如，电泳)可以限制但不消除这种扩散。
发明内容
本文提供用于将来自生物样品的细胞定位到空间条码化孔中的方法和手段。细胞可在条码化孔中透化或裂解，从而确保整个细胞的内容物保留在空间条码化孔内用于结合捕获探针(以及后续分析)。在一些示例中，通过将样品压入空间条码化孔的阵列，可以将生物样品分成大约细胞大小的组成部分。
将细胞及其内容物包含在单个孔中导致更高的捕获效率，因为分析物在与捕获探针的捕获域结合之前不必通过相对大体积的溶液扩散。此外，捕获细胞的转录组导致试验中更高的灵敏度和空间分辨率。使用带有单个捕获探针群的孔为在单张玻片上运行多组学试验提供了可能。将捕获探针固定在孔壁上还可以支持捕获探针的三维空间条码化，实现空间分辨率的第三维。此外，孔的使用模拟了微滴环境。在空间上限制反应的体积(使用本文所述的方法和底物)可以导致反应动力学的速度和效率的提高，同时减少试验试剂的使用。
本文提供了确定生物样品中分析物位置的方法，其包括：(a)将生物样品的部分置于多个孔中，其中多个孔中的孔包括包含多个捕获探针的表面，其中多个捕获探针中的一个包含空间条码和捕获域；(b)从生物样品中释放分析物，其中分析物特异性结合捕获探针的捕获域；以及(c)确定(i)对应于分析物或其互补物的序列，以及(ii)对应于空间条码或其互补物的序列，并使用(i)和(ii)的序列以确定分析物在生物样品中的位置。在本文所述任何方法的一些实施方式中，基材包含约100万至约500万个孔。
在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔是平底孔。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔是圆底孔。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有六边形的周界。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有七边形的周界。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有八边形的周界。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有五边形的周界。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有方形的周界。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有圆形的周界。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有基本相同的周长。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔不具有基本相同的周长。
在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约3μm至约7μm的平均直径。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约4μm至约6μm的平均直径。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约12μm2至约30μm2的面积。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约15μm2至约27μm2的面积。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约18μm2至约24μm2的面积。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有约10μm至约35μm的深度。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有约15μm至约30μm的深度。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有约20μm至约25μm的深度。
在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔具有约7.0μm至约20μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔具有约7.0μm至约10μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔具有约7.0μm至约8.5μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。
在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个捕获探针置于孔的底部表面。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个捕获探针置于孔的一个或多个侧表面。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个捕获探针置于孔的底部表面和孔的一个或多个侧表面。
在本文所述任何方法的一些实施方式中，步骤(a)中的设置是使用辊或冲压装置施加的压力进行的。在本文所述任何方法的一些实施方式中，使用寡核苷酸光刻将多个探针预先连接到孔的表面。在本文所述任何方法的一些实施方式中，使用桥式扩增将多个探针预先连接到孔的表面。在本文所述任何方法的一些实施方式中，通过将多个可溶性水凝胶珠置于孔中将多个捕获探针预先置于孔中，其中多个可溶性水凝胶珠包含多个捕获探针。
在本文所述任何方法的一些实施方式中，步骤(c)中的释放包括裂解生物样品的部分。本文所述任何方法的一些实施方式中进一步包括，在步骤(c)之前向多个孔中的每个孔加入一种或多种裂解剂。在本文所述任何方法的一些实施方式中，步骤(a)中多个孔的每个孔包含一种或多种裂解剂。
本文所述任何方法的一些实施方式中进一步包括，在步骤(b)之前对生物样品进行固定、染色和成像的一种或多种。在本文所述任何方法的一些实施方式中，生物样品在步骤(b)之前置于透明基材上。
在本文所述任何方法的一些实施方式中，生物样品是组织样品。在本文所述任何方法的一些实施方式中，组织样品是新鲜、冷冻的组织样品。在本文所述任何方法的一些实施方式中，组织样品是固定的组织样品。在本文所述任何方法的一些实施方式中，组织样品是***固定石蜡包埋(FFPE)组织样品。
在本文所述任何方法的一些实施方式中，步骤(d)包括使用特异性结合到捕获域的分析物作为模板延伸捕获探针的末端。在本文所述任何方法的一些实施方式中，步骤(d)包括对(i)对应于分析物或其互补物的序列，和(ii)对应于空间条码或其互补物的序列进行测序。在本文所述任何方法的一些实施方式中，测序是高通量测序。
在本文所述任何方法的一些实施方式中，分析物是RNA。在本文所述任何方法的一些实施方式中，RNA是mRNA。在本文所述任何方法的一些实施方式中，分析物是DNA。在本文所述任何方法的一些实施方式中，DNA是基因组DNA。
本文还提供了确定生物样品中分析物位置的方法，其包括：(a)包括多个孔的基材，其中多个孔中的孔包含：(i)包含多个捕获探针的表面，其中多个捕获探针的一个包含空间条码和捕获域；以及(ii)多个分析物捕获剂，其中多个分析物捕获剂的分析物包含分析物结合部分、分析物结合部分条码和分析物捕获序列；(b)将生物样品置于多个孔中；(c)从生物样品中释放分析物，其中分析物特异性结合分析物捕获剂的分析物结合部分，分析物捕获剂的分析物捕获序列特异性结合捕获探针的捕获域；以及(d)确定(i)对应于分析物结合部分条码或其互补物的序列，和(ii)对应于空间条码或其互补物的序列，并使用(i)和(ii)的序列以确定生物样品中分析物的位置。
在本文所述任何方法的一些实施方式中，基材包含约100万至约500万个孔。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔是平底孔。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔是圆底孔。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有六边形的周界。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有七边形的周界。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有八边形的周界。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有五边形的周界。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有方形的周界。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有圆形的周界。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有基本相同的周长。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔不具有基本相同的周长。
在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约3μm至约7μm的平均直径。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约4μm至约6μm的平均直径。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约12μm2至约30μm2的面积。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约15μm2至约27μm2的面积。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约18μm2至约24μm2的面积。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有约10μm至约35μm的深度。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有约15μm至约30μm的深度。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有约20μm至约25μm的深度。
在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔具有约7.0μm至约20μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔具有约7.0μm至约10μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔具有约7.0μm至约8.5μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。
在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个捕获探针置于孔的底部表面。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个捕获探针置于孔的一个或多个侧表面。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个捕获探针置于孔的底部表面和孔的一个或多个侧表面。
在本文所述任何方法的一些实施方式中，步骤(b)中的压制是使用辊或冲压装置施加的压力进行的。在本文所述任何方法的一些实施方式中，使用寡核苷酸光刻将多个探针预先连接到孔的表面。在本文所述任何方法的一些实施方式中，使用桥式扩增将多个探针预先连接到孔的表面。在本文所述任何方法的一些实施方式中，通过将多个可溶性水凝胶珠预先置于孔中将多个捕获探针置于孔中，其中所述多个可溶性水凝胶珠包含多个捕获探针。
在本文所述任何方法的一些实施方式中，步骤(c)中的释放包括裂解生物样品的部分。本文所述任何方法的一些实施方式中进一步包括，在步骤(c)之前向多个孔中的每个孔加入一种或多种裂解剂。在本文所述任何方法的一些实施方式中，步骤(a)中多个孔的每个孔包含一种或多种裂解剂。
本文所述任何方法的一些实施方式中进一步包括，在步骤(b)之前对生物样品进行固定、染色和成像的一种或多种。在本文所述任何方法的一些实施方式中，生物样品在步骤(b)之前置于透明基材上。
在本文所述任何方法的一些实施方式中，生物样品是组织样品。在本文所述任何方法的一些实施方式中，组织样品是新鲜、冷冻的组织样品。在本文所述任何方法的一些实施方式中，组织样品是固定的组织样品。在本文所述任何方法的一些实施方式中，组织样品是***固定石蜡包埋(FFPE)组织样品。
在本文所述任何方法的一些实施方式中，步骤(d)包括使用分析物结合部分条码作为模板延伸捕获探针的末端。在本文所述任何方法的一些实施方式中，步骤(d)包括对(i)对应于分析物结合部分条码或其互补物的序列，和(ii)对应于空间条码或其互补物的序列进行测序。在本文所述任何方法的一些实施方式中，测序是高通量测序。
在本文所述任何方法的一些实施方式中，分析物结合部分是抗体或其抗原结合片段。在本文所述任何方法的一些实施方式中，分析物是蛋白质。在本文所述任何方法的一些实施方式中，蛋白是胞内蛋白。在本文所述任何方法的一些实施方式中，蛋白是胞外蛋白。
本文还提供了包括多个孔的装置，其中多个孔的一个孔包括包含多个捕获探针的表面，其中多个捕获探针包含空间条码和捕获域，并且其中：该装置包含约100万个孔至约500万个孔；多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，其平均直径为约3μm至约7μm；多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，其面积为约12μm2至约30μm2；多个孔的每个孔具有约10μm至约35μm的深度；并且多个孔具有约7.0μm至约20μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。
在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔的每个孔是平底孔。在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔的每个孔是圆底孔。
在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有六边形、七边形、八边形、五边形、方形或圆形的周界。在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有基本相同的周长。在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔的每个孔不具有基本相同的周长。
在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约4μm至约6μm的平均直径。在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约15μm2至约27μm2的面积。在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约18μm2至约24μm2的面积。在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有约15μm至约30μm的深度。在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有约20μm至约25μm的深度。在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔具有约7.0μm至约10μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔具有约7.0μm至约8.5μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。
在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个捕获探针置于孔的底部表面。在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个捕获探针置于孔的一个或多个侧表面。在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个捕获探针置于孔的底部表面和孔的一个或多个侧表面。在本文所述任何装置的一些实施方式中，使用寡核苷酸光刻将多个探针预先连接到孔的表面。在本文所述任何装置的一些实施方式中，使用桥式扩增将多个探针预先连接到孔的表面。
在本文所述任何装置的一些实施方式中，通过将多个可溶性水凝胶珠预先置于孔中将多个捕获探针置于孔中，其中多个可溶性水凝胶珠包含多个捕获探针。
在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔的每个孔进一步包含一种或多种裂解剂。在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔的每个孔进一步包含一种或多种分析物捕获剂。
本文还提供了包括多个孔的装置，其中多个孔的一个孔包括包含多个捕获探针的表面，其中多个捕获探针的一个在5'至3'方向上包含空间条码和捕获域，以及与来自生物样品的分析物的序列的至少一部分互补的序列，并且其中：该基材装置包含约100万个孔至约500万个孔；多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，其平均直径为约3μm至约7μm；多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，其面积为约12μm2至约30μm2；多个孔的每个孔具有约10μm至约35μm的深度；并且多个孔具有约7.0μm至约20μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。
在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔的每个孔是平底孔。在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔的每个孔是圆底孔。在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有六边形、七边形、八边形、五边形、方形或圆形的周界。在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有基本相同的周长。在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔的每个孔不具有基本相同的周长。
在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约4μm至约6μm的平均直径。在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约15μm2至约27μm2的面积。在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约18μm2至约24μm2的面积。在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有约15μm至约30μm的深度。在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有约20μm至约25μm的深度。在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔具有约7.0μm至约10μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔具有约7.0μm至约8.5μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。
在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个捕获探针置于孔的底部表面。在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个捕获探针置于孔的一个或多个侧表面。在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个捕获探针置于孔的底部表面和孔的一个或多个侧表面。在本文所述任何装置的一些实施方式中，使用寡核苷酸光刻将多个探针预先连接到孔的表面。在本文所述任何装置的一些实施方式中，使用桥式扩增将多个探针预先连接到孔的表面。在本文所述任何装置的一些实施方式中，通过将多个可溶性水凝胶珠预先置于孔中将多个捕获探针置于孔中，其中所述多个可溶性水凝胶珠包含多个捕获探针。
在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔的每个孔进一步包含一种或多种裂解剂。
在本文所述任何装置的一些实施方式中，多个孔的每个孔进一步包含一种或多种分析物捕获剂。
本文还提供了包括本文所述任何装置的试剂盒。本文所述任何试剂盒的一些实施方式进一步包含用于执行本文所述任何方法的使用说明。本文所述任何试剂盒的一些实施方式进一步包含逆转录酶、聚合酶、RNA酶、蛋白酶、DNA酶和脂肪酶中的一种或多种。本文所述任何试剂盒的一些实施方式进一步包含裂解剂。
本说明书中提到的可在因特网上获得的所有发表物、专利和专利申请通过引用纳入本文，就如同将各篇单独的发表物、专利、专利申请和信息项目专门和单独地通过引用纳入本文那样。对于通过引用纳入的出版物、专利、专利申请和信息项目与本说明书中所含公开内容相矛盾的内容，均意于以本说明书为准和/或本说明书优先于任何相矛盾的材料。
在以范围来描述值的情况下，应当理解的是，该描述包括在该范围内的所有可能的子范围的公开，以及在该范围内的特定数值的公开，而不管是否明确地说明了特定数值或特定子范围。
术语“每个”提及一组物品时，意在鉴别该集合中的一个单独物品，但不一定指该集合中的每一项物品，除非另有明确说明，或除非用法的上下文另有明确说明。
本文描述了本发明的特征的各种实施方式。然而，应当理解，这些实施方式仅作为示例提供，并且在不脱离本公开的范围的情况下，本领域技术人员可以作出许多变化、改变和替换。还应理解，本文所描述的特定实施方式的各种替代方案也在本公开的范围内。
附图说明
以下附图说明了本发明的特征和优点的某些实施方式。这些实施方式无意以任何方式限制所附权利要求的范围。附图中的相同附图标记表示相同的元素。
图1示出了示例性空间分析工作流程。
图2示出了示例性空间分析工作流程。
图3是示出如本文所述的条码化捕获探针的示例的示意图。
图4是说明可裂解捕获探针的示意图，其中裂解的捕获探针可进入非透化细胞并结合到样品内的目标分析物。
图5是示例性多重空间条码化特征的示意图。
图6A是说明用于“像素化”样品的示范性、非限制性、非穷尽性步骤的工作流程示意图，其中样品通过空心针或微针切割、压印、显微解剖或转移，将样品的一小部分移动到个体分区或孔中。
图6B是描绘多针像素化(multi-needle pixilation)的示意图，其中一组针头穿过支架上的样品并穿入下面含有凝胶珠和试剂的纳米孔中。一旦针进入纳米孔，细胞就会弹出。
图7A-7B显示7A)示例孔阵列的侧视图，每个孔中有独特的空间条码化捕获探针和7B)示例孔阵列的倾斜俯视图。
图8A-8B显示8A)示例组织切片和组织切片在空间条码化孔阵列上方的相对定位，以及8B)在组织切片被压入孔中导致组织切片的细胞进入孔中后的空间条码化孔阵列。
图9A-9C显示9A)使用光刻将空间条码化捕获探针放置在孔内的示例手段，9B)使用条码化微珠将空间条码化捕获探针放置在孔内的示例手段，以及9C)使用桥式扩增将空间条码捕获探针放置在孔内的示例手段。
图10A-10J显示10A)示例性桥式扩增法，其包括第一引物序列和第二引物序列，以及第一衔接子序列，10B)第一示例性引物序列在第一步桥式扩增中延伸以形成第一互补链，10C)第一互补链在第二步桥式扩增中与第二引物序列结合，10D)第二引物在第三步桥式扩增中延伸形成第一反向序列互补链，10E)第四步桥式扩增中的第一互补链和第一反向序列互补链，以及第三和第四引物序列，10F)重复第二步、第三步和第四步桥式扩增得到的第二互补链和第二反向序列互补链的结果，10G)去除反向序列互补链后桥式扩增的最终结果，10H)与衔接子序列结合的第一互补链，10I)使用衔接子序列作为模板延伸第一互补链以形成捕获探针，和10J)作为桥式扩增的结果的完整示例性捕获探针。
图11A-11B显示11A)示例组织切片和组织切片在空间条码化孔阵列上方的相对定位，以及11B)在组织切片已经接触到孔的上表面并且电极放置在空间条码化孔阵列和组织切片的对侧之后的空间条码化孔阵列。
图12A-12B显示12A)示例组织切片和在组织切片被压入孔中导致组织切片的细胞进入孔后的空间条码化孔阵列，以及12B)在组织切片被压入孔中并且电极放置在空间条码化孔阵列和组织切片的对侧之后的空间条码化孔阵列。
图13A-13B显示13A)带有XY微控制器的微孔阵列和载物台，以及13B)由载物台和XY微控制器定位在微孔阵列上方的组织样品。
具体实施方式
本文所述的空间分析方法和组合物能以高空间分辨率提供生物样品内大量分析物和/或各种各样分析物的表达数据，同时保留天然空间背景信息。空间分析方法和组合物可以包括，例如，使用包括空间条码(例如，提供关于分析物在细胞或组织样品(例如哺乳动物细胞或哺乳动物组织样品)内的位置或方位的信息的核酸序列)的捕获探针，和能够与细胞产生和/或其中存在的分析物(例如，蛋白质和/或核酸)结合的捕获域。空间分析方法和组合物还可包括使用具有捕获域的捕获探针，其捕获用于间接检测分析物的中间物(intermediate agent)。例如，中间物可以包括与中间物相关联的核酸序列(例如，条码)。因此，中间物的检测指示细胞或组织样品中的分析物。
空间分析的方法和组合物的非限制性方面描述于美国专利号10,774,374,10,724,078,10,480,022,10,059,990,10,041,949,10,002,316,9,879,313,9,783,841,9,727,810,9,593,365,8,951,726,8,604,182,7,709,198,美国专利申请公开号2020/239946,2020/080136,2020/0277663,2020/024641,2019/330617,2019/264268,2020/256867,2020/224244,2019/194709,2019/71796,2019/085383,2019/055594,2018/216161,2018/051322,2018/0245142,2017/241911,2017/089811,2017/067096,2017/029875,2017/0016053,2016/108458,2015/000854,2013/171621,WO 2018/091676,WO2020/176788,Rodriques等,Science 363(6434):1463-1467,2019；Lee等,Nat.Protoc.10(3):442-458,2015；Trejo等,PLoS ONE 14(2):e0212031,2019；Chen等,Science 348(6233):aaa6090,2015；Gao等,BMC Biol.15:50,2017；和Gupta等,Nature Biotechnol.36:1197-1202,2018；Visium空间基因表达试剂盒用户指南(Visium Spatial GeneExpression Reagent Kits User Guide)(例如，Rev C，日期2020年6月),和/或Visium空间组织优化试剂盒用户指南(Visium Spatial Tissue Optimization Reagent Kits UserGuide)(例如，Rev C，日期2020年7月)，两者均可得于10x基因组学有限公司(10xGenomics)支持文档网站，可以任意组合使用。本文描述了空间分析方法和组合物的其它非限制性方面。
可以在本公开中使用的一些通用术语可以见于WO2020/176788的第(I)(b)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663。通常，“条码”是一种标签或标识符，它传递或能够传递信息(例如，关于样品中分析物、珠和/或捕获探针的信息)。条码可以是分析物的部分，也可以独立于分析物。条码可以附接于分析物。特定条码相对于其它条码可能是独特的。就本发明而言，“分析物”可包括任何待分析的生物物质、结构、部分或组分。术语“目标”可以类似地指感兴趣的分析物。
分析物可大致分为两类：核酸分析物和非核酸分析物。非核酸分析物的示例包括但不限于脂质、碳水合合物、肽、蛋白质、糖蛋白(N-连接或O-连接)、脂蛋白、磷蛋白、蛋白质的特定磷酸化或乙酰化变体、蛋白质的酰胺化变体、蛋白质的羟基化变体、蛋白质的甲基化变体，蛋白质泛素化变体、蛋白质硫酸化变体、病毒蛋白(例如，病毒衣壳、病毒包膜、病毒外壳、病毒附件、病毒糖蛋白、病毒刺突等)、胞外和胞内蛋白质、抗体和抗原结合片段。在一些实施方式中，分析物可定位于亚细胞位置，包括例如细胞器，例如线粒体、高尔基体、内质网、叶绿体、内吞囊泡、排出囊泡、液泡、溶酶体等。在一些实施方式中，分析物可以是肽或蛋白质，包括但不限于抗体和酶。分析物的其它示例可见于WO2020/176788第(I)(c)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663。在一些实施方式中，分析物可被间接检测，例如通过中间物的检测，例如连接产物或分析物捕获剂(例如，寡核苷酸偶联的抗体)，例如本文所述的那些。
通常从对象处获取“生物样品”，以使用各种技术中的任一种进行分析，包括但不限于活检、手术和激光捕获显微镜(LCM)，并且通常包括来自对象的细胞和/或其它生物材料。在一些实施方式中，生物样品可以是组织切片。在一些实施方式中，生物样品可以是固定和/或染色的生物样品(例如，固定和/或染色的组织切片)。染色剂的非限制性示例包括组织染色剂(例如，苏木精和/或伊红)和免疫染色剂(例如，荧光染色剂)。在一些实施方式中，可以对生物样品(例如，固定和/或染色的生物样品)成像。生物样品也描述于WO2020/176788第(I)(d)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。
在一些实施方式中，生物样品用一种或多种透化试剂透化。例如，生物样品的透化可以促进分析物的捕获。示例性透化剂和条件描述于WO2020/176788的第(I)(d)(ii)(13)部分或示例性实施方式部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663。
基于阵列的空间分析方法涉及将一种或多种分析物从生物样品转移到基材上的特征阵列，其中各特征与阵列上的独特空间位置相关联。转移分析物的后续分析包括确定分析物的相同性以及生物样品中分析物的空间位置。分析物在生物样品中的空间位置是基于阵列中分析物所结合(例如，直接或间接)的特征以及特征在阵列上的相对空间位置来确定的。
“捕获探针”是指能够捕获(直接或间接)和/或标记生物样品中的分析物(例如，感兴趣的分析物)的任何分子。在一些实施方式中，捕获探针是核酸或多肽。在一些实施方式中，捕获探针包括条码(例如，空间条码和/或独特分子标识符(UMI))和捕获域。在一些实施方式中，捕获探针可包括裂解域和/或功能域(例如，引物结合位点，例如用于下一代测序(NGS))。参见例如WO2020/176788的第(II)(b)部分(例如，第(i)-(vi)小节)和/或美国专利申请公开号2020/0277663。捕获探针的产生可以通过任何合适的方法来实现，包括在WO2020/176788的第(II)(d)(ii)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中描述的那些。
在一些实施方式中，可采用任何合适的多重化技术(例如，描述于WO 2020/176788的第(IV)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663)来检测(例如同时或依次检测)来自生物样品的多于一种分析物类型(例如，核酸和蛋白质)
在一些实施方式中，可以使用一种或多种分析物捕获剂进行一种或多种分析物(例如，蛋白质分析物)的检测。如本文所用，“分析物捕获剂”是指某一物质，其与分析物(例如，生物样品中的分析物)以及与捕获探针(例如，连接至基材或特征的捕获探针)相互作用以鉴别分析物。在一些实施方式中，分析物捕获剂包括：(i)分析物结合部分(例如，其能结合至分析物)，例如抗体或其抗原结合片段；(ii)分析物结合部分条码；和(iii)分析物捕获序列。如本文所用，术语“分析物结合部分条码”是指与分析物结合部分相关联或以其它方式鉴别分析物结合部分的条码。如本文所用，术语“分析物捕获序列”是指被配置为杂交到捕获探针的捕获域、结合到捕获探针的捕获域、耦合到捕获探针的捕获域或以其它方式与捕获探针的捕获域相互作用的区域或部分。在一些情况中，分析物结合部分条码(或其部分)可能能够从分析物捕获剂去除(例如，裂解)。分析物捕获剂的其它描述可见于WO2020/176788的第(II)(b)(ix)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(b)(viii)部分。
存在将空间条码与一个或多个相邻细胞相关联的至少两种方法，从而使得空间条码将一个或多个细胞和/或一个或多个细胞的内容标识为与特定空间位置相关联。一种方法是促进分析物或分析物代用物(proxy)(例如，中间物)移出细胞并朝向空间条码化阵列(例如，包括空间条码化捕获探针)。另一种方法是从阵列裂解空间条码化捕获探针，并促进空间条码化捕获探针朝向生物样品和/或至生物样品中或至生物样品上。
在一些情况下，捕获探针可以用于从模板(例如，DNA或RNA模板，例如分析物或中间物(例如，连接产物或分析物捕获剂)，或其一部分)，或其衍生物，引发、复制并由此产生任选条码化的延伸产物(参见，例如，WO2020/176788的第(II)(b)(vii)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663，关于延伸的捕获探针)。在一些情况下，捕获探针可以用于与模板(例如，DNA或RNA模板，例如分析物或中间物，或其部分)形成连接产物，由此产生用作模板代用物的连接产物。
如本文所用，“延伸的捕获探针”是指具有添加到捕获探针末端(例如，3'或5'端)的附加核苷酸从而延伸捕获探针总长度的捕获探针。例如，“延伸的3'端”表示附加的核苷酸被添加到捕获探针的最3'核苷酸以延伸的捕获探针的长度，例如，通过用于延伸的核酸分子的聚合反应，包括通过聚合酶(例如，DNA聚合酶或逆转录酶)催化的模板化聚合。在一些实施方式中，延伸捕获探针包括向捕获探针的3'末端添加与特异性结合捕获探针的捕获域的分析物或中间物的核酸序列互补的核酸序列。在一些实施方式中，捕获探针使用逆转录延伸。在一些实施方式中，捕获探针使用一种或多种DNA聚合酶延伸。延伸的捕获探针包括捕获探针的序列和捕获探针的空间条码序列。
在一些实施方式中，延伸的捕获探针被扩增(例如，在本体溶液中或在阵列上)以产生足以用于下游分析(例如通过DNA测序)的量。在一些实施方式中，延伸的捕获探针(例如，DNA分子)充当扩增反应(例如，聚合酶链反应)的模板。
在WO2020/176788的第(II)(a)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中描述了空间分析方法的其它变化形式，在一些实施方式中包括成像步骤。捕获的分析物(和/或中间物或其部分)的分析，例如，包括样品移出、捕获探针的延伸、测序(例如，裂解的延伸的捕获探针和/或与延伸的捕获探针互补的cDNA分子的测序)、阵列上测序(例如，使用例如原位杂交或原位连接方法)、时域分析和/或邻近捕获，描述于WO2020/176788的第(II)(g)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663。一些质量控制措施也描述于WO2020/176788的第(II)(h)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。
空间信息可以提供具有生物学和/或医学重要性的信息。例如，本文描述的方法和组合物可以允许：鉴定疾病或病症的一种或多种生物标志物(例如，诊断、预后和/或用于确定治疗功效)；确定用于治疗疾病或病症的候选药物目标；将对象鉴定(例如，诊断)为患有疾病或病症；鉴定对象的疾病或病症的阶段和/或预后；将对象鉴定为具有增加的发展疾病或病症的可能性；监测对象的疾病或病症的进展；确定治疗对象的疾病或病症的功效；确定治疗对疾病或病症有效的患者亚群；对患有疾病或病症的对象的治疗的修改；选择参加临床试验的对象；和/或为患有疾病或病症的对象选择治疗。用于识别生物学和/或医学重要性的空间信息的示例性方法可以在美国专利申请公开号2021/0140982A1,美国专利申请号2021/0198741A1，和/或美国专利申请号2021/0199660找到。
空间信息可以提供具有生物学重要性的信息。例如，本文描述的方法和组合物可以允许：鉴定转录组和/或蛋白质组表达谱(例如，在健康和/或患病组织中)；近距离鉴别多种分析物类型(例如，最近邻分析)；确定患病组织中上调和/或下调的基因和/或蛋白质；肿瘤微环境的表征；肿瘤免疫反应的表征；细胞类型的表征及其在组织中的共定位；组织内遗传变异的鉴定(例如，基于与特定疾病或障碍生物标志物相关联的基因和/或蛋白质表达谱)。
通常，对于基于空间阵列的方法，基材起到支持捕获探针直接或间接附接到阵列特征的作用。“特征”是一个实体，作为空间分析中使用的各种分子实体的支持或存储库。在一些实施方式中，阵列中的一些或全部特征被功能化以用于分析物捕获。示例性基材描述于WO2020/176788的第(II)(c)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。阵列的示例性特征和几何属性可以在WO2020/176788的第(II)(d)(i)、(II)(d)(iii)和(II)(d)(iv)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中找到。
通常，当将生物样品与包括捕获探针的基材(例如，具有嵌入、点样、印刷、制造在基材上的捕获探针的基材，或具有包括捕获探针的特征(例如，珠、孔)的基材)接触时，分析物和/或中间物(或其部分)可被捕获。如本文所用，使生物样品“接触”基材指任何接触(例如，直接或间接)，使得捕获探针可以与来自生物样品的分析物相互作用(例如，共价或非共价结合(例如，杂交))。捕获可以主动(例如，使用电泳)或被动(例如，使用扩散)实现。分析物捕获进一步描述于WO2020/176788的第(II)(e)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。
在一些情况中，可以通过将具有条码(例如空间条码)的分子(例如肽、脂质或核酸分子)附连和/或引至生物样品(例如，引至生物样品中的细胞)来进行空间分析。在一些实施方式中，将具有多个条码(例如，多个空间条码)的多个分子(例如，多个核酸分子)引入生物样品(例如，生物样品中的多个细胞))用于空间分析。在一些实施方式中，在将具有条码的分子附连和/或引至生物样品之后，可以将生物样品物理分离(例如，解离)成单细胞或细胞群以进行分析。一些这样的空间分析方法描述于WO2020/176788的第(III)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。
在一些情况中，空间分析可以通过检测与分析物杂交的多个寡核苷酸来进行。在一些情况中，例如，可以使用RNA模板连接(RTL)进行空间分析。RTL的方法之前已经描述过。参见例如Credle等,Nucleic Acids Res.2017年8月21日；45(14):e128。通常，RTL包括两个寡核苷酸与分析物(例如，RNA分子，例如mRNA分子)上的相邻序列的杂交。在一些情况中，寡核苷酸是DNA分子。在一些情况中，寡核苷酸之一在3'末端包括至少两个核糖核酸碱基和/或另一寡核苷酸在5'末端包括磷酸化核苷酸。在一些情况中，两个寡核苷酸之一包括捕获域(例如，聚(A)序列、非均聚序列)。在与分析物杂交后，连接酶(例如，SplintR连接酶)将两个寡核苷酸连接在一起，产生连接产物。在一些情况中，两个寡核苷酸与彼此不相邻的序列杂交。例如，两个寡核苷酸的杂交在杂交的寡核苷酸之间产生间隙。在一些情况中，聚合酶(例如，DNA聚合酶)可以在连接之前延伸寡核苷酸之一。连接后，连接产物从分析物释放出来。在一些情况下，利用核酸内切酶(例如，RNA酶H)释放连接产物。释放的连接产物然后可以被阵列上的捕获探针(例如，代替分析物的直接捕获)捕获，任选地被扩增和测序，从而确定生物样品中分析物的位置和任选地丰度。
在空间信息分析期间，获得与分析物相关联的空间条码的序列信息，并且该序列信息可用于提供关于分析物在生物样品中的空间分布的信息。可以使用各种方法来获得空间信息。在一些实施方式中，特定捕获探针和它们捕获的分析物与基材上特征阵列中的特定位置相关联。例如，特定空间条码可以在阵列制造之前与特定阵列位置相关联，并且空间条码的序列可以与特定阵列位置信息一起存储(例如，在数据库中)，从而使得每个空间条码唯一地映射到特定的阵列位置。
或者，特定空间条码可以在制造期间沉积在特征阵列中的预定位置，从而使得在每个位置，仅存在一种类型的空间条码，由此空间条码与阵列的单个特征独特地相关联。必要时，可以使用本文所述的任何方法对阵列进行解码，以便空间条码与阵列特征位置独特地相关联，并且可以如上所述存储该映射。
当在空间信息分析期间获得捕获探针和/或分析物的序列信息时，可以通过参考存储的将每个空间条码与阵列特征位置独特关联的信息来确定捕获探针和/或分析物的位置。以此方式，特定捕获探针和捕获分析物与特征阵列中的特定位置相关联。各阵列特征位置表示相对于阵列的坐标参考点(例如，阵列位置、基准标志物)的位置。因此，各特征位置在阵列的坐标空间中具有“地址”或位置。
一些示例性空间分析工作流程描述于WO2020/176788的示例性实施方式部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。参见例如WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的以“在本文描述的工作流程的一些非限制性示例中，可以将样品浸入……”开头的示例性实施方式。2020/0277663.还参见，例如，Visium空间基因表达试剂盒用户指南(Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits User Guide)(例如，Rev C，日期2020年6月)，和/或Visium空间组织优化试剂盒用户指南(Visium Spatial TissueOptimization Reagent Kits User Guide)(例如，Rev C，日期2020年7月)。
在一些实施方式中，可以使用专用硬件和/或软件来进行空间分析，例如WO2020/176788的第(II)(e)(ii)和/或(V)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中描述的任何***，或在WO2020/123320的用于成像的控制载玻片、使用控制载玻片和基材的方法、使用用于成像的控制载玻片和基材的***和/或样品和阵列对齐装置和方法、信息标签中描述的任何一种或多种装置或方法。
用于进行空间分析的合适***可以包括部件，例如用于容纳生物样品的室(例如，流动池或可密封的流体密封室)。生物样品可以被固定在例如生物样品容器中。一个或多个流体室可以通过流体导管连接到室和/或样品容器，并且可以通过流体泵、真空源或连接到流体导管的其它装置(产生压强梯度以驱动流体流)将流体递送到室和/或样品容器中。一个或多个阀也可以连接到流体导管以调节试剂从储器到室和/或样品容器的流动。
***可以任选地包括控制单元，该控制单元包括一个或多个电子处理器、输入接口、输出接口(例如显示器)和存储单元(例如固态存储介质，例如但不限于，磁性、光学或其它固态、持久性、可写和/或可重写存储介质)。控制单元可以任选地通过网络连接到一个或多个远程设备。控制单元(及其组件)通常可以进行本文描述的任何步骤和功能。在***连接到远程设备的情况下，远程设备(或多个设备)可以进行本文描述的任何步骤或特征。该***可以任选地包括用于捕获图像的一个或多个检测器(例如，CCD、CMOS)。***还可以任选地包括用于照射样品的一个或多个光源(例如，基于LED、基于二极管、激光器)、具有特征的基材、来自捕获在基材上的生物样品的分析物以及各种控制和校准介质。
***可以可选地包括在一种或多种有形存储介质和硬件组件(例如专用集成电路)中编码和/或实现的软件指令。软件指令在由控制单元(尤其是电子处理器)或集成电路执行时，可以使控制单元、集成电路或其它执行软件指令的组件执行本文所述的任何方法步骤或功能。
在一些情况中，本文描述的***可以检测(例如配准图像)阵列上的生物样品。示例性方法以检测阵列上生物样品的方法描述于WO 2021/102003和/或美国专利申请序列号16/951,854中，其每一个都通过引用全文纳入本文。
在将分析物从生物样品转移到基材上的特征阵列之前，可以将生物样品与阵列对齐。生物样品和包括捕获探针的特征阵列的对齐可以促进空间分析，这可以用于检测生物样品中不同位置内分析物存在和/或水平的差异，例如，生成分析物的存在和/或水平的三维图。用于生成分析物存在和/或水平的二维和/或三维图的示例性方法描述于PCT申请号2020/053655中，空间分析方法一般描述于WO 2021/102039和/或美国专利申请序列号16/951,864中，其每一个都通过引用全文纳入本文。
在一些情况中，可以使用一个或多个基准标志物将分析物存在和/或水平的图与生物样品的图像对齐，例如，放置在成像***视野中的物体出现在产生的图像中，如WO2020/123320,、WO 2021/102005的基材属性部分、用于成像的控制载玻片部分和/或美国专利申请序列号16/951,843中所述，其每一个都通过引用全文纳入本文。基准标志物可被用作对准的参考点或测量标度(例如，以对准样品和阵列、以对准两个基材、以确定基材上样品或阵列相对于基准标志物的位置)和/或用于尺寸和/或距离的定量测量。
基于阵列的空间分析方法涉及将一种或多种分析物从生物样品转移到基材上的特征阵列，其中各特征与阵列上的独特空间位置相关联。转移分析物的后续分析包括确定分析物的相同性以及生物样品中每种分析物的空间位置。每种分析物在生物样品中的空间位置是基于阵列中每个分析物所结合的特征以及特征在阵列上的相对空间位置来确定的。
存在至少两种将空间条码与一个或多个相邻细胞相关联的一般方法，使得空间条码将一个或多个细胞和/或一个或多个细胞的内容标识为与特定空间位置相关联。一种一般方法是促进分析物出细胞并朝向空间条码化阵列。图1描绘了该一般方法的示例性实施方式。在图1中，使聚集有捕获探针(如本文进一步描述)的空间条码化阵列与生物样品101接触，并且生物样品被透化，使分析物从样品迁移到阵列。分析物与空间条码化阵列102上的捕获探针相互作用。一旦分析物杂交/结合到捕获探针，则任选地从阵列移出样品并且分析捕获探针以获得空间解析的分析物信息103。
另一种一般方法是从阵列裂解空间条码化捕获探针，并促进空间条码化捕获探针朝向生物样品和/或至生物样品中或至生物样品上。图2描绘了该一般方法的示例性实施方式，可以使聚集有捕获探针(如本文进一步描述的)的空间条码化阵列与样品201接触。空间条码化捕获探针被裂解，然后与所提供生物样品202内的细胞相互作用。这种相互作用可以是共价或非共价的细胞表面相互作用。该相互作用可以是由递送***或细胞穿透肽促进的细胞内相互作用。一旦空间条码化捕获探针与特定细胞相关联，就可以任选地移出样品以进行分析。样品在分析前可以选择性地分离。一旦标记的细胞与空间条码化捕获探针相关联，就可以分析捕获探针以获得关于标记的细胞203的空间解析信息。“捕获探针”是指能够捕获(直接或间接)和/或标记生物样品中的分析物(例如，感兴趣的分析物)的任何分子。在一些实施方式中，捕获探针是核酸或多肽。在一些实施方式中，捕获探针是偶联物(例如，寡核苷酸-抗体偶联物)。在一些实施方式中，捕获探针包括条码(例如，空间条码和/或独特分子标识符(UMI))和捕获域。
图3是示出如本文所述的捕获探针的示例的示意图。如图所示，捕获探针302任选地通过例如二硫键接头的裂解域303耦合到特征301。捕获探针可包括对后续处理有用的功能性序列，例如功能性序列304，其可包括测序仪特异性流动池附接序列，例如P5或P7序列，以及功能性序列306，其可包括测序引物序列，例如R1引物结合位点、R2引物结合位点。在一些实施方式中，序列304是P7序列，序列306是R2引物结合位点。空间条码305可包括在捕获探针内以用于对目标分析物条码化。通常可选择功能性序列以与各种不同测序***中的任何一种兼容，例如离子激流质子(Ion Torrent Proton)或PGM、Illumina测序仪、PacBio、牛津纳米孔(Oxford Nanopore)等及其要求。在一些实施方式中，可选择功能性序列以与非商业化测序***兼容。可使用适当功能性序列的此类测序***和技术的示例包括(但不限于)离子激流质子或PGM测序、Illumina测序、PacBio SMRT测序和牛津纳米孔测序。此外，在一些实施方式中，可以选择功能性序列以与其它测序***(包括非商业化测序***)兼容。
在一些实施方式中，空间条码305、功能性序列304(例如，流动池附接序列)和306(例如，测序引物序列)可以是附接到给定特征的所有探针所共用的。空间条码还可包括捕获域307以促进目标分析物的捕获。
每个捕获探针可任选地包括至少一个裂解域。裂解域表示用于将探针可逆地附接到阵列特征的探针部分，如本文所述。此外，捕获探针的一个或多个区段或区域可任选地通过裂解域的裂解而从阵列特征中释放。例如，空间条码和/或通用分子标识符(UMI)可以通过裂解域的裂解来释放。
图4是说明可裂解捕获探针的示意图，其中裂解的捕获探针可进入非透化细胞并结合到样品内的分析物。捕获探针401包含裂解域402、细胞穿透肽403、报告分子404和二硫键(-S-S-)。405表示捕获探针的所有其他部分，例如，空间条码和捕获域。
对于附接到共同阵列特征的多个捕获探针，多个捕获探针的一个或多个空间条码序列可以包括对于耦合到特征的所有捕获探针相同的序列和/或在耦合到特征的所有捕获探针之间不同的序列。
图5是示例性多重空间条码化特征的示意图。在图5中，特征501可耦合到空间条码化捕获探针，其中特定特征的空间条码化探针可具有相同的空间条码，但具有设计成将特征的空间条码与多个目标分析物相关联的不同捕获域。例如，特征可以耦合到四种不同类型的空间条码化捕获探针，每种类型的空间条码化捕获探针具有空间条码502。与该特征相关联的一种类型捕获探针包括空间条码502与聚(T)捕获域503的组合，其设计用于捕获mRNA目标分析物。与该特征相关联的第二类型捕获探针包括空间条码502与用于gDNA分析的随机N-聚体捕获域504的组合。与该特征相关联的第三类型捕获探针包括与感兴趣的分析物捕获剂505互补的捕获域和空间条码502的组合。与该特征相关联的第四类型捕获探针包括空间条码502与捕获探针的组合，该捕获探针可特异性结合可在CRISPR分析(例如CRISPR/Cas9)中起作用的核酸分子506。虽然图5中仅示出了四种不同的捕获探针条码化构建体，但是捕获探针条码化构建体可被定制用于与核酸相关的任何给定分析物的分析，并且能够与这种构建体结合。例如，图5中所示的方案也可用于本文中所公开的其它分析物的同时分析，包括但不限于：(a)mRNA，谱系追踪构建体，细胞表面或细胞内蛋白质和代谢物，以及gDNA；(b)mRNA，可获得的染色质(例如，ATAC-seq，DNA酶-seq，和/或MNA酶-seq)细胞表面或细胞内蛋白质和代谢物，以及扰动剂(例如，CRISPR-crRNA/sgRNA、TALEN、锌指核酸酶和/或如本文所述的反义寡核苷酸)；(c)mRNA、细胞表面或细胞内蛋白质和/或代谢物，条码化标记剂(例如，本文所述的MHC多聚体)和免疫细胞受体(例如，T细胞受体)的V(D)J序列。在一些实施方式中，扰动剂可以是小分子、抗体、药物、适配体、miRNA、物理环境(例如，温度变化)，或任何其它已知扰动剂。
本文所描述的任何方法的一些实施方式可包括将生物样品分离成单细胞、细胞群、细胞类型或一个或多个感兴趣区域。例如，在与一个或多个捕获探针接触之前，可将生物样品分离成单细胞、细胞群、细胞类型或一个或多个感兴趣的区域。在其它示例中，首先将生物样品与一个或多个捕获探针接触，然后将其分离成单细胞、细胞群、细胞类型或一个或多个感兴趣的区域。
在一些实施方式中，可以使用像素化将生物样品分离成块(chucks)。像素化可包括步骤：提供生物样品，并冲压出生物样品的一个或多个部分。然后可以使用生物样品的冲压出的部分来进行本文所述的任何方法。在一些实施方式中，生物样品的冲压出的部分可以是随机图案或设计图案。在一些实施方式中，生物样品的冲压出的部分可以集中在生物样品中的感兴趣区域或亚细胞结构上。
图6A是说明用于“像素化”样品的示范性、非限制性、非穷尽性步骤的工作流程示意图，其中样品通过空心针或微针切割、压印、显微解剖或转移，将样品的一小部分移动到个体分区或孔中。
图6B是描绘多针像素化的示意图，其中针阵列穿过支架上的样品并穿入含有珠(例如，凝胶珠)和试剂的纳米孔中。一旦针进入纳米孔，细胞就会弹出。
I.生物样品中分析物的位置的鉴定
空间上确定生物样品(例如细胞或组织)中目标分析物中的位置的能力是科学研究细胞工具箱中的一个强大工具。由于目标分析物在细胞或组织内和周围扩散而导致的空间信息丢失可导致灵敏度损失和空间分辨率降低，例如，当试图捕获与它们在细胞或组织内天然存在的位置相对应的分析物时。本公开内容为扩散或其他机制导致的问题提供了解决方案，该机制可能会将目标分析物置换到细胞或组织内与其天然环境相对应的范围之外。通过为细胞或组织亚群(例如，两个或多个细胞)提供微环境，可以减轻或消除目标分析物在捕获前的扩散或分散，从而提高灵敏度和空间分辨率。
(a)用于鉴定生物样品中分析物位置的方法
本文公开了使用包含多个孔和固定在孔内的空间条码化阵列的基材来确定分析物在生物样品(例如，本文所述的任何示例性生物样品)中的位置的方法，其包括：(a)将生物样品的部分置于多个孔中，其中多个孔中的孔包括包含多个捕获探针的表面，其中多个捕获探针中的一个包含空间条码和捕获域；(b)从生物样品中释放分析物，其中分析物特异性结合捕获探针的捕获域；以及(c)确定(i)对应于分析物或其互补物的序列，以及(ii)对应于空间条码或其互补物的序列，并使用(i)和(ii)的序列以确定分析物在生物样品中的位置。该方法是特别有利的，因为将生物样品的部分置于多个孔中的孔中允许孔中生物样品的部分在孔中裂解，并分析来自孔内的细胞的分析物。例如，生物样品(例如，一个细胞、两个细胞、三个细胞等)的部分的裂解可以发生在多个孔的一个孔内。方法还减少了进行本文所述方法所需的试剂体积。方法还提供分析期间分析物扩散的减少。本文提供的方法还包括使用在孔的侧面具有捕获探针的孔，其可以提供来自孔中生物样品的部分的分析物的三维分析。
在一些实施方式中，基材可以包括多个孔。在一些实施方式中，多个孔限制于基材的面积。在一些实施方式中，包括多个孔的基材的面积可以是约6.5mm×约6.5mm(例如，约6.1mm×约6.5mm、约6.2mm×约6.5mm、约6.3mm×约6.5mm、约6.4mm×约6.5mm、约6.6mm×约6.5mm、约6.7mm×约6.5mm、约6.8mm×约6.5mm、约6.9mm×约6.5mm、约6.5mm×约6.1mm、约6.5mm×约6.2mm、约6.5mm×约6.3mm、约6.5mm×约6.5mm、约6.5mm×约6.6mm、约6.5mm×约6.7mm、约6.5mm×约6.8mm、或约6.5mm×约6.9mm)。
在一些实施方式中，包括多个孔的基材的面积可以是约11mm×约11mm(例如，约11.1mm×约11mm、约11.2mm×约11mm、约11.3mm×约11mm、约11.4mm×约6mm、约11.6mm×约11mm、约11.7mm×约11mm、约11.8mm×约11mm、约11.9mm×约11mm、约11mm×约11.1mm、约11mm×约11.2mm、约11mm×约11.3mm、约11mm×约11.4mm、约11mm×约11.6mm、约11mm×约11.7mm、约11mm×约11.8mm、或约11mm×约11.9mm)。
在一些实施方式中，基材的面积可以包括约100万至约500万个孔(例如，约140万至约500万、约180万至约500万、约220万至约500万、约260万至约500万、约300万至约500万、约340万至约500万、约380万至约500万、约420万至约500万、约460万至约500万、约100万至约460万、约100万至约420万、约100万至约380万、约100万至约340万、约100万至约300万、约100万至约260万、约100万至约220万、约100万至约180万、或约100万至约140万)。
在一些实施方式中，多个孔可以用规则方式排列在基材上在一些实施方式中，多个孔可以用不规则方式排列在基材上
在一些实施方式中，多个孔的每个孔的开口可以具有几何形状。例如，孔的开口可以具有圆形、三角形、方形、五边形、六边形、七边形或八边形的形状。在一些实施方式中，孔的开口可以具有多个侧面。例如，多个孔的每个孔的开口可以具有3至10个侧面(例如，4至10个，5至10个，6至10个，7至10个，8至10个，9至10个，3至9个，3至8个，3至7个，3至6个，3至5个，或3至4个侧面)。在一些实施方式中，对于多个孔中的所有孔，多个孔中每个孔的开口可以是基本相同的。在一些实施方式中，对于多个孔中的所有孔，多个孔中每个孔的开口可以是基本不同的。
在一些实施方式中，多个孔的每个孔的开口可以具有约3μm至约7μm(例如，约3.4μm和约7μm之间、约3.8μm和约7μm之间、约4.2μm和约7μm之间、约4.6μm和约7μm之间、约5μm之间约7μm、约5.4μm至约7μm、约5.8μm至约7μm、约6.2μm至约7μm、约6.6μm至约7μm、约3μm至约6.6μm，约3μm至约6.2μm之间，约3μm至约5.8μm之间，约3μm至约5.4μm之间，约3μm至约5μm之间，约3μm至约4.6μm之间、约3μm至约4.2μm之间、约3μm至约3.8μm之间，或者约3μm至约3.4μm之间)之间的直径。
在一些实施方式中，多个孔的每个孔的开口可以具有在约15μm2至约27μm2(例如约17μm2至约27μm2、约18μm2至约27μm2、约19μm2至约27μm2、约20μm2至约27μm2、约21μm2至约27μm2，约22μm2至约27μm2，约23μm2至约27μm2，约24μm2至约27μm2，约25μm2至约27μm2，约26μm2至约27μm2，约15μm2至约26μm2，约15μm2至约25μm2，约15μm2至约24μm2，约15μm2至约23μm2，约15μm2至约22μm2，约15μm2至约21μm2，约15μm2至约20μm2，约15μm2至约15μm2至约19μm2、约15μm2至约18μm2、约15μm2至约17μm2、或约15μm2至约16μm2)范围之间的面积。
在一些实施方式中，多个孔的每个孔的底部可以具有在约15μm2至约27μm2(例如约17μm2至约27μm2、约18μm2至约27μm2、约19μm2至约27μm2、约20μm2至约27μm2、约21μm2至约27μm2，约22μm2至约27μm2，约23μm2至约27μm2，约24μm2至约27μm2，约25μm2至约27μm2，约26μm2至约27μm2，约15μm2至约26μm2，约15μm2至约25μm2，约15μm2至约24μm2，约15μm2至约23μm2，约15μm2至约22μm2，约15μm2至约21μm2，约15μm2至约20μm2，约15μm2至约15μm2至约19μm2、约15μm2至约18μm2、约15μm2至约17μm2、或约15μm2至约16μm2)范围之间的表面积。
在一些实施方式中，多个孔的一个孔的孔隙的边缘可以与相邻孔的孔隙的边缘分开约1μm至约3μm(例如，约1.2μm至约3μm，约1.4μm至约3μm、约1.6μm至约3μm、约1.8μm至约3μm、约2μm至约3μm、约2.2μm至约3μm、约2.4μm至约3μm、约2.6μm至约3μm，约2.8μm至约3μm，约1μm至约2.8μm，约1μm至约2.6μm，约1μm至约2.4μm，约1μm至约2.2μm，约1μm至约2μm、约1μm至约1.8μm、约1μm至约1.6μm、约1μm至约1.4μm或约1μm至约1.2μm)。
在一些实施方式中，多个孔中的每个孔可以由约7.0μm至约25μm(例如，约7.0μm至约20μm、约7.0μm至约15μm、约7.0μm至约12μm，约7.0μm至约10μm，约7.0μm至约8.5μm，约8.5μm至约25μm，约8.5μm至约20μm，约8.5μm至约15μm，约8.5μm至约12μm、约8.5μm至约10μm、约10μm至约25μm、约10μm至约15μm或约15μm至约20μm)的几何中心到中心距离分开。
在一些实施方式中，多个孔的每个孔的深度可以在约10μm至约35μm(例如，约10μm至约32.5μm，约10μm至约30μm、约10μm至约27.5μm、约10μm至约25μm、约10μm至约22.5μm、约10μm至约20μm、约10μm至约17.5μm、约10μm至约15μm，约10μm至约12.5μm，约12.5μm至约35μm，约15μm至约35μm，约17.5μm至约35μm，约20μm至约35μm，约22.5μm至约35μm、约25μm至约35μm、约27.5μm至约35μm、约30μm至约35μm或约32.5μm至约35μm)之间。
在一些实施方式中，多个孔的每个孔可以具有平底。在一些实施方式中，多个孔的每个孔可以具有圆(例如，半球)底。在一些实施方式中，孔的圆底可以具有凹或凸形。
在一些实施方式中，孔包含多个捕获探针。在一些实施方式中，捕获探针可以包括空间条码。在一些实施方式中，捕获探针可以包括捕获域(例如，本文所述任何示例性捕获域)。在一些实施方式中，捕获探针可以包括切割位点。在一些实施方式中，捕获探针可以连接于孔的表面或置于孔中的珠。在一些实施方式中，捕获域可以包括功能化序列。在一些实施方式中，功能化序列可以是独特分子标识(UMI)序列。在一些实施方式中，UMI可以位于相对于捕获域的5’端。
在一些实施方式中，捕获域可以是任何能够捕获目标分析物的试剂。在一些实施方式中，捕获域可以位于捕获探针的3’末端。在一些实施方式中，捕获域可以是同源多核苷酸序列，例如聚(dT)序列、聚(dA)序列、聚(dG)序列或聚(dC)序列在一些实施方式中，捕获域可以是基因特异性序列(例如，与特异性目标分析物互补的序列)
在一些实施方式中，多个捕获探针可以固定在多个珠上(例如，本文所述任何示例性珠)。在一些实施方式中，多个珠可以是多个水凝胶珠。在一些实施方式中，水凝胶珠可以由天然材料、合成材料或其组合制成。在一些实施方式中，水凝胶珠可以是可溶性水凝胶珠(例如，条件溶解的聚合物，例如DTT敏感水凝胶)。
通常，每个孔可以包含至少一个珠。在一些实施方式中，每个孔可以包含一个或多于一个珠(例如两个珠、三个珠、或四个珠)。在一些实施方式中，珠可以具有在约3μm至约6μm之间(例如，约3.5μm至约6μm、约4μm至约6μm、约4.5μm至约6μm、约5μm至约6μm、约5.5μm至约6μm、约3μm至约5.5μm、约3μm至约5μm、约3μm至约4.5μm、约3μm至约4μm、或约3μm至约3.5μm)的直径。
在一些实施方式中，多个捕获探针可以固定于每个孔的一个或更多表面。例如，多个捕获探针可以固定于每个孔的底部表面。在一些示例中，多个捕获探针可以固定于每个孔的一个或更多侧表面。在一些实施方式中，多个捕获探针可以固定于至少一个表面(例如，两个表面，三个表面，四个表面，五个表面，六个表面，七个表面，八个表面，九个表面，或十个表面)。在一些实施方式中，多个捕获探针可以固定于孔的底部和一个或更多侧面。
在一些实施方式中，多个捕获探针可以通过刻印法固定于每个孔的一个或更多表面。在一些实施方式中，多个捕获探针可以通过光刻法固定于每个孔的一个或更多表面。在一些实施方式中，可通过共价结合将接头固定到每个孔的一个或多个表面以开始光刻法。
在一些实施方式中，捕获探针可以通过光刻法构建到接头上。在一些实施方式中，接头可以被光不稳定的保护基团保护。在一些实施方式中，保护基团可以包括硝基苄基保护基团。在一些实施方式中，保护基团可以包括苄基保护基团。在一些实施方式中，保护基团可以包括羰基保护基团。
在一些实施方式中，核苷酸光刻可以包括将孔阵列暴露于光。在一些实施方式中，光可以是紫外(UV)光。例如，光的波长可以在约10nm和约400nm(例如，约50nm至约400nm、约100nm至约400nm、约150nm至约400nm、约200nm至约400nm、约250nm至约400nm，约300nm至约400nm，约350nm至约400nm，约10nm至约350nm，约10nm至约300nm，约10nm至约250nm，约10nm至约200nm，约10nm至约150nm、约10nm至约100nm、约10nm至约50nm、约100nm至约300nm、约200nm至约300nm、或约100nm至约200nm)之间。应当理解，可以基于所使用的保护基团来选择光的波长。
在一些实施方式中，核苷酸光刻可以包括通过掩膜将孔阵列暴露于光。在一些实施方式中，掩模可以保护至少一个孔免于暴露于光。例如，掩膜可以保护至少1％的孔(例如，至少5％的孔、至少10％的孔、至少20％的孔、至少40％的孔、至少60％的孔、至少80％的孔、至少90％的孔、至少95％的孔、或至少99％的孔)
在一些实施方式中，孔阵列可以多次暴露在UV光下。在一些实施方式中，孔阵列可暴露于UV光10至100次(例如，20至100次之间、30至100次之间、40至100次之间、50至100次之间、60至100次之间、70至100次之间、80至100次之间、90至100次之间、10至90次之间、10至80次之间、10至70次之间、10至60次之间、10至50次之间、10至40次、10至30次之间或10至20次)。
在一些实施方式中，多个捕获探针可以通过扩增法固定于每个孔的一个或更多表面。在一些实施方式中，多个捕获探针可以通过桥式扩增法固定于每个孔的一个或更多表面。例如，引物首先连接到多个孔的一个或多个表面。在一些实施方式中，两个引物(例如，正向引物和反向引物)首先连接到多个孔的一个或多个表面。然后扩增引物以形成局部克隆群体(图10)。
在本公开中，将生物样品置于多个孔的一个或多个孔中在一些实施方式中，对生物样品施加压力以将生物样品分配到多个孔的一个或多个孔中。例如，可以使用辊或冲压装置施加压力。在一些实施方式中，可以使用用户的手或手指施加压力。
在一些实施方式中，生物样品是组织样品。在一些实施方式中，生物样品是组织样品切片。在一些实施方式中，生物样品是新鲜组织样品。在一些实施方式中，生物样品是新鲜、冷冻的组织样品。在一些实施方式中，生物样品是固定的组织样品(例如，***固定石蜡包埋(FFPE)样品)。在一些实施方式中，生物样品是包埋于最佳切割温度(OCT)化合物中的组织样品。
方法还包括从生物样品中释放一种或多种目标分析物，其中从生物样品中释放的一种或多种目标分析物的目标分析物特异性结合或杂交孔中捕获探针的捕获域。
在一些实施方式中，裂解生物样品以释放一种或多种目标分析物。裂解溶液可包括离子表面活性剂，例如肌氨酰和十二烷基硫酸钠(SDS)。更一般而言，化学裂解剂可包括但不限于有机溶剂、螯合剂、洗涤剂(例如，离子型、阴离子型、两性离子型等)、表面活性剂和离液剂。本文描述了裂解剂的其他示例。
在一些实施方式中，目标分析物是核酸。在一些实施方式中，核酸是DNA(例如，基因组DNA或线粒体DNA)。在一些实施方案中，核酸是RNA。在一些实施方式中，RNA包括本文所述的任何RNA分子(例如，mRNA)。在一些实施方式中，目标分析物是蛋白质。在一些实施方式中，蛋白质是胞内蛋白、胞外蛋白或细胞表面蛋白。
(c)试剂盒
本文还提供了可用于进行本文描述的任何方法的试剂盒。例如，本文提供了包括本文所述任何装置的试剂盒。在一些示例中，试剂盒可进一步包括用于执行本文所述的任何方法的使用说明。在一些示例中，试剂盒可进一步包括逆转录酶、聚合酶、RNA酶、蛋白酶、DNA酶和脂肪酶中的一种或多种。在一些实施方式中，试剂盒可进一步包括本文所述的一种或多种裂解剂和/或透化剂。
在一些实施方式中，试剂盒进一步包括用于向组织施加压力以将组织细胞分散到孔中的装置。
实施例
实施例1.用于在基材上的孔中创建空间捕获探针的方法
具有阵列形式的孔的示例性基材示于图7A和7B。图7A显示了基材710的剖切侧视图，包括阵列形式700中的孔(720)。每个孔720被显示为具有宽度722和深度726，并且每个孔720通过壁724与另一个孔隔开。阵列700的每个孔720被示为具有相同的宽度722和深度726并且包括平底部分。此外，阵列700的每个孔720被等厚的壁724隔开。可以用本领域已知的任何方式将阵列700的孔720构建到基材710的表面中或构建到基材710的表面上。例如，可以使用现有的刻印技术将孔720蚀刻到基材的表面。
每个孔720显示为包含多个空间条码化捕获探针730。通常，捕获探针730包含切割域、功能序列、空间条码和捕获域。功能序列可以是本文所述的任何可选序列。空间条码可以是本文所述的任何条码序列。捕获域可以是设计用于确保捕获域与目标分析物杂交的锚定序列。每个个体孔720的捕获探针730基本上相同，并且不同孔720之间的捕获探针730各自具有独特的空间条码以帮助确定目标分析物在捕获后的空间位置。
尽管在一些实施方式中，捕获探针730可单独或与孔底部上的捕获探针组合固定至孔720的侧表面，但图7A中的捕获探针730显示为固定至孔720的底部表面。通常，捕获探针730可以固定在孔720的一个或更多(例如，两个或更多、三个或更多)表面上。
图7B显示了基材710中或基材710上的示例性孔阵列700的倾斜俯视图。阵列700显示为具有六边形开口的十八个孔720的规则阵列，例如相等壁厚724和中心到中心间距723。总之，孔阵列700可以延伸以覆盖基材710的部分。
用于分离孔阵列700中的生物样品的一部分的示例性工作流程过程如图8A-8B所示。如图8A所示，生物样品840被示为固定(例如，可逆地固定)到支持性背衬842。生物样品可以是本文所述的任何样品。支持性背衬842通常可以是能够在操作过程中支持生物样品840的刚性或柔性背衬。在一些实施方式中，背称842可以是液体可透化的。生物样品840位于孔阵列800上方，背衬842背离孔820，并且生物样品840紧邻阵列顶部。
然后将生物样品840压入孔阵列800中，如图8B所示。生物样品840通过机械压力引导生物样品840的部分进入个体孔820而被压入阵列800。在一些实施方式中，生物样品840可以由用户用手或手指施加的压力压入阵列800中。在一些实施方式中，生物样品840可以用用户操作的装置(例如，辊)压入阵列800中
施加到背衬842的压力足以使用阵列800的开口将生物样品840分成更小的样品，从而分割和分散样品840。通常，每个孔820可以包含生物样品的单个片段844并且多个孔可以各自包含生物样品的片段844。片段844可以是被压入孔820中的生物样品840的任何部分，并且可以构成例如生物样品840的细胞，或多于一个细胞。图8B描绘了包含片段844的阵列800中的每个孔820，所述片段844包括生物样品840的一到两个示例性细胞。生物样品840的片段844及其内容物基本上包含在每个孔820内并且在片段844裂解时靠近捕获探针830。在一些实施方式中，一旦样品840已在阵列800中完成分割，则可任选地移除背衬842。缓冲溶液可以与背衬842接触。缓冲液可以渗透液体可透化的背衬842并流入每个孔820，包括含有生物样品的片段844的孔820。缓冲液可以包括一种或多种能够破坏每个孔820内的片段844的细胞壁或膜的裂解剂。裂解剂可以是本文列出的任何生物活性或化学裂解剂。可以允许包含裂解剂的缓冲液接触片段844一段时间，从而裂解片段844的细胞，并从细胞内释放感兴趣的分析物。
感兴趣的分析物在每个孔820内与捕获探针830的捕获域相互作用达一个孵育期。捕获探针830通过本文描述的任何切割手段从孔820的表面切割。然后进行文库构建方案以确定结合分析物的空间位置。
可以使用多种方法将图7和图8的捕获探针固定到孔的表面。图9A至9C一般描绘了将捕获探针固定到孔表面的三种示例性方法。图9A描绘了使用核苷酸光刻在孔920的底部表面上构建的捕获探针930。简而言之，核苷酸光刻依赖于通过使用保护性光不稳定基团添加单核苷酸来构建核酸链。如本领域已知的，固体支持物上的光刻化学合成可以选择性地直接在阵列的表面上合成探针。
简而言之，孔920的一个或多个表面上的共价接头分子可以包括在暴露端的光不稳定保护基团(PPG)。PPG可以通过PPG特异性波长的光950去除。例如，基于硝基苄基的PPG可以用波长在200nm和320nm之间的光950切割。光950被导向通过光刻掩模，该掩模选择性地指定暴露哪些孔920。光950从固定到孔920表面的接头分子去除PPG，从而活化暴露的孔920内的接头分子以与溶液中的核苷酸基团结合。
将包含带有联合PPG基团的核苷酸的溶液添加到孔920中，并且暴露的接头分子可以与进入的受保护的核苷酸结合，从而将单个PPG保护的核苷酸添加到链中。未暴露于光950下的接头预计不会与进入的受保护的核苷酸结合。通过缓冲液交换去除未结合的核苷酸，并通过新一轮的光950暴露和受保护的核苷酸添加重复该过程，从而在已知和特异性序列的接头分子上构建核酸链。
图9B描述了一个过程，其中所述捕获探针930可以置于孔920内同时固定到珠960上。通常，如本文所述，捕获探针930可以通过与珠960的表面的共价连接固定到珠960的表面。例如，捕获探针930可以通过使用亲和素或链霉亲和素接头固定到珠960的表面。珠960可以由本公开的任何材料组成，但通常，可溶性水凝胶材料可以允许将固定的捕获探针930放置在特定的孔内以结合到孔920的表面。
一般而言，包含固定有捕获探针930的珠960的缓冲液流到阵列900上。珠960的直径可以是孔920深度的约50％至80％(例如，55％至80％、60％至80％、65％至80％、70％至80％、75％至80％、50％至75％、50％至70％、50％至65％、50％至60％或50％至55％)。以此方式，可以将单个珠子960沉积到孔920中。固定到珠960表面的捕获探针930包括共同的空间条码，使得每个珠960在空间上识别单个孔。可以溶解珠960并且释放捕获探针930并将其固定到孔920的表面。
作为进一步的替代方案，捕获探针930可以使用桥式扩增在阵列900的孔920内构建，如图9C所示。通常，核酸引物首先连接到孔的一个或多个表面。在一些实施方式中，可以使用两个引物(例如正向引物和反向引物)，其中所述第一引物序列可以特异性结合第一衔接子序列，并且第二引物序列可以特异性结合第二衔接子序列。桥式扩增的更多细节可以在图10A-10J中找到。
图10A描绘了与第一衔接子序列1010结合的第一引物序列1001和未结合的第二引物序列1002。通常，衔接子序列1010可以包括用于核酸扩增的附加序列。例如，图10A的衔接子序列1010包括与第一引物序列1001互补的结合序列1011、空间条码序列1012和与第二引物序列1002互补的接头序列1013。如图10B所示，然后使用逆转录将第一引物序列1001延伸成与衔接子序列1010互补的第一互补DNA(cDNA)1015链。然后从延伸的cDNA 1015变性衔接子序列1010。缓冲液流过孔的表面。延伸的cDNA 1015的接头序列1013接触第二引物序列1002并特异性结合，从而产生如图10C中的“桥式”结构。
进一步示于图10D，桥接的cDNA 1015用作聚合模板将第二引物序列1002延伸成具有第一cDNA 1015的互补序列的第二cDNA 1020。聚合后，第一cDNA 1015和第二cDNA 1020通过各自的5'末端固定到孔的表面，并通过互补碱基配对结合。第一cDNA 1015和第二cDNA1020通过本文所述的任何方式变性。
现在参考图10E，在第一cDNA 1015和第二cDNA 1020变性后，第二cDNA 1020以相反的顺序与衔接子序列1010共享相同的序列，例如，具有靠近孔表面的接头序列1013。第一cDNA 1015和第二cDNA 1020可提供新的延伸底物用于重复多轮的桥式扩增。以与上述相同的方式，第一cDNA 1015可以桥接到第二引物序列1002并且第二cDNA 1020桥接到第一引物序列1001。第一cDNA 1015和第二cDNA 1020通过聚合被复制以产生附加的第一cDNA和第二cDNA链。图10F描绘了复制的第一cDNA链1015a和1015b以及第二cDNA链1020a和1020b。
在几轮桥式扩增以获得第一cDNA 1015链的必需密度之后，可以从孔的表面去除(例如，切割)第二cDNA 1020序列。图10G描绘了剩余的第一cDNA链1015a和1015b。
如图10H所示，可以将第二衔接子序列1030添加到溶液中。第二衔接子序列1030包括与第一接头序列1013互补的第二接头序列1031、独特分子标识(UMI)1032和分析物捕获序列或结构域1033。第二衔接子序列1030结合多个第一链cDNA 1015之一的第一接头序列1013。
参考图10I，第二衔接子序列1030用作逆转录模板以延伸多个第一链cDNA 1015以形成延伸的cDNA 1035，其包括附加的序列部分，例如UMI、分析物捕获序列，其包含在第二衔接子序列1030中。
如图10J所示，第二衔接子序列1030从多个延伸的第一cDNA 1035变性并通过稀释或缓冲液交换从溶液中去除。多个延伸的第一cDNA 1035链是捕获探针，其能够结合任何目标分析物，其包含与样品裂解后的分析物捕获序列1033互补的序列。
实施例2.基于孔的空间阵列的电泳方法
在一些实施方式中，可将电场施加到孔阵列以促使目标分析物朝向微孔中的捕获探针。如图11A所示，生物样品1140被示为固定(例如，可逆地固定)到支持性背衬1142。生物样品可以是本文所述的任何样品。支持性背衬1142通常可以是能够在操作过程中支持生物样品1140的刚性或柔性背衬。在一些实施方式中，背称1142可以是液体可透化的。生物样品1140位于孔阵列1100上方，背衬1142背离孔1120，并且生物样品1140紧邻阵列顶部。
生物样品1140与孔阵列1100的上表面接触，如图11B所示。正极1150与生物样品1140的一侧接触，负极1152与孔阵列1100的一侧接触。在一些实施方式中，孔阵列1100包括与孔1120相对的导电表面以促进导电。例如，与孔1120相对的孔阵列1100表面可以涂有导电物质，例如金属或半导体。
在一些实施方式中，可以将生物样品1140切片并施加电场。图12A显示了生物样品1240被分割成多个较小的样品并分散到孔1220中。如先前参考图8B所描述的，阵列1200中的每个孔1220包含片段1244，所述片段1244包括生物样品1240的一到两个示例性细胞。生物样品1244的片段1240及其内容物基本上包含在每个孔1220内并且在片段1244裂解时靠近捕获探针1230。
正极1250与生物样品1240的一侧接触，负极1252与孔阵列1200的一侧接触。在正极1250和负极1252之间产生电场。来自生物样品1240的分析物迁移到捕获探针1230。
在一些实施方式中，取决于目标分析物的电荷，正电极1250接触孔阵列1200的一侧并且负电极1252接触生物样品1240的一侧。
在一些实施方式中，生物样品1240通过致动***定位在阵列1200附近。致动***可以促进阵列1200的孔1220附近的生物样品1240的对齐。现在参照图13A和13B，示出了具有致动器1310和载玻片托盘1312的示例性致动***1300。具有生物样品1304的基材1302放置到载玻片托盘1312中。致动***1300操作致动器1310以将生物样品1304排列在微孔阵列1320的孔附近。致动器1310操作以在竖直或水平方向上定位生物样品1304，使得生物样品1304与微孔阵列1320的孔接触。
然后采用任何将目标分析物迁移到捕获探针的方法以促进文库制备。

Claims (124)

1.一种确定生物样品中分析物位置的方法，所述方法包括：
(a)将生物样品的部分设置于基材的多个孔中，其中所述多个孔中的孔包括包含多个捕获探针的表面，其中所述多个捕获探针中的捕获探针包含空间条码和捕获域；
(b)从生物样品释放分析物，其中所述分析物与捕获探针的捕获域杂交；和
(c)确定(i)对应于分析物或其互补物的序列，和(ii)对应于空间条码或其互补物的序列，并使用(i)和(ii)的序列以确定生物样品中分析物的位置。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述基材包含约100万个孔至约500万个孔。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中多个孔的每个孔是平底孔或圆底孔。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述多个孔中的每个孔包含六边形、七边形、八边形、五边形、方形或圆形的周界。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述多个孔的每个孔具有基本相同的周长。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述多个孔的每个孔不具有基本相同的周长。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述多个孔的每个孔包含开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约3μm至约7μm的平均直径。
8.根据权利要求7所述的方法，所述开口和/或底部表面具有约4μm至约6μm的平均直径。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述多个孔的每个孔包含开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约12μm2至约30μm2的面积。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述多个孔的每个孔包含开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约15μm2至约27μm2的面积。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述多个孔的每个孔包含开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约18μm2至约24μm2的面积。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述多个孔的每个孔具有约10μm至约35μm的深度。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述多个孔的每个孔具有约15μm至约30μm的深度。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述多个孔的每个孔具有约20μm至约25μm的深度。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述多个孔具有约7.0μm至约20μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述多个孔具有约7.0μm至约10μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述多个孔具有约7.0μm至约8.5μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述多个捕获探针设置于孔的底部表面。
19.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述多个捕获探针设置于孔的一个或多个侧表面。
20.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述多个捕获探针设置于孔的底部表面和孔的一个或多个侧表面。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的设置是使用辊装置或冲压装置施加的压力进行的。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前使用寡核苷酸光刻将所述多个捕获探针连接到孔的表面。
23.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前使用桥式扩增将所述多个捕获探针连接到孔的表面。
24.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前通过将多个可溶性水凝胶珠设置于孔中以将多个捕获探针设置于孔中，其中多个可溶性水凝胶珠包含多个捕获探针。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的释放包括裂解生物样品的部分。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述方法进一步包括，在步骤(c)之前向所述多个孔的每个孔加入一种或多种裂解剂。
27.根据权利要求25所述的方法，其中在步骤(a)中，所述多个孔的每个孔包含一种或多种裂解剂。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括，在步骤(b)之前，对生物样品进行固定、染色和/或成像的一种或多种。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述生物样品在步骤(b)之前被设置于透明基材上。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述生物样品是组织样品。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述组织样品是新鲜、冷冻的组织样品。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述组织样品是固定的组织样品。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述组织样品是***固定石蜡包埋(FFPE)组织样品。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，进一步包括(d)使用特异性结合到捕获域的分析物作为模板延伸捕获探针的末端。
35.根据权利要求34所述的方法，其中步骤(d)进一步包括对(i)对应于分析物或其互补物的序列，和(ii)对应于空间条码或其互补物的序列进行测序。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述测序是高通量测序。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述分析物是RNA。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述RNA是mRNA。
39.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述分析物是DNA。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述DNA是基因组DNA。
41.一种确定生物样品中分析物位置的方法，所述方法包括：
(a)提供包括多个孔的基材，其中所述多个孔中的孔包含：
(i)包含多个捕获探针的表面，其中所述多个捕获探针中的捕获探针包含空间条码和捕获域；和
(ii)多个分析物捕获剂，其中所述多个分析物捕获剂的分析物包含分析物结合部分、分析物结合部分条码和分析物捕获序列；
(b)将生物样品设置于所述多个孔中；
(c)从生物样品释放分析物，其中所述分析物由分析物捕获剂的分析物结合部分特异性结合，并且分析物捕获剂的分析物捕获序列由捕获探针的捕获域特异性结合；和
(d)确定(i)对应于分析物结合部分条码或其互补物的序列，和(ii)对应于空间条码或其互补物的序列，并使用(i)和(ii)的序列以确定生物样品中分析物的位置。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述基材包含约100万个孔至约500万个孔。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述多个孔的每个孔是平底孔或圆底孔。
44.根据权利要求41-43中任一项所述的方法，其中所述多个孔的每个孔包含六边形、七边形、八边形、五边形、方形或圆形的周界。
45.根据权利要求41-44中任一项所述的方法，其中所述多个孔的每个孔具有基本相同的周长。
46.根据权利要求41-44中任一项所述的方法，其中所述多个孔的每个孔不具有基本相同的周长。
47.根据权利要求41-46中任一项所述的方法，其中所述多个孔的每个孔包含开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约3μm至约7μm的平均直径。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述多个孔的每个孔包含开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约4μm至约6μm的平均直径。
49.根据权利要求41-48中任一项所述的方法，其中所述多个孔的每个孔包含开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约12μm2至约30μm2的面积。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述多个孔的每个孔包含开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约15μm2至约27μm2的面积。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述多个孔的每个孔包含开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约18μm2至约24μm2的面积。
52.根据权利要求41-51中任一项所述的方法，其中所述所述多个孔的每个孔具有约10μm至约35μm的深度。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述多个孔的每个孔具有约15μm至约30μm的深度。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述多个孔的每个孔具有约20μm至约25μm的深度。
55.根据权利要求41-54中任一项所述的方法，其中所述多个孔具有约7.0μm至约20μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述多个孔具有约7.0μm至约10μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述多个孔具有约7.0μm至约8.5μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。
58.根据权利要求41-57中任一项所述的方法，其中所述多个捕获探针设置于孔的底部表面。
59.根据权利要求41-57中任一项所述的方法，其中所述多个捕获探针设置于孔的一个或多个侧表面。
60.根据权利要求41-57中任一项所述的方法，其中所述多个捕获探针设置于孔的底部表面和孔的一个或多个侧表面。
61.根据权利要求41-60中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的设置是使用辊或冲压装置施加的压力进行的。
62.根据权利要求41-61中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前使用寡核苷酸光刻将所述多个探针连接到孔的表面。
63.根据权利要求41-61中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前使用桥式扩增将所述多个探针连接到孔的表面。
64.根据权利要求41-61中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前通过将多个可溶性水凝胶珠设置于孔中以将所述多个捕获探针设置于孔中，其中所述多个可溶性水凝胶珠包含多个捕获探针。
65.根据权利要求41-64中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的释放包括裂解生物样品的部分。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述方法进一步包括，在步骤(c)之前向所述多个孔中的每个孔加入一种或多种裂解剂。
67.根据权利要求65所述的方法，其中在步骤(a)中，所述多个孔的每个孔包含一种或多种裂解剂。
68.根据权利要求41-67中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括，在步骤(b)之前，对生物样品进行固定、染色，和/或成像的一种或多种。
69.根据权利要求41-68中任一项所述的方法，其中所述生物样品在步骤(b)之前被设置于透明基材上。
70.根据权利要求41-69中任一项所述的方法，其中所述生物样品是组织样品。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述组织样品是新鲜、冷冻的组织样品。
72.根据权利要求70所述的方法，其中所述组织样品是固定的组织样品。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述组织样品是***固定石蜡包埋(FFPE)组织样品。
74.根据权利要求41-73中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括使用分析物结合部分条码作为模板延伸捕获探针的末端。
75.根据权利要求41-74中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括对(i)对应于分析物结合部分条码或其互补物的序列，和(ii)对应于空间条码或其互补物的序列进行测序。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述测序是高通量测序。
77.根据权利要求41-76中任一项所述的方法，其中所述分析物结合部分是抗体或其抗原结合片段。
78.根据权利要求41-77中任一项所述的方法，其中所述分析物是蛋白质。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述蛋白质是胞内蛋白。
80.根据权利要求78所述的方法，其中所述蛋白质是胞外蛋白。
81.一种包括多个孔的装置，其中所述多个孔的孔包括包含多个捕获探针的表面，其中所述多个捕获探针的捕获探针包含空间条码和捕获域，并且其中：
所述装置包含约100万个孔至约500万个孔；
所述多个孔的每个孔包含开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约3μm至约7μm的平均直径；
所述多个孔的每个孔包含开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约12μm2至约30μm2的面积；
所述多个孔的每个孔具有约10μm至35μm的深度；并且
所述多个孔具有约7.0μm至约20μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。
82.根据权利要求81所述的装置，其中所述多个孔的每个孔包含平底或圆底孔。
83.根据权利要求81或82所述的装置，其中所述多个孔的每个孔包含六边形、七边形、八边形、五边形、方形或圆形的周界。
84.根据权利要求81-83中任一项所述的装置，其中所述多个孔的每个孔具有基本相同的周长。
85.根据权利要求81-83中任一项所述的装置，其中所述多个孔的每个孔不具有基本相同的周长。
86.根据权利要求81-85中任一项所述的装置，其中所述多个孔的每个孔包含开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约4μm至约6μm的平均直径。
87.根据权利要求81-86中任一项所述的装置，其中所述多个孔的每个孔包含开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约15μm2至约27μm2的面积。
88.根据权利要求87所述的装置，其中所述多个孔的每个孔包含开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约18μm2至约24μm2的面积。
89.根据权利要求81-88中任一项所述的装置，其中所述多个孔的每个孔具有约15μm至约30μm的深度。
90.根据权利要求89所述的装置，其中所述多个孔的每个孔具有约20μm至约25μm的深度。
91.根据权利要求81-90中任一项所述的装置，其中所述多个孔具有约7.0μm至约10μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。
92.根据权利要求91所述的装置，其中所述多个孔具有约7.0μm至约8.5μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。
93.根据权利要求81-92中任一项所述的装置，其中所述多个捕获探针设置于孔的底部表面。
94.根据权利要求81-92中任一项所述的装置，其中所述多个捕获探针设置于孔的一个或多个侧表面。
95.根据权利要求81-92中任一项所述的装置，其中所述多个捕获探针设置于孔的底部表面和孔的一个或多个侧表面。
96.根据权利要求81-95中任一项所述的装置，其中使用寡核苷酸光刻将所述多个探针预先连接到孔的表面。
97.根据权利要求81-95中任一项所述的装置，其中使用桥式扩增将所述多个探针预先连接到孔的表面。
98.根据权利要求81-95中任一项所述的装置，其中通过将多个可溶性水凝胶珠预先设置于孔中以将多个捕获探针设置于孔中，其中多个可溶性水凝胶珠包含多个捕获探针。
99.根据权利要求81-98中任一项所述的装置，其中所述多个孔的每个孔进一步包含一种或多种裂解剂。
100.根据权利要求81-99中任一项所述的装置，其中所述多个孔的每个孔进一步包含一种或多种分析物捕获剂。
101.一种包括多个孔的装置，其中所述多个孔的孔包括包含多个捕获探针的表面，其中所述多个捕获探针的捕获探针在5'至3'方向上包含空间条码和捕获域，以及与来自生物样品的分析物的序列的至少部分互补的序列，并且其中：
所述装置包含约100万个孔至约500万个孔；
所述多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约3μm至约7μm的平均直径；
所述多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约12μm2至约30μm2的面积；
所述多个孔的每个孔具有约10μm至35μm的深度；并且
所述多个孔具有约7.0μm至约20μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。
102.根据权利要求101所述的装置，其中所述多个孔的每个孔包含平底孔或圆底孔。
103.根据权利要求101或102所述的装置，其中所述多个孔的每个孔包含六边形、七边形、八边形、五边形、方形或圆形的周界。
104.根据权利要求101-103中任一项所述的装置，其中所述多个孔的每个孔具有基本相同的周长。
105.根据权利要求101-103中任一项所述的装置，其中所述多个孔的每个孔不具有基本相同的周长。
106.根据权利要求101-105中任一项所述的装置，其中所述多个孔的每个孔包含开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约4μm至约6μm的平均直径。
107.根据权利要求101-106中任一项所述的装置，其中所述多个孔的每个孔包含开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约15μm2至约27μm2的面积。
108.根据权利要求107所述的装置，其中所述多个孔的每个孔包含开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约18μm2至约24μm2的面积。
109.根据权利要求101-108中任一项所述的装置，其中所述多个孔的每个孔具有约15μm至约30μm的深度。
110.根据权利要求109所述的装置，其中所述多个孔的每个孔具有约20μm至约25μm的深度。
111.根据权利要求101-110中任一项所述的装置，其中所述多个孔具有约7.0μm至约10μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。
112.根据权利要求111所述的装置，其中所述多个孔具有约7.0μm至约8.5μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。
113.根据权利要求101-112中任一项所述的装置，其中所述多个捕获探针设置于孔的底部表面。
114.根据权利要求101-112中任一项所述的装置，其中所述多个捕获探针设置于孔的一个或多个侧表面。
115.根据权利要求101-112中任一项所述的装置，其中所述多个捕获探针设置于孔的底部表面和孔的一个或多个侧表面。
116.根据权利要求101-115中任一项所述的装置，其中使用寡核苷酸光刻将所述多个探针预先连接到孔的表面。
117.根据权利要求101-115中任一项所述的装置，其中使用桥式扩增将所述多个探针预先连接到孔的表面。
118.根据权利要求101-115中任一项所述的装置，其中通过将多个可溶性水凝胶珠预先设置于孔中以将多个捕获探针设置于孔中，其中所述多个可溶性水凝胶珠包含多个捕获探针。
119.根据权利要求101-118中任一项所述的装置，其中所述多个孔的每个孔进一步包含一种或多种裂解剂。
120.根据权利要求81-119中任一项所述的装置，其中所述多个孔的每个孔进一步包含一种或多种分析物捕获剂。
121.一种试剂盒，其包含如权利要求81-120中任一项所述的装置。
122.根据权利要求121所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于执行权利要求1-80中任一项的方法的使用说明。
123.根据权利要求121或122所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含逆转录酶、聚合酶、RNA酶、蛋白酶、DNA酶和脂肪酶中的一种或多种。
124.根据权利要求121至123中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含裂解剂。
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