CN114196715A - 一种化学酶法合成假尿苷的方法 - Google Patents

一种化学酶法合成假尿苷的方法 Download PDF

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CN114196715A CN202111581013.9A CN202111581013A CN114196715A CN 114196715 A CN114196715 A CN 114196715A CN 202111581013 A CN202111581013 A CN 202111581013A CN 114196715 A CN114196715 A CN 114196715A
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gly
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Abstract

本发明公开了一种化学酶法合成假尿苷的方法，将核糖‑5‑磷酸与假尿苷‑5‑磷酸糖苷酶突变体合成假尿苷单磷酸，再经去磷酸化、分离后得到假尿苷；所述假尿苷‑5‑磷酸糖苷酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明通过化学‑酶促反应合成假尿苷，通过简单的反应，以较低的成本实现假尿苷的大量生产，推进了假尿苷工业化合成的应用。

Description

一种化学酶法合成假尿苷的方法
技术领域
本发明涉及假尿苷的合成技术领域，尤其涉及一种化学酶法合成假尿苷的方法。
背景技术
上世纪中期，研究者发现在核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)和转运RNA(transfer RNA，tRNA)中存在一种和尿嘧啶核苷结构类似的异构体，其核糖并不与尿嘧啶(uracil，U)的N1相连，而是与C5相连，形成假尿嘧啶核苷(pseudouridine，ψ)，假尿嘧啶核苷简称假尿苷。在生物体内，RNA上的尿苷通过假尿苷合成酶将核糖与碱基之间的C-N键裂解并重新连接形成C-C键，异构成假尿苷，假尿苷的结构式如式(I)所示。
Figure BDA0003427113770000011
后来的研究发现，snRNA等细胞内丰度高的非编码RNA上均有丰富的假尿苷修饰。近年随着测序技术的发展，发现mRNA上也存在丰富的假尿苷修饰。研究发现对mRNA进行假尿苷修饰，不仅能够降低mRNA引发的免疫反应，还能够提高编码基因的翻译效率。近年来，核酸药物尤其是mRNA疫苗和药物的研发出现了较多成功的案例。这些mRNA中都无一例外的使用假尿苷代替了原本的尿苷。因此，假尿苷的需求越来越大，其合成方法引起广泛的关注。
目前，在假尿苷的制备方面，主要依赖化学方法合成，但是化学法存在合成步骤长、收率低等问题，同时合成过程中使用了较多易燃易爆试剂。生物合成方面，有研究者使用工程化大肠杆菌表达外源合成途径合成假尿苷，但是存在培养周期长、纯化过程复杂的问题。因此，快速便捷的大量合成假尿苷存在一定的缺陷。
针对化学方法合成存在合成步骤长、收率低、使用较多易燃易爆试剂等问题，大肠杆菌工程菌合成存在的培养周期长和纯化过程复杂的问题，有必要寻求一种通过化学-酶促反应合成假尿苷的方法，通过简单的反应，以较低的成本实现假尿苷的大量生产。
发明内容
本发明的目的是为了提出一种化学酶法合成假尿苷的方法，以至少解决现有技术中存在的诸多缺陷之一。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种化学酶法合成假尿苷的方法，将核糖-5-磷酸与假尿苷-5-磷酸糖苷酶突变体合成假尿苷单磷酸，再经去磷酸化、分离后得到假尿苷；所述假尿苷-5-磷酸糖苷酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
根据本发明的实施例，所述假尿苷-5-磷酸糖苷酶突变体的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。
根据本发明的实施例，所述假尿苷-5-磷酸糖苷酶突变体由氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示假尿苷-5-磷酸糖苷酶突变得到。作为优选，所述假尿苷-5-磷酸糖苷酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
根据本发明的实施例，所述核糖-5-磷酸采用AMP水解得到。
根据本发明的实施例，所述去磷酸化前将蛋白变性，离心去蛋白沉淀，对上清液进行反复过滤，直至尿嘧啶含量为零。
作为优选，所述去磷酸化前将反应液加热蛋白变性，离心后对上清液过滤，然后进行纳滤，直至滤出液电导率下降到10mS/cm。
根据本发明的实施例，所述去磷酸化步骤为将滤液加入乙醇，混匀后加入NaOH并充分反应。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1.本发明利用化学方法合成核糖-5-磷酸，并与尿嘧啶为底物；加入假尿苷-5-磷酸糖苷酶突变体酶法合成假尿苷单磷酸；对第一步反应液进行处理，除去影响后续分离纯化的杂质；对假尿苷单磷酸进行去磷酸化，得到假尿苷。
2.本发明采用化学酶法合成得到的假尿苷转化率高，反应时间短、纯化过程简单，仅需简单的试剂即可得到，适用于工业化合成推广。
附图说明
图1为本发明合成假尿苷单磷酸反应中间取样去磷酸后HPLC检测结果。
图2为本发明假尿苷标准品和尿嘧啶标准品HPLC结果。
图3为本发明采用突变体R146E/H156Q/K210A化学酶法得到假尿苷HPLC结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并不是为了限定本发明。
本发明提供一种化学酶法合成假尿苷的方法，将野生型假尿苷-5-磷酸糖苷酶与核糖-5-磷酸和尿嘧啶进行分子对接，再选择活性位点附近的氨基酸进行突变，获得假尿苷-5-磷酸糖苷酶突变体R146E/H156Q/K210A；化学法将AMP水解纯化得到核糖-5-磷酸后，与尿嘧啶在假尿苷-5-磷酸糖苷酶突变体作用后经纯化得到假尿苷。
本发明中，使用的所有大肠杆菌菌株和质粒，购买自BioVector质粒载体菌种细胞蛋白抗体基因保藏中心；实验采用其他试剂均为市售。
实施例1化学法合成核糖-5-磷酸
将50g AMP溶解于3L 1M HCl中，加热至100℃，搅拌反应1h。然后降至室温，用饱和KOH溶液调节体系pH至8.2，加入异丙醇析出沉淀，即为核糖-5-磷酸粗品。将核糖-5-磷酸粗品溶液加入离子交换树脂，使用0.2、0.4、0.6、0.8和1.0M氯乙酸溶液洗脱，纯化得到纯化的核糖-5-磷酸溶液，经过冷冻干燥得到30g核糖-5-磷酸。使用配备蒸发光散射检测器HPLC测定，核糖-5-磷酸的纯度为85％。
核糖-5-磷酸的检测方法如下：
色谱柱：Waters XBridge BEH Amide，250×4.6mm，5μm；
柱温：40℃；
流速：1mL/min；
流动相A：乙腈；
流动相B：2g/L乙酸铵；
方法：70％A+30％B，恒定梯度；
分析时间：25min。
实施例2假尿苷-5-磷酸糖苷酶的表达、纯化及突变
1)假尿苷-5-磷酸糖苷酶的表达、纯化
假尿苷-5-磷酸糖苷酶来源于Dorea formicigenerns ATCC 27755，合成针对大肠杆菌密码子优化的假尿苷-5-磷酸糖苷酶，其两端分别使用NdeI和XhoI酶切位点。使用限制性内切酶NdeI和XhoI对目的基因和pET-28a质粒进行酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的基因片段和载体片段，使用T4 DNA连接酶进行连接反应后，转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布加有卡那霉素的平板。挑取单克隆进行菌落PCR验证后，选择连接成功的菌株提取质粒测序，验证目的片段序列准确性。
测序正确的质粒转化BL21(DE3)菌株后，挑取单克隆至LB试管中培养过夜。次日按1：100接种200mL LB培养基，37℃培养6h，接种5L发酵罐。37℃培养至OD接近30时，将温度降低至20℃，加入0.2mM IPTG，诱导12h后下罐。7000g离心收集菌体后使用缓冲液重悬，高压破碎释放重组蛋白后，通过镍柱亲和层析纯化得到目的蛋白。
2)假尿苷-5-磷酸糖苷酶突变位点选择
根据PDB Bank中编号4GIM的蛋白结构，通过同源模建的方法，建立假尿苷-5-磷酸糖苷酶的蛋白结构，然后与核糖-5-磷酸和尿嘧啶进行分子对接，选择活性位点附近氨基酸进行突变，得到突变体R146E/H156Q/K210A(分别代表第146、156及210个氨基酸的突变)。突变体基因合成、蛋白表达和纯化与野生型相同。
假尿苷-5-磷酸糖苷酶突变体R146E/H156Q/K210A氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
假尿苷-5-磷酸糖苷酶氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
实施例3合成假尿苷单磷酸
1)合成
称量220.8g核糖-5-磷酸、4.8g MnCl2·4H2O，使用5L去离子水将其溶解。再称量53.7g尿嘧啶，用4.8L去离子水溶解(加热至80℃帮助溶解)。
将配制的两个溶液倒入20L反应器中，设置搅拌速度150rpm，温度37℃，pH 7.5。待温度上升至37℃，pH在7.5(±0.05)时分别加入终浓度0.5mg/ml假尿苷-5-磷酸糖苷酶及其突变体，使用2M NaOH溶液自动调节pH。反应30min后，缓慢补加4.8L 100mM溶解完全的尿嘧啶溶液。2h后每隔30min取样500μL沸水浴加热10min，离心取上清进行去磷酸处理后HPLC检测，如图1所示，待检测到的假尿苷产量稳定后终止反应。
2)中间处理
将上述反应液加热至80℃保持10min使蛋白变性，冷却后离心去除蛋白沉淀。对上清液进行过滤，然后使用200D滤膜进行纳滤。对滤出液进行检测，直至电导率下降到10mS/cm，并且不能检测到尿嘧啶为止。
3)假尿苷单磷酸的去磷酸化
将纳滤后的溶液倒入20L反应器中，加入等体积乙醇，混合均匀后缓慢加入10倍当量的NaOH。设置转速150rpm，温度60℃，反应1h后HPLC检测，结果如图3所示，确定反应完全后收集反应液进行假尿苷的分离纯化。
通过本实施例采用假尿苷-5-磷酸糖苷酶突变体获得假尿苷产量为7.9g/L，转化率为51％，纯度为98.3％。
对比例
采用本发明实施例2相同方法，针对其中一个或两个活性位点进行突变，分别获得得到假尿苷-5-磷酸糖苷酶突变体R146E，假尿苷-5-磷酸糖苷酶突变体H156Q/K210A以及假尿苷-5-磷酸糖苷酶突变体R146E/H156Q。
然后采用本发明实施例3相同的方法与实施例1中得到的核糖-5-磷酸进行酶合成，中间处理以及去磷酸化分别得到假尿苷。分别统计产量及转化率与突变体R146E/H156Q/K210A得到的结果进行对比，结果如表1所示。
表1：不同方法得到假尿苷的结果对比
Figure BDA0003427113770000071
可见，采用不同的假尿苷-5-磷酸糖苷酶进行化学酶法合成假尿苷，假尿苷的转化率存在较大差异，仅存在一个氨基酸以及两个氨基酸突变的情况下，其转化率没有获得较大的改善，当出现R146E/H156Q/K210A的突变时，其转化率获得明显的提升，可以证明，三个不同位点的氨基酸突变对于酶的活性提升产生了协同作用。
实验例假尿苷和尿嘧啶的检测
以市售假尿苷标准品和尿嘧啶标准品分别作为对照进行HPLC检测，另外对本发明实施例3中得到的假尿苷，按照如下方法进行HPLC检测，条件如下：
色谱柱：Waters XBridge BEH Amide，250×4.6mm，5μm；
波长：262nm；
柱温：30℃；
流速：1mL/min；
流动相A：0.2％乙酸铵水溶液(称取2g乙酸铵溶于1L水中)；
流动相B：ACN。
洗脱梯度如表2所示。
表2：
Figure BDA0003427113770000081
如图2所示，采用本实验例提供的检测条件得到假尿苷标准品和尿嘧啶标准品HPLC结果分别如图2A、2B所示，分别在3.460min、3.923min处出峰；如图3所示，采用假尿苷-5-磷酸糖苷酶突变体R146E/H156Q/K210A酶法得到的假尿苷在3.439min处出峰，与假尿苷标准品的差异处于正常范围内。
本发明并不仅仅限于说明书和实施方式中所描述，因此对于熟悉领域的人员而言可容易地实现另外的优点和修改，故在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念的精神和范围的情况下，本发明并不限于特定的细节、代表性的方案和这里描述的示例。
序列表
<110> 武汉糖智药业有限公司
<120> 一种化学酶法合成假尿苷的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Lys Thr Lys Tyr Leu Val Glu Ser Cys Leu Leu Thr His Gly Leu
1 5 10 15
Arg Ser Ile Thr Asp Gly Glu Val Ile Arg Ala Trp Asp Gly Val Asn
20 25 30
Ala Thr Phe Ala Trp Ile Asp Glu Gly Lys Ile Gln Thr Gly Cys Met
35 40 45
Glu Arg Phe Ile Glu Phe Arg Lys Arg Lys Ile Lys Leu Arg Val Asn
50 55 60
Cys Lys Asn Met Asp Glu Met Leu Lys Lys Arg Val Pro Gly Ala Leu
65 70 75 80
Thr Ala Ala Gly Thr Met Glu Ala Cys His Arg Leu Gly Ile Pro Val
85 90 95
Thr Val Thr Cys Gly Ile Gly Gly Ile Gly Asn Ile Pro Gly Glu Thr
100 105 110
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130 135 140
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130 135 140
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<212> DNA
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attcagctgg aaagcattgt tgaaaatgcc aaactggcag gctatattgc agaattcaaa 780
taa 783

Claims (8)

1.一种化学酶法合成假尿苷的方法，其特征在于，将核糖-5-磷酸与假尿苷-5-磷酸糖苷酶突变体合成假尿苷单磷酸，再经去磷酸化、分离后得到假尿苷；所述假尿苷-5-磷酸糖苷酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述假尿苷-5-磷酸糖苷酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述假尿苷-5-磷酸糖苷酶突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的假尿苷-5-磷酸糖苷酶突变得到。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述假尿苷-5-磷酸糖苷酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核糖-5-磷酸采用AMP水解得到。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述去磷酸化前将蛋白变性，离心去蛋白沉淀，对上清液进行反复过滤，直至尿嘧啶含量为零。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述去磷酸化前将反应液加热蛋白变性，离心后对上清液过滤，然后进行纳滤，直至滤出液电导率下降到10mS/cm。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述去磷酸化步骤为将滤液加入乙醇，混匀后加入NaOH并充分反应。
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