CN116829729A - 用于捕获探针和/或条形码的方法、组合物和*** - Google Patents

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H·金
D·苏科维奇
L·卡蒂瑞
A·M·坦托里
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10X Genomics Ltd
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10X Genomics Ltd
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Abstract

本文提供了用于将连接探针和/或捕获柄序列捕获到捕获探针的捕获结构域的方法。

Description

用于捕获探针和/或条形码的方法、组合物和***
相关申请的交叉引用
本申请要求以下美国临时申请序列号的权益：2020年12月21日提交的63/128,796；2021年2月12日提交的63/148,825；和2021年10月5日提交的63/252,323，其中每个申请的全部内容以引用方式并入本文。
背景技术
由于不同细胞内不同的分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)，故组织内的细胞在细胞形态和/或功能上具有差异。细胞在组织内的具***置(例如，细胞相对于相邻细胞的位置或细胞相对于组织微环境的位置)可影响例如细胞的形态、分化、命运、活力、增殖、行为、信号传导以及与组织中的其他细胞的串扰。
空间异质性先前已使用通常在完整组织或一部分组织(例如，组织切片)的背景下提供少量分析物的数据、或者提供来自各个单细胞的重要分析物数据的技术进行了研究，但未能提供关于来自起源生物样品(例如，组织)的单细胞的位置的信息。
对生物样品内分析物的空间分析可能需要确定分析物序列或其互补序列和空间条形码序列或其互补序列，以鉴定分析物的位置。可以将生物样品放置在固体载体上，从而在对其进行分析以鉴定或表征该样品内的分析物(诸如DNA、RNA或其他遗传物质)时提高特异性和效率。
发明内容
本公开以用于确定生物样品中分析物的位置和丰度的方法、组合物、装置和***为特征。通过确定生物样品内分析物(例如，蛋白质、DNA或RNA)的空间位置和丰度，能够更好地理解各种背景(诸如疾病模型)中的空间异质性。本文描述了用于将探针和/或条形码捕获到捕获结构域的方法。在一些情况下，本文所公开的技术便于下游处理，诸如对结合到捕获结构域的探针和/或条形码进行测序。
在一些实例中，本文所公开的方法、组合物、装置和***利用以RNA作为模板的连接(RTL)来分析生物样品中的分析物(例如，RNA)。在一些实例中，RTL与“夹层过程”结合使用，其中分析物从第一基板转移到第二基板，用于进一步的下游处理。在一些实例中，分析物捕获剂用于分析生物样品中的分析物(例如，蛋白质)。在一些实例中，本文所公开的方法允许对两种不同类型的分析物进行空间分析。
在一些情况下，本文公开了一种用于分析安装在第一基板上的生物样品中的分析物的方法，包括：将第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸与分析物杂交，其中第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸各自包含与分析物的相邻序列基本上互补的序列，并且其中第二探针寡核苷酸包含捕获探针结合结构域；将第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸偶联，从而生成连接探针；将第一基板与包括阵列的第二基板对准，使得生物样品的至少一部分与阵列的至少一部分对准，其中该阵列包括多个捕获探针，其中多个捕获探针中的一个捕获探针包括：(i)空间条形码和(ii)捕获结构域；当生物样品与阵列的至少一部分对准时，(i)从分析物释放连接探针，然后(ii)将连接探针从生物样品迁移到阵列；以及将连接探针与捕获结构域杂交。
在一些情况下，第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸位于连续核酸序列上。在一些情况下，第一探针寡核苷酸位于连续核酸序列的3’末端。在一些情况下，第二探针寡核苷酸位于连续核酸序列的5’末端。在一些情况下，相邻序列彼此邻接。在一些情况下，相邻序列彼此相距至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个核苷酸。
在一些情况下，这些方法还包括生成延伸的第一探针寡核苷酸，其中该延伸的第一探针寡核苷酸包含与介于杂交至第一探针寡核苷酸的序列和杂交至第二探针寡核苷酸的序列之间的序列互补的序列。
在一些情况下，这些方法还包括使用聚合酶生成延伸的第二探针寡核苷酸，其中该延伸的第二探针寡核苷酸包含与介于杂交至第一探针寡核苷酸的序列和杂交至第二探针寡核苷酸的序列之间的序列互补的序列。
在一些情况下，这些方法还包括将第三探针寡核苷酸与第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸杂交。
在一些情况下，第三探针寡核苷酸包含：与第一探针寡核苷酸中杂交至第三探针寡核苷酸的一部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或者100％互补的序列；以及与第二探针寡核苷酸中杂交至第三探针寡核苷酸的一部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或者100％互补的序列。
在一些情况下，将第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸偶联包括经由连接酶将第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸连接。在一些情况下，将第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸偶联包括经由连接酶：(a)将第一探针寡核苷酸和延伸的第二探针寡核苷酸连接；或(b)将延伸的第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸连接。在一些情况下，连接酶选自splintR连接酶、单链DNA连接酶或T4 DNA连接酶。
在一些情况下，这些方法还包括在释放步骤之前扩增连接探针，任选地其中该扩增包括滚环扩增。
在一些情况下，对准步骤包括：(i)将第一基板安装在支撑装置的第一构件上，该第一构件被构造成保持第一基板；(ii)将第二基板安装在支撑装置的第二构件上；(iii)将试剂介质施加到第一基板和/或第二基板，其中该试剂介质包含透化剂，并任选地包含用于释放连接探针的作用剂；以及(iv)操作支撑装置的对准机构以移动第一构件和/或第二构件，使得至少一部分生物样品与至少一部分阵列对准，并且使得这部分生物样品和这部分阵列接触试剂介质。
在一些情况下，对准机构联接到第一构件、第二构件，或者第一构件和第二构件两者。在一些情况下，对准机构包括线性致动器，任选地其中：该线性致动器被构造成沿与第一构件和/或第二构件的平面正交的轴线移动第二构件，并且/或者该线性致动器被构造成沿与第一构件和/或第二构件的平面正交的轴线移动第一构件，并且/或者该线性致动器被构造成以至少0.1mm/s的速度移动第一构件、第二构件，或者第一构件和第二构件两者，并且/或者该线性致动器被构造成以至少0.1lb大小的力移动第一构件、第二构件，或者第一构件和第二构件两者。
在一些情况下，在释放步骤(d)期间，在第一基板与第二基板之间维持一定的分隔距离，任选地其中该分隔距离小于50微米，任选地其中该分隔距离介于2微米至25微米之间，任选地其中该分隔距离是在与支撑生物样品的第一基板表面正交的方向上测量的，并且/或者至少这部分生物样品与至少这部分阵列在竖直方向上对准。
在一些情况下，第一基板和第二基板中的至少一者还包括隔件，其中在第一基板和第二基板被安装于支撑装置上之后，隔件设置在第一基板与第二基板之间，并且被构造成将试剂介质保持在由第一基板、第二基板和隔件形成的腔室内，并且维持第一基板与第二基板之间的分隔距离，隔件被定位成至少部分地围绕第一基板上的其上设置有生物样品的区域和/或设置在第二基板上的阵列，其中第一基板的该区域、隔件和第二基板至少部分地包围包括生物样品在内的容积。
在一些情况下，腔室包括部分或完全密封的腔室，并且/或者第二基板包括隔件，并且/或者第一基板包括隔件，并且/或者将试剂介质施加到第一基板和/或第二基板包括将试剂介质施加到隔件的某个区域，该区域位于第二基板的封闭区之外，该封闭区由隔件形成。
在一些情况下，随着第一基板和/或第二基板经由对准机构移动，第一基板相对于第二基板成一角度，使得第一基板的下降载片和第二基板的一部分接触试剂介质，任选地其中：第一基板的下降侧将试剂介质推向相反方向，并且/或者对准机构进一步移动第一基板和/或第二基板，以维持第一基板和第二基板的近似平行排列以及第一基板与第二基板之间的分隔距离，任选地当维持该近似平行排列和分隔距离时，隔件完全封闭和包围至少这部分生物样品和至少这部分阵列，并且隔件形成了腔室的保持一定体积试剂介质的侧面。
在一些情况下，这些方法还包括使生物样品与试剂介质接触，该试剂介质包含透化剂和用于释放连接探针的作用剂，从而透化生物样品并从分析物中释放连接探针。在一些情况下，用于释放连接探针的作用剂包括核酸酶。在一些情况下，核酸酶包括核糖核酸酶，任选地其中该核糖核酸酶选自核糖核酸酶A、核糖核酸酶C、核糖核酸酶H或核糖核酸酶I。在一些情况下，透化剂包括蛋白酶。在一些情况下，蛋白酶选自胰蛋白酶、胃蛋白酶、弹性蛋白酶或蛋白酶K。在一些情况下，试剂介质还包含去污剂。在一些情况下，去污剂选自十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基肌氨酸钠、皂苷、Triton X-100TM或Tween-20TM。在一些情况下，试剂介质包含少于5w/v％的选自SDS和十二烷基肌氨酸钠的去污剂。在一些情况下，试剂介质包含至少5w/v％的选自SDS和十二烷基肌氨酸钠的去污剂。在一些情况下，试剂介质不包含十二烷基硫酸钠(SDS)和十二烷基肌氨酸钠。
在一些情况下，试剂介质还包含聚乙二醇(PEG)。
在一些情况下，生物样品和阵列与试剂介质接触约1分钟至约60分钟。在一些情况下，生物样品和阵列与试剂介质接触约30分钟。
在一些情况下，这些方法还包括确定(i)连接探针的全部或部分序列，或者其互补序列，和(ii)空间条形码的全部或部分序列，或者其互补序列，任选地其中该方法还包括使用(i)和(ii)的确定序列来确定生物样品中分析物的位置和丰度。在一些情况下，该确定包括对以下各项进行测序：(i)连接探针的全部或部分序列，或者其互补序列，和(ii)空间条形码的全部或部分序列，或者其互补序列。
在一些情况下，连接探针的序列包括空间条形码序列或其反向互补序列，以及对应于生物样品中的分析物的序列或其反向互补序列。
在一些情况下，从与这部分阵列对准的这部分生物样品中释放的连接探针的至少50％被这部分阵列中的捕获探针捕获。在一些情况下，在生物样品正下方的斑点中检测到至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的连接探针。
在一些情况下，捕获探针包括多聚(T)序列。在一些情况下，捕获探针包括对分析物具有特异性的序列。在一些情况下，捕获探针还包括一个或多个功能性结构域、独特分子标识符(UMI)、裂解结构域，以及它们的组合。
在一些情况下，分析物是RNA。在一些情况下，分析物是mRNA。
在一些情况下，这些方法包括分析生物样品中的不同分析物。在一些情况下，分析不同分析物包括：使生物样品与多种分析物捕获剂接触，其中多种分析物捕获剂中的一种分析物捕获剂包括分析物结合部分和捕获剂条形码结构域，其中该分析物结合部分特异性地结合不同分析物，并且其中该捕获剂条形码结构域包括分析物结合部分条形码和捕获柄序列；以及将捕获柄序列与捕获结构域杂交。在一些情况下，该方法还包括确定(i)捕获剂条形码结构域的全部或部分序列；以及(ii)空间条形码的全部或部分序列，或者其互补序列。在一些情况下，该方法还包括使用(i)和(ii)的确定序列来分析生物样品中的不同分析物。
在一些情况下，释放步骤还从不同的分析物中释放捕获剂条形码结构域。在一些情况下，不同的分析物是蛋白质分析物。在一些情况下，蛋白质分析物是细胞外蛋白质。在一些情况下，蛋白质分析物是细胞内蛋白质。在一些情况下，分析物结合部分是抗体。在一些情况下，分析物捕获剂包括接头。在一些情况下，接头是可裂解接头。在一些情况下，可裂解接头是光可裂解接头、紫外线可裂解接头或酶可裂解接头。在一些情况下，可裂解接头是光可裂解接头。
在一些情况下，本文还公开了一种用于分析安装在第一基板上的生物样品中的分析物的方法，包括：使生物样品与多种分析物捕获剂接触，其中多种分析物捕获剂中的一种分析物捕获剂包括分析物结合部分和捕获剂条形码结构域，其中该分析物结合部分特异性地结合该分析物，并且其中该捕获剂条形码结构域包括分析物结合部分条形码和捕获柄序列；将第一基板与包括阵列的第二基板对准，使得生物样品的至少一部分与阵列的至少一部分对准，其中该阵列包括多个捕获探针，其中多个捕获探针中的一个捕获探针包括：(i)空间条形码和(ii)捕获结构域；当生物样品与阵列的至少一部分对准时，(i)从分析物释放捕获剂条形码结构域，然后(ii)被动或主动地将捕获剂条形码结构域从生物样品迁移到阵列；以及将捕获柄序列偶联到捕获结构域。在一些情况下，这些方法还包括确定：(i)捕获剂条形码结构域的全部或部分序列，或者其互补序列；以及(ii)空间条形码的全部或部分序列，或者其互补序列。在一些情况下，这些方法还包括使用(i)和(ii)的确定序列来确定生物样品中分析物的位置和丰度。
在一些情况下，对准步骤包括：(i)将第一基板安装在支撑装置的第一构件上，该第一构件被构造成保持第一基板；(ii)将第二基板安装在支撑装置的第二构件上；(iii)将试剂介质施加到第一基板和/或第二基板，其中该试剂介质包含透化剂，并任选地包含用于释放连接探针的作用剂；以及(iv)操作支撑装置的对准机构以移动第一构件和/或第二构件，使得至少一部分生物样品与至少一部分阵列对准，并且使得这部分生物样品和这部分阵列接触试剂介质。
在一些情况下，对准机构联接到第一构件、第二构件，或者第一构件和第二构件两者。在一些情况下，对准机构包括线性致动器，任选地其中：该线性致动器被构造成沿与第一构件和/或第二构件的平面正交的轴线移动第二构件，并且/或者该线性致动器被构造成沿与第一构件和/或第二构件的平面正交的轴线移动第一构件，并且/或者该线性致动器被构造成以至少0.1mm/s的速度移动第一构件、第二构件，或者第一构件和第二构件两者，并且/或者该线性致动器被构造成以至少0.1lb大小的力移动第一构件、第二构件，或者第一构件和第二构件两者。
在一些情况下，在释放步骤(d)期间，在第一基板与第二基板之间维持一定的分隔距离，任选地其中该分隔距离小于50微米，任选地其中该分隔距离介于2微米至25微米之间，任选地其中该分隔距离是在与支撑生物样品的第一基板表面正交的方向上测量的，并且/或者至少这部分生物样品与至少这部分阵列在竖直方向上对准。
在一些情况下，第一基板和第二基板中的至少一者还包括隔件，其中在第一基板和第二基板被安装于支撑装置上之后，隔件设置在第一基板与第二基板之间，并且被构造成将试剂介质保持在由第一基板、第二基板和隔件形成的腔室内，并且维持第一基板与第二基板之间的分隔距离，隔件被定位成至少部分地围绕第一基板上的其上设置有生物样品的区域和/或设置在第二基板上的阵列，其中第一基板的该区域、隔件和第二基板至少部分地包围包括生物样品在内的容积。
在一些情况下，腔室包括部分或完全密封的腔室，并且/或者第二基板包括隔件，并且/或者第一基板包括隔件，并且/或者将试剂介质施加到第一基板和/或第二基板包括将试剂介质施加到隔件的某个区域，该区域位于第二基板的封闭区之外，该封闭区由隔件形成。
在一些情况下，随着第一基板和/或第二基板经由对准机构移动，第一基板相对于第二基板成一角度，使得第一基板的下降载片和第二基板的一部分接触试剂介质，任选地其中：第一基板的下降侧将试剂介质推向相反方向，并且/或者对准机构进一步移动第一基板和/或第二基板，以维持第一基板和第二基板的近似平行排列以及第一基板与第二基板之间的分隔距离，任选地当维持该近似平行排列和分隔距离时，隔件完全封闭和包围至少这部分生物样品和至少这部分阵列，并且隔件形成了腔室的保持一定体积试剂介质的侧面。
在一些情况下，释放包括使生物样品和阵列与包含核酸酶的试剂介质接触。在一些情况下，将捕获柄序列偶联到捕获结构域包括杂交。在一些情况下，核酸酶包括核糖核酸酶。在一些情况下，核糖核酸酶选自核糖核酸酶A、核糖核酸酶C、核糖核酸酶H和核糖核酸酶I。在一些情况下，试剂介质还包含透化剂。在一些情况下，释放还包括透化生物样品，同时从分析物结合部分中释放捕获剂条形码结构域。在一些情况下，透化剂包括蛋白酶。在一些情况下，蛋白酶选自胰蛋白酶、胃蛋白酶、弹性蛋白酶或蛋白酶K。在一些情况下，试剂介质还包含去污剂。在一些情况下，去污剂选自十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基肌氨酸钠、皂苷、Triton X-100TM或Tween-20TM。在一些情况下，试剂介质包含少于5w/v％的选自SDS和十二烷基肌氨酸钠的去污剂。在一些情况下，试剂介质包含至少5w/v％的选自SDS和十二烷基肌氨酸钠的去污剂。在一些情况下，试剂介质不包含十二烷基硫酸钠(SDS)和十二烷基肌氨酸钠。
在一些情况下，试剂介质还包含PEG。
在一些情况下，生物样品和阵列与试剂介质接触约1分钟至约60分钟。
在一些情况下，生物样品和阵列与试剂介质接触约30分钟。在一些情况下，该方法还包括分析生物样品中的不同分析物。在一些情况下，分析不同分析物包括：将第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸与不同分析物杂交，其中第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸各自包含与不同分析物的相邻序列基本上互补的序列，并且其中第二探针寡核苷酸包含捕获探针结合结构域；将第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸偶联，从而生成包含捕获探针结合结构域的连接探针；以及将该连接探针的捕获探针结合结构域与捕获结构域杂交。在一些情况下，这些方法还包括确定：(i)连接探针的全部或部分序列，或者其互补序列，和(ii)空间条形码的全部或部分序列，或者其互补序列。在一些情况下，该方法还包括使用(i)和(ii)的确定序列来分析生物样品中的不同分析物。在一些情况下，释放步骤还从不同的分析物中释放连接探针。
在一些情况下，不同的分析物是RNA。在一些情况下，不同的分析物是mRNA。
在一些情况下，捕获探针包括多聚(T)序列。在一些情况下，捕获探针包括对捕获柄序列具有特异性的序列。在一些情况下，捕获探针还包括一个或多个功能性结构域、独特分子标识符(UMI)、裂解结构域，以及它们的组合。
在一些情况下，分析物结合部分是抗体。在一些情况下，分析物捕获剂包括接头。在一些情况下，接头是可裂解接头。在一些情况下，可裂解接头是光可裂解接头、紫外线可裂解接头或酶可裂解接头。
在一些情况下，生物样品是组织样品。在一些情况下，组织样品是实体组织样品。在一些情况下，实体组织样品是组织切片。在一些情况下，组织样品是固定的组织样品。在一些情况下，固定的组织样品是***固定石蜡包埋的(FFPE)组织样品。在一些情况下，FFPE组织在步骤(a)之前脱蜡和解交联。在一些情况下，固定的组织样品是***固定石蜡包埋的细胞团块。在一些情况下，组织样品是新鲜的冷冻组织样品。
在一些情况下，组织样品在步骤(a)之前被固定和染色。
在一些情况下，这些方法还包括分析第三基板上的第二生物样品中的第二分析物。在一些情况下，分析第二分析物包括：将第三探针寡核苷酸和第四探针寡核苷酸与第二分析物杂交，其中第三探针寡核苷酸和第四探针寡核苷酸各自包含与第二分析物的相邻序列基本上互补的序列，并且其中第四探针寡核苷酸包含第二捕获探针结合结构域；将第三探针寡核苷酸和第四探针寡核苷酸偶联，从而生成第二连接探针；将第三基板与包括阵列的第二基板对准，使得第二生物样品的至少一部分与阵列的至少一部分对准；当第二生物样品与阵列的至少一部分对准时，(i)从第二分析物释放第二连接探针，然后(ii)将第二连接探针从第二生物样品迁移到阵列；以及将第二连接探针与捕获结构域杂交。
在一些情况下，第二分析物是RNA。在一些情况下，RNA是mRNA。
在一些情况下，分析第三基板上的第二生物样品中的第二分析物包括：使第二生物样品与多种第二分析物捕获剂接触，其中多种第二分析物捕获剂中的一种第二分析物捕获剂包括第二分析物结合部分和第二捕获剂条形码结构域，其中该第二分析物结合部分特异性地结合第二分析物，并且其中该第二捕获剂条形码结构域包括第二分析物结合部分条形码和第二捕获柄序列；将第三基板与包括阵列的第二基板对准，使得第二生物样品的至少一部分与阵列的至少一部分对准；当第二生物样品与阵列的至少一部分对准时，(i)从第二分析物释放第二捕获剂条形码结构域，然后(ii)将第二捕获剂条形码结构域从第二生物样品迁移到阵列；以及将第二捕获柄序列偶联到捕获结构域。
在一些情况下，第二分析物是蛋白质分析物。在一些情况下，蛋白质分析物是细胞外蛋白质。在一些情况下，蛋白质分析物是细胞内蛋白质。
在一些情况下，这些方法还包括确定(i)连接探针的全部或部分序列，或者其互补序列，和(ii)空间条形码的全部或部分序列，或者其互补序列，任选地其中该方法还包括使用(i)和(ii)的确定序列来确定生物样品中分析物的位置和丰度。
在一些情况下，第二生物样品是组织样品，任选地其中该组织样品是实体组织样品。在一些情况下，组织样品是组织切片。在一些情况下，组织样品是固定的组织样品。在一些情况下，固定的组织样品是***固定石蜡包埋的(FFPE)组织样品。在一些情况下，将FFPE组织脱蜡和解交联。在一些情况下，固定的组织样品是***固定石蜡包埋的细胞团块。在一些情况下，组织样品是新鲜组织样品或冷冻组织样品。在一些情况下，组织样品被固定和染色。
在一些情况下，本文所公开的方法还包括分析：第四基板上的第三生物样品中的第三分析物；第五基板上的第四生物样品中的第四分析物；第六基板或更多基板上的第五生物样品或更多生物样品中的第五分析物或更多分析物。
本文还公开了用于分析生物样品中的分析物的***或试剂盒。在一些情况下，该***或试剂盒包括(a)被构造成保持第一基板和第二基板的支撑装置，其中生物样品被放置在第一基板上，并且其中第二基板包括多个捕获探针，其中多个捕获探针中的一个捕获探针包括：(i)空间条形码和(ii)捕获结构域；(b)(b1)第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸，其中第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸各自包含与分析物的相邻序列基本上互补的序列，其中第二探针寡核苷酸包含捕获探针结合结构域，并且其中第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸能够连接在一起形成连接探针；或(b2)多种分析物捕获剂，其中多种分析物捕获剂中的一种分析物捕获剂包括分析物结合部分和捕获剂条形码结构域，其中分析物结合部分特异性地结合分析物，并且其中捕获剂条形码结构域包括分析物结合部分条形码和捕获柄序列；(c)试剂介质，其包含透化剂，并任选地包含用于释放连接探针的作用剂；以及(d)用于实施本文所公开的任何一种方法的说明书。在一些情况下，透化剂是胃蛋白酶或蛋白酶K。在一些情况下，用于释放连接探针的作用剂是核糖核酸酶，任选地其中该核糖核酸酶是核糖核酸酶A、核糖核酸酶C、核糖核酸酶H或核糖核酸酶I。在一些情况下，该***或试剂盒还包括位于支撑装置上的对准机构，其用于将第一基板和第二基板对准。在一些情况下，对准机构包括线性致动器，其中第一基板包括第一构件，第二基板包括第二构件，并且任选地其中：该线性致动器被构造成沿与第一构件和/或第二构件的平面正交的轴线移动第二构件，并且/或者该线性致动器被构造成沿与第一构件和/或第二构件的平面正交的轴线移动第一构件，并且/或者该线性致动器被构造成以至少0.1mm/s的速度移动第一构件、第二构件，或者第一构件和第二构件两者，并且/或者该线性致动器被构造成以至少0.1lb大小的力移动第一构件、第二构件，或者第一构件和第二构件两者。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均以引用方式并入本文，其程度与每个单独的出版物、专利、专利申请或信息条目特异性且单独地指示以引用方式并入相同。如果通过引用并入的出版物、专利、专利申请和信息项与本说明书中包含的公开内容相矛盾，则本说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。
在以范围描述值的情况下，应理解，该描述包括公开这样的范围内所有可能的子范围，以及落入这样的范围内的具体数值，而不管明确陈述的是具体数值还是具体子范围。
在提及项目集合而使用时，术语“各”旨在识别集合中的单个项目但不一定是指集合中的每个项目，除非另有明确说明，或除非使用的上下文另有明确指示。
本文描述了本公开的特征的各种实施方案。然而，应当理解，此类实施方案仅通过举例来提供，在不脱离本公开范围的情况下，本领域技术人员可以想到许多变型形式、变化和替换方案。还应当理解，本文所述具体实施方案的各种替代方案也在本公开的范围内。
附图说明
以下附图展示了本公开的特征和优点的某些实施方案。这些实施方案无意于以任何方式限制所附权利要求书的范围。附图中相同的附图符号表示相同的元件。
图1为示出如本文所述加条形码的捕获探针的一个实例的示意图。
图2为示意可切割捕获探针的示意图，其中被切割的捕获探针可进入到非透化细胞中并与样品内的目标分析物结合。
图3是示例性的多路化的带空间条形码的特征的示意图。
图4是一种示例性的分析物捕获试剂的示意图。
图5是描绘固定有特征的捕获探针524与分析物捕获剂526之间的示例性相互作用的示意图。
图6A、图6B和图6C是展示可以如何在基于阵列的***中利用链霉亲和素细胞标签来产生在空间上加条形码的细胞或细胞内容物的示意图。
图7是展示抗扩散介质(例如，封盖)的侧视图的示意图。
图8A和图8B是展示电泳转移***的放大视图图8A和侧视图图8B的示意图，该电泳转移***被配置为将转录分析物导向在空间上加条形码的捕获探针阵列。
图9是展示利用电泳转移***的示例性工作流程方案的示意图。
图10A示出了示例分析工作流程的示意图，其中在透化后进行分析物的电泳迁移。
图10B示出了示例分析工作流程的示意图，其中分析物的电泳迁移和透化同时进行。
图11A示出了在电泳期间使用的示例垂直单载片构造。
图11B示出了在电泳期间使用的示例平行单载片构造。
图11C示出了在电泳期间使用的示例多载片构造。
图12A示出了使用连接探针来捕获细胞内分析物的示例性工作流程。
图12B示出的示例性示意图展示了夹持在基板与在空间上加条形码的捕获探针阵列之间的组织样品，其中连接探针被转移到在空间上加条形码的捕获探针阵列。
图13示出了在FFPE小鼠大脑组织中分析连接探针之后空间分辨基因表达信息的示例性图像。
图14示出了在FFPE小鼠肾脏组织中分析连接探针之后空间分辨基因表达信息的示例性图像。
图15示出了在FFPE小鼠大脑组织中分析连接探针之后空间分辨基因表达信息的示例性图像。
图16A示出了使用连接探针和分析物捕获剂来捕获细胞内分析物的示例性工作流程。
图16B示出的示例性示意图展示了夹持在基板与在空间上加条形码的捕获探针阵列之间的组织样品，其中连接探针和捕获剂条形码结构域被转移到在空间上加条形码的捕获探针阵列。
图17A示出的示例性示意图展示了使用核糖核酸酶可裂解接头从分析物捕获剂的分析物结合部分中释放捕获剂条形码结构域。
图17B示出的示例性示意图展示了使用紫外线可裂解接头从分析物捕获剂的分析物结合部分中释放捕获剂条形码结构域。
图18A和图18B示出了在FFPE小鼠大脑组织中分析连接探针之后空间分辨基因表达信息的示例性图像。
图19A示出了使用新鲜的冷冻组织样品进行空间分析测定的示例性工作流程。
图19B示出了使用***固定石蜡包埋的(FFPE)组织样品进行空间分析测定的示例性工作流程。
图20示出的表格提供了对来自多个生物样品的分析物进行多重化转移所产生的数据。
图21A示出了使用非夹持技术的小鼠胸腺样品、小鼠睾丸样品和人类乳腺癌样品的热图和聚类图像。
图21B示出了使用单样品夹持技术的小鼠胸腺样品、小鼠睾丸样品和人类乳腺癌样品的热图和聚类图像。
图22A和图22B示出了使用多样品夹持技术的小鼠样品和人类样品的热图和聚类图像。
图23示出了描绘夹持过程的示例性示意图。
图24示出的表格提供了来自对非夹层对照和夹层构造透化条件进行比较的实验的数据。
图25示出了非夹层对照与夹层构造透化条件之间的示例性比较。
图26示出了空间聚类分析和对海马转录物Hpca的分析的示例性图像，其中对非夹层对照和夹层构造透化条件进行比较。
图27A示出了对非夹层对照和夹层构造条件进行比较的人类大脑的热图和聚类图像。
图27B示出了对非夹层对照和夹层构造条件进行比较的人类***的热图和聚类图像。
图28A示出了在夹层构造条件下，在FFPE小鼠脾脏组织中使用连接探针的蛋白酪氨酸磷酸酶C型受体(Ptprc)RNA的空间分辨基因表达信息的示例性图像。
图28B示出了在夹层构造条件下，在FFPE小鼠脾脏组织中使用分析物捕获剂的CD45R的空间分辨蛋白质表达信息的示例性图像。
图28C示出了在非夹层构造对照条件下，在FFPE脾脏组织中使用连接探针的PtprcRNA的空间分辨基因表达信息的示例性图像。
图28D示出了在非夹层构造对照条件下，在FFPE小鼠脾脏组织中使用分析物捕获剂的CD45R的空间分辨蛋白质表达信息的示例性图像。
图29A示出了在夹层构造条件下，在FFPE小鼠大脑组织中使用连接探针的酪氨酸羟化酶(Th)RNA的空间分辨基因表达信息的示例性图像。
图29B示出了在夹层构造条件下，在FFPE小鼠大脑组织中使用分析物捕获剂的酪氨酸羟化酶蛋白(TH)的空间分辨蛋白质表达信息的示例性图像。
图29C示出了在非夹层构造对照条件下，在FFPE小鼠大脑组织中使用连接探针的Th RNA的空间分辨基因表达信息的示例性图像。
图29D示出了在非夹层构造对照条件下，在FFPE小鼠大脑组织中使用分析物捕获剂的TH的空间分辨蛋白质表达信息的示例性图像。
图30A示出了在夹层构造条件下，在FFPE小鼠胚胎躯干组织中使用连接探针的Ter119 RNA的空间分辨基因表达信息的示例性图像。
图30B示出了在夹层构造条件下，在FFPE小鼠胚胎躯干组织中使用分析物捕获剂的Ter119的空间分辨蛋白质表达信息的示例性图像。
图30C示出了在非夹层构造条件下，在FFPE小鼠胚胎躯干组织中使用连接探针的Ter119 RNA的空间分辨基因表达信息的示例性图像。
图30D示出了在非夹层构造条件下，在FFPE小鼠胚胎躯干组织中使用分析物捕获剂的Ter119的空间分辨蛋白质表达信息的示例性图像。
图31A示出了在夹层构造条件下，在FFPE小鼠胚胎的头部和上部躯干组织中使用连接探针的Ter119 RNA的空间分辨基因表达信息的示例性图像。
图31B示出了在夹层构造条件下，在FFPE小鼠胚胎的头部和上部躯干组织中使用分析物捕获剂的Ter119的空间分辨蛋白质表达信息的示例性图像。
图31C示出了在非夹层构造条件下，在FFPE小鼠胚胎的头部和上部躯干组织中使用连接探针的Ter119 RNA的空间分辨基因表达信息的示例性图像。
图31D示出了在非夹层构造条件下，在FFPE小鼠胚胎的头部和上部躯干组织中使用分析物捕获剂的Ter119的空间分辨蛋白质表达信息的示例性图像。
图32A、图33A、图34A、图35A和图36A示出了在夹层构造条件下，在FFPE小鼠胚胎的头部和上部躯干组织中使用连接探针的Mpped1(图32A)、Tnnc1(图33A)、Fgf15(图34A)、Epyc(图35A)和Serpina1e(图36A)RNA的空间分辨基因表达信息的示例性图像。
图32B、图33B、图34B、图35B和图36B示出了在夹层构造条件下，在FFPE小鼠胚胎的头部和上部躯干组织中使用分析物捕获剂的Mpped1(图32B)、Tnnc1(图33B)、Fgf15(图34B)、Epyc(图35B)和Serpina1e(图36B)的空间分辨蛋白质表达信息的示例性图像。
图32C、图33C、图34C、图35C和图36C示出了在夹层构造条件下，在FFPE小鼠胚胎躯干组织中使用连接探针的Mpped1(图32C)、Tnnc1(图33C)、Fgf15(图34C)、Epyc(图35C)和Serpina1e(图36C)RNA的空间分辨基因表达信息的示例性图像。
图32D、图33D、图34D、图35D和图36D示出了在非夹层构造条件下，在FFPE小鼠胚胎的头部和上部躯干组织中使用连接探针的Mpped1(图32D)、Tnnc1(图33D)、Fgf15(图34D)、Epyc(图35D)和Serpina1e(图36D)RNA的空间分辨基因表达信息的示例性图像。
图32E、图33E、图34E、图35E和图36E示出了在非夹层构造条件下，在FFPE小鼠胚胎的头部和上部躯干组织中使用分析物捕获剂的Mpped1(图32E)、Tnnc1(图33E)、Fgf15(图34E)、Epyc(图35E)和Serpina1e(图36E)的空间分辨蛋白质表达信息的示例性图像。
图32F、图33F、图34F、图35F和图36F示出了在非夹层构造条件下，在FFPE小鼠胚胎躯干组织中使用连接探针的Mpped1(图32F)、Tnnc1(图33F)、Fgf15(图34F)、Epyc(图35F)和Serpina1e(图36F)RNA的空间分辨基因表达信息的示例性图像。
图32G、图33G、图34G、图35G和图36G示出了在非夹层构造条件下，在FFPE小鼠胚胎躯干组织中使用分析物捕获剂的Mpped1(图32G)、Tnnc1(图33G)、Fgf15(图34G)、Epyc(图35G)和Serpina1e(图36G)的空间分辨蛋白质表达信息的示例性图像。
图32H、图33H、图34H、图35H和图36H示出了在非夹层构造条件下，在其中仅检测到RNA的FFPE小鼠胚胎的头部和上部躯干组织中使用连接探针的Mpped1(图32H)、Tnnc1(图33H)、Fgf15(图34H)、Epyc(图35H)和Serpina1e(图36H)RNA的空间分辨基因表达信息的示例性图像。
图32I、图33I、图34I、图35I和图36I示出了在非夹层构造条件下，在其中仅检测到RNA的FFPE小鼠胚胎躯干组织中使用连接探针的Mpped1(图32I)、Tnnc1(图33I)、Fgf15(图34I)、Epyc(图35I)和Serpina1e(图36I)RNA的空间分辨基因表达信息的示例性图像。
图37A示出了处于闭合方位的示例样品处理设备的透视图。
图37B示出了处于开启方位的示例样品处理设备的透视图。
图38A示出了示例性夹持过程，其中使得第一基板(包括生物样品)和第二基板处于彼此接近的状态。
图38B示出了完全形成的夹层构造，其产生了由一个或多个隔件、第一基板和第二基板形成的腔室。
图39A示出了第一基板在第二基板之上(上方)成角度。
图39B示出了当第一基板下降时，并且/或者当第二基板上升时，第一基板的下降侧可以接触试剂介质的液滴。
图39C示出了第一基板与第二基板之间的夹层构造已完全闭合，其中隔件与第一基板和第二基板两者接触。
图40A至图40E示出了成角度夹层组件的示例工作流程。
图41A示出了成角度闭合工作流程的侧视图。
图41B示出了成角度闭合工作流程的顶视图。
具体实施方式
I.引言
本文所述的空间分析方法、***和组合物能够以高空间分辨率提供生物样品内的多种分析物的大量分析物和/或表达数据，同时保留天然的空间背景。空间分析方法和组合物可以包括例如使用捕获探针，该捕获探针包括空间条形码(例如，提供关于细胞或组织样品(例如，哺乳动物细胞或哺乳动物组织样品)内分析物的位置或方位的信息的核酸序列)和能够结合由细胞产生和/或存在于细胞中的分析物(例如，蛋白质和/或核酸)的捕获结构域。空间分析方法和组合物还可以包括使用具有捕获结构域的捕获探针，该捕获结构域捕获用于间接检测分析物的中间剂。例如，中间剂可以包括与该中间剂相关联的核酸序列(例如，条形码)。中间剂的检测因此指示细胞或组织样品中的分析物。
空间分析方法和组合物的非限制性方面见述于以下中：美国专利号10,774,374、10,724,078、10,480,022、10,059,990、10,041,949、10,002,316、9,879,313、9,783,841、9,727,810、9,593,365、8,951,726、8,604,182、7,709,198；美国专利申请公开号2020/239946、2020/080136、2020/0277663、2020/024641、2019/330617、2019/264268、2020/256867、2020/224244、2019/194709、2019/161796、2019/085383、2019/055594、2018/216161、2018/051322、2018/0245142、2017/241911、2017/089811、2017/067096、2017/029875、2017/0016053、2016/108458、2015/000854、2013/171621；WO 2018/091676、WO2020/176788；Rodriques等人，Science 363(6434)：1463-1467，2019；Lee等人，Nat.Protoc.10(3)：442-458，2015；Trejo等人，PLoS ONE 14(2)：e0212031，2019；Chen等人，Science 348(6233)：aaa6090，2015；Gao等人，BMC Biol.15：50，2017；和Gupta等人，Nature Biotechnol.36：1197-1202，2018；Visium空间基因表达试剂盒用户指南(例如，RevC，日期为2020年6月)和/或Visium空间组织优化试剂盒用户指南(例如，Rev C，日期为2020年7月)，二者均在10x基因组学支持文献网站(10x Genomics Support Documentationwebsite)提供，并可以任何组合在本文中使用。本文描述了空间分析方法和组合物的其他非限制性方面。
可用于本公开中的一些通用术语可见于WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(I)(b)节中。通常，“条形码”为传达或能够传达信息(例如，关于样品、珠和/或捕获探针中的分析物的信息)的标签或标识符。条形码可以是分析物的一部分，也可以独立于分析物。条形码可以附接到分析物。特定条形码相对于其他条形码可以是独特的。出于本公开的目的，“分析物”可以包括待分析的任何生物物质、结构、部分或组分。术语“目标”可以类似地指感兴趣的分析物。
分析物可以大致分为以下两组之一：核酸分析物和非核酸分析物。非核酸分析物的实例包括但不限于脂质、碳水化合物、肽、蛋白质、糖蛋白(N-连接或O-连接)、脂蛋白、磷蛋白、蛋白质的特定磷酸化或乙酰化变体、蛋白质的酰胺化变体、蛋白质的羟基化变体、蛋白质的甲基化变体、蛋白质的泛素化变体、蛋白质的硫酸化变体、病毒蛋白(例如，病毒衣壳、病毒包膜、病毒外壳、病毒辅助蛋白、病毒糖蛋白、病毒刺突等)、胞外和胞内蛋白、抗体和抗原结合片段。在一些实施方案中，分析物可位于亚细胞位置，包括例如细胞器，例如线粒体、高尔基体、内质网、叶绿体、胞吞小泡、胞泌小泡、液泡、溶酶体等。在一些实施方案中，分析物可以是肽或蛋白质，包括但不限于抗体和酶。分析物的其他实例可以在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(I)(c)节中找到。在一些实施方案中，可以间接检测分析物，诸如通过检测中间试剂，例如连接的探针(例如连接产物)或分析物捕获剂(例如寡核苷酸缀合的抗体)，诸如本文所述的那些。
“生物样品”通常从受试者获得，以供使用多种技术中的任一种技术进行分析，这些技术包括但不限于活检、手术和激光捕获显微术(LCM)，并且通常包括来自受试者的细胞和/或其他生物材料。在一些实施方案中，生物样品可以是组织切片。在一些实施方案中，生物样品可以是固定的和/或染色的生物样品(例如，固定的和/或染色的组织切片)。染色剂的非限制性实例包括组织学染色剂(例如，苏木精和/或曙红)和免疫学染色剂(例如，荧光染色剂)。在一些实施方案中，可以对生物样品(例如，固定的和/或染色的生物样品)进行成像。生物样品也在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(I)(d)节中有所描述。
在一些实施方案中，用一种或多种透化试剂来透化生物样品。例如，透化生物样品可以促进分析物捕获。示例性的透化剂和透化条件在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(I)(d)(ii)(13)节或示例性实施方案章节中有所描述。
基于阵列的空间分析方法涉及将一种或多种分析物从生物样品转移到基板上的特征阵列，其中每个特征与该阵列上的独特空间位置相关联。随后对转移的分析物的分析包括确定分析物的身份和分析物在生物样品内的空间位置。分析物在生物样品内的空间位置基于分析物在阵列上所结合(例如，直接或间接地)的特征和该特征在阵列内的相对空间位置来确定。
“捕获探针”是指能够捕获(直接或间接地)和/或标记生物样品中的分析物(例如，感兴趣的分析物)的任何分子。在一些实施方案中，捕获探针是核酸或多肽。在一些实施方案中，捕获探针包括条形码(例如，空间条形码和/或独特分子标识符(UMI))和捕获结构域。在一些实施方案中，捕获探针可以包括裂解结构域和/或功能结构域(例如，引物结合位点，诸如用于下一代测序(NGS))。
在一些情况下，捕获结构域被设计成检测一种或多种特定的感兴趣分析物。例如，可以设计捕获结构域，使其包含与一种感兴趣的分析物互补或基本上互补的序列。因此，可以检测单一分析物的存在。替代性地，可以设计捕获结构域，使其包含与多种相关分析物的保守区域互补或基本上互补的序列。在一些情况下，多种相关分析物是在相同或相似的细胞途径中起作用或者具有保守同源性和/或功能的分析物。捕获探针的设计可以基于用户的意图来确定，并且可以是能够用于检测感兴趣分析物的任何序列。因此，在一些实施方案中，根据感兴趣的目标分析物，捕获结构域序列可以是随机的、半随机的、确定的，或者它们的组合。
图1是示出如本文所述的示例性捕获探针的示意图。如图所示，捕获探针102任选地通过切割结构域103如二硫连接子与特征101联接。捕获探针可以包括对后续加工有用的功能性序列104。功能序列104可包括测序仪特异性流动池附接序列(例如，P5或P7序列)的全部或部分、测序引物序列的全部或部分(例如，R1引物结合位点、R2引物结合位点)或其组合。捕获探针还可包括空间条形码105。捕获探针还可包括唯一分子标识符(UMI)序列106。虽然图1将空间条形码105示出为位于UMI序列106的上游(5’)，但应理解，其中UMI序列106位于空间条形码105的上游(5’)的捕获探针也适合用于任何本文描述的方法中。捕获探针还可包括捕获结构域107以便于目标分析物的捕获。在一些实施方案中，捕获探针包括一个或多个另外的功能序列，其可位于例如空间条形码105与UMI序列106之间、UMI序列106与捕获结构域107之间或捕获结构域107之后。捕获结构域可具有与核酸分析物的序列互补的序列。捕获结构域可以具有与本文所述的连接探针互补的序列。捕获结构域可以具有与分析物捕获剂中存在的捕获操作序列互补的序列。捕获结构域可以具有与夹板寡核苷酸互补的序列。这类夹板寡核苷酸除了具有与捕获探针的捕获结构域互补的序列之外，还可以具有核酸分析物的序列、与本文所述连接探针的一部分互补的序列，以及/或者本文所述的捕获操作序列。
通常可以选择与多种不同测序***中的任一种***及其要求相容的功能序列，这些测序***例如：Ion Torrent Proton或PGM、Illumina测序仪器、PacBio、OxfordNanopore，等等。在一些实施方案中，可以选择与未商业化的测序***相容的功能序列。可以使用合适的功能序列的这类测序***和技术的实例包括(但不限于)Ion TorrentProton或PGM测序、Illumina测序、PacBio SMRT测序和Oxford Nanopore测序。此外，在一些实施方案中，功能序列可选择为与其他测序***相容，包括非商业化测序***。
在一些实施方案中，空间条形码105和功能序列104对于附接到给定特征的所有探针是共有的。在一些实施方案中，附接到给定特征的捕获探针的UMI序列106不同于附接到给定特征的不同捕获探针的UMI序列。
图2是展示可裂解捕获探针的示意图，其中裂解的捕获探针可以进入非透化细胞并与样品内的分析物结合。捕获探针201含有切割结构域202、细胞穿透肽203、报告分子204和二硫键(-S-S-)。205代表捕获探针的所有其它部分，例如空间条形码和捕获结构域。
图3是示例性的多路化的带空间条形码的特征的示意图。在图3中，特征301可与多个加有空间条形码的捕获探针联接，其中特定特征的所述多个加有空间条形码的探针可具有相同的空间条形码，但具有设计为将该特征的空间条形码与多于一种目标分析物相关联的不同捕获结构域。例如，一个特征可与四种不同类型的加有空间条形码的捕获探针联接，每种类型的加有空间条形码的捕获探针都具有空间条形码302。与该特征相关联的一种类型的捕获探针包括空间条形码302与设计为捕获mRNA目标分析物的poly(T)捕获结构域303的组合。与该特征相关联的第二类型的捕获探针包括空间条形码302与用于gDNA分析的随机N-聚体捕获结构域304的组合。与该特征相关联的第三类型的捕获探针包括空间条形码302与和目的分析物捕获剂的捕获手柄序列互补的捕获结构域305的组合。与该特征相关联的第四类型的捕获探针包括空间条形码302与可与核酸分子特异性结合的捕获结构域306的组合，该捕获结构域可在CRISPR测定(例如，CRISPR/Cas9)中起作用。虽然图3中仅示出了四种不同的加有条形码的捕获探针构建体，但可定制加有条形码的捕获探针构建体来分析与核酸相关联并且能够与这样的构建体结合的任何给定分析物。例如，图3中示出的方案还可用于本文公开的其他分析物的并行分析，包括但不限于：(a)mRNA、谱系跟踪构建体、细胞表面或细胞内蛋白和代谢物、以及gDNA；(b)mRNA、可接近的染色质(例如，ATAC-seq、DNase-seq和/或MNase-seq)、细胞表面或细胞内的蛋白质和代谢物，以及扰动剂(例如，CRISPRcrRNA/sgRNA、TALEN、锌指核酸酶，和/或如本文所述的反义寡核苷酸)；(c)mRNA、细胞表面或细胞内的蛋白质和/或代谢物、加条形码的标记剂(例如，本文所述的MHC多聚体)，以及免疫细胞受体(例如，T细胞受体)的V(D)J序列。在一些实施方案中，扰动剂可以是小分子、抗体、药物、适配体、miRNA、物理环境(例如，温度变化)或任何其他已知的扰动剂。参见例如WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(b)节(例如，分节(i)至(vi))。捕获探针的产生可以通过任何适当的方法实现，包括WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(d)(ii)节中描述的那些方法。
在一些实施方案中，来自生物样品的多于一种分析物类型(例如，核酸和蛋白质)可以使用任何适当的多重分析技术来检测(例如，同时或依次)，诸如WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(IV)节中描述的那些技术。
在一些实施方案中，可以使用一种或多种分析物捕获剂来进行对一种或多种分析物(例如，蛋白质分析物)的检测。如本文所用，“分析物捕获剂”是指与分析物(例如，生物样品中的分析物)以及与捕获探针(例如，附接到基板或特征的捕获探针)相互作用以识别分析物的试剂。在一些实施方案中，分析物捕获剂包含：(i)分析物结合部分(例如，其与分析物结合)，例如，抗体或其抗原结合片段；(ii)分析物结合部分条形码；和(iii)捕获操作序列。如本文所用，术语“分析物结合部分条形码”是指与分析物结合部分缔合或以其他方式识别分析物结合部分的条形码。如本文所用，术语“分析物捕获序列”或“捕获操作序列”是指被构造成与捕获探针的捕获结构域杂交、结合、偶联或以其他方式相互作用的区域或部分。在一些实施方案中，捕获操作序列与捕获探针的捕获结构域互补。在一些情况下，分析物结合部分条形码(或其部分)也许能够从分析物捕获剂去除(例如，裂解)。
图4是由分析物结合部分404和分析物结合部分条形码结构域408组成的示例性分析物捕获试剂402的示意图。示例性分析物结合部分404是能够与分析物406结合的分子，并且分析物捕获试剂能够与带空间条形码的捕获探针相互作用。分析物结合部分可以以高亲和力和/或高特异性结合分析物406。分析物捕获试剂可以包括分析物结合部分条形码结构域408、核苷酸序列(例如，寡核苷酸)，后者可以与捕获探针的捕获结构域的至少一部分或全部杂交。分析物结合部分条形码结构域408可以包含本文所述的分析物结合部分条形码和捕获手柄序列。分析物结合部分404可以包括多肽和/或适配体。分析物结合部分404可以包括抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)。
图5是描绘固定有特征的捕获探针524与分析物捕获剂526之间的示例性相互作用的示意图。特征固定化的捕获探针524可以包括空间条形码508以及功能序列506和UMI510，如本文别处所述。捕获探针还可以包括能够结合分析物捕获试剂526的捕获结构域512。分析物捕获试剂526可以包括功能序列518、分析物结合部分条形码516和能够结合捕获探针524的捕获结构域512的捕获手柄序列514。分析物捕获试剂还可以包括允许捕获试剂条形码结构域516与分析物结合部分522偶联的接头520。
图6A、图6B和图6C是展示可以如何在基于阵列的***中利用链霉亲和素细胞标签来产生在空间上加条形码的细胞或细胞内容物的示意图。例如，如图6A所示，肽结合的主要组织相容性复合物(MHC)可以单独地与生物素(β2m)缔合并结合到链霉亲和素部分，使得链霉亲和素部分包括多个pMHC部分。这些部分中的每一个都可以与TCR结合，使得链霉亲和素经由多重MCH/TCR结合相互作用与目标T细胞结合。多种相互作用协同起效，能够显著提高结合亲和力。这种提高的亲和力可以改善对T细胞的标记，还可以降低标签从T细胞表面解离的可能性。如在图6B中所示，捕获试剂条形码结构域601可以用抗生蛋白链菌素602修饰并与生物素化的MHC 603的多个分子接触，使得生物素化的MHC 603分子与抗生蛋白链菌素缀合的捕获试剂条形码结构域601偶联。所得到的是带条形码的MHC多聚体复合物605。如在图6B中所示，捕获试剂条形码结构域序列601可以将MHC鉴定为其相关标记，并且还包括任选的功能序列诸如与其它寡核苷酸杂交的序列。如在图6C中所示，一种实施例寡核苷酸是捕获探针606，其包含互补序列(例如，对应于C C C的rGrGrG)、条形码序列和其它功能序列，例如UMI、衔接子序列(例如，包含测序引物序列(例如，R1或部分R1(“pR1”)、R2)、流动池附着序列(例如，P5或P7或其部分序列))等。在某些情况下，捕获探针606可以首先与特征(例如，凝胶珠子)相关联并从特征中释放。在其它实施方案中，捕获探针606可以与MHC-寡核苷酸复合物605的捕获试剂条形码结构域601杂交。然后可以在引物延伸反应中延伸杂交的寡核苷酸(间隔区C C C和间隔区rGrGrG)，从而产生包含对应于两个空间条形码序列(与捕获探针相关联的空间条形码，以及与MHC-寡核苷酸复合物相关联的条形码)中的每一者的序列的构建体。在一些情况下，这些对应序列中的一者或两者可以是捕获探针606或捕获剂条形码结构域601中的原始序列的互补序列。在其他实施方案中，捕获探针和捕获剂条形码结构域连接在一起。所得构建体可以任选地进一步加工(例如，以添加任何另外的序列和/或用于清除)，然后进行测序。如本文别处所述，源自捕获探针606空间条形码序列的序列可以用于鉴定特征，且源自捕获试剂条形码结构域601上的空间条形码序列的序列可以用于鉴定结合在细胞表面上的特定肽MHC复合物604(例如，当使用MHC-肽文库筛选免疫细胞或免疫细胞群体时)。
对分析物捕获剂的附加描述可以在WO 2020/176788的第(II)(b)(ix)节和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(b)(viii)节中找到。
至少有两种方法将空间条形码与一个或多个相邻细胞相关联，使得该空间条形码将一个或多个细胞和/或一个或多个细胞的内容物标识为与特定空间位置相关联。一种方法是将分析物或分析物替代物(例如，中间剂)推出细胞并推向在空间上加条形码的阵列(例如，包括在空间上加条形码的捕获探针)。另一种方法是将在空间上加条形码的捕获探针从阵列上裂解，然后将在空间上加条形码的捕获探针推向生物样品以及/或者推到生物样品之中或之上。
在一些情况下，捕获探针可以被构造成从模板(例如，DNA或RNA模板，诸如分析物或中间剂(例如，连接的探针(例如，连接产物)或分析物捕获剂)，或其一部分)或其衍生物引发、复制且因此产生任选地加条形码的延伸产物(参见例如，WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663有关延伸的捕获探针的第(II)(b)(vii)节)。在一些情况下，捕获探针可以被构造成与模板(例如，DNA或RNA模板，诸如分析物或中间剂，或其一部分)形成连接的探针(例如，连接产物)，从而产生用作模板替代物的连接产物。
如本文所用，“延伸的捕获探针”是指在捕获探针的末端(例如，3’或5’端)添加了额外的核苷酸，由此使该捕获探针的全长延伸的捕获探针。例如，“延伸的3’端”表示额外的核苷酸添加到捕获探针的最靠近3’端的核苷酸以延伸该捕获探针的长度，例如，通过用于延伸核酸分子的聚合反应，包括由聚合酶(例如，DNA聚合酶或逆转录酶)催化的模板化聚合。在一些实施方案中，延伸捕获探针包括向捕获探针的3’端添加核酸序列，该核酸序列与特异性地结合捕获探针的捕获结构域的分析物或中间剂的核酸序列互补。在一些实施方案中，使用逆转录来延伸捕获探针。在一些实施方案中，使用一种或多种DNA聚合酶来延伸捕获探针。延伸的捕获探针包括捕获探针的序列和捕获探针的空间条形码的序列。
在一些实施方案中，将延伸的捕获探针扩增(例如，在本体溶液中或在阵列上)以产生足以用于下游分析(例如，经由DNA测序)的量。在一些实施方案中，延伸的捕获探针(例如，DNA分子)充当扩增反应(例如，聚合酶链式反应)的模板。
空间分析方法的附加变型(在一些实施方案中包括成像步骤)在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(a)节中有所描述。对所捕获分析物(和/或中间剂或其部分)的分析，例如，包括样品去除、延伸捕获探针、测序(例如，对裂解的延伸捕获探针和/或与延伸捕获探针互补的cDNA分子进行测序)、阵列上测序(例如，使用例如原位杂交方法或原位连接方法)、时间分析和/或邻近捕获，在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(g)节中有所描述。WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(h)节中描述了一些质量控制措施。
空间信息可提供具有生物学和/或医学重要性的信息。例如，本文描述的方法和组合物可允许：鉴定疾病或病症的一种或多种生物标志物(例如，诊断生物标志物、预后生物标志物和/或用于确定治疗功效的生物标志物)；鉴定用于治疗疾病或病症的候选药物靶标；鉴定(例如，诊断)受试者患有某疾病或病症；鉴定受试者的疾病或病症的阶段和/或预后；鉴定受试者具有增加的发生某疾病或病症的可能性；监测受试者的疾病或病症的进展；确定受试者的疾病或病症的治疗功效；鉴定治疗对于疾病或病症有效的患者亚群；改进患有某疾病或病症的受试者的治疗；选择参与临床试验的受试者；和/或选择针对患有某疾病或病症的受试者的治疗。
空间信息可提供具有生物学重要性的信息。例如，本文所述的方法和组合物能够允许：识别转录组表达谱和/或蛋白质组表达谱(例如，在健康组织和/或患病组织中)；识别非常接近的多种分析物类型(例如，最近邻分析)；确定患病组织中上调和/或下调的基因和/或蛋白质；表征肿瘤微环境；表征肿瘤免疫反应；表征细胞类型和它们在组织中的共定位；以及识别组织内的遗传变体(例如，基于与特定疾病或异常生物标志物相关联的基因表达谱和/或蛋白质表达谱)。
通常，对于基于空间阵列的方法，基板用作将捕获探针直接或间接地附接到阵列特征的支持物。“特征”是充当空间分析中使用的各种分子实体的支持物或储存库的实体。在一些实施方案中，阵列中的一些或全部特征被功能化，以便捕获分析物。示例性基板在WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(c)节中有所描述。阵列的示例性特征和几何属性可以在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(d)(i)节、第(II)(d)(iii)节和第(II)(d)(iv)节中找到。
一般来讲，当生物样品与包括捕获探针的基板(例如，具有嵌入、点样、印刷、制造在基板上的捕获探针的基板，或具有包括捕获探针的特征(例如，珠粒、孔)的基板)接触时，可以捕获分析物和/或中间剂(或其部分)。如本文所用，生物样品与基板的“接触”是指使得捕获探针可以与来自生物样品的分析物相互作用(例如，共价或非共价结合(例如，杂交))的任何接触(例如，直接或间接)。捕获可以主动实现(例如，使用电泳)或被动实现(例如，使用扩散)。分析物捕获在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(e)节中进一步描述。
在一些情况下，可以通过将具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，肽、脂质或核酸分子)附接到和/或引入生物样品(例如，生物样品中的细胞)来进行空间分析。在一些实施方案中，将具有多个条形码(例如，多个空间条形码)的多个分子(例如，多个核酸分子)引入生物样品(例如，生物样品中的多个细胞)，以用于空间分析。在一些实施方案中，在将具有条形码的分子附接到和/或引入生物样品之后，可以将生物样品物理分离(例如，解离)成单细胞或细胞群以供分析。一些这样的空间分析方法在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(III)节中有所描述。
在一些情况下，可以通过检测与分析物杂交的多个寡核苷酸来进行空间分析。例如，在一些情况下，可以使用RNA模板化连接(RTL)来进行空间分析。之前已描述过RTL方法。参见例如，Credle等人，Nucleic Acids Res.2017年8月21日；45(14)：e128。通常，RTL包括两个寡核苷酸与分析物(例如，RNA分子，如mRNA分子)上的相邻序列的杂交。在一些情况下，寡核苷酸为DNA分子。在一些情况下，寡核苷酸中的一个在3’末端处包括至少两个核糖核酸碱基和/或另一个寡核苷酸在5’末端处包括磷酸化核苷酸。在某些情况下，两个寡核苷酸之一包括捕获结构域(例如，聚A序列、非均聚序列)。在与分析物杂交之后，连接酶(例如，SplintR连接酶)将两个寡核苷酸连接在一起，产生连接的探针(例如，连接产物)。在某些情况下，两个寡核苷酸与彼此不相邻的序列杂交。例如，两个寡核苷酸的杂交在杂交的寡核苷酸之间产生间隙。在某些情况下，聚合酶(例如，DNA聚合酶)可以在连接之前延伸寡核苷酸之一。连接后，连接的探针(例如，连接产物)从分析物释放。在一些情况下，使用核酸内切酶(例如，核糖核酸酶A、核糖核酸酶C、核糖核酸酶H或核糖核酸酶I)来释放连接探针(例如，连接产物)。然后可以通过阵列上的捕获探针(例如，代替对分析物的直接捕获)来捕获释放的连接探针(例如，连接产物)，任选地扩增并测序，从而确定生物样品中分析物的位置，并任选地确定生物样品中分析物的丰度。
在分析空间信息期间，获得与分析物相关联的空间条形码的序列信息，该序列信息可以用于提供关于生物样品中分析物的空间分布的信息。可以使用各种方法来获得空间信息。在一些实施方案中，特定的捕获探针和它们捕获的分析物与基板上特征的阵列中的特定位置相关联。例如，特定的空间条形码可在阵列制造之前与特定的阵列位置相关联，并且空间条形码的序列可与特定的阵列位置信息一起存储(例如，存储在数据库中)，以便每个空间条形码唯一地映射到一个特定的阵列位置。
或者，特定的空间条形码可在制造期间沉积在特征阵列中的预定位置处，使得在每个位置处仅存在一种类型的空间条形码，以便空间条形码唯一地与阵列的单个特征相关联。必要时，可使用任何本文描述的方法对阵列解码，使得空间条形码唯一地与阵列特征位置相关联，并且可如上所述存储此映射。
当在空间信息的分析期间获得关于捕获探针和/或分析物的序列信息时，可通过参考唯一地关联每个空间条形码与阵列特征位置的存储信息来确定捕获探针和/或分析物的位置。以这种方式，特定的捕获探针和所捕获分析物与特征阵列中的特定位置相关联。每个阵列特征位置表示相对于阵列的坐标参考点(例如，阵列位置、基准标记物)的位置。因此，每个特征位置在阵列的坐标空间中均具有一个“地址”或位置。
一些示例性空间分析工作流程在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的示例性实施方案章节中有所描述。参见例如WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663中以“在本文描述的工作流程的一些非限制性实例中，可将样品浸入......”开头的示例性实施方案。另外参见例如Visium空间基因表达试剂盒用户指南(例如，Rev C，日期为2020年6月)和/或Visium空间组织优化试剂盒用户指南(例如，RevC，日期为2020年7月)。
在一些实施方案中，可使用专用硬件和/或软件来进行空间分析，如WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(e)(ii)和/或(V)节中描述的任何***，或者WO 2020/123320的“用于成像的对照载片，使用对照载片和基板进行成像的方法，使用对照载片和基板进行成像的***，和/或样品和阵列对准装置及方法，信息标签”部分中描述的装置或方法中的任何一种或多种。
用于执行空间分析的合适***可以包括诸如用于容纳生物样品的腔室(例如，流动池或可密封的流体密封腔室)之类的部件。生物样品可以安装在例如生物样品保持器中。一个或多个流体腔室可以经由流体导管连接到前述腔室和/或样品保持器，流体可以经由流体泵、真空源或联接到流体导管产生压力梯度以驱动流体流动的其他装置输送到前述腔室和/或样品保持器中。一个或多个阀也可以连接到流体导管，以调节试剂从储存器到前述腔室和/或样品保持器的流动。
该***可以任选地包括控制单元，该控制单元包括一个或多个电子处理器、输入接口、输出接口(诸如显示器)和存储单元(例如固态存储介质，诸如但不限于磁存储介质、光存储介质或其他固态存储介质，持久的、可写的和/或可重写的存储介质)。该控制单元可以任选地经由网络连接到一个或多个远程装置。该控制单元(及其部件)一般可以执行本文所述步骤和功能中的任一种。在***连接到远程装置的情况下，一个或多个远程装置可以执行本文所述步骤或特征中的任一种。该***可以任选地包括一个或多个用于捕获图像的检测器(例如，CCD、CMOS)。该***还可以任选地包括用于照射样品的一个或多个光源(例如，基于LED、基于二极管、激光器)、具有特征的基板、来自基板上捕获的生物样品的分析物，以及各种对照和校准介质。
该***可以任选地包括在有形存储介质和硬件部件(诸如专用集成电路)中的一者或多者中编码和/或实现的软件指令。这些软件指令在由控制单元(特别是电子处理器)或集成电路执行时，可以使得控制单元、集成电路或执行软件指令的其他部件执行本文所述方法步骤或功能中的任一种。
在一些情况下，本文所述的***可以检测(例如，记录图像)阵列上的生物样品。用于检测阵列上的生物样品的示例性方法在PCT申请号2020/061064和/或美国专利申请序列号16/951,854中有所描述。
在将分析物从生物样品转移到基板上的特征阵列之前，可以将生物样品与阵列对准。生物样品与包括捕获探针的特征阵列对准可以促进空间分析，其可以用于检测生物样品中不同位置内分析物存在和/或水平的差异，例如，以生成分析物存在和/或水平的三维图。用于生成分析物存在和/或水平的二维图和/或三维图的示例性方法在PCT申请号2020/053655中有所描述，空间分析方法在WO 2020/061108和/或美国专利申请序列号16/951，864中有大致描述。
在一些情况下，可以使用一个或多个基准标记物(例如，放置在成像***的视野中且出现在所产生的图像中的物体)将分析物存在和/或水平的图与生物样品的图像对准，如WO 2020/123320、PCT申请号2020/061066和/或美国专利申请序列号16/951,843的“基板属性”章节、“用于成像的对照载片”章节中所述。基准标记物可以用作参考点或测量标度，用于对准(例如，对准样品和阵列、对准两个基板、确定样品或阵列在基板上相对于基准标记物的位置)以及/或者用于尺寸和/或距离的定量测量。
该夹层过程在PCT专利申请公布号WO 2020/123320中有所描述，该专利申请公布全文以引用方式并入本文。
II.用于捕获分析物及其衍生物的方法、组合物、装置和***
(a)引言
本文提供了用于分析生物样品中的核酸或蛋白质分析物的位置和丰度的方法、装置、组合物和***。在一些情况下，这些方法包括将具有生物样品的第一基板与包括多个捕获探针的第二基板对准(即，夹持在一起)，从而将生物样品“夹持”在这两个基板之间。在生物样品与具有多个探针(在任一种情况下)的基板相互作用时，如本文所提供的，可以测定生物样品中核酸或蛋白质分析物的位置和丰度。该方法的优点在于，本文所提供的步骤在分析物或分析物衍生的分子之前通过捕获探针进行，大多数(如果不是全部)步骤可以在不具有捕获探针的基板上进行，从而提供了成本有效的方法。
本文所提供的方法和***可以应用于分析物或分析物衍生的分子。如本文所用，分析物衍生的分子包括但不限于来自以RNA作为模板的连接(RTL)测定的连接探针(例如，连接产物)、逆转录产物(例如，延伸的捕获探针)和分析物结合部分条形码(例如，鉴定该分析物结合部分(例如，抗体)的结合部分条形码)。在一些实施方案中，分析物或分析物衍生的分子包括RNA和/或DNA。在一些实施方案中，分析物或分析物衍生的分子包括一种或多种蛋白质。
在一些情况下，本文所公开的方法、装置、组合物和***提供分析物或分析物衍生分子从生物样品的有效释放，使得该分析物或分析物衍生分子可以使用本文所公开的方法轻易地捕获或检测。
在一些情况下，本文所公开的方法、装置、组合物和***允许使用包含多个捕获探针的单个阵列从不同生物样品中检测分析物或分析物衍生的分子。因此，在一些情况下，这些方法、装置、组合物和***允许从多个样品中连续捕获分析物或分析物衍生的分子。然后，这些分析物或分析物衍生的分子可以使用生物样品特定的索引序列进行去多重化，以鉴定其生物样品来源。
下文提供了本文所公开的方法、装置、组合物和***的实施方案。
(A)示例性生物样品
如本文所用的生物样品可以是本文所述或本领域已知的任何合适的生物样品。在一些实施方案中，生物样品是组织。在一些实施方案中，组织样品是实体组织样品。在一些实施方案中，生物样品是组织切片。在一些实施方案中，组织被快速冷冻并切片。可使用本文描述的或本领域已知的任何合适的方法来快速冷冻组织样品和对组织样品切片。在一些实施方案中，生物样品，例如组织，在切片之前使用液氮快速冷冻。在一些实施方案中，使用冷冻切片来执行切片。在一些实施方案中，所述方法还在冷冻切片之后包括解冻步骤。在一些实施方案中，生物样品(例如，组织样品)被固定在例如甲醇、丙酮、PFA中，或者经***固定和石蜡包埋(FFPE)。在一些实施方案中，生物样品包含完整细胞。在一些实施方案中，生物样品是细胞团块，例如固定的细胞团块，例如FFPE细胞团块。在本文所公开的RTL方法的一些实例中使用FFPE样品。直接捕获固定样品的RNA的局限性在于，固定(例如，FFPE)样品的RNA完整性可能低于新鲜样品，从而使得直接捕获RNA更加困难，例如，通过捕获共同序列，诸如mRNA分子的多聚(A)尾。然而，通过利用与转录组中的RNA目标序列杂交的RTL探针寡核苷酸，可以避免需要RNA分析物具有完整的多聚(A)尾和目标序列。因此，RTL探针可以用于有利地改进对固定样品的捕获和空间分析。
在本文所述方法的每个步骤之前、期间和/或之后，可以对生物样品(例如，组织样品)进行染色和成像。可使用本文描述的或本领域已知的任何方法来对生物样品染色和/或成像。在一些实施方案中，成像在对样品脱氨之前进行。在一些实施方案中，使用H&E染色方法对生物样品染色。在一些实施方案中，对组织样品染色并成像约10分钟至约2小时(或本文描述的该范围的任何子范围)。不同类型的生物样品的染色和成像可能需要额外的时间。
组织样品可以从受试者(例如，人类受试者)的组织或器官中的任何合适位置获得。在一些情况下，样品是人类样品。在一些情况下，样品是人类***组织样品。在一些情况下，样品是人类大脑组织样品。在一些实施方案中，样品是胚胎样品。胚胎样品可以是非人类胚胎样品。在一些情况下，样品是小鼠胚胎样品。
(B)示例性的第一基板和第二基板
在一些情况下，将生物样品放置(例如，安装或以其他方式固定)在第一基底上。第一基底可以是生物样品可安装在其上的任何固体或半固体支撑物。在一些情况下，第一基底为载片。在一些情况下，载片为玻璃载片。在一些实施方案中，基底由玻璃、硅、纸、水凝胶、聚合物整料或本领域已知的其他材料制成。在一些实施方案中，第一基底由惰性材料或基质组成(例如，玻璃载片)，所述基底已通过例如用包含将便于生物样品的安装的反应性基团的材料处理基底而官能化。
在一些实施方案中，第一基底不包括多个捕获探针(例如，阵列)，每个捕获探针包含空间条形码。
基底，例如第一基底和/或第二基底，通常可具有任何合适的形式或格式。例如，基底可以是平坦的、弯曲的，例如凸出或凹入弯曲的。例如，第一基底可朝向生物样品例如组织样品与第一基底之间发生相互作用的区域弯曲。在一些实施方案中，基底是平坦的，例如平面的、芯片(chip)或载片。基底可在第一基底内含有一个或多个图案化表面(例如，通道、孔、突起、脊、凹坑等)。
基底，例如第一基底和/或第二基底，可以是任何期望的形状。例如，基底通常可以是薄的平坦形状(例如，正方形或长方形)。在一些实施方案中，基底结构具有圆角(例如，以增加安全性或稳健性)。在一些实施方案中，基底结构具有一个或多个切角(例如，以与滑动夹具或十字工作台一起使用)。在其中基底结构平坦的一些实施方案中，基底结构可以是具有平坦表面的任何适宜类型的支撑物(例如，芯片或载片如显微镜载片)。
第一基底和/或第二基底可任选地包括各种结构，如但不限于突起、脊和通道。基底可被微图案化以限制分析物的横向扩散(例如，以提高空间分析的分辨率)。用这样的结构修饰的基底可被修饰以允许分析物、特征(例如，珠)或各个位点处的探针的关联。例如，其中用各种结构修饰基底的位点可与其他位点邻接或不邻接。
在一些实施方案中，第一基底和/或第二基底的表面使用技术如(但不限于)冲压、微蚀刻或模制技术进行修饰以包含一个或多个孔。在其中第一基底和/或第二基底包括一个或多个孔的一些实施方案中，第一基底可以是凹载片或腔载片。例如，可由第一基底和/或第二基底的表面上的一个或多个浅凹陷形成孔。在其中第一基底和/或第二基底包括一个或多个孔的一些实施方案中，可通过向第一基底结构的表面附接盒(例如，含有一个或多个腔室的盒)来形成孔。
在其中第一基底和/或第二基底被修饰为含有一个或多个结构(包括但不限于孔、突起、脊、特征或标记)的一些实施方案中，结构可包括物理改变的位点。例如，用各种结构修饰的第一基底和/或第二基底可包括物理性质，包括但不限于物理构造、磁力或压缩力、化学官能化位点、化学改变的位点和/或静电改变的位点。在其中第一基底被修饰为含有各种结构(包括但不限于孔、突起、脊、特征或标记)的一些实施方案中，结构以图案施加。替代性地，这些结构可以随机分布。
在一些实施方案中，第一基板在其表面上包括一个或多个标记，例如，以在本文所公开的夹层过程期间提供用于将生物样品的至少一部分与第二基板上的多个捕获探针对准的指导。例如，第一基板可以包括识别样品区的样品区指示符。在一些实施方案中，在本文所述的夹持过程期间，第一基板上的样品区指示符与第二基板上包括多个捕获探针的区域对准。在一些实施方案中，第一基板和/或第二基板可以包括基准标记。在一些实施方案中，第一基底和/或第二基底不包括基准标记。在一些实施方案中，第一基底不包括基准标记而第二基底包括基准标记。可使用包括但不限于印刷、喷砂和在表面上沉积的技术来制作这样的标记。
在一些实施方案中，可使用一个或多个基准标记即放置在成像***的视场中的物体来执行成像，所述物体将出现在所产生的图像中。基准标记通常用作参考点或测量标尺。基准标记可包括但不限于可检测标签如荧光、放射性、化学发光和比色标签。例如，Carter等人，Applied Optics46：421-427，2007)中描述了使用基准标记来稳定和定向生物样品，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，基准标记可以是物理颗粒(例如，纳米颗粒、微球、纳米球、珠、柱或本文描述的或本领域已知的任何其他示例性物理颗粒)。
在一些实施方案中，基准标记可存在于第一基底上以提供生物样品的定向。在一些实施方案中，可向第一基底联接微球以帮助生物样品的定向。在一些实例中，联接至第一基底的微球可产生光学信号(例如，荧光)。在一些实施方案中，可向第一基底联接量子点以帮助生物样品的定向。在一些实例中，联接至第一基底的量子点可产生光学信号。
在一些实施方案中，基准标记可以是可检测信号分子可与之相互作用而生成信号的固定分子。例如，可向当经受特定波长(或波长范围)的光时能够发荧光的化学部分连接或联接标记核酸。虽然不是必需的，但使用可使用用于检测标记的cDNA的相同条件(例如，成像条件)检测的标记可能是有利的。
在一些实施方案中，基准标记可随机放置在视场中。例如，含有荧光团的寡核苷酸可在第一基底上的随机位置处随机印刷、压印、合成或附接到第一基底(例如，玻璃载片)。可使组织切片与第一基底接触，使得含有荧光团的寡核苷酸接触或接近来自组织切片的细胞或细胞的组分(例如，mRNA或DNA分子)。可获得第一基底和组织切片的图像，并可确定荧光团在组织切片图像内的位置(例如，通过查看叠加了荧光团检测的组织切片光学图像)。在一些实施方案中，基准标记可精确地放置在视场中(例如，在第一基底上的已知位置处)。在这种情况下，基准标记可被压印、附接或合成在第一基底上并与生物样品接触。通常，拍摄样品和基准标记的图像，并可通过查看图像来确认基准标记在第一基底上的位置。
在一些实施方案中，基准标记可以是附接到第一基底的固定分子(例如，物理颗粒)。例如，基准标记可以是纳米颗粒，例如纳米棒、纳米线、纳米立方体、纳米金字塔或球形纳米颗粒。在一些实例中，纳米颗粒可以由重金属(例如，金)制成。在一些实施方案中，纳米颗粒可以由金刚石制成。在一些实施方案中，基准标记可以是肉眼可见的。
各种各样不同的第一基板可以用于前述目的。通常，第一基底可以是任何合适的支撑材料。示例性的第一基底包括但不限于玻璃、改性和/或官能化玻璃、水凝胶、膜(films/membranes)、塑料(包括例如丙烯酸类塑料、聚苯乙烯、苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、TeflonTM、环烯烃、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷、树脂、Zeonor、二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和改性硅)、碳、金属、无机玻璃、光纤束以及聚合物如聚苯乙烯、环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚丙烯、聚乙烯聚碳酸酯或其组合。
在上文讨论的第一基底材料的实例中，聚苯乙烯是适合于结合带负电荷的大分子的疏水性材料，因为它通常含有很少的亲水性基团。对于固定在玻璃载片上的核酸，通过增加玻璃表面的疏水性，可增加核酸的固定。这样的增强可允许相对更密堆积的形成(例如，提供改善的特异性和分辨率)。
在另一个实例中，第一基底可为流动池。流动池可由前述材料中的任何一种形成，并且可包括允许试剂、溶剂、特征和分析物通过流动池的通道。在一些实施方案中，将水凝胶包埋的生物样品组装在流动池中(例如，利用流动池将水凝胶引入到生物样品)。在一些实施方案中，不将水凝胶包埋的生物样品组装在流动池中。在一些实施方案中，然后可以如本文所述制备和/或等距膨胀水凝胶包埋的生物样品。
类似于第一基板(例如，没有捕获探针的基板)和/或第二基板的示例性基板在上文的部分(I)和WO 2020/123320中有所描述，该专利据此全文以引用方式并入本文。
(b)使用以RNA作为模板的连接来捕获核酸分析物
在一些实施方案中，本文所述的方法、装置、组合物和***利用以RNA作为模板的连接来检测分析物。如本文所用，在空间上“以RNA作为模板的连接”或“RTL”或简称“模板化连接”是这样一种过程：其中探针对中的各个探针寡核苷酸(例如，第一探针寡核苷酸、第二探针寡核苷酸)与生物样品(例如，组织样品)中的分析物(例如，RNA分子)的相邻序列杂交。然后将这些RTL探针寡核苷酸偶联(例如，连接)在一起，从而产生连接探针(例如，连接产物)。以RNA作为模板的连接在PCT公布号WO 2021/133849 A1和美国公布号US 2021/0285046 A1中公开，以上专利公布中的每一者均全文以引用方式并入本文。
使用RTL的一个优点是其允许增强对分析物(例如，低表达分析物)的检测，因为两个探针寡核苷酸都必须与分析物杂交才能发生偶联(例如，连接)反应。如本文所用，“偶联”是指两个探针寡核苷酸之间的相互作用，其产生包含这两个探针寡核苷酸的单个连接探针。在一些情况下，偶联是通过连接实现的。在一些情况下，偶联是通过一个探针寡核苷酸延伸到第二个探针寡核苷酸，之后连接来实现的。在一些情况下，通过杂交(例如，使用与这两个探针寡核苷酸中的每一者杂交的第三探针寡核苷酸)，之后使用第三探针寡核苷酸作为模板来延伸一个探针寡核苷酸或填充这两个探针寡核苷酸之间的序列间隙，由此实现偶联。
由偶联(例如，连接)这两个探针寡核苷酸而产生的连接探针(例如，连接产物)可以充当目标分析物(诸如分析物衍生的分子)的替代物。另外，应当理解，探针寡核苷酸对可以被设计成覆盖任何感兴趣的基因。例如，可以设计一对探针寡核苷酸，使得可以设想，每种分析物(例如，全外显子组、转录组、基因组)都可以使用这对探针寡核苷酸来检测。
在一些情况下，本文公开了用于分析生物样品中的分析物的方法，包括：(a)将第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸与分析物杂交，其中第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸各自包含与分析物的相邻序列基本上互补的序列，并且其中第二探针寡核苷酸包含捕获探针结合结构域；(b)将第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸偶联，从而生成包含捕获探针结合结构域的连接探针(例如，连接产物)；(c)使生物样品与试剂介质接触，该试剂介质包含透化剂和用于释放连接探针(例如，连接产物)的作用剂，从而(i)透化生物样品并且(ii)从分析物中释放连接探针(例如，连接产物)；以及(d)将连接探针(例如，连接产物)的捕获探针结合结构域与捕获探针的捕获结构域杂交，其中捕获探针包括：(i)空间条形码和(ii)捕获结构域。
本文还提供了用于分析安装在第一基板上的生物样品中的分析物的方法，包括：(a)将第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸与分析物杂交，其中第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸各自包含与分析物的相邻序列基本上互补的序列，并且其中第二探针寡核苷酸包含捕获探针结合结构域；(b)将第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸偶联(例如，连接)，从而生成包含捕获探针结合结构域的连接探针(例如，连接产物)；(c)将第一基板与包括阵列的第二基板对准，使得生物样品的至少一部分与阵列的至少一部分对准，其中该阵列包括多个捕获探针，其中多个捕获探针中的一个捕获探针包括：(i)空间条形码和(ii)捕获结构域；(d)当生物样品与阵列的至少一部分对准时，(i)从分析物释放连接探针(例如，连接产物)，然后(ii)被动或主动地将连接探针(例如，连接产物)从生物样品迁移到阵列；以及(e)将连接探针(例如，连接产物)的捕获探针结合结构域与捕获结构域杂交。
在一些实施方案中，将连接探针(例如，连接产物)从第一基板转移到第二基板的过程称为“夹持”过程。该夹层过程在PCT专利申请公布号WO 2020/123320中有所描述，该专利申请公布全文以引用方式并入本文。在本文描述的方法中，使位于一个基板上且具有捕获探针的阵列与位于不同基板上的生物样品接触，使得阵列与生物样品接触(例如，将这些基板夹持在一起)。在一些实施方案中，无需基板保持器的帮助，阵列和生物样品就可以接触(例如，夹持在一起)。在一些实施方案中，阵列基板和生物样品基板可以放置在被设计成将生物样品和阵列对准的基板保持器(例如，阵列对准装置)中。例如，基板保持器可以具有用于两个基板的位置保持器。在一些实施方案中，包括捕获探针的阵列可以定位在基板保持器的一侧上(例如，在第一基板位置保持器中)。在一些实施方案中，生物样品可以在第二位置保持器中放置在基板保持器的相邻侧上。在一些实施方案中，铰链可以位于两个基板位置保持器之间，这允许基板保持器闭合，例如，在这两个基板位置保持器之间形成夹层。在一些实施方案中，当基板保持器闭合时，生物样品和具有捕获探针的阵列在足以允许生物样品中存在的分析物与阵列的捕获探针相互作用的条件下彼此接触。例如，可以将干燥的透化试剂放置在生物样品上，然后再水合。透化溶液可以流过基板保持器，以透化生物样品，并允许生物样品中的分析物与捕获探针相互作用。此外，基板或透化溶液的温度可以用于引发或控制透化速率。例如，包括阵列的基板、包括生物样品的基板或这两种基板可以保持在低温下，以降低扩散和透化效率。在一些实施方案中，这些基板一旦被夹持，就可以加热，以引发透化并且/或者增加扩散效率。从透化组织释放的转录物可以扩散到阵列中，然后被捕获探针捕获。可以开启夹层，然后在阵列上进行cDNA合成。
在一些实施方案中，如本文所公开的方法包括将一个或多个探针寡核苷酸对(例如，RTL探针)与感兴趣的目标分析物(例如RNA，例如mRNA)的相邻或附近序列杂交。在一些实施方案中，这些探针寡核苷酸对包括与分析物互补或基本上互补的序列。例如，在一些实施方案中，每个探针寡核苷酸均包括与感兴趣的mRNA互补或基本上互补(例如，与感兴趣的mRNA的一部分序列互补)的序列。在一些实施方案中，每种目标分析物均包括第一目标区域和第二目标区域。在一些实施方案中，这些方法包括提供多个第一探针寡核苷酸和多个第二探针寡核苷酸，其中用于目标分析物的一对探针寡核苷酸包含第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸两者。在一些实施方案中，第一探针寡核苷酸与分析物的第一目标区域杂交，第二探针寡核苷酸与分析物的第二相邻或几乎相邻的目标区域杂交。
在一些情况下，探针寡核苷酸是DNA分子。在一些情况下，第一探针寡核苷酸是DNA分子。在一些情况下，第二探针寡核苷酸是DNA分子。在一些情况下，第一探针寡核苷酸在3’末端处包括至少两个核糖核酸碱基。在一些情况下，第二探针寡核苷酸在5’末端处包括磷酸化核苷酸。
可以使用本领域已知的方法来设计RTL探针。在一些情况下，将探针对设计成覆盖物种(例如，小鼠或人类)的整个转录组。在一些情况下，将RTL探针设计成覆盖转录组(例如，小鼠或人类)的子集。在一些情况下，本文所公开的方法利用约500个、约1000个、约2000个、约3000个、约4000个、约5000个、约6000个、约7000个、约8000个、约9000个、约10,000个、约15,000个、约20,000个或更多个探针对。
在一些实施方案中，用于RTL的探针寡核苷酸对中的一个探针寡核苷酸包括多聚(A)序列或其互补序列。在一些情况下，多聚(A)序列或其互补序列位于这一个探针寡核苷酸的5’末端上。在一些情况下，多聚(A)序列或其互补序列位于这一个探针寡核苷酸的3’末端上。在一些实施方案中，用于RTL的探针寡核苷酸对中的一个探针寡核苷酸包括简并序列或UMI序列。在一些实施方案中，UMI序列对特定的目标或一组目标具有特异性。在某些情况下，所述UMI序列或其互补序列位于探针寡核苷酸之一的5′端。在某些情况下，所述UMI序列或其互补序列位于探针寡核苷酸之一的3′端。
在一些情况下，分析物的第一目标区域和第二目标区域彼此直接相邻。在一些实施方案中，第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸与之杂交的互补序列彼此相距1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、约15个、约20个、约25个、约30个、约35个、约40个、约45个、约50个、约55个、约60个、约65个、约70个、约75个、约80个、约85个、约90个、约95个、约100个、约125个或约150个核苷酸。在偶联(例如，连接)之前，可以首先填充这些探针寡核苷酸之间的间隙，使用例如dNTP与聚合酶的组合，该聚合酶诸如聚合酶mu、DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶、VENT聚合酶、Taq聚合酶，以及/或者它们的任何组合、衍生物和变体(例如，工程化突变体)。在一些实施方案中，当第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸被一个或多个核苷酸彼此分开时，使用脱氧核糖核苷酸来延伸和偶联(例如，连接)第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸。
在一些情况下，第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸与相同转录物上的分析物杂交。在某些情况下，所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸与相同外显子上的分析物杂交。在某些情况下，所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸与不同外显子上的分析物杂交。在某些情况下，所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸与作为易位事件的结果的分析物杂交(例如，在癌症背景下)。本文提供的方法使得可能鉴定改变一种或两种探针寡核苷酸的杂交率的选择性剪接事件、易位事件和突变(例如，单核苷酸多态性、***、缺失、点突变)。
在某些实施方案中，本文公开的第一和/或第二探针包括：在3’末端处的至少两个核糖核酸碱基；一个功能序列；在5’末端处的一个磷酸化的核苷酸；和/或一个捕获探针结合结构域。在一些实施方案中，功能性序列是引物序列。
“捕获探针结合结构域”是与捕获探针中存在的特定捕获结构域互补的序列。在一些实施方案中，捕获探针结合结构域包括多聚(A)序列。在某些实施方案中，所述捕获探针结合结构域包括聚尿苷序列、聚胸苷序列或它们的组合。在某些实施方案中，所述捕获探针结合结构域包括随机序列(例如，随机六聚体或八聚体)。在某些实施方案中，所述捕获探针结合结构域与检测感兴趣的特定靶标的捕获探针中的捕获结构域互补。在某些实施方案中，提供了与捕获探针结合结构域相互作用的捕获探针结合结构域阻断部分。在某些实施方案中，捕获探针结合结构域阻断部分包括与捕获探针结合结构域互补或基本上互补的序列。在一些实施方案中，捕获探针结合结构域阻断部分防止捕获探针结合结构域在捕获探针存在时与捕获探针结合。在一些实施方案中，在将捕获探针结合结构域(例如，存在于连接探针(例如，连接产物)中)结合到捕获探针之前，去除捕获探针结合结构域阻断部分。在一些实施方案中，捕获探针结合结构域阻断部分包括多聚尿苷序列、多聚胸苷序列，或它们的组合。
探针寡核苷酸与目标分析物杂交可以发生在具有与探针寡核苷酸100％互补的序列的目标处。在一些实施方案中，杂交可以发生在具有与探针寡核苷酸至少(例如，至少约)80％、至少(例如，至少约)85％、至少(例如，至少约)90％、至少(例如，至少约)95％、至少(例如，至少约)96％、至少(例如，至少约)97％、至少(例如，至少约)98％或至少(例如，至少约)99％互补的序列的目标处。杂交之后，在一些实施方案中，第一探针寡核苷酸得以延伸。杂交之后，在一些实施方案中，第二探针寡核苷酸得以延伸。例如，在一些情况下，第一探针寡核苷酸与第二探针寡核苷酸上游的目标序列杂交，而在其他情况下，第一探针寡核苷酸与第二探针寡核苷酸下游的目标序列杂交。
在一些实施方案中，本文所公开的方法包括在第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸杂交之后的洗涤步骤。该洗涤步骤除去任何未结合的寡核苷酸，并且可以使用本领域已知的任何技术来进行。在一些实施方案中，使用预杂交缓冲液来洗涤样品。在某些实施方案中，使用磷酸盐缓冲液。在某些实施方案中，执行多个洗涤步骤以除去未结合的寡核苷酸。例如，减少生物样品中存在的未杂交探针的量是有利的，因为这些未杂交探针可能干扰下游的应用和方法。
在一些实施方案中，在探针寡核苷酸(例如，第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸)与目标分析物杂交之后，探针寡核苷酸(例如，第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸)偶联(例如，连接)在一起，从而产生与目标分析物互补的单个连接探针(例如，连接产物)。如本文所述，连接可以通过酶促方法或化学方法来进行。例如，第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸与分析物的第一目标区域和第二目标区域杂交，并且这些探针寡核苷酸经历核酸反应以将它们连接在一起。例如，可以使用连接酶(例如，T4 RNA连接酶(Rnl2)、SplintR连接酶或T4 DNA连接酶)对这些探针进行酶促连接反应。参见例如，Zhang L.等人，Archaeal RNA ligase from thermoccocus kodakarensis for template dependentligation RNA Biol.2017；14(1)：36-44中对KOD连接酶的描述。本领域技术人员应当理解，各种试剂、缓冲液、辅因子等均可以用于连接反应中，具体取决于所使用的连接酶。
在一些实施方案中，第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸位于连续核酸序列上。在一些实施方案中，第一探针寡核苷酸位于连续核酸序列的3’末端。在一些实施方案中，第一探针寡核苷酸位于连续核酸序列的5’末端。在一些实施方案中，第二探针寡核苷酸位于连续核酸序列的3’末端。在一些实施方案中，第二探针寡核苷酸位于连续核酸序列的5’末端。
在一些实施方案中，该方法还包括将第三探针寡核苷酸与第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸杂交，使得第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸彼此邻接。在一些实施方案中，第三探针寡核苷酸包含与第一探针寡核苷酸中杂交至第三探针寡核苷酸的一部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的序列。在一些实施方案中，第三探针寡核苷酸包含与第一探针寡核苷酸中杂交至第三探针寡核苷酸的一部分100％互补的序列。在一些实施方案中，第三探针寡核苷酸包含与第二探针寡核苷酸中杂交至第三探针寡核苷酸的一部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的序列。在一些实施方案中，第三探针寡核苷酸包含与第二探针寡核苷酸中杂交至第三探针寡核苷酸的一部分100％互补的序列。
在一些实施方案中，用于鉴定暴露于不同透化条件的生物样品中分析物的位置的方法包括：(a)使生物样品与基板接触，其中该基板包括多个捕获探针，其中多个捕获探针中的一个捕获探针包括捕获结构域；(b)使生物样品与第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸接触，其中第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸基本上与分析物的相邻序列互补，并且其中第二探针寡核苷酸包括能够结合捕获探针的捕获结构域的捕获探针结合结构域；(c)将第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸与分析物的相邻序列杂交；(d)将第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸偶联(例如，连接)，从而产生与分析物基本上互补的连接探针(例如，连接探针(例如，连接产物))；(e)从分析物中释放连接探针(例如，连接产物)；(f)将连接探针(例如，连接产物)的捕获探针结合结构域与捕获探针的杂交结构域杂交；(g)将挂锁寡核苷酸与结合到捕获结构域的连接探针(例如，连接产物)杂交(例如，使得挂锁寡核苷酸环化)，其中该挂锁寡核苷酸包括：(i)与连接探针(例如，连接产物)的第一部分基本上互补的第一序列，(ii)骨架序列，和(iii)与连接探针(例如，连接产物)的第二部分基本上互补的第二序列；以及(i)连接并扩增环化挂锁寡核苷酸(例如，使用滚环扩增，使用环化挂锁寡核苷酸作为模板)，从而产生扩增的环化挂锁寡核苷酸，然后使用该扩增的环化挂锁寡核苷酸来鉴定生物样品中分析物的位置。
在一些实施方案中，该方法还包括在释放步骤之前扩增连接探针(例如，连接产物)。在一些实施方案中，整个连接探针(例如，连接产物)被扩增。在一些实施方案中，只有部分连接探针(例如，连接产物)被扩增。在一些实施方案中，扩增是等温的。在一些实施方案中，扩增不是等温的。可以使用本文所述的任何方法来进行扩增，诸如但不限于链置换扩增反应、滚环扩增反应、连接酶链式反应、转录介导的扩增反应、等温扩增反应，以及/或者10环介导的扩增反应。在一些实施方案中，扩增连接探针(例如，连接产物)产生扩增的连接探针(例如，连接产物)，其包括：(i)特异性地结合捕获结构域的连接探针(例如，连接产物)的全部或部分序列，或者其互补序列，以(ii)空间条形码的全部或部分序列，或者其互补序列。
在一些实施方案中，该方法还包括确定：(i)连接探针(例如，连接产物)的全部或部分序列，或者其互补序列，和(ii)空间条形码的全部或部分序列，或者其互补序列。在一些实施方案中，该方法还包括使用(i)和(ii)的确定序列来确定生物样品中分析物的位置和丰度。
在一些实施方案中，在第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸偶联(例如，连接)产生连接产物之后，将连接探针(例如，连接产物)从分析物释放。为了释放连接探针(例如，连接产物)，使用核糖核酸内切酶(例如，核糖核酸酶A、核糖核酸酶C、核糖核酸酶H或核糖核酸酶I)。核糖核酸内切酶(诸如核糖核酸酶H)特异性地裂解RNA:DNA杂交体中的RNA。在一些实施方案中，连接探针(例如，连接产物)通过酶促方法释放。在一些实施方案中，使用核糖核酸内切酶从分析物中释放探针。在一些实施方案中，核糖核酸内切酶是一种或多种核糖核酸酶H。在一些实施方案中，核糖核酸酶H是核糖核酸酶H1或核糖核酸酶H2。
在一些实施方案中，释放连接探针(例如，连接产物)包括使生物样品与试剂介质接触，该试剂介质包含透化剂和用于释放连接探针(例如，连接产物)的作用剂，从而透化生物样品并且从分析物中释放连接探针(例如，连接产物)。在一些实施方案中，用于释放连接探针(例如，连接产物)的作用剂包括核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶是核酸内切酶。在一些实施方案中，核酸酶是核酸外切酶。在一些实施方案中，核酸酶包括核糖核酸酶。在一些实施方案中，核糖核酸酶选自核糖核酸酶A、核糖核酸酶C、核糖核酸酶H或核糖核酸酶I。
在一些实施方案中，试剂介质包含聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，PEG是约PEG 2K至约PEG 16K。在一些实施方案中，PEG是PEG 2K、3K、4K、5K、6K、7K、8K、9K、10K、11K、12K、13K、14K、15K或16K。在一些实施方案中，PEG以约2％至25％、约4％至约23％、约6％至约21％、或约8％至约20％(v/v)的浓度存在。
在一些实施方案中，试剂介质包括润湿剂。
在一些情况下，在产生连接探针(例如，连接产物)之后，本文所公开的方法包括同时用以下物质来处理生物样品：透化剂，诸如蛋白酶K(以透化生物样品)，以及释放剂，诸如核酸内切酶，诸如核糖核酸酶H(以从分析物中释放连接探针(例如，连接产物))。在一些情况下，透化步骤和释放步骤同时发生。在一些情况下，透化步骤发生在释放步骤之前。在一些实施方案中，透化剂包括蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶选自胰蛋白酶、胃蛋白酶、弹性蛋白酶或蛋白酶K。在一些实施方案中，蛋白酶是肽链内切酶。可以使用的肽链内切酶包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、梭菌蛋白酶、谷氨酰肽链内切酶(GluC)、ArgC、肽基-asp肽链内切酶(ApsN)、肽链内切酶LysC和肽链内切酶LysN。在一些实施方案中，肽链内切酶是胃蛋白酶。
在一些实施方案中，试剂介质还包含去污剂。在一些实施方案中，去污剂选自十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基肌氨酸钠、皂苷、Triton X-100TM或Tween-20TM。在一些实施方案中，试剂介质包含少于5w/v％的选自十二烷基硫酸钠(SDS)和十二烷基肌氨酸钠的去污剂。在一些实施方案中，试剂介质包含至少5w/v％的选自SDS和十二烷基肌氨酸钠的去污剂。在一些实施方案中，试剂介质不包含SDS和十二烷基肌氨酸钠。
在一些实施方案中，生物样品和阵列与试剂介质接触约1分钟至约60分钟(例如，约1分钟至约55分钟、约1分钟至约50分钟、约1分钟至约45分钟、约1分钟至约40分钟、约1分钟至约35分钟、约1分钟至约30分钟、约1分钟至约25分钟、约1分钟至约20分钟、约1分钟至约15分钟、约1分钟至约10分钟、约1分钟至约5分钟、约5分钟至约60分钟、约5分钟至约55分钟、约5分钟至约50分钟、约5分钟至约45分钟、约5分钟至约40分钟、约5分钟至约35分钟、约5分钟至约30分钟、约5分钟至约25分钟、约5分钟至约20分钟、约5分钟至约15分钟、约5分钟至约10分钟、约10分钟至约60分钟、约10分钟至约55分钟、约10分钟至约50分钟、约10分钟至约45分钟、约10分钟至约40分钟、约10分钟至约35分钟、约10分钟至约30分钟、约10分钟至约25分钟、约10分钟至约20分钟、约10分钟至约15分钟、约15分钟至约60分钟、约15分钟至约55分钟、约15分钟至约50分钟、约15分钟至约45分钟、约15分钟至约40分钟、约15分钟至约35分钟、约15分钟至约30分钟、约15分钟至约25分钟、约15分钟至约20分钟、约20分钟至约60分钟、约20分钟至约55分钟、约20分钟至约50分钟、约20分钟至约45分钟、约20分钟至约40分钟、约20分钟至约35分钟、约20分钟至约30分钟、约20分钟至约25分钟、约25分钟至约60分钟、约25分钟至约55分钟、约25分钟至约50分钟、约25分钟至约45分钟、约25分钟至约40分钟、约25分钟至约35分钟、约25分钟至约30分钟、约30分钟至约60分钟、约30分钟至约55分钟、约30分钟至约50分钟、约30分钟至约45分钟、约30分钟至约40分钟、约30分钟至约35分钟、约35分钟至约60分钟、约35分钟至约55分钟、约35分钟至约50分钟、约35分钟至约45分钟、约35分钟至约40分钟、约40分钟至约60分钟、约40分钟至约55分钟、约40分钟至约50分钟、约40分钟至约45分钟、约45分钟至约60分钟、约45分钟至约55分钟、约45分钟至约50分钟、约50分钟至约60分钟、约50分钟至约55分钟，或约55分钟至约60分钟)。在一些实施方案中，生物样品和阵列与试剂介质接触约30分钟。
在一些实施方案中，连接探针(例如，连接产物)包括捕获探针结合结构域，其可以与捕获探针(例如，直接或间接地固定在基板上的捕获探针)杂交。在一些实施方案中，捕获探针包括空间条形码和捕获结构域。在一些实施方案中，连接探针(例如，连接产物)的捕获探针结合结构域特异性地结合捕获探针的捕获结构域。
在一些实施方案中，本文所提供的方法包括将生物样品安装在第一基板上，然后将第一基板与包括阵列的第二基板对准，使得生物样品的至少一部分与阵列的至少一部分对准，其中该阵列包括多个捕获探针。在连接探针(例如，连接产物)与捕获探针杂交之后，可以进行如本文所公开的下游方法。
在一些实施方案中，从与这部分阵列对准的这部分生物样品中释放的连接探针(例如，连接产物)的至少50％被这部分阵列的捕获探针捕获。在一些实施方案中，在生物样品正下方的斑点中检测到至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的连接探针(例如，连接产物)。
在一些实施方案中，捕获探针包括多聚(T)序列。在一些实施方案中，捕获探针包括对分析物具有特异性的序列。在一些实施方案中，捕获探针包括功能性结构域。在一些实施方案中，捕获探针还包括一个或多个功能性结构域、独特分子标识符(UMI)、裂解结构域，以及它们的组合。在一些实施方案中，捕获探针结合结构域包括多聚(A)序列。在一些实施方案中，捕获探针结合结构域包括与检测感兴趣的目标分析物的捕获探针的捕获结构域互补的序列。在一些实施方案中，分析物是RNA。在一些实施方案中，分析物是mRNA。
在一些实施方案中，连接探针(例如，连接产物)(例如，分析物衍生的分子)包括捕获探针结合结构域，其可以与捕获探针(例如，直接或间接地固定在基板上的捕获探针)杂交。本文所提供的方法包括使生物样品与基板接触，其中捕获探针附连到基板(例如，直接或间接地固定到基板)。在连接探针(例如，连接产物)与捕获探针杂交之后，可以进行如本文所公开的下游方法(例如，测序、原位分析诸如RCA)。
在一些实施方案中，该方法还包括分析生物样品中的不同分析物。在一些实施方案中，分析不同分析物包括：(a)进一步使生物样品与多种分析物捕获剂接触，其中多种分析物捕获剂中的一种分析物捕获剂包括分析物结合部分和捕获剂条形码结构域，其中该分析物结合部分特异性地结合不同分析物，并且其中该捕获剂条形码结构域包括分析物结合部分条形码和与捕获探针的捕获结构域互补的捕获柄序列；以及(b)将分析物捕获序列与捕获结构域杂交。
图16A中示出了用于分析蛋白质和RNA分析物的工作流程的一个示例性实施方案。如图16A所示，安装在第一基板上的固定组织样品(例如，安装在载片上的组织样品)解交联，之后探针对与核酸分析物杂交。也如图16A所示，探针对的第一探针和第二探针相连，例如连接。在将样品与特异性地结合不同分析物(例如，蛋白质分析物)的分析物捕获剂(例如，抗体)一起孵育之前，任选地(例如，用缓冲液)洗涤样品。分析物捕获剂包括捕获剂条形码结构域。在一些实施方案中，分析物捕获剂是具有寡核苷酸标签的抗体，该寡核苷酸标签包括捕获剂条形码结构域。在一些实施方案中，在如本文所述的夹层条件下，连接探针(例如，连接产物)和抗体寡核苷酸标签从组织中释放。对于夹层条件，安装有组织的载片可以与阵列对准，然后在如本文所述夹层构造中用试剂介质透化(参见例如，图16B)。在一些实施方案中，试剂介质包含核糖核酸酶和透化剂(例如，蛋白酶K)。透化将连接探针(例如，连接产物)和捕获剂条形码结构域释放，用于捕获到包括具有多个捕获探针的阵列的第二基板上(参见例如，图16B)。在捕获连接探针和捕获剂条形码结构域之后，可以移除组织载片(例如，夹层可以“开启”或“破裂”)。
在一些实施方案中，在开启夹层后，捕获探针可以延伸，可以制备测序文库并测序，然后可以通过计算对结果进行分析。
在一些实施方案中，该方法还包括确定(i)捕获剂条形码结构域的全部或部分序列；以及(ii)空间条形码的全部或部分序列，或者其互补序列。在一些实施方案中，该方法还包括使用(i)和(ii)的确定序列来分析生物样品中的不同分析物。在一些实施方案中，释放步骤还从不同的分析物中释放捕获剂条形码结构域。在一些实施方案中，不同的分析物是蛋白质分析物。在一些实施方案中，蛋白质分析物是细胞外蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质分析物是细胞内蛋白质。
(c)使用分析物捕获剂来捕获分析物进行空间检测
在一些实施方案中，本文所提供的方法、组合物、装置和***利用分析物捕获剂进行空间检测。“分析物捕获剂”是指与目标分析物(例如，蛋白质)和捕获探针相互作用的分子。此类分析物捕获剂可以用于鉴定分析物。在一些实施方案中，分析物捕获剂可以包括分析物结合部分和捕获剂条形码结构域。在一些实施方案中，分析物捕获剂包括接头。在一些实施方案中，接头是可裂解接头。在一些实施方案中，可裂解接头是光可裂解接头、紫外线可裂解接头或酶可裂解接头。
分析物结合部分是能够结合特定分析物的分子。在一些实施方案中，分析物结合部分包括抗体或抗体片段。在一些实施方案中，分析物结合部分包括多肽和/或适配体。在一些实施方案中，分析物是蛋白质(例如，细胞表面上的蛋白质，或者细胞内蛋白质)。
捕获剂条形码结构域可以包括捕获柄序列，该捕获柄序列可以与捕获探针的捕获结构域的至少一部分或全部杂交。在一些实施方案中，捕获柄序列与捕获探针的捕获结构域的一部分或全部互补。在一些实施方案中，捕获柄序列包括多聚(A)尾。在一些实施方案中，捕获柄序列包括能够结合多聚(T)结构域的序列。在一些实施方案中，捕获剂条形码结构域包括分析物结合部分条形码和捕获柄序列。分析物结合部分条形码是指与分析物结合部分相关联或者以其他方式鉴定分析物结合部分的条形码，捕获柄序列可以与捕获探针杂交。在一些实施方案中，捕获柄序列特异性地结合捕获探针的捕获结构域。本文描述了可用于对分析物进行空间检测的分析物捕获剂的其他实施方案。
本文提供了用于分析生物样品中的分析物的方法，包括：(a)使生物样品与多种分析物捕获剂接触，其中多种分析物捕获剂中的一种分析物捕获剂包括分析物结合部分和捕获剂条形码结构域，其中该分析物结合部分特异性地结合该分析物，并且其中该捕获剂条形码结构域包括分析物结合部分条形码和捕获柄序列；(b)使生物样品与试剂介质接触，该试剂介质包含用于从分析物结合部分中释放捕获剂条形码结构域的作用剂，从而从分析物结合部分中释放捕获剂条形码结构域；以及(c)将捕获柄序列与捕获探针的捕获结构域杂交，其中捕获探针包括(i)空间条形码和(ii)捕获结构域。
本文还提供了用于分析安装在第一基板上的生物样品中的分析物的方法，包括：(a)使生物样品与多种分析物捕获剂接触，其中多种分析物捕获剂中的一种分析物捕获剂包括分析物结合部分和捕获剂条形码结构域，其中该分析物结合部分特异性地结合该分析物，并且其中该捕获剂条形码结构域包括分析物结合部分条形码和捕获柄序列；(b)将第一基板与包括阵列的第二基板对准，使得生物样品的至少一部分与阵列的至少一部分对准，其中该阵列包括多个捕获探针，其中多个捕获探针中的一个捕获探针包括(i)空间条形码和(ii)捕获结构域；(c)当生物样品与阵列的至少一部分对准时，(i)从分析物释放捕获剂条形码结构域，然后(ii)被动或主动地将捕获剂条形码结构域从生物样品迁移到阵列；以及(d)将捕获柄序列偶联到捕获结构域。
本文还提供了用于分析安装在第一基板上的生物样品中的分析物的方法，包括：(a)使生物样品与多种分析物捕获剂接触，其中多种分析物捕获剂中的一种分析物捕获剂包括分析物结合部分和捕获剂条形码结构域，其中该分析物结合部分特异性地结合该分析物，并且其中该捕获剂条形码结构域包括分析物结合部分条形码和捕获柄序列；(b)将第一基板与包括阵列的第二基板对准，使得生物样品的至少一部分与阵列的至少一部分对准，其中该阵列包括多个捕获探针，其中多个捕获探针中的一个捕获探针包括(i)空间条形码和(ii)捕获结构域；(c)当生物样品与阵列的至少一部分对准时，(i)从分析物释放捕获剂条形码结构域，然后(ii)被动或主动地将捕获剂条形码结构域从生物样品迁移到阵列；以及(d)将捕获柄序列与捕获结构域杂交。
在一些实施方案中，将连接探针(例如，连接产物)从第一基板转移到第二基板的过程称为“夹层过程”。该夹层过程在上文和PCT专利申请公布号WO 2020/123320中有所描述，该专利申请公布全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，该方法还包括：确定(i)捕获剂条形码结构域的全部或部分序列，或者其互补序列；以及(ii)空间条形码的全部或部分序列，或者其互补序列。在一些实施方案中，该方法还包括使用(i)和(ii)的确定序列来确定生物样品中分析物的位置和丰度。
在一些实施方案中，将分析物捕获剂引入生物样品中，其中分析物结合部分特异性地结合目标分析物，然后可以处理生物样品以从该生物样品中释放捕获剂条形码结构域。在一些实施方案中，然后捕获剂条形码结构域可以迁移并结合到捕获探针的捕获结构域，因而捕获剂条形码结构域可以延伸，从而在捕获剂条形码结构域的末端处生成空间条形码互补体。在一些实施方案中，在空间上加标签的捕获剂条形码结构域可以从捕获探针变性，然后使用本文所述的方法进行分析。
在一些实施方案中，释放包括使生物样品和阵列与包含核酸酶的试剂介质接触。在一些实施方案中，核酸酶包括核糖核酸酶。在一些实施方案中，核糖核酸酶选自核糖核酸酶A、核糖核酸酶C、核糖核酸酶H和核糖核酸酶I。在一些实施方案中，试剂介质还包含透化剂。在一些实施方案中，释放还包括透化生物样品，同时从分析物中释放捕获剂条形码结构域。在一些实施方案中，透化剂还包括蛋白酶。在一些实施方案中，该蛋白酶选自胰蛋白酶、胃蛋白酶、弹性蛋白酶或蛋白酶K。
在一些实施方案中，通过使用不同的刺激物从分析物结合部分释放捕获剂条形码结构域，该刺激物可以包括但不限于蛋白酶(例如，蛋白酶K)、核糖核酸酶和紫外光。
在一些实施方案中，试剂介质还包含去污剂。在一些实施方案中，去污剂选自十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基肌氨酸钠、皂苷、Triton X-100TM或Tween-20TM。在一些实施方案中，试剂介质包含少于5w/v％的选自十二烷基硫酸钠(SDS)和十二烷基肌氨酸钠的去污剂。在一些实施方案中，试剂介质包含至少5w/v％的选自SDS和十二烷基肌氨酸钠的去污剂。在一些实施方案中，试剂介质不包含SDS和十二烷基肌氨酸钠。
在一些实施方案中，生物样品和阵列与试剂介质接触约1分钟至约60分钟(例如，约1分钟至约55分钟、约1分钟至约50分钟、约1分钟至约45分钟、约1分钟至约40分钟、约1分钟至约35分钟、约1分钟至约30分钟、约1分钟至约25分钟、约1分钟至约20分钟、约1分钟至约15分钟、约1分钟至约10分钟、约1分钟至约5分钟、约5分钟至约60分钟、约5分钟至约55分钟、约5分钟至约50分钟、约5分钟至约45分钟、约5分钟至约40分钟、约5分钟至约35分钟、约5分钟至约30分钟、约5分钟至约25分钟、约5分钟至约20分钟、约5分钟至约15分钟、约5分钟至约10分钟、约10分钟至约60分钟、约10分钟至约55分钟、约10分钟至约50分钟、约10分钟至约45分钟、约10分钟至约40分钟、约10分钟至约35分钟、约10分钟至约30分钟、约10分钟至约25分钟、约10分钟至约20分钟、约10分钟至约15分钟、约15分钟至约60分钟、约15分钟至约55分钟、约15分钟至约50分钟、约15分钟至约45分钟、约15分钟至约40分钟、约15分钟至约35分钟、约15分钟至约30分钟、约15分钟至约25分钟、约15分钟至约20分钟、约20分钟至约60分钟、约20分钟至约55分钟、约20分钟至约50分钟、约20分钟至约45分钟、约20分钟至约40分钟、约20分钟至约35分钟、约20分钟至约30分钟、约20分钟至约25分钟、约25分钟至约60分钟、约25分钟至约55分钟、约25分钟至约50分钟、约25分钟至约45分钟、约25分钟至约40分钟、约25分钟至约35分钟、约25分钟至约30分钟、约30分钟至约60分钟、约30分钟至约55分钟、约30分钟至约50分钟、约30分钟至约45分钟、约30分钟至约40分钟、约30分钟至约35分钟、约35分钟至约60分钟、约35分钟至约55分钟、约35分钟至约50分钟、约35分钟至约45分钟、约35分钟至约40分钟、约40分钟至约60分钟、约40分钟至约55分钟、约40分钟至约50分钟、约40分钟至约45分钟、约45分钟至约60分钟、约45分钟至约55分钟、约45分钟至约50分钟、约50分钟至约60分钟、约50分钟至约55分钟，或约55分钟至约60分钟)。在一些实施方案中，生物样品和阵列与试剂介质接触约30分钟。
本文还提供了进一步包括分析生物样品中的不同分析物的方法。在一些实施方案中，分析不同分析物包括：(a)将第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸与不同分析物杂交，其中第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸各自包含与不同分析物的相邻序列基本上互补的序列，并且其中第二探针寡核苷酸包含捕获探针结合结构域；(b)将第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸连接，从而生成包含捕获探针结合结构域的连接探针(例如，连接产物)；以及(c)将连接探针(例如，连接产物)的捕获探针结合结构域与捕获结构域杂交。
在一些实施方案中，该方法还包括确定：(i)连接探针(例如，连接产物)的全部或部分序列，或者其互补序列，和(ii)空间条形码的全部或部分序列，或者其互补序列。在一些实施方案中，该方法还包括使用(i)和(ii)的确定序列来分析生物样品中的不同分析物。在一些实施方案中，释放步骤还从不同的分析物中释放连接探针(例如，连接产物)。在一些实施方案中，不同的分析物是RNA。在一些实施方案中，不同的分析物是mRNA。
在一些实施方案中，捕获探针包括多聚(T)序列。在一些实施方案中，捕获探针包括与捕获柄序列互补的序列。在一些实施方案中，捕获探针包括功能性结构域。在一些实施方案中，捕获探针还包括一个或多个功能性结构域、独特分子标识符(UMI)、裂解结构域，以及它们的组合。
在一些实施方案中，生物样品是组织样品。在一些实施方案中，组织样品是组织切片。在一些实施方案中，组织样品是固定的组织样品。在一些实施方案中，固定的组织样品是***固定石蜡包埋的(FFPE)组织样品。在一些实施方案中，在本文所提供的任何一种方法的步骤(a)之前，将FFPE组织脱蜡和解交联。在一些实施方案中，固定的组织样品是***固定石蜡包埋的细胞团块。在一些实施方案中，组织样品是新鲜组织样品或冷冻组织样品。在一些实施方案中，在本文所提供的任何一种方法的步骤(a)之前，将组织样品固定和染色。
在一些情况下，RTL在两个寡核苷酸之间进行，其中每个寡核苷酸均附连到分析物结合部分(即，蛋白质结合部分)。一般来讲，这种环境中的RTL方法如下所述。在一些实施方案中，本文提供了一种确定生物样品中的至少一种分析物的位置的方法，包括：(a)将第一分析物结合部分与生物样品中的第一分析物杂交，其中该第一分析物结合部分与第一寡核苷酸结合，其中第一寡核苷酸包括：(i)功能性序列；(ii)第一条形码；和(iii)第一桥接序列；(b)将第二分析物结合部分与生物样品中的第二分析物杂交，其中第二分析物结合部分与第二寡核苷酸结合；其中第二寡核苷酸包括：(i)捕获探针结合结构域序列，(ii)第二条形码；和(ii)第二桥接序列；(c)使生物样品与第三寡核苷酸接触；(d)将第三寡核苷酸与第一寡核苷酸的第一桥接序列和第二寡核苷酸的第二桥接序列杂交；(e)将第一寡核苷酸和第二寡核苷酸连接，产生连接探针(例如，连接产物)；(f)使生物样品与基板接触，其中捕获探针附连到基板，其中捕获探针包括空间条形码和捕获结构域；以及(g)允许第二寡核苷酸的捕获探针结合结构域序列特异性地结合捕获结构域。在一些情况下，连接探针(例如，连接产物)从分析物结合部***解。
在一些情况下，生物样品中非常靠近的两种分析物(例如，两种不同的蛋白质)分别被第一分析物结合部分和第二分析物结合部分检测。在一些实施方案中，第一分析物结合部分和/或第二分析物结合部分是分析物捕获剂(例如，本文所述的任何示例性分析物捕获剂)。在一些实施方案中，第一分析物结合部分和/或第二分析物结合部分是第一蛋白质。在一些实施方案中，第一分析物结合部分和/或第二分析物结合部分是抗体。例如，抗体可以包括但不限于单克隆抗体、重组抗体、合成抗体、单结构域抗体、单链可变片段(scFv)和/或抗原结合片段(Fab)。在一些实施方案中，第一分析物结合部分与细胞表面分析物(例如，本文所述的任何示例性细胞表面分析物)结合。在一些实施方案中，与分析物结合以代谢方式进行。在一些实施方案中，与分析物结合以酶促方式进行。在一些实施方案中，这些方法包括与一抗结合的二抗，从而增强其检测。
在一些实施方案中，第一分析物结合部分和第二分析物结合部分各自结合相同的分析物。在一些实施方案中，第一分析物结合部分和/或第二分析物结合部分各自结合不同的分析物。例如，在一些实施方案中，第一分析物结合部分结合第一多肽，第二分析物结合部分结合第二多肽。
在确定生物样品中的至少一种分析物的位置的任何方法的一些实施方案中，第一寡核苷酸和/或第二寡核苷酸分别与第一分析物结合部分和/或第二分析物结合部分结合(例如，使用本文所述的任何方法缀合或以其他方式附接)。
在如本文所述确定生物样品中的至少一种分析物的位置的任何方法的一些实施方案中，第二寡核苷酸与第二分析物结合部分结合(例如，使用本文所述的任何方法缀合或以其他方式附接)。例如，第二寡核苷酸可以共价连接到第二分析物结合部分。在一些实施方案中，第二寡核苷酸经由其5’末端与第二分析物结合部分结合。在一些实施方案中，第二寡核苷酸包括游离的3’末端。在一些实施方案中，第二寡核苷酸经由其3’末端与第二分析物结合部分结合。在一些实施方案中，第二寡核苷酸包括游离的5’末端。
在一些实施方案中，这些寡核苷酸经由接头(例如，本文所述的任何示例性接头)与第一分析物结合部分和/或第二分析物结合部分结合。在一些实施方案中，接头是可裂解接头。在一些实施方案中，接头是具有光敏性化学键的接头(例如，光可裂解接头)。在一些实施方案中，接头是可以经历诱导解离的可裂解接头。
图17A至图17B示出的示例性示意图展示了从分析物结合部分中释放捕获剂条形码结构域的方法。图17A示出了使用核糖核酸酶可裂解接头从分析物捕获剂的分析物结合部分中释放捕获剂条形码结构域。特别地，目标(在图17A中用圆圈表示)与抗体相互作用。在建立相互作用之后，酶(例如，核糖核酸酶)将接头裂解，从抗体中释放条形码。对抗体具有特异性的条形码被捕获在包括多个探针的载片上。类似地，图17B示出了使用紫外线可裂解接头从分析物捕获剂的分析物结合部分中释放捕获剂条形码结构域。
在一些实施方案中，这些寡核苷酸经由5’末端与分析物结合结构域结合(例如，经由本文所述的任何方法附接)。
在一些实施方案中，条形码用于鉴定其所结合的分析物结合部分。条形码可以是本文描述的任何示例性条形码。在一些实施方案中，第一寡核苷酸和/或第二寡核苷酸包括捕获探针结合结构域序列。例如，当捕获结构域序列是多聚(T)序列时，捕获探针结合结构域序列可以是多聚(A)序列。
在一些实施方案中，第三寡核苷酸(例如，夹板寡核苷酸)与第一寡核苷酸和第二寡核苷酸两者杂交，使得第一寡核苷酸和第二寡核苷酸能够连接。在一些实施方案中，使用连接酶。在一些方面，连接酶包括DNA连接酶。在一些方面，连接酶包括RNA连接酶。在一些方面，连接酶包括T4 DNA连接酶。在一些实施方案中，连接酶是SplintR连接酶。
(d)夹层过程
在一些实施方案中，来自生物样品的一种或多种分析物从生物样品中释放，然后迁移到包括捕获探针阵列的基板上，用于附接到阵列的捕获探针。在一些实施方案中，分析物向包括捕获探针阵列的基板释放和迁移以保留生物样品中分析物的原始空间背景的方式发生。在一些实施方案中，生物样品安装在第一基板上，包括捕获探针阵列的基板是第二基板。在一些实施方案中，第一基板和第二基板的对准通过夹持过程来促进。因此，本文描述了用于将如本文所述的第一基板与具有捕获探针阵列的第二基板夹持在一起的方法、组合物、装置和***。
图23是描绘包括生物样品的第一基板(例如，载片2303上有组织切片2302)与包括在空间上加条形码的阵列的第二基板(例如，载片2304上填充有在空间上加条形码的捕获探针2306)之间的示例性夹持过程的示意图。在该示例性夹持过程期间，第一基板与第二基板对准，使得生物样品的至少一部分与阵列的至少一部分对准(例如，在夹层构造中对准)。如图所示，第二基板(例如，载片2304)处于第一基板(例如，载片2303)的上方位置。在一些实施方案中，第一基板(例如，载片2303)可以定位在第二基板(例如，载片2304)的上方。在一些实施方案中，第一基板和第二基板对准，以维持这两个基板之间的间隙或分隔距离2307。当第一基板和第二基板对准时，一种或多种分析物从生物样品中释放，然后主动或被动地迁移到阵列中以便捕获。在一些实施方案中，当生物样品和阵列的对准部分与试剂介质2305接触时，迁移发生。释放的一种或多种分析物可以经由试剂介质2305主动或被动地迁移跨过间隙2307向捕获探针2306移动，然后被捕获探针2306捕获。
在一些实施方案中，第一基板与第二基板之间的分隔距离2307维持在介于2微米与1mm之间(例如，介于2微米与800微米之间、介于2微米与700微米之间、介于2微米与600微米之间、介于2微米与500微米之间、介于2微米与400微米之间、介于2微米与300微米之间、介于2微米与200微米之间、介于2微米与100微米之间、介于2微米与25微米之间、介于2微米与10微米之间)，该分隔距离是在与第一基板支撑样品的表面正交的方向上测量的。在一些实施方案中，第一基板与第二基板之间的分隔距离2307小于50微米。在一些情况下，所述距离为2微米。在一些情况下，所述距离为2.5微米。在一些情况下，所述距离为约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25微米。在一些实施方案中，将第二基底放置成与第一基底上的样品直接接触以确保没有扩散性空间分辨率损失。在一些实施方案中，该分隔距离是在与第一基板支撑生物样品的表面正交的方向上测量的。
在一些实施方案中，该夹持过程可以通过例如以下专利中所述的装置、样品保持器、样品处理设备或***来促进：美国专利申请公布号20210189475、PCT/US2021/036788或PCT/US2021/050931。
在一些实施方案中，第一基板和第二基板被放置在被构造成将生物样品和阵列对准的基板保持器(例如，阵列对准装置)中。在一些实施方案中，该装置包括样品保持器。在一些实施方案中，样品保持器包括分别接收第一基板和第二基板的第一构件和第二构件。该装置可以包括对准机构，该对准机构连接到前述构件中的至少一者，并且将第一构件和第二构件对准。因此，本公开的装置可以有利地对准第一基板和第二基板，以及可能位于第一基板和第二基板的表面上的任何样品、加条形码的探针或透化试剂。
在一些实施方案中，该夹持过程包括：将第一基板安装在支撑装置的第一构件上，该第一构件被构造成保持第一基板；将第二基板安装在支撑装置的第二构件上，该第二构件被构造成保持第二基板，将试剂介质施加到第一基板和/或第二基板，该试剂介质包含透化剂，操作支撑装置的对准机构以移动第一构件和/或第二构件，使得生物样品的一部分与捕获探针阵列的一部分对准(例如，在竖直方向上对准)并且处于捕获探针阵列的阈值距离内，并且使得这部分生物样品和捕获探针接触试剂介质，其中透化剂从生物样品中释放分析物。
在样品保持器的一些实施方案中，该样品保持器可以包括第一构件，该第一构件包括第一保持机构，该第一保持机构被构造成保持包括样品的第一基板。第一保持机构可以被构造成将第一基板保持设置在第一平面中。样品保持器还可以包括第二构件，该第二构件包括第二保持机构，该第二保持机构被构造成将第二基板保持设置在第二平面中。样品保持器还可以包括连接到第一构件和第二构件中的一者或两者的对准机构。该对准机构可以被构造成将第一构件和第二构件沿第一平面和/或第二平面对准，使得当第一构件和第二构件对准并且处于沿与第二平面正交的轴线的阈值距离内时，样品与试剂介质的至少一部分接触。对准机构可以被构造成沿与第二平面正交的轴线移动第二构件并且/或者沿与第一平面正交的轴线移动第一构件。
在一些实施方案中，对准机构包括线性致动器。在一些实施方案中，对准机构包括移动板、衬套、有肩螺钉、电机托架和线性致动器中的一者或多者。移动板可以联接到第一构件或第二构件。在一些情况下，对准机构可以包括联接到第一构件的第一移动板，以及联接到第二构件的第二移动板。在一些实施方案中，线性致动器被构造成沿与第一构件和/或第二构件的平面正交的轴线移动第二构件。例如，移动板可以联接到第二构件，并且通过在上方向上朝第一基板向上移动该移动板，可以调节沿z轴(例如，与第二基板正交)的分隔距离。在一些实施方案中，线性致动器被构造成沿与第一构件和/或第二构件的平面正交的轴线移动第一构件。移动板的这种移动可以通过线性致动器来实现，该线性致动器被构造成以一定速度移动第一构件和/或第二构件。该速度可以由以能够通信的方式耦接到线性致动器的控制器来控制。在一些实施方案中，线性致动器被构造成以至少0.1mm/s(例如，至少0.1mm/s至2mm/s)的速度移动第一构件、第二构件，或者第一构件和第二构件两者。在一些方面，可以选择该速度，以使试剂介质内的气泡产生或截留减少或最小化。在一些实施方案中，线性致动器被构造成以至少0.1lb大小的力(例如，介于0.1磅与4.0磅之间的力)移动第一构件、第二构件，或者第一构件和第二构件两者。
在一些方面，移动板(例如，闭合夹层)的速度可以影响试剂介质内的气泡产生或截留。在“夹持”过程期间，使试剂介质内的气泡产生或截留最小化可能是有利的，因为气泡可能会妨碍分析物通过该试剂介质迁移到阵列。在一些实施方案中，选择闭合速度以使试剂介质内的气泡产生或截留最小化。在一些实施方案中，选择闭合速度以缩短试剂介质的流动前沿从与第一基板和第二基板的初始接触点扫过夹层区所花费的时间(本文中也称为“闭合时间”)。在一些实施方案中，选择闭合速度以将闭合时间缩短到小于约1100毫秒(ms)。在一些实施方案中，选择闭合速度以将闭合时间缩短到小于约1000ms。在一些实施方案中，选择闭合速度以将闭合时间缩短到小于约900ms。在一些实施方案中，选择闭合速度以将闭合时间缩短到小于约750ms。在一些实施方案中，选择闭合速度以将闭合时间缩短到小于约600ms。在一些实施方案中，选择闭合速度以将闭合时间缩短到约550ms或更短的时间。在一些实施方案中，选择闭合速度以将闭合时间缩短到约370ms或更短的时间。在一些实施方案中，选择闭合速度以将闭合时间缩短到约200ms或更短的时间。在一些实施方案中，选择闭合速度以将闭合时间缩短到约150ms或更短的时间。
图37A是根据一些示例实施方式的处于闭合方位的示例样品处理设备3700(在本文中也称为支撑装置、样品保持器和阵列对准装置)的透视图。如图所示，样品处理设备3700包括第一构件3704、第二构件3710、任选地图像捕获装置3720、第一基板3706、任选地铰链3715，以及任选地镜子3716。铰链3715可以被构造成通过沿铰链3715以蛤壳方式开启和/或闭合第一构件3704，来允许第一构件3704以开启或闭合构型定位。
图37B是根据一些示例实施方式的处于开启位置的示例样品处理设备3700的透视图。如图所示，样品处理设备3700包括一个或多个第一保持机构3708，该第一保持机构被构造成保持一个或多个第一基板3706。在图37B的该实例中，第一构件3704被构造成保持两个第一基板3706，然而第一构件3704可以被构造成保持更多或更少的第一基板3706。
在一些方面，当样品处理设备3700处于开启方位时(如图37B所示)，第一基板3706和/或第二基板3712可以装载和定位在样品处理设备3700内，诸如分别在第一构件3704和第二构件3710内。如上所述，铰链3715可以允许第一构件3704闭合在第二构件3710上并形成夹层构造(例如，图23所示的夹层构造)。
在一些方面，在第一构件3704闭合在第二构件3710上之后，样品处理设备3700的对准机构(未示出)可以致动第一构件3704和/或第二构件3710，以形成用于透化步骤的夹层构造(例如，使第一基板3706和第二基板3712彼此更靠近，并且处于该夹层构造的阈值距离内)。对准机构可以被构造成控制夹层构造的速度、角度等。
在一些实施方案中，生物样品(例如，图23的组织样品2302)可以在闭合第一构件3704之前，在第一构件3704内对准(例如，经由第一保持机构3708)，使得样品2302的期望的感兴趣区域与第二基板(例如，载片2304)的加条形码的阵列对准，例如，当第一基板和第二基板在夹层构造中对准时。需注意，元件编号“37XX”是指来自图37A和图37B的元件，元件编号“23XX”是指图23中的元件，其中““XX”是任意两位数。这种对准可以手动(例如，由用户)或自动(例如，经由自动化对准机构)完成。在对准之后或之前，可以将隔件施加到第一基板3706和/或第二基板3712，以在夹持期间维持第一基板3706与第二基板3712之间的最小间距。在一些方面，试剂介质(例如，试剂介质2305)可以施加到第一基板3706和/或第二基板3712。第一构件3704然后可以闭合在第二构件3710上并形成夹层构造。分析物(包括诸如RTL连接产物和/或分析物捕获剂的衍生物)2308可以被捕获探针2306捕获，然后可以被加工用于空间分析。
在一些实施方案中，在透化步骤期间，图像捕获装置3720可以捕获组织2302与捕获探针2306之间的重叠区的图像。如果在样品处理设备3700内存在多于一个第一基板3706和/或第二基板3712，则图像捕获装置3720可以被配置为捕获一个或多个重叠区的一个或多个图像。关于支撑装置、样品保持器、样品处理设备或用于实施夹持过程的***的更多细节在例如PCT公布号WO 2021/0189475和PCT/US2021/050931中有所描述，以上PCT公布中的每一者均全文以引用方式并入本文。
生物样品内的分析物可以通过破坏(例如，透化、消化等)生物样品来释放，也可以在不破坏生物样品的情况下释放。本文描述了透化生物样品的各种方法(例如，本文所述的任何透化试剂和/或条件)，包括例如在各种温度下使用各种去污剂、缓冲剂、蛋白酶和/或核酸酶不同的时间段。此外，本文描述了向生物样品输送流体(例如，缓冲液、透化溶液)的各种方法，包括使用基板保持器(例如，用于夹层组件、夹层构造，如本文所述)。
本文提供了用于将流体输送到设置在第一基板的某个区上的生物样品和设置在第二基板上的阵列的方法。
在一些实施方案中，参考图23，本文所述介于包括生物样品的第一基板(例如，载片2303)和包括在空间上加条形码的阵列的第二基板(例如，具有加条形码的捕获探针2306的载片2304)之间的夹层构造可以包括试剂介质(例如液体试剂介质，例如透化溶液2305或另外的目标分子释放和捕获溶液)来填充间隙(例如，间隙2307)。可能希望试剂介质在这些载片之间没有气泡，以便于转移具有空间信息的目标分子。此外，存在于这些载片之间的气泡可能使得期望的感兴趣区域的图像捕获的至少一部分模糊。因此，可能希望在透化步骤期间确保或鼓励抑制和/或消除这两个基板(例如，载片2303和载片2304)之间的气泡。
在一些方面，可能可以使用多种填充方法和/或闭合方法来减少或消除这些载片之间的气泡形成。
本文所述的工作流程可以包括使设置在第一基板或第二基板上的试剂介质(例如液体试剂介质，例如透化溶液2305)的液滴分别与第二基板或第一基板的至少一部分接触。在一些实施方案中，该接触包括拉近两个基板的距离，使得第一基板上的样品与第二基板上的捕获探针的条形码阵列对准。
在一些实施方案中，液滴包括透化试剂(例如，本文所述的任何透化试剂)。在一些实施方案中，通过在各种温度下输送透化试剂(例如，包含透化试剂的流体)来调控生物样品的透化速率。
在本文所述的示例夹层制作工作流程中，试剂介质(例如，液体试剂介质、透化溶液2305)可以填充第一基板(例如，载片2303)与第二基板(例如，具有加条形码的捕获探针2306的载片2304)之间的间隙(例如，间隙2307)，以保证或实现具有空间信息的目标分子的转移。本文描述了可以抑制气泡形成和抑制转录物和/或目标分子或分析物的不希望的流动的填充方法的实例。本文所述的夹层构造制作过程中的稳健流控技术可以通过在分子从组织载片移动到捕获载片时减少或防止分子的偏转来保存空间信息。
图38A示出了示例性夹持过程3800，其中使得包括生物样品3802(例如，组织切片)的第一基板(例如，载片3803)和第二基板(例如，包括在空间上加条形码的捕获探针3806的载片3804)处于彼此接近的状态。如图38A所示，液体试剂液滴(例如，透化溶液3805)被引导至第二基板上接近捕获探针3806并且介于生物样品3802与第二基板(例如，包括在空间上加条形码的捕获探针3806的载片3804)之间的位置。透化溶液3805可以释放分析物，这些分析物能够被阵列的捕获探针3806捕获。如进一步所示，一个或多个隔件3810可以定位在第一基板(例如，载片3803)与第二基板(例如，包括在空间上加条形码的捕获探针3806的载片3804)之间。一个或多个隔件3810可以被构造成维持第一基板与第二基板之间的分隔距离。虽然一个或多个隔件3810被示为设置在第二基板上，但是除此之外或替代性地，隔件可以设置在第一基板上。
在一些实施方案中，一个或多个隔件3810被构造成将第一基板与第二基板之间的分隔距离维持在介于约2微米与1毫米之间(例如，介于约2微米与800微米之间、介于约2微米与700微米之间、介于约2微米与600微米之间、介于约2微米与500微米之间、介于约2微米与400微米之间、介于约2微米与300微米之间、介于约2微米与200微米之间、介于约2微米与100微米之间、介于约2微米与25微米之间，或者介于约2微米与10微米之间)，该分隔距离是在与第一基板支撑样品的表面正交的方向上测量的。在一些情况下，该分隔距离为约2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、11微米、12微米、13微米、14微米、15微米、16微米、17微米、18微米、19微米、20微米、21微米、22微米、23微米、24微米或25微米。在一些实施方案中，该分隔距离小于50微米。在一些实施方案中，该分隔距离小于25微米。在一些实施方案中，该分隔距离小于20微米。该分隔距离可以包括至少2μm的距离。
图38B示出了根据一些示例实施方式的完全形成的夹层构造，其产生了由一个或多个隔件3610、第一基板(例如，载片303)和第二基板(例如，包括在空间上加条形码的捕获探针306的载片304)形成的腔室3650。在图38B的该实例中，液体试剂(例如，透化溶液305)填充腔室3650的容积，并且可以产生透化缓冲液，该透化缓冲液允许分析物、RTL连接产物和分析物捕获剂从生物样品302向第二基板(例如，载片3804)的捕获探针306扩散。在一些方面，透化缓冲液的流动可能使来自生物样品3802的转录物和/或分子偏转，因而可能影响用于空间分析的分析物的扩散转移。由一个或多个隔件3810、第一基板和第二基板产生的部分或完全密封的腔室3850可以减少或防止转录物和/或分子在从生物样品3802扩散转移到捕获探针3806的过程中的不希望的对流运动。
在一些情况下，第一基板和第二基板布置在如本文所述的成角度夹层组件中。例如，在夹持这两个基板(例如，载片3803和载片3804)期间，可以使用成角度闭合工作流程来抑制或消除气泡形成。
图39A至图39C描绘了根据一些示例实施方式的用于夹持具有生物样品3902的第一基板(例如，载片3903)和第二基板(例如，具有捕获探针3906的载片3904)的示例性成角度闭合工作流程3900的侧视图和顶视图。
图39A描绘了第一基板(例如，包括生物样品3902的载片3903)在第二基板(例如，载片3904)之上(上方)成角度。如图所示，试剂介质(例如，透化溶液)3905的液滴位于隔件3910上，朝向图39A侧视图的右手侧。虽然图39A在该侧视图的右手侧描绘了试剂介质，但是应当理解，这种描绘并不意在限制试剂介质在隔件上的位置。
图39B示出了当第一基板下降时，并且/或者当第二基板上升时，第一基板的下降侧(例如，载片3903朝向第二基板成角度的一侧)可以接触试剂介质3905的液滴。第一基板的下降侧可以将试剂介质3905推向相反的方向(例如，朝向隔件3910的相对侧、朝向第一基板相对于下降侧的相对侧)。例如，在图39B的侧视图中，当夹层构造形成时，试剂介质3905可以从右向左推进。
在一些实施方案中，进一步移动第一基板和/或第二基板，以实现第一基板和第二基板的近似平行排列。
图39C描绘了第一基板与第二基板之间的夹层构造已完全闭合，其中隔件3910与第一基板和第二基板两者接触，并且维持这两个基板之间的分隔距离，任选地近似平行排列。如图39C的顶视图所示，隔件3910完全封闭和包围生物样品3902和捕获探针3906，并且隔件3910形成了保持一定体积试剂介质3905的腔室3950的侧面。
应当理解，尽管图39A至图39C描绘了第一基板(例如，包括生物样品3902的载片3903)在第二基板(例如，载片3904)之上(上方)成角度，并且该第二基板包括隔件3910，但是应当理解，示例性的成角度闭合工作流程可以包括第二基板在第一基板之上(上方)成角度，并且该第一基板包括隔件3910。
图40A至图40E描绘了根据一些示例实施方式的成角度夹层组件的示例工作流程4000。如图40A中所示，基板4012(例如，包括第一基板(诸如载片2303)或第二基板(诸如载片2304)，其包括在空间上加条形码的捕获探针2306，如图23所示)可以定位和放置在基座4004(例如，本文所公开的样品保持器的第一构件或第二构件)上，其中基板4012的一侧由弹簧4015支撑。弹簧4015可以从基座4004在上方向上延伸，并且可以被构造成沿与基座4004成不同角度的平面设置基板4012。基板4012的角度可以使得放置在基板4012的表面(例如，隔件附接到基板的表面)上的试剂介质4005的液滴(例如，液体试剂介质的液滴)不会从该表面掉落(例如，由于重力)。该角度可以基于重力与用于使液滴移动远离和移动离开基板4012的任何表面力的关系来确定。
图40B描绘了放置在基板4012上的试剂介质的液滴4005。如图所示，液滴4005位于基板4012接触弹簧4015的一侧，并且位于弹簧4015附近和该弹簧之上(上方)。
如图40C中所示，另一个基板4006可以定位在基板4012之上(上方)，并且与基座4004成基本上平行的角度。例如，在基板4012是本文所公开的第二基板(例如，来自图23的包括在空间上加条形码的捕获探针的载片2304)的情况下，基板4006可以是本文所公开的第一基板(例如，载片2303)。在其中基板4012是本文所公开的第一基板(例如，载片2303)的情况下，基板4006可以是第二基板(例如，包括在空间上加条形码的捕获探针的载片2304)。
在一些情况下，支撑基板4006的另一个基座(未示出)(例如，本文所公开的样品保持器的第一构件或第二构件)可以被构造成以基本上平行于基座4004的角度保持基板1706。
如图40D中所示，基板4006可以朝向基板4012下降，使得基板4006的下降侧首先接触液滴4005。在一些方面，基板4006的下降侧可以将液滴4005推向基板4006的相对侧。在一些实施方案中，基板4012可以朝向基板4006向上移动，以实现基板4006的下降侧与液滴4005接触。
图40E描绘了基板4006和基板4012已实现完全夹层闭合，其中试剂介质4005的液滴定位在两个侧面之间。在一些方面并且如图所示，当基板4006下降到液滴4005上并朝向基板4012移动时(并且/或者随着基板4012朝向基板4006抬起时)，弹簧4015可以压缩，基板4012可以下降到基座4004并且变得与基板4006基本上平行。
图41A是根据一些示例实施方式的成角度闭合工作流程4100的侧视图。图41B是根据一些示例实施方式的成角度闭合工作流程4100的顶视图。如步骤4105所示并且根据图40C至图40D，试剂介质4105的液滴定位在基板4112接触弹簧4115的一侧。
在步骤4110处，成角度基板4106的下降侧首先接触试剂介质4105的液滴。基板4106与试剂介质4105的液滴接触可以形成线性或低曲率的流动前沿，其随着载片闭合而均匀地填充。
在步骤4115处，基板4106朝向基板4112进一步下降(或者基板4112朝向基板4106抬起)，基板4106的下降侧可以接触液体试剂并且可以将液体试剂推向与下降侧相对的一侧，从而产生可以防止或减少载片之间的气泡截留的线性或低曲率流动前沿。如进一步所示，随着基板4106下降，弹簧4115可以开始压缩。
在步骤4120处，试剂介质4105的液滴填充基板4106与基板4112之间的间隙(例如，如图23中所示的间隙2307)。液体试剂的线性流动前沿可以通过沿基板4112和/或基板4106的接触侧挤压液滴4105体积来形成。此外，毛细流动也可以有助于填充间隙区。如步骤4120中进一步所示，弹簧4115可以被完全压缩，使得基板4106、基板4112和基座4104基本上彼此平行。
在一些方面，本文所公开的成角度闭合工作流程(例如，FOREMAN HUB图39A至图39C、图40A至图40E，以及图41A至图41B)可以由样品处理设备执行(例如，如PCT/US2021/050931中所述，该专利据此全文以引用方式并入本文)。
关于成角度闭合工作流程以及用于实施成角度闭合工作流程的装置和***的进一步细节在PCT/US2021/036788和PCT/US2021/050931中有所描述，这些专利据此全文以引用方式并入本文。
用于减少或消除气泡形成并且/或者用于减少不想要的流体流动的附加构造在PCT/US2021/036788中有所描述，该专利据此全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，试剂介质包含透化剂。用于此目的的合适试剂包括但不限于有机溶剂(例如，丙酮、乙醇和甲醇)、交联剂(例如，多聚甲醛)、洗涤剂(例如，皂苷、TritonX-100TM、Tween-20TM或十二烷基硫酸钠(SDS))和酶(例如，胰蛋白酶、蛋白酶(例如，蛋白水解酶K)。在一些实施方案中，洗涤剂为阴离子洗涤剂(例如，SDS或N-月桂酰肌氨酸钠盐溶液)。示例性的透化试剂见述于PCT专利申请公开号WO 2020/123320中，该专利申请通过引用整体并入。
在一些实施方案中，试剂介质包含裂解试剂。裂解溶液可包含离子表面活性剂，例如月桂酰肌氨酸钠和十二烷基硫酸钠(SDS)。更一般地，化学裂解剂可包括但不限于有机溶剂、螯合剂、去污剂、表面活性剂和离液序列高的试剂。示例性的裂解试剂见述于PCT专利申请公开号WO 2020/123320中，该专利申请通过引用整体并入。
在一些实施方案中，试剂介质包含蛋白酶。示例性的蛋白酶包括例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、弹性蛋白酶和蛋白水解酶K。示例性的蛋白酶见述于PCT专利申请公开号WO 2020/123320中，该专利申请通过引用整体并入。
在一些实施方案中，试剂介质包含去污剂。示例性的去污剂包括十二烷基硫酸钠(SDS)、月桂酰肌氨酸钠、皂苷、Triton X-100TM和Tween-20TM。示例性的去污剂见述于PCT专利申请公开号WO 2020/123320中，该专利申请通过引用整体并入。
在一些实施方案中，试剂介质包含核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶包括核糖核酸酶。在一些实施方案中，核糖核酸酶选自核糖核酸酶A、核糖核酸酶C、核糖核酸酶H和核糖核酸酶I。在一些实施方案中，试剂介质包含十二烷基硫酸钠(SDS)、蛋白酶K、胃蛋白酶、N-月桂酰肌氨酸、核糖核酸酶及其钠盐中的一者或多者。
样品保持器与用于使生物样品和阵列的对齐部分与试剂介质接触以促进分析物捕获的多种不同方案相容。在一些实施方案中，将试剂介质直接沉积在第二基板上(例如，形成包含透化试剂和特征阵列的试剂介质)，并且/或者直接沉积在第一基板上。在一些实施方案中，将试剂介质沉积在第一基板和/或第二基板上，然后将第一基板和第二基板在夹层构造中对准，使得试剂介质与生物样品和阵列的对准部分接触。在一些实施方案中，将试剂介质引入间隙2307中，同时第一基板和第二基板在夹层构造中对准。
在某些实施方案中，先将干燥的透化试剂施加或形成为第一基板或第二基板或两者上的层，之后再使其与样品和特征阵列接触。例如，试剂能够以溶液的形式沉积在第一基板或第二基板或两者上，然后干燥。干燥方法包括但不限于旋涂试剂的稀溶液，然后蒸发包含在试剂中的溶剂或试剂本身。替代性地，在其他实施方案中，可以将试剂以干燥形式直接施加到第一基板或第二基板或两者上。在一些实施方案中，涂覆过程可以在分析工作流程之前完成，并且第一基板和第二基板可以预先涂覆后储存起来。替代性地，涂覆过程可以作为分析工作流程的一部分进行。在一些实施方案中，试剂是透化试剂。在一些实施方案中，试剂是透化酶、缓冲液、去污剂，或它们的任何组合。在一些实施方案中，透化酶是胃蛋白酶。在一些实施方案中，试剂为干燥的试剂(例如，不含水分或液体的试剂)。在一些情况下，包含样品(例如，组织学组织切片)的基底是水合的。可以通过使样品与不包含透化试剂的试剂介质(例如，缓冲液)接触来将样品水合。在一些实施方案中，在进行水合的同时，第一基板和第二基板在夹层构造中对准。
在一些情况下，生物样品和阵列的对准部分与试剂介质2305接触约1分钟。在一些情况下，生物样品和阵列的对准部分与试剂介质2305接触约5分钟。在一些情况下，生物样品和阵列的对准部分与间隙1207中的试剂介质1205接触约1分钟、约5分钟、约10分钟、约12分钟、约15分钟、约18分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约36分钟、约45分钟或约1小时。在一些情况下，生物样品和阵列的对准部分与试剂介质2305接触约1分钟至60分钟。在一些情况下，生物样品和阵列的对准部分与试剂介质2305接触约30分钟。
在一些实施方案中，在样品与透化剂初始接触之后，透化剂可以从与样品的接触中移除(例如，通过开启样品保持器)，之后样品完全透化。例如，在一些实施方案中，只有一部分样品被透化，并且样品中只有一部分分析物可以被特征阵列捕获。在一些情况下，被捕获并可用于检测的分析物的量的减少可以由样品不完全透化所引起的侧向扩散的减少来抵消。一般来讲，测定的空间分辨率由分析物在横向方向(即，与样品表面的法线方向正交)上的扩散程度决定。第一基板上的样品与第二基板上的特征阵列之间的距离越大，横向方向上的扩散程度就越大，并伴随分辨率损失。从最靠近特征阵列的一部分样品释放的分析物具有较短的扩散路径，因此不会像来自离特征阵列最远的样品部分的分析物那样在侧向上扩散得那么远。因此，在一些情况下，可使用样品的不完全透化(通过减少透化剂与样品之间的接触时间)来在测定中保持足够的空间分辨率。
在一些情况下，装置配置为控制第一基底和第二基底的温度。在一些实施方案中，将第一构件和第二构件的温度降低到低于室温的第一温度(例如，25摄氏度)(例如，20摄氏度或更低、15摄氏度或更低、10摄氏度或更低、5摄氏度或更低、4摄氏度或更低、3摄氏度或更低、2摄氏度或更低、1摄氏度或更低、0摄氏度或更低、-1摄氏度或更低、-5摄氏度或更低)。在一些实施方案中，装置包括温度控制***(例如，加热和冷却传导线圈)以控制样品保持器的温度。或者，在其他实施方案中，样品保持器的温度外部控制(例如，经由制冷或热板)。在第一步中，设定到或设定在第一温度的第二构件接触第一基板，并且设定到或设定在第一温度的第一构件接触第二基板，从而将第一基板和第二基板的温度降低到第二温度。在一些实施方案中，第二温度等于第一温度。在一些实施方案中，第一温度低于室温(例如，25℃)。在一些实施方案中，第二温度在从约-10℃至约4℃的范围内。在一些实施方案中，第二温度低于室温(例如，25摄氏度)(例如，20摄氏度或更低、15摄氏度或更低、10摄氏度或更低、5摄氏度或更低、4摄氏度或更低、3摄氏度或更低、2摄氏度或更低、1摄氏度或更低、0摄氏度或更低、-1摄氏度或更低、-5摄氏度或更低)。
在一个示例性实施方案中，使第二基底与透化试剂接触。在一些实施方案中，透化试剂是干燥的。在一些实施方案中，透化试剂是凝胶或液体。同样在该示例性实施方案中，生物样品与缓冲液接触。第一基板和第二基板都被置于较低的温度下，以减缓扩散和透化效率。替代性地，在一些实施方案中，样品可以直接与液体透化试剂接触，而不会由于基板处于第二温度而引起不希望的透化启动。在一些实施方案中，低温减缓或阻止透化启动。在第二步中，将样品保持器和基板保持在低温下(例如，在第一温度或第二温度下)继续减缓或防止样品透化。在第三步中，加热样品保持器(因此加热第一基板和第二基板)以引发透化。在一些实施方案中，样品保持器被加热到第三温度。在一些实施方案中，第三温度高于室温(例如，25摄氏度)(例如，30摄氏度或更高、35摄氏度或更高、40摄氏度或更高、50摄氏度或更高、60摄氏度或更高)。在一些实施方案中，从样品的透化组织释放的分析物扩散到第二基底的表面并被捕获在第二基底的阵列(例如，加有条形码的探针)上。在第四步中，将第一基板和第二基板分离(例如，拉开)，停止温度控制。
在一些实施方案中，在第一基板或第二基板(或两者)包括孔的情况下，可以将透化溶液引入一些或所有孔中，然后可以通过闭合样品保持器使样品和特征阵列接触，以将样品透化。在某些实施方案中，可以将透化溶液浸泡到直接施加于样品的水凝胶膜中，并且/或者浸泡到阵列的特征(例如，珠粒)中。当第一基板和第二基板在夹层构造中对准时，透化溶液促进分析物从样品迁移到阵列。
在某些实施方案中，不同的透化剂或不同浓度的透化剂可以输注到阵列特征(例如，珠粒)中或如上所述的水凝胶层中。通过局部改变一种或多种透化试剂的性质，可在空间上调节从样品捕获分析物的过程。
在一些情况下，分析物从生物样品向第二基底的迁移是被动的(例如，经由扩散)。替代性地，在某些实施方案中，分析物从生物样品的迁移是主动进行的(例如，通过电泳，即通过施加电场来促进迁移)。在一些情况下，第一基板和第二基板可以包含导电环氧树脂。来自电源的电线可连接到导电环氧树脂，从而允许用户施加电流并在第一基底和第二基底之间产生电场。在一些实施方案中，与在不施加电场的情况下(例如，经由两个基板的手动对准)随机扩散到匹配基板上相比，电泳迁移导致更高的分析物捕获效率和所捕获分析物(例如，在特征阵列上)更好的空间保真度。电泳迁移的示例性方法(包括在图7至图11C中展示的那些方法)在WO 2020/176788中，包括在图13至图15、图24A至图24B和图25A至图25C中有所描述，该专利据此全文以引用方式并入本文。
当分析物从样品迁移到特征阵列时，可能发生空间分辨率损失，并且扩散迁移的分量发生在横向(例如，侧向)方向上，大致平行于在其上安装样品的第一基板表面。为了解决这种分辨率损失，在一些实施方案中，可以将沉积在具有各向异性扩散的材料上或者输注到该材料中的透化剂施加到样品或特征阵列。第一基板和第二基板通过样品保持器对准并发生接触。包括输注到各向异性材料中的透化溶液的透化层定位在第二基板上。
在一些实施方案中，特征阵列可以构建在输注有透化剂的水凝胶层顶上。水凝胶层可以安装在第二基板上，或者替代性地，水凝胶层本身可以用作第二基板。当第一基板和第二基板对准时，透化剂从水凝胶层中扩散出来，穿过或围绕特征阵列到达样品。来自样品的分析物迁移到特征阵列。特征阵列与样品之间的直接接触有助于减少分析物的侧向扩散，从而减轻如果分析物的扩散路径较长时将会发生的空间分辨率损失。
空间分析工作流程可以包括本文所述的夹持过程，例如，如图23中所述的过程。在一些实施方案中，工作流程包括提供包含生物样品的第一基板。在一些实施方案中，工作流程包括将生物样品安装到第一基板上。在其中生物样品是组织样品的一些实施方案中，工作流程包括将组织样品切片(例如，低温恒温器切片)。在一些实施方案中，工作流程包括固定步骤。在一些情况下，固定步骤可包括用甲醇固定。在一些情况下，固定步骤包括***(例如，2％的***)。
在一些实施方案中，使用任何本文描述的方法对第一基底上的生物样品染色。在一些情况下，对生物样品成像，捕获在染色步骤期间产生的染色图案。在一些情况下，生物样品然后在夹持过程之前脱色。
可以使用已知的染色技术对生物样品进行染色，包括但不限于Can-Grunwald染色技术、吉姆萨染色技术、苏木精和曙红(H&E)染色技术、苏木精染色技术、哲纳尔氏染色技术、利什曼染色技术、马森三色染色技术、柏氏染色技术、罗氏染色技术、银染色技术、苏丹染色技术、瑞氏染色技术和/或过碘酸希夫(PAS)染色技术。PAS染色通常在***或丙酮固定之后执行。在一些实施方案中，生物样品可以使用如本文别处所述的可检测标签(例如，放射性同位素、荧光团、化学发光化合物、生物发光化合物和染料)来染色。在一些实施方案中，仅使用一种类型的染色剂或一种技术对生物样品进行染色。在一些实施方案中，染色包括生物染色技术，诸如H&E染色。在一些实施方案中，染色包括使用苏木精的生物染色。在一些实施方案中，染色包括使用荧光偶联抗体鉴定分析物，例如通过免疫荧光法。在一些实施方案中，使用两种或更多种不同类型的染色剂或者两种或更多种不同的染色技术来对生物样品染色。例如，可以通过以下方式来制备生物样品：使用一种技术(例如，H&E染色和明场成像)进行染色和成像，之后使用另一种技术(例如，IHC/IF染色和荧光显微术)对同一生物样品进行染色和成像。在一些情况下，对第一基底上的生物样品染色。
在一些情况下，免疫荧光方法包括阻断步骤。阻断步骤可以包括使用阻断探针来减少抗体的非特异性结合。阻断步骤可以任选地进一步包括使生物样品与去污剂接触。在一些情况下，去污剂可以包括Triton X-100TM。所述方法还可包括抗体孵育步骤。在一些实施方案中，抗体孵育步骤引起抗体与生物样品中的目的抗原的选择性结合。在一些实施方案中，抗体与寡核苷酸缀合(例如，如本文所述的寡核苷酸-抗体缀合物)。在一些实施方案中，抗体不与寡核苷酸缀合。在一些实施方案中，该方法还包括抗体染色步骤。抗体染色步骤可以包括直接免疫染色法，其中标记的抗体直接结合被染色的分析物。替代性地，抗体染色步骤可以包括间接免疫染色法，其中第一种抗体结合被染色的分析物，第二种标记的抗体结合第一种抗体。在一些实施方案中，抗体染色步骤在组装夹层之前进行。在抗体孵育步骤中使用寡核苷酸-抗体缀合物的一些实施方案中，该方法不包括抗体染色步骤。
在一些情况下，这些方法包括对生物样品成像。在一些情况下，成像发生在夹层组装之前。在一些情况下，成像发生在夹层构造组装时。在一些情况下，成像发生在透化生物样品期间。在一些情况下，使用高分辨率技术(例如，具有300点/平方英寸(dpi)或更大的分辨率)来捕获图像。例如，可以使用明场成像(例如，在苏木精或H&E染色的环境中)或使用荧光显微术来捕获图像，以检测粘附的标签。在一些情况下，使用例如共聚焦显微镜在时间上捕获高分辨率图像。在一些情况下，捕获低分辨率图像。低分辨率图像(例如，约72dpi并且通常具有RGB颜色设置的图像)可以在工作流程的任何点捕获，该任何点包括但不限于分析物的染色、脱色、透化、夹层组装和迁移。在一些情况下，在生物样品透化期间拍摄低分辨率图像。
在一些实施方案中，通过免疫荧光法确定生物样品中一种或多种分析物的位置。在一些实施方案中，一种或多种可检测标签(例如，荧光团标记的抗体)结合到由第一载片上的探针捕获(与该探针杂交)的一种或多种分析物，并且一种或多种分析物的位置通过在合适的条件下检测这些标签来确定。在一些实施方案中，一种或多种荧光团标记的抗体用于缀合至与第一载片上的探针缔合的部分或与第一载片上的探针杂交的分析物。在一些情况下，当荧光团被合适波长的光激发时，通过对荧光团标记的抗体成像来确定一种或多种分析物的位置。在一些实施方案中，通过将免疫荧光数据与生物样品的图像相关联来确定生物样品中一种或多种分析物的位置。在一些情况下，在整个透化步骤中对组织成像。
在一些情况下，可对生物样品脱色。在一些情况下，在生物样品的透化之前进行脱色。仅作为实例，H&E染色可通过在HCl中洗涤样品来脱色。在一些情况下，H&E染色剂的苏木精通过在HCl中洗涤样品来脱色。在一些实施方案中，脱色可包括在HCl中洗涤1、2、3次或更多次。在一些实施方案中，脱色可包括向下游溶液(例如，透化溶液)添加HCl。
在本文公开的任何方法之间，所述方法可包括洗涤步骤(例如，用SSC(例如，0.1xSSC))。洗涤步骤可以进行一次或多次(例如，1次、2次、3次，在本文所公开的步骤之间)。在一些情况下，洗涤步骤进行约10秒、约15秒、约20秒、约30秒或约1分钟。在一些情况下，共洗涤三次，每次20秒。在一些情况下，洗涤步骤发生在样品染色之前、样品脱色之后、样品透化之前、样品透化之后，或前述时间的任何组合。
在一些情况下，在该夹持过程之后，第一基板和第二基板相分离(例如，使得它们不再在夹层构造中对准，在本文中也称为开启夹层)。在一些实施方案中，在第一基板和第二基板分离之后，可以对捕获的分析物进行后续分析(例如，cDNA合成、文库制备和测序)。
在一些实施方案中，将连接产物或含甲基化衔接子的核酸从第一基板转移到第二基板的过程在本文中可互换地称为“夹层过程”、“夹持过程”或“夹持”。该夹层过程在PCT专利申请公布号WO 2020/123320、PCT/US2021/036788和PCT/US2021/050931中进一步描述，这些专利申请公布全文以引用方式并入本文。
(e)使用多重化夹层制作机
本公开还提供了使用连续夹层过程，使用单个含有捕获探针的阵列来检测不同载片上的不同生物样品(例如，组织)中的分析物的方法、组合物、装置和***。因此，对于本文所公开的方法，只需要一个含有捕获探针的阵列。以此方式，如本文所述，来自不同样品或组织的分析物可以被连续捕获并通过样品特异性索引序列进行去多重化。
该方法包括在多个生物样品(即，第一样品、第二样品、第三样品等)中生成连接探针(例如，连接产物)。上文已经描述了连接探针(例如，连接产物)的生成，并且本文使用相同的方法从分析物生成连接探针(例如，连接产物)，其中分析物是蛋白质分析物或核酸(即，mRNA)分析物。也就是说，在一些情况下，本文所公开的多重化夹层制作方法可以用于检测蛋白质分析物。在其他情况下，本文所公开的多重化夹层制作方法可以用于检测核酸(即，mRNA)分析物。
这些方法、组合物、装置和***包括在多个生物样品(即，第一样品、第二样品、第三样品等)中利用分析物捕获剂。上文已经描述了使用分析物捕集剂进行空间检测，并且本文使用相同的方法，利用分析物捕获剂来鉴定生物样品中的分析物。在一些实施方案中，本文所公开的多重化夹层制作方法可以用于检测蛋白质分析物。
如下文所讨论的，生成的每个连接探针(例如，连接产物)或分析物捕获剂包括样品索引序列，该样品索引序列是在多重夹层方法中与特定来源样品相关联的核苷酸序列。在生成每个连接探针(例如，连接产物)或分析物捕获剂之后，将每个样品连续地夹持到具有多个捕获探针的阵列或载片上，这些捕获探针可以检测来自连接探针(例如，连接产物)或分析物捕获剂的捕获探针结合结构域并与之杂交。在夹持过程期间，加索引的连接探针或分析物捕获剂主动或被动地从样品迁移到阵列以供捕获探针捕获。然后开启夹层构造，将下一个样品与阵列夹持在一起。在一些实施方案中，在夹持下一个样品之前，对阵列进行洗涤。然后可以将附加的样品或组织(例如，2个或更多个)与具有多个捕获探针的阵列或载片夹持在一起，其中来自附加的样品或组织的连接探针(例如，连接产物)或分析物捕获剂能够以类似的方式转移到阵列。因为每个样品包括独特样品索引，所以能够鉴定阵列上捕获的每个连接探针(例如，连接产物)或分析物捕获剂的来源样品。此外，可以鉴定连接探针(例如，连接产物)的位置。在一些实施方案中，可以鉴定分析物捕获剂的位置。在一些情况下，使用基因表达载片(即，阵列)上的基准标记来鉴定位置，使得连接探针在阵列上的位置反映样品在样品载片上的位置。示例性的基准标记在PCT专利申请公布号WO 2020/123320中有所描述，该专利申请公布全文以引用方式并入本文。
此类方法、组合物、装置和***允许仅使用一个基因表达载片来检测多个样品中的分析物，并且可以在本文所述的任何载片样品上进行。例如，在一些情况下，生物样品是***固定石蜡包埋的(FFPE)样品、冷冻样品或新鲜样品。在一些情况下，生物样品与一种或多种染色剂接触。在一些情况下，一种或多种染色剂包括苏木精和曙红。在一些情况下，使用本领域中已知的方法(例如，使用一种或多种光学标签，诸如荧光标签、放射性标签、化学发光标签、量热标签或比色标签)来检测细胞标记。在一些情况下，在生成连接探针(例如，连接产物)之前以及在将连接探针(例如，连接产物)转移到基因表达载片之前，对生物样品成像。
本文所述的多重夹层方法、组合物、装置和***允许检测不同类型的样品和不同的分析物。例如，在一些情况下，在多重夹层方法中使用的样品来自不同的物种。在一些情况下，在多重夹层方法中使用的样品来自同一物种，不过是同一物种中的不同个体。在一些情况下，在多重夹层方法中使用的样品来自同一个体生物体。在一些情况下，样品来自不同的组织或细胞类型。在一些情况下，样品来自相同的组织或细胞类型。在一些情况下，样品来自同一受试者，是在不同时间点(例如，治疗前和治疗后)采集的。应当理解，样品可以来自任何来源，只要生成的连接产物具有对于每个样品独特的样品索引序列即可。
在本文描述的方法中可以使用多个样品。例如，在一些情况下，至少使用两个样品。在一些情况下，在本文所公开的方法中使用多于两个样品(例如，至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个样品)。应当理解，每个样品可以来自不同的来源(例如，不同的物种、不同的生物体)。在一些实施方案中，从每个样品中检测和鉴定相同的基因。在一些实施方案中，对于每个样品，检测和鉴定不同的基因。
为了将一个样品与另一个样品区分开，多重化设置中每个样品的探针寡核苷酸可以包括一个或多个独特序列，用于鉴定连接探针(例如，连接产物)的来源。在一些情况下，该独特序列是样品索引序列。在一些情况下，每个样品的探针寡核苷酸均包括一个或多个(例如，至少1个、2个、3个、4个、5个或更多个)独特样品索引序列，用于鉴定连接探针(例如，连接产物)的来源。
在一些情况下，样品索引的长度为约5个核苷酸至约50个核苷酸(例如，约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个核苷酸)。在一些实施方案中，样品索引的长度为约5个核苷酸至15个核苷酸。在一些实施方案中，样品索引的长度为约10个核苷酸至12个核苷酸。合成的核苷酸和/或天然存在的核苷酸均可以用于生成样品索引序列。应当理解，可以设计任何序列，只要该序列在其他样品索引序列中是独特的，并且任选地该序列可以与样品基因组中的任何序列区分开。
样品索引序列可以位于连接探针(例如，连接产物)上的任何位置，只要其不影响(1)探针寡核苷酸与分析物杂交，(2)连接探针寡核苷酸以生成连接探针(例如，连接产物)，以及(3)捕获探针结合结构域与阵列上的捕获探针杂交。例如，在一些情况下，样品索引序列可以位于第一探针寡核苷酸(例如，左侧探针；即，如图12A中所示)上。在一些情况下，样品索引位于第一探针寡核苷酸中不与分析物杂交的瓣上。在一些情况下，样品索引序列可以位于第二探针寡核苷酸(例如，右侧探针；即，如图12A中所示)上。在一些情况下，样品索引位于第二探针寡核苷酸中不与分析物杂交的瓣上。
(f)***和试剂盒
本文还公开了用于本文所公开的任何一种方法的***和试剂盒。在一些情况下，该***或试剂盒用于分析生物样品中的分析物。在一些情况下，该***或试剂盒包括被构造成保持第一基板和第二基板的支撑装置，其中生物样品被放置在第一基板上，并且其中第二基板包括多个捕获探针，其中多个捕获探针中的一个捕获探针包括：(i)空间条形码和(ii)捕获结构域。在一些情况下，该***或试剂盒包括第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸，其中第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸各自包含与分析物的相邻序列基本上互补的序列，其中第二探针寡核苷酸包含捕获探针结合结构域，并且其中第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸能够连接在一起形成连接探针。在一些情况下，该***或试剂盒包括多种分析物捕获剂，其中多种分析物捕获剂中的一种分析物捕获剂包括分析物结合部分和捕获剂条形码结构域，其中分析物结合部分特异性地结合分析物，并且其中捕获剂条形码结构域包括分析物结合部分条形码和捕获柄序列。在一些情况下，该***或试剂盒还包括试剂介质，该试剂介质包含透化剂，并任选地包含用于释放连接探针的作用剂。在一些情况下，该***或试剂盒包括用于实施本文所述任何一种方法的说明书。
在一些情况下，透化剂是胃蛋白酶或蛋白酶K。在一些情况下，用于释放连接探针的作用剂是核糖核酸酶，任选地其中该核糖核酸酶是核糖核酸酶H。
在一些情况下，该***或试剂盒还包括位于支撑装置上的对准机构，其用于将第一基板和第二基板对准。在一些情况下，对准机构包括线性致动器，第一基板包括第一构件，第二基板包括第二构件。线性致动器可以被构造成沿与第一构件和/或第二构件的平面正交的轴线移动第二构件。线性致动器可以被构造成沿与第一构件和/或第二构件的平面正交的轴线移动第一构件。线性致动器可以被构造成以至少0.1mm/s的速度移动第一构件、第二构件，或者第一构件和第二构件两者。最后，在一些情况下，线性致动器可以被构造成以至少0.1lb大小的力移动第一构件、第二构件，或者第一构件和第二构件两者。
实施例
实施例1-用夹层过程来捕获连接探针的方法
a.使用与小鼠转录组的一小部分杂交的探针对来捕获与小鼠大脑样品和小鼠肾脏样品中的分析物杂交的连接探针的方法。
在一个非限制性实例中，将标准载片(对于夹层条件)或基因表达(GEx)载片(对于非夹层对照条件)上的小鼠大脑和小鼠肾脏FFPE切片脱蜡，H&E染色并成像。接下来，用HCl溶液洗涤三次，对组织样品进行苏木精脱色。然后在pH 9.0的TE中在70℃下孵育1小时，使切片解交联。去除TE，将组织置于1x PBS-Tween中孵育15分钟。
将探针对的各个探针寡核苷酸(例如，第一探针寡核苷酸、第二探针寡核苷酸)与小鼠大脑组织中的分析物(例如，RNA分子)的相邻序列杂交。然后将这些RTL探针寡核苷酸连接在一起，从而产生连接探针(例如，连接产物)(图12A)。连接探针(例如，连接产物)包括捕获探针结合结构域。这些探针被设计成与小鼠转录组的一部分杂交(例如，使用总共5000个探针对)或者与小鼠转录组中的每种转录物杂交。
在连接这些RTL探针寡核苷酸之后，使用以下各种条件从组织中释放连接探针：(A)在试剂介质中使用核糖核酸酶的夹层过程；(B)在试剂介质中使用核糖核酸酶+蛋白酶K的夹层过程；或者(C)未使用夹层方法(即，对照)。对于夹层条件A和B，将安装有组织的标准载片与GEx载片对准，并且如本文所述以夹层构造进行透化(参见例如，图12B)。对于非夹层条件C，将安装有组织的GEx载片直接置于GEx阵列上透化。透化后，捕获探针得以延伸，制备测序文库并测序，通过计算对结果进行分析。
下面的表1和表2示出了小鼠大脑5000探针对实验的结果。
[表1]
[表2]
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如表1和表2所示，使用夹持方法的核糖核酸酶+蛋白酶K的组合引起可用目标读段分数增加、组织下斑点中读段增加，以及成组基因中位数和UMI计数中位数增加。
图13示出了来自小鼠大脑5000探针实验的结果。如图13中所见，大规模地观察到分析物检测和聚类(例如，使用5000个探针对)。另外，实现了对个体基因(例如，Hpca)的检测。综上所述，这些数据证明了使用这些夹层方法对基因簇乃至各个基因进行成像的能力。
下面的表3和表4示出了在使用被设计成与小鼠转录组的一部分杂交的探针(例如，使用部分(即，n＝5000)总探针对)的设置下，在小鼠肾脏上捕获的连接探针的结果。
[表3]
[表4]
如表3和表4所示，使用夹持方法的核糖核酸酶+蛋白酶K的组合引起可用目标读段分数增加、组织下斑点中读段增加，以及成组基因中位数和UMI计数中位数增加。
图14示出了来自小鼠肾脏5000探针实验的结果。如图14中所见，大规模地观察到分析物检测和聚类(例如，使用5000个探针对)。另外，实现了对个体基因(例如，Gatm)的检测。综上所述，这些数据证明了使用这些夹层方法对基因簇乃至各个基因进行成像的能力。
此外，如表5所示，对于人类样品使用3000个探针对或对于小鼠样品使用5000个探针对测试来自人类大脑、人类肺部、小鼠脾脏、小鼠胸腺和小鼠睾丸的其他FFPE样品。夹持样品，使用核糖核酸酶和蛋白酶K的组合将探针释放。
[表5]
b.使用与被设计成覆盖整个小鼠转录组的探针对杂交的探针对来捕获与小鼠大脑样品中的分析物杂交的连接探针的方法。
在第二组小鼠大脑样品中重复实施例1a的方法，不同的是使用覆盖整个小鼠转录组的探针对(21,000个探针对)。表6示出了使用被设计成覆盖整个小鼠转录组的探针对来捕获连接探针的结果。
[表6]
如图15所示，在夹层方法和非夹层方法中都观察到了分析物检测，证明在这两种设置中都有检测分析物的能力。另外，实现了对个体基因(例如，Rbfox3；Hpca)的检测。综上所述，这些数据证明了使用这些夹层方法对基因簇乃至各个基因进行成像的能力。
表7示出了使用探针对来捕获连接探针的结果，这些探针对被设计成用不同类型的组织样品来覆盖人类转录组(3000探针组)或小鼠转录组(5000探针组)。
[表7]
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实施例2-用夹层过程来对RNA和蛋白质进行空间分析的方法
在一个非限制性实例中，进行了RNA和蛋白质的空间分析方法。简言之，根据实施例1a中的步骤，将标准载片(对于夹层条件)或基因表达(GEx)载片(对于非夹层对照条件)上的小鼠大脑FFPE切片解交联。使用小鼠特异性探针组对小鼠部分转录组进行探针杂交(n＝5000个探针对)，之后如实施例1所述进行RTL探针连接。然后将这些切片与用于NeuN和Gfap的加totalseq B寡核苷酸标签的抗体一起孵育，之后洗涤。用寡核苷酸对抗体加标签，这些寡核苷酸具有与GEx载片的捕获探针捕获结构域互补的序列和独特地识别该抗体的条形码序列。在如本文所述的夹层条件下或在非夹层条件下，连接探针和抗体寡核苷酸标签从组织中释放。对于两种条件，试剂介质包括核糖核酸酶和蛋白酶K。对于夹层条件，将安装有组织的载片与GEx载片对准，并且如本文所述以夹层构造进行透化(参见例如，图16B)。对于非夹层条件，将安装在GEx载片上的组织直接置于GEx阵列上透化。透化后，捕获探针得以延伸，制备测序文库并测序，通过计算对结果进行分析。
表8示出了mRNA分析结果。表9示出了抗体分析结果。
[表8]
/>
[表9]
如图18A至图18B所示，在夹层方法和非夹层方法中都观察到了mRNA和蛋白质分析物检测，证明在这两种设置中都有检测分析物的能力。另外，实现了对个体基因(例如，RbFox3/NeuN；Gfap)的检测。综上所述，这些数据证明了使用这些夹层方法对成簇的蛋白质或mRNA分析物乃至各个蛋白质或mRNA分析物进行成像的能力。
实施例3-利用夹层过程进行空间转录组学分析的方法
在一个非限制性实例中，该夹层过程可以用于如本文所述的空间转录组学分析工作流程中的下游分析步骤。
图19A示出了使用新鲜的冷冻组织样品进行空间分析测定的示例性工作流程。例如，将组织切片(a)固定并染色(例如，苏木精和曙红染色、荧光抗体染色)；(b)成像，以评估抗体染色的质量；(c)将组织切片脱色并卸下；(d)在进行夹层过程之前，用蛋白酶K和十二烷基肌氨酸钠透化组织切片；以及(e)进行逆转录方案，生成分析物文库。
图19B示出了使用***固定石蜡包埋的(FFPE)组织样品进行空间分析测定的示例性工作流程。例如，将FFPE组织切片(a)脱蜡，其中石蜡包埋材料被去除；(b)固定并染色(例如，苏木精和曙红染色、荧光抗体染色)；(b)成像，以评估抗体染色的质量；(c)将组织切片脱色并卸下；(d)在进行夹层过程之前，用核糖核酸酶、蛋白酶K和十二烷基肌氨酸钠透化组织切片；以及(e)进行逆转录方案，生成分析物文库。
实施例4-利用连续夹层过程进行空间转录组学分析的方法
在一个非限制性实例中，可以使用连续生物切片来重复该夹层过程，这些连续生物切片转移到包括多个捕获探针的同一基板。
为了证明从多个生物样品中捕获分析物的能力，在单独的载片上生成连接探针，其中每个载片包括不同的生物样品。简言之，在生物样品1中，使用小鼠样品。在生物样品2中，使用人类样品。特别地，将小鼠胸腺或小鼠睾丸生物样品用作生物样品1，将人类肺部或人类乳腺癌样品用作生物样品2。探针被设计成与小鼠特异性mRNA分析物或人类特异性分析物杂交。在一些实施方案中，使用了部分转录组探针组。在一些实施方案中，使用了小鼠转录组探针组。在一些实施方案中，使用了人类转录组探针对。
将探针对中的各个探针寡核苷酸(例如，第一探针寡核苷酸、第二探针寡核苷酸)与每个生物样品中的分析物(例如，RNA分子)的相邻序列杂交。然后将这些RTL探针寡核苷酸连接在一起，从而产生连接探针。在连接这些RTL探针寡核苷酸之后，添加核糖核酸酶H以从分析物中释放连接产物，然后向样品中添加蛋白酶K以透化生物样品。
在透化步骤期间，将每个样品(即，生物样品1和生物样品2)连续添加到第二基板(即，包括用于捕获连接探针的捕获探针的基板)中。连接探针上的多聚(A)序列与捕获探针结构域的多聚(T)序列杂交。在来自生物样品1的连接探针杂交之后，将生物样品1从含有捕获探针的基板上移除。用1xSSC短暂洗涤含有捕获探针的基板，快速干燥，然后对生物样品2重复这种夹层转移方法。
如图图20所示，检测到了人类RTL连接探针，证明可以实现多个探针的连续转移。以下生物样品作为对照：其中不使用夹持方法的生物样品(即，小鼠胸腺、小鼠睾丸和人类乳腺癌)(图21A)，以及其中使用单次夹持转移的生物样品(图21B)。在每个对照中，如热图和聚类图像(图21A至图21B)所示，在阵列上捕获并检测到连接探针。
图22A至图22B示出了每种样品类型的热图，证明第二基板中测序读段的位置和饱和度。图22A至图22B还示出了利用loupe文件基准的叠加图中组织下读段的聚类和空间性。假设具有相似基因表达的组织区域将聚集在一起，并在这些图像中用相同的颜色来表示。聚类读段的叠加表明，捕获了来自小鼠组织和人类组织两者的读段。在热图中看到的组织下读段的图案表示为叠加的聚类读段中的每种组织类型。
结果证明了在同一阵列上连续捕获来自不同生物样品的分析物的能力。结果还证明了通过计算对样品进行去多重化的能力。
实施例5-从安装在载片上的新鲜冷冻小鼠大脑切片有效地将分析物捕获到空间阵列载片上
在一个非限制性实例中，在夹层条件和非夹层条件下证明了分析物被捕获到在空间上加条形码的阵列上和随后的测序。对于测试(夹持)条件，使用了存档的包含苏木精/伊红染色的新鲜冷冻小鼠脑切片的组织固定标准载玻片。对于对照(非夹层)条件，使用了具有直接安装到阵列区上的苏木精/曙红染色的新鲜冷冻小鼠大脑切片的基因表达(GEx)阵列载片。在这两种条件下，对组织切片进行苏木精脱色步骤。将根据“夹持”条件处理的载片在37℃下短暂干燥，然后连同GEx载片以及包含十二烷基肌氨酸钠和蛋白酶K的透化缓冲液一起安装在仪器中。在仪器中夹层闭合时，将组织切片透化1分钟。对于根据非夹层条件处理的组织固定GEx载片，在不进行夹持的情况下，使用相同的透化缓冲液将切片透化5分钟。对于这两种情况，在透化后，将GEx载片上所捕获的含有多聚A的mRNA转录物逆转录成cDNA，之后进行标准测序文库制备和测序。
图24示出了描绘每斑点基因中位数和每斑点UMI计数中位数的结果。
显示Log10 UMI的视觉热图结果在图25中示出。Log10 UMI计数的空间模式在夹层条件和非夹层条件下是相似的。
图26描绘了空间聚类分析(顶行2605)和对海马转录物Hpca的分析(底行2610)。空间模式在夹层条件和非夹层条件下相差无几。
实施例6-从安装在载片上的FFPE人类大脑切片和人类***切片有效地将分析物捕获到空间阵列载片上
在一个非限制性实例中，将标准载片(对于夹层条件)或基因表达(GEx)载片(对于非夹层对照条件)上的人类大脑和人类***FFPE切片脱蜡，H&E染色并成像。接下来，用HCl溶液洗涤三次，对组织样品进行苏木精脱色，然后根据实施例1a中的步骤进行解交联。
如实施例1所述，进行探针杂交，之后进行RTL探针连接。然后将这些切片与用于NeuN和Gfap的加totalseq B寡核苷酸标签的抗体一起孵育，之后洗涤。用寡核苷酸对抗体加标签，这些寡核苷酸具有与GEx载片的捕获探针捕获结构域互补的序列和独特地识别该抗体的条形码序列。在如本文所述的夹层条件下或在非夹层条件下，连接探针和抗体寡核苷酸标签从组织中释放。对于两种条件，试剂介质包括核糖核酸酶和蛋白酶K。对于夹层条件，将安装有组织的载片与GEx载片对准，并且如本文所述以夹层构造进行透化(参见例如，图16B)。对于非夹层条件，将安装在GEx载片上的组织直接置于GEx阵列上透化。透化后，捕获探针得以延伸，制备测序文库并测序，通过计算对结果进行分析。
示出人类大脑组织和人类***组织的Log10 UMI的视觉热图结果分别在图27A和图27B中示出。Log10 UMI计数的空间模式在夹层条件和非夹层条件下是相似的。人类大脑组织和人类***组织的空间聚类分析分别在图27A和图27B中描绘。这些数据证明，空间聚类在夹层条件和非夹层条件下相差无几。
实施例7-从安装在载片上的小鼠脾脏切片、大脑切片、头部切片和躯干切片有效地将分析物多重化捕获到空间阵列载片上
在一个非限制性实例中，将FFPE小鼠脾脏样品、FFPE小鼠大脑样品、FFPE小鼠胚胎躯干样品和FFPE小鼠胚胎头部切片样品放置到标准载片上(对于夹层条件)或空间表达(GEx)载片上(作为非夹层条件)。GEx载片包括在空间上加条形码的捕获探针的阵列。简言之，将组织切片并安装在载片上，然后在干燥器中干燥过夜。次日，将组织加热到60℃，之后脱蜡、再水合。进行H&E染色，然后对组织成像。使用HCl将组织脱色，在柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中在95℃下解交联1小时。解交联之后，将组织与全小鼠转录组RTL(模板化连接)探针组一起在50℃下孵育过夜。次日，洗涤组织以去除未杂交的探针，然后用连接酶处理以将RTL探针连接在一起。在另一个洗涤步骤之后，用抗体封闭缓冲液将组织封闭。将组织与缀合抗体文库(例如，包含多种分析物捕获剂的文库，其中每种分析物捕获剂均包含缀合至寡核苷酸的抗原特异性抗体)一起孵育过夜。次日，如下所述将组织置于夹持条件或非夹层条件下。
用PBS-T洗涤放置在标准载片上用于夹持条件的组织，用曙红保持，然后用SSC洗涤。将这些组织置于本文所述的夹持条件下。简言之，将组织载片连同GEx载片和在缓冲液中包含核糖核酸酶和蛋白酶K的试剂溶液一起安装在仪器中。在仪器中实现夹层闭合时，将组织切片透化30分钟，从而允许来自分析物捕获剂的连接产物和寡核苷酸迁移到GEx载片上，以供捕获探针捕获。在透化和捕获之后，将GEx载片从仪器中取出。
用PBST洗涤放置在GEx载片上用于非夹持条件的组织，然后用SSC洗涤。用核糖核酸酶对组织进行30分钟的探针释放步骤，之后用包含蛋白酶K和去污剂的透化缓冲液进行1小时的透化步骤。因此，连接产物和分析物捕获剂被GEx载片的捕获探针捕获。
不管条件是怎样的，GEx载片均用2xSSC洗涤两次，并进行探针延伸、变性和预扩增，之后对模板化连接和分析物捕获剂文库进行扩增和测序。
测序之后，评估每种条件(夹持条件和非夹持条件)下的质量、灵敏度和检测结果。如表10中所示，全局检测转录物(即，mRNA)和蛋白质的质量、灵敏度和检测结果在夹层条件和非夹层条件下相差无几。
[表10]
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生成图像，以针对个体生物标志物评估小鼠脾脏组织和小鼠大脑组织中基因表达和基因产物(例如，蛋白质)分布图的重叠情况。例如，评估了在脾脏和大脑两者中表达的CD45。如图28A(夹持条件)和图28C(非夹持条件)所示，蛋白酪氨酸磷酸酶C型受体(Ptprc；例如，Ensembl：ENSMUSG00000026395)mRNA表达在脾脏组织样品中检测到。另外，在夹持条件下(图28B)和非夹持条件下(图28D)也都检测到基因产物(例如，蛋白质)CD45R。CD45R是Ptprc的蛋白质名称，确定Ptprc的mRNA表达和CD45R的蛋白质表达是否有重叠。如图28A至图28B和图28C至图28D中所示，夹持条件(77％相关性)和非夹持条件(76％相关性)分别证明转录物和蛋白质存在重叠，表明转录物(即，mRNA)和蛋白质检测(1)在组织的相似区域中得到识别，并且(2)在小鼠脾脏样品中，在夹层条件和非夹层条件下相差无几。
还评估了小鼠大脑样品。特别地，在小鼠大脑样品中全局评估每种条件(夹持条件和非夹持条件)下的质量、灵敏度和检测结果。如表11中所示，全局检测转录物(即，mRNA)和蛋白质的质量、灵敏度和检测结果在小鼠大脑样品中，在夹层条件和非夹层条件下相差无几。
[表11]
类似于上述的小鼠脾脏样品图像，在小鼠大脑样品中评估了个体基因表达和蛋白质产物。如图29A(夹持条件)和图29C(非夹持条件)所示，酪氨酸羟化酶(Th；例如，Ensembl：ENSMUSG00000000214)mRNA表达在大脑中检测到。另外，在夹持条件下(图29B)和非夹持条件下(图29D)也检测到基因产物(例如，蛋白质)TH。由于TH是由Th产生的蛋白质，因此确定Th的mRNA表达和TH的蛋白质表达是否重叠。如图29A至图29B和图29C至图29D中所示，夹持条件(63％相关性)和非夹持条件(63％相关性)分别观察到转录物和蛋白质存在重叠，从而证明转录物(即，mRNA)和蛋白质检测在小鼠大脑样品中，在夹层条件和非夹层条件下相差无几。
使用相同的方法(即，测试夹持条件对比非夹持对照条件，同时检测RNA和蛋白质两者)对胚胎躯干切片和胚胎头部切片进行附加实验。除了检测RNA和蛋白质两者的条件之外，还包括第三种条件作为对照。该第三种条件(表12和表13中的条件3)仅检测RNA的存在和丰度。在每种情况下，均使用如本文先前所述的模板化连接来检测RNA。对于下面的表12和表13中所示的条件1和条件2，也使用本文所述的分析物捕获剂方法来检测蛋白质。在小鼠胚胎躯干样品和头部/上部躯干样品中评估每种条件(夹持条件对比非夹持条件)下的质量、灵敏度和检测结果。如表12和表13中所示，全局检测转录物(即，mRNA)和蛋白质的质量、灵敏度和检测结果在小鼠胚胎躯干样品和头部样品中，在夹层条件和非夹层条件下相差无几。另外，在条件1与条件3之间全局检测转录物(即，mRNA)的质量、灵敏度和检测结果大致相同，证明蛋白质捕获方法和夹持方法都没有对使用模板化连接方法的RNA捕获造成干扰。
[表12]-小鼠胚胎躯干样品数据
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[表13]-小鼠胚胎头部/上部躯干样品数据
除了对每个组进行全局表达分析之外，还针对个体目标分析了小鼠胚胎躯干和头部/上部躯干样品中单个目标的转录物(即，mRNA)和蛋白质的位置和丰度。图30A至图30B示出了在条件1(即，夹持条件)下，小鼠胚胎躯干样品中淋巴细胞抗原76(Terl19)(例如，NCBI基因ID：104231)的mRNA(图30A)和蛋白质(图30B)检测结果。图30C至图30D示出了在条件2(即，非夹持条件)下，小鼠胚胎躯干样品中Ter119的mRNA(图30C)和蛋白质(图30D)检测结果。图31A至图31B示出了在条件1(即，夹持条件)下，小鼠胚胎头部样品中Ter119的mRNA(图31A)和蛋白质(图31B)检测结果。图31C至图31D示出了在条件2(即，非夹持条件)下，小鼠胚胎头部/上部躯干样品中Ter119的mRNA(图31C)和蛋白质(图31D)检测结果。如图30A至图31D中所示，在夹持条件和非夹持条件下，Ter119 mRNA和蛋白质都易于检测，且mRNA和蛋白质检测有相当大的重叠，从而证明该方法具有适应性和再现性，受条件的影响很小。
在小鼠胚胎躯干样品和头部样品中分析了附加的单一生物标志物。如图32A至图32I中所示，分析了含金属磷酸酯酶结构域1(Mpped1；例如，Ensembl：ENSMUSG00000041708)mRNA和蛋白质。Mpped1很容易在小鼠胚胎头部样品的大脑区域中检测到。图32A示出了使用夹持条件(表12和表13的条件1)检测小鼠胚胎头部样品中的Mpped1 RNA。图32B示出了使用夹持条件(表12和表13的条件1)检测小鼠胚胎头部样品中的Mpped1蛋白。然而，在小鼠胚胎躯干样品中不易检测到Mpped1 mRNA。与这些观察结果一致，Mpped1具有金属磷酸酯酶活性，这可能在大脑发育中发挥作用。与夹持条件数据一致，在非夹持条件下在头部中检测到Mpped1 RNA和蛋白质(图32D(mRNA)和图32E(蛋白质))，但在躯干中没有检测到(图32F(mRNA)和图32G(蛋白质))。类似地，在其中仅检测到RNA的非夹持条件下，在头部(图32H)而不是在躯干(图32I)中检测到Mpped1 RNA。因此，不管条件如何，可以在同一样品中同时检测基因和蛋白质表达，低至单一生物标志物水平。
在来自表12和表13的条件1、2和3下，在小鼠头部/上部躯干和胚胎躯干样品中检查了四种附加的生物标志物：肌钙蛋白C1，慢骨骼肌和心肌型(Tnnc1，例如Ensembl：ENSMUSG00000091898)；成纤维细胞生长因子15(Fgf15，例如Ensembl：ENSMUSG00000031073)；骺蛋白聚糖(Epyc，例如Ensembl：ENSMUSG00000019936)；以及丝氨酸(或半胱氨酸)肽酶抑制剂，进化枝A，成员1E(Serpinale，例如Ensembl：ENSMUSG00000072849)。参见图33A至图36I。Tnnc1参与肌肉收缩调节，并且在每种条件下，在所有样品中均轻易地检测到其表达。参见图33A至图33I。Fgf15在视网膜神经发生中起到细胞命运决定因子的作用。事实上，在胚胎的每个头部样品的眼睛中均发现了它的表达，但在躯干中没有检测到其表达。参见图34A至图34I。Epyc在骨形成和软骨结构中起作用，在每个样品(头部和躯干)中均检测到。参见图35A至图35I。最后，Serpina1e在肝脏中有活性，因为它在α-1抗胰蛋白酶蛋白生产中起作用。如图36A至图361中所示，在小鼠胚胎的躯干中检测到Serpina1e，但在头部/上部躯干样品中没有检测到。这些生物标志物图像中的每一者之间一致的是，与非夹持方法相比，夹持方法易于检测到单独的mRNA或蛋白质生物标志物。因此，在使用夹持情况或非夹持条件的情况下，可以使用本文所述的方法跨多种组织类型同时检测基因和蛋白质两者的表达，低至单一生物标志物水平。

Claims (125)

1.一种用于分析安装在第一基板上的生物样品中的分析物的方法，所述方法包括：
(a)将第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸与所述分析物杂交，其中所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸各自包含与所述分析物的相邻序列基本上互补的序列，并且其中所述第二探针寡核苷酸包含捕获探针结合结构域；
(b)将所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸偶联，从而生成连接探针；
(c)将所述第一基板与包括阵列的第二基板对准，使得所述生物样品的至少一部分与所述阵列的至少一部分对准，其中所述阵列包括多个捕获探针，其中所述多个捕获探针中的一个捕获探针包括：(i)空间条形码和(ii)捕获结构域；
(d)当所述生物样品与所述阵列的至少一部分对准时，(i)从所述分析物释放所述连接探针，然后(ii)将所述连接探针从所述生物样品迁移到所述阵列；以及
(e)将所述连接探针与所述捕获结构域杂交。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸位于连续核酸序列上。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一探针寡核苷酸位于所述连续核酸序列的3’末端。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述第二探针寡核苷酸位于所述连续核酸序列的5’末端。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述相邻序列彼此邻接。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述相邻序列彼此相距至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个核苷酸。
7.根据权利要求6所述的方法，还包括生成延伸的第一探针寡核苷酸，其中所述延伸的第一探针寡核苷酸包含与介于杂交至所述第一探针寡核苷酸的序列和杂交至所述第二探针寡核苷酸的序列之间的序列互补的序列。
8.根据权利要求6所述的方法，还包括使用聚合酶生成延伸的第二探针寡核苷酸，其中所述延伸的第二探针寡核苷酸包含与介于杂交至所述第一探针寡核苷酸的序列和杂交至所述第二探针寡核苷酸的序列之间的序列互补的序列。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括将第三探针寡核苷酸与所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸杂交。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述第三探针寡核苷酸包含：
(i)与所述第一探针寡核苷酸中杂交至所述第三探针寡核苷酸的一部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或者100％互补的序列；以及
(ii)与所述第二探针寡核苷酸中杂交至所述第三探针寡核苷酸的一部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或者100％互补的序列。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸偶联包括经由连接酶将所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸连接。
12.根据权利要求7至11中任一项所述的方法，其中将所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸偶联包括经由连接酶：
(i)将所述第一探针寡核苷酸和所述延伸的第二探针寡核苷酸连接；或者
(ii)将所述延伸的第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸连接。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述连接酶选自splintR连接酶、单链DNA连接酶或T4 DNA连接酶。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括在所述释放步骤之前扩增所述连接探针，任选地其中所述扩增包括滚环扩增。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述扩增包括滚环扩增。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述释放步骤(d)包括使所述生物样品与试剂介质接触，所述试剂介质包含透化剂和用于释放所述连接探针的作用剂，从而透化所述生物样品并从所述分析物中释放所述连接探针。
17.根据权利要求0所述的方法，其中所述对准包括：
(i)将所述第一基板安装在支撑装置的第一构件上，所述第一构件被构造成保持所述第一基板；
(ii)将所述第二基板安装在所述支撑装置的第二构件上；
(iii)将所述试剂介质施加到所述第一基板和/或所述第二基板；以及
(iv)操作所述支撑装置的对准机构以移动所述第一构件和/或所述第二构件，使得至少一部分所述生物样品与至少一部分所述阵列对准，并且使得这部分所述生物样品和这部分所述阵列接触所述试剂介质。
18.根据权利要求0所述的方法，其中所述对准机构联接到所述第一构件、所述第二构件，或者所述第一构件和所述第二构件两者。
19.根据权利要求0或0所述的方法，其中所述对准机构包括线性致动器，任选地其中：
所述线性致动器被构造成沿与所述第一构件和/或所述第二构件的平面正交的轴线移动所述第二构件，并且/或者
所述线性致动器被构造成沿与所述第一构件和/或所述第二构件的平面正交的轴线移动所述第一构件，并且/或者
所述线性致动器被构造成以至少0.1mm/s的速度移动所述第一构件、所述第二构件，或者所述第一构件和所述第二构件两者，并且/或者
所述线性致动器被构造成以至少0.1lb大小的力移动所述第一构件、所述第二构件，或者所述第一构件和所述第二构件两者。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述释放步骤(d)期间，在所述第一基板与所述第二基板之间维持一定的分隔距离，任选地其中所述分隔距离小于50微米，任选地其中所述分隔距离介于2微米至25微米之间，任选地其中所述分隔距离是在与所述第一基板的支撑所述生物样品的表面正交的方向上测量的，并且/或者至少这部分所述生物样品与至少这部分所述阵列在竖直方向上对准。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一基板和所述第二基板中的至少一者还包括隔件，其中在所述第一基板和所述第二基板被安装于所述支撑装置上之后，所述隔件设置在所述第一基板与所述第二基板之间，并且被构造成将所述试剂介质保持在由所述第一基板、所述第二基板和所述隔件形成的腔室内，并且维持所述第一基板与所述第二基板之间的分隔距离，所述隔件被定位成至少部分地围绕所述第一基板上的其上设置有所述生物样品的区域和/或设置在所述第二基板上的所述阵列，其中所述第一基板的所述区域、所述隔件和所述第二基板至少部分地包围包括所述生物样品在内的容积。
22.根据权利要求21所述的方法，其中：
所述腔室包括部分或完全密封的腔室，并且/或者
所述第二基板包括所述隔件，并且/或者
所述第一基板包括所述隔件，并且/或者
将所述试剂介质施加到所述第一基板和/或所述第二基板包括将所述试剂介质施加到所述隔件的某个区域，所述区域位于所述第二基板的封闭区之外，所述封闭区由所述隔件形成。
23.根据权利要求17至22中任一项所述的方法，其中随着所述第一基板和/或所述第二基板经由所述对准机构移动，所述第一基板相对于所述第二基板成一角度，使得所述第一基板的下降载片和所述第二基板的一部分接触所述试剂介质，
任选地其中：
所述第一基板的下降侧将所述试剂介质推向相反方向，并且/或者
所述对准机构进一步移动所述第一基板和/或所述第二基板，以维持所述第一基板和所述第二基板的近似平行排列以及所述第一基板与所述第二基板之间的分隔距离，任选地当维持所述近似平行排列和所述分隔距离时，所述隔件完全封闭和包围至少这部分所述生物样品和至少这部分所述阵列，并且所述隔件形成了所述腔室的保持一定体积所述试剂介质的侧面。
24.根据权利要求16至23中任一项所述的方法，其中所述用于释放所述连接探针的作用剂包括核酸酶。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述核酸酶包括核糖核酸酶，任选地其中所述核糖核酸酶选自核糖核酸酶A、核糖核酸酶C、核糖核酸酶H或核糖核酸酶I。
26.根据权利要求16至25中任一项所述的方法，其中所述透化剂包括蛋白酶。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述蛋白酶选自胰蛋白酶、胃蛋白酶、弹性蛋白酶或蛋白酶K。
28.根据权利要求16至27中任一项所述的方法，其中所述试剂介质还包含去污剂。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述去污剂选自十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基肌氨酸钠、皂苷、Triton X-100TM或Tween-20TM。
30.根据权利要求16至29中任一项所述的方法，其中所述试剂介质包含少于5w/v％的选自SDS和十二烷基肌氨酸钠的去污剂。
31.根据权利要求16至29中任一项所述的方法，其中所述试剂介质包含至少5w/v％的选自SDS和十二烷基肌氨酸钠的去污剂。
32.根据权利要求16至28中任一项所述的方法，其中所述试剂介质不包含十二烷基硫酸钠(SDS)和十二烷基肌氨酸钠。
33.根据权利要求16至32中任一项所述的方法，其中所述试剂介质还包含聚乙二醇(PEG)。
34.根据权利要求16至33中任一项所述的方法，其中所述生物样品和所述阵列与所述试剂介质接触约1分钟至约60分钟。
35.根据权利要求16至34中任一项所述的方法，其中所述生物样品和所述阵列与所述试剂介质接触约30分钟。
36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括确定(i)所述连接探针的全部或部分序列，或者其互补序列，和(ii)所述空间条形码的全部或部分序列，或者其互补序列，任选地其中所述方法还包括使用(i)和(ii)的确定序列来确定所述生物样品中的所述分析物的位置和丰度。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述确定包括对以下各项进行测序：(i)所述连接探针的全部或部分序列，或者其互补序列，和(ii)所述空间条形码的全部或部分序列，或者其互补序列。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述连接探针的序列包括所述空间条形码的序列或其反向互补序列，以及对应于所述生物样品中的所述分析物的序列或其反向互补序列。
39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中从与这部分所述阵列对准的这部分所述生物样品中释放的所述连接探针的至少50％被这部分所述阵列中的捕获探针捕获。
40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述生物样品正下方的斑点中检测到至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的所述连接探针。
41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述捕获探针包括多聚(T)序列。
42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述捕获探针包括与所述第一探针寡核苷酸或所述第二探针寡核苷酸互补的序列。
43.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述捕获探针还包括一个或多个功能性结构域、独特分子标识符(UMI)、裂解结构域，以及它们的组合。
44.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分析物是RNA。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述RNA是mRNA。
46.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括分析所述生物样品中的不同分析物。
47.根据权利要求46所述的方法，其中分析所述不同分析物包括：
(a)使所述生物样品与多种分析物捕获剂接触，其中所述多种分析物捕获剂中的一种分析物捕获剂包括分析物结合部分和捕获剂条形码结构域，其中所述分析物结合部分特异性地结合所述不同分析物，并且其中所述捕获剂条形码结构域包括分析物结合部分条形码和捕获柄序列；以及
(b)将所述捕获柄序列与所述捕获结构域杂交。
48.根据权利要求47所述的方法，还包括确定(i)所述捕获剂条形码结构域的全部或部分序列；以及(ii)所述空间条形码的全部或部分序列，或者其互补序列。
49.根据权利要求48所述的方法，还包括使用(i)和(ii)的确定序列来分析所述生物样品中的所述不同分析物。
50.根据权利要求46至49中任一项所述的方法，还包括释放步骤，其中从所述不同分析物中释放所述捕获剂条形码结构域。
51.根据权利要求46至50中任一项所述的方法，其中所述不同分析物是蛋白质分析物。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述蛋白质分析物是细胞外蛋白质。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述蛋白质分析物是细胞内蛋白质。
54.根据权利要求47至53中任一项所述的方法，其中所述分析物结合部分是抗体。
55.根据权利要求47至54中任一项所述的方法，其中所述分析物捕获剂包括接头。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述接头是可裂解接头。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述可裂解接头是光可裂解接头、紫外线可裂解接头或酶可裂解接头。
58.根据权利要求56或57所述的方法，其中所述可裂解接头是光可裂解接头。
59.一种用于分析安装在第一基板上的生物样品中的分析物的方法，所述方法包括：
(a)使所述生物样品与多种分析物捕获剂接触，其中所述多种分析物捕获剂中的一种分析物捕获剂包括分析物结合部分和捕获剂条形码结构域，其中所述分析物结合部分特异性地结合所述分析物，并且其中所述捕获剂条形码结构域包括分析物结合部分条形码和捕获柄序列；
(b)将所述第一基板与包括阵列的第二基板对准，使得所述生物样品的至少一部分与所述阵列的至少一部分对准，其中所述阵列包括多个捕获探针，其中所述多个捕获探针中的一个捕获探针包括：(i)空间条形码和(ii)捕获结构域；
(c)当所述生物样品与所述阵列的至少一部分对准时，(i)从所述分析物释放所述捕获剂条形码结构域，然后(ii)被动或主动地将所述捕获剂条形码结构域从所述生物样品迁移到所述阵列；以及
(d)将所述捕获柄序列偶联到所述捕获结构域。
60.根据权利要求59所述的方法，还包括确定：(i)所述捕获剂条形码结构域的全部或部分序列，或者其互补序列；以及(ii)所述空间条形码的全部或部分序列，或者其互补序列。
61.根据权利要求60所述的方法，还包括使用(i)和(ii)的确定序列来确定所述生物样品中的所述分析物的位置和丰度。
62.根据权利要求59至61中任一项所述的方法，其中所述确定包括对以下各项进行测序：(i)所述捕获剂条形码结构域的全部或部分序列，或者其互补序列，和(ii)所述空间条形码的全部或部分序列，或者其互补序列。
63.根据权利要求59至62中任一项所述的方法，其中所述释放步骤(c)包括使所述生物样品和所述阵列与包含核酸酶的试剂介质接触。
64.根据权利要求59至0中任一项所述的方法，其中所述释放步骤(c)包括使所述生物样品和所述阵列与包含透化剂的试剂介质接触。
65.根据权利要求63或0所述的方法，其中所述对准包括：
(i)将所述第一基板安装在支撑装置的第一构件上，所述第一构件被构造成保持所述第一基板；
(ii)将所述第二基板安装在所述支撑装置的第二构件上，
(iii)将所述试剂介质施加到所述第一基板和/或所述第二基板，以及
(iv)操作所述支撑装置的对准机构以移动所述第一构件和/或所述第二构件，使得至少一部分所述生物样品与至少一部分所述阵列对准，并且使得这部分所述生物样品和这部分所述阵列接触所述试剂介质。
66.根据权利要求0所述的方法，其中所述对准机构联接到所述第一构件、所述第二构件，或者所述第一构件和所述第二构件两者。
67.根据权利要求0或0所述的方法，其中所述对准机构包括线性致动器，任选地其中：
所述线性致动器被构造成沿与所述第一构件和/或所述第二构件的平面正交的轴线移动所述第二构件，并且/或者
所述线性致动器被构造成沿与所述第一构件和/或所述第二构件的平面正交的轴线移动所述第一构件，并且/或者
所述线性致动器被构造成以至少0.1mm/s的速度移动所述第一构件、所述第二构件，或者所述第一构件和所述第二构件两者，并且/或者
所述线性致动器被构造成以至少0.1lb大小的力移动所述第一构件、所述第二构件，或者所述第一构件和所述第二构件两者。
68.根据权利要求59至0中任一项所述的方法，其中在所述释放步骤(d)期间，在所述第一基板与所述第二基板之间维持一定的分隔距离，任选地其中所述分隔距离小于50微米，任选地其中所述分隔距离介于2微米至25微米之间，任选地其中所述分隔距离是在与所述第一基板的支撑所述生物样品的表面正交的方向上测量的，并且/或者至少这部分所述生物样品与至少这部分所述阵列在竖直方向上对准。
69.根据权利要求59至0中任一项所述的方法，其中所述第一基板和所述第二基板中的至少一者还包括隔件，其中在所述第一基板和所述第二基板被安装于所述支撑装置上之后，所述隔件设置在所述第一基板与所述第二基板之间，并且被构造成将所述试剂介质保持在由所述第一基板、所述第二基板和所述隔件形成的腔室内，并且维持所述第一基板与所述第二基板之间的分隔距离，所述隔件被定位成至少部分地围绕所述第一基板上的其上设置有所述生物样品的区域和/或设置在所述第二基板上的所述阵列，其中所述第一基板的所述区域、所述隔件和所述第二基板至少部分地包围包括所述生物样品在内的容积。
70.根据权利要求0所述的方法，其中：
所述腔室包括部分或完全密封的腔室，并且/或者
所述第二基板包括所述隔件，并且/或者
所述第一基板包括所述隔件，并且/或者
将所述试剂介质施加到所述第一基板和/或所述第二基板包括将所述试剂介质施加到所述隔件的某个区域，所述区域位于所述第二基板的封闭区之外，所述封闭区由所述隔件形成。
71.根据权利要求0至0中任一项所述的方法，其中随着所述第一基板和/或所述第二基板经由所述对准机构移动，所述第一基板相对于所述第二基板成一角度，使得所述第一基板的下降载片和所述第二基板的一部分接触所述试剂介质，
任选地其中：
所述第一基板的下降侧将所述试剂介质推向相反方向，并且/或者
所述对准机构进一步移动所述第一基板和/或所述第二基板，以维持所述第一基板和所述第二基板的近似平行排列以及所述第一基板与所述第二基板之间的分隔距离，任选地当维持所述近似平行排列和所述分隔距离时，所述隔件完全封闭和包围至少这部分所述生物样品和至少这部分所述阵列，并且所述隔件形成了所述腔室的保持一定体积所述试剂介质的侧面。
72.根据权利要求59至0中任一项所述的方法，其中将所述捕获柄序列偶联到所述捕获结构域包括杂交。
73.根据权利要求0或0所述的方法，其中所述核酸酶包括核糖核酸酶。
74.根据权利要求0所述的方法，其中所述核糖核酸酶选自核糖核酸酶A、核糖核酸酶C、核糖核酸酶H和核糖核酸酶I。
75.根据权利要求0所述的方法，其中所述试剂介质还包含透化剂。
76.根据权利要求63至0中任一项所述的方法，其中所述释放步骤还包括透化所述生物样品，同时从所述分析物结合部分中释放所述捕获剂条形码结构域。
77.根据权利要求63至75所述的方法，其中所述透化剂包括蛋白酶。
78.根据权利要求76所述的方法，其中所述蛋白酶选自胰蛋白酶、胃蛋白酶、弹性蛋白酶或蛋白酶K。
79.根据权利要求63至0中任一项所述的方法，其中所述试剂介质还包含去污剂。
80.根据权利要求0所述的方法，其中所述去污剂选自十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基肌氨酸钠、皂苷、Triton X-100TM或Tween-20TM。
81.根据权利要求63至79中任一项所述的方法，其中所述试剂介质包含少于5w/v％的选自SDS和十二烷基肌氨酸钠的去污剂，或者其中所述试剂介质包含至少5w/v％的选自SDS和十二烷基肌氨酸钠的去污剂。
82.根据权利要求63至78中任一项所述的方法，其中所述试剂介质不包含十二烷基硫酸钠(SDS)和十二烷基肌氨酸钠。
83.根据权利要求63至82中任一项所述的方法，其中所述试剂介质还包含PEG。
84.根据权利要求59至83中任一项所述的方法，其中所述生物样品和所述阵列与所述试剂介质接触约1分钟至约60分钟。
85.根据权利要求59至84中任一项所述的方法，其中所述生物样品和所述阵列与所述试剂介质接触约30分钟。
86.根据权利要求59至85中任一项所述的方法，其中所述捕获探针包括多聚(T)序列。
87.根据权利要求59至86中任一项所述的方法，其中所述捕获探针包括与所述捕获柄序列互补的序列。
88.根据权利要求59至76中任一项所述的方法，其中所述捕获探针还包括一个或多个功能性结构域、独特分子标识符(UMI)、裂解结构域，以及它们的组合。
89.根据权利要求59至88中任一项所述的方法，其中所述分析物结合部分是抗体。
90.根据权利要求59至89中任一项所述的方法，其中所述分析物捕获剂包括接头。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述接头是可裂解接头。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述可裂解接头是光可裂解接头、紫外线可裂解接头或酶可裂解接头。
93.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物样品是组织样品。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述组织样品是实体组织样品。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述实体组织样品是组织切片。
96.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物样品是固定的组织样品。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述固定的组织样品是***固定石蜡包埋的(FFPE)组织样品。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述FFPE组织在步骤(a)之前脱蜡和解交联。
99.根据权利要求96所述的方法，其中所述固定的组织样品是***固定石蜡包埋的细胞团块。
100.根据权利要求93所述的方法，其中所述组织样品是新鲜的冷冻组织样品。
101.根据权利要求93所述的方法，其中所述组织样品在步骤(a)之前被固定和染色。
102.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括分析第三基板上的第二生物样品中的第二分析物。
103.根据权利要求102所述的方法，其中分析所述第二分析物包括：
(a)将第三探针寡核苷酸和第四探针寡核苷酸与所述第二分析物杂交，其中所述第三探针寡核苷酸和所述第四探针寡核苷酸各自包含与所述第二分析物的相邻序列基本上互补的序列，并且其中所述第四探针寡核苷酸包含第二捕获探针结合结构域；
(b)将所述第三探针寡核苷酸和所述第四探针寡核苷酸偶联，从而生成第二连接探针；
(c)将所述第三基板与包括所述阵列的所述第二基板对准，使得所述第二生物样品的至少一部分与所述阵列的至少一部分对准；
(d)当所述第二生物样品与所述阵列的至少一部分对准时，(i)从所述第二分析物释放所述第二连接探针，然后(ii)将所述第二连接探针从所述第二生物样品迁移到所述阵列；以及
(e)将所述第二连接探针与所述捕获结构域杂交。
104.根据权利要求102或103所述的方法，其中所述第二分析物是RNA。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述RNA是mRNA。
106.根据权利要求102所述的方法，其中分析第三基板上的第二生物样品中的第二分析物包括：
(a)使所述第二生物样品与多种第二分析物捕获剂接触，其中所述多种第二分析物捕获剂中的一种第二分析物捕获剂包括第二分析物结合部分和第二捕获剂条形码结构域，其中所述第二分析物结合部分特异性地结合所述第二分析物，并且其中所述第二捕获剂条形码结构域包括第二分析物结合部分条形码和第二捕获柄序列；
(b)将所述第三基板与包括阵列的第二基板对准，使得所述第二生物样品的至少一部分与所述阵列的至少一部分对准；
(c)当所述第二生物样品与所述阵列的至少一部分对准时，(i)从所述第二分析物释放所述第二捕获剂条形码结构域，然后(ii)将所述第二捕获剂条形码结构域从所述第二生物样品迁移到所述阵列；以及
(d)将所述第二捕获柄序列偶联到所述捕获结构域。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述第二分析物是蛋白质分析物。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述蛋白质分析物是细胞外蛋白质。
109.根据权利要求107所述的方法，其中所述蛋白质分析物是细胞内蛋白质。
110.根据权利要求102至105中任一项所述的方法，还包括确定(i)所述连接探针的全部或部分序列，或者其互补序列，和(ii)所述空间条形码的全部或部分序列，或者其互补序列，任选地其中所述方法还包括使用(i)和(ii)的确定序列来确定所述生物样品中的所述第二分析物的位置和丰度。
111.根据权利要求102或106至109中任一项所述的方法，还包括确定：(i)所述第二捕获柄序列的全部或部分序列，或者其互补序列，和(ii)所述空间条形码的全部或部分序列，或者其互补序列，任选地其中所述方法还包括使用(i)和(ii)的确定序列来确定所述生物样品中的所述第二分析物的位置和丰度。
112.根据权利要求102至111中任一项所述的方法，其中所述第二生物样品是第二组织样品，任选地其中所述第二组织样品是第二实体组织样品。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述第二组织样品是第二组织切片。
114.根据权利要求112或113所述的方法，其中所述第二组织样品是第二固定组织样品。
115.根据权利要求114所述的方法，其中所述第二固定组织样品是第二***固定石蜡包埋的(FFPE)组织样品。
116.根据权利要求115所述的方法，其中所述第二FFPE组织在步骤(a)之前脱蜡和解交联。
117.根据权利要求114至116中任一项所述的方法，其中所述第二固定组织样品是第二***固定石蜡包埋的细胞团块。
118.根据权利要求112所述的方法，其中所述第二组织样品是第二新鲜组织样品或第二冷冻组织样品。
119.根据权利要求112至117中任一项所述的方法，其中所述第二组织样品在步骤(a)之前被固定和染色。
120.根据权利要求102至119中任一项所述的方法，还包括分析：
(a)第四基板上的第三生物样品中的第三分析物；
(b)第五基板上的第四生物样品中的第四分析物；
(c)第六基板或更多基板上的第五生物样品或更多生物样品中的第五分析物或更多分析物。
121.一种用于分析生物样品中的分析物的***或试剂盒，所述***或试剂盒包括：
(a)被构造成保持第一基板和第二基板的支撑装置，其中所述生物样品被放置在所述第一基板上，并且其中所述第二基板包括多个捕获探针，其中所述多个捕获探针中的一个捕获探针包括：(i)空间条形码和(ii)捕获结构域；
(b)
(b1)第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸，其中所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸各自包含与所述分析物的相邻序列基本上互补的序列，其中所述第二探针寡核苷酸包含捕获探针结合结构域，并且其中所述第一探针寡核苷酸和所述第二探针寡核苷酸能够连接在一起形成连接探针；
或
(b2)多种分析物捕获剂，其中所述多种分析物捕获剂中的一种分析物捕获剂包括分析物结合部分和捕获剂条形码结构域，其中所述分析物结合部分特异性地结合所述分析物，并且其中所述捕获剂条形码结构域包括分析物结合部分条形码和捕获柄序列；
(c)试剂介质，其包含透化剂，并任选地包含用于释放所述连接探针的作用剂；以及
(d)用于实施前述权利要求中任一项所述的方法的说明书。
122.根据权利要求121所述的***或试剂盒，其中所述透化剂是胃蛋白酶或蛋白酶K。
123.根据权利要求121或122所述的***或试剂盒，其中用于释放所述连接探针的所述作用剂是核糖核酸酶，任选地其中所述核糖核酸酶选自核糖核酸酶A、核糖核酸酶C、核糖核酸酶H或核糖核酸酶I。
124.根据权利要求121至123中任一项所述的***或试剂盒，还包括位于所述支撑装置上的对准机构，其用于将所述第一基板和所述第二基板对准。
125.根据权利要求124所述的***或试剂盒，其中所述对准机构包括线性致动器，其中所述第一基板包括第一构件，所述第二基板包括第二构件，并且任选地其中：
所述线性致动器被构造成沿与所述第一构件和/或所述第二构件的平面正交的轴线移动所述第二构件，并且/或者
所述线性致动器被构造成沿与所述第一构件和/或所述第二构件的平面正交的轴线移动所述第一构件，并且/或者
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