CN116478966B - 新型鲍曼不动杆菌噬菌体内溶酶蛋白及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新型鲍曼不动杆菌噬菌体内溶酶蛋白及其制备和应用，具体地，本发明提供了一种来源于多重耐药鲍曼不动杆菌噬菌体的重组溶媒蛋白，及其制备和应用。所述的蛋白可以用于鲍曼不动杆菌感染导致的疾病或病症的治疗。

Description

新型鲍曼不动杆菌噬菌体内溶酶蛋白及其制备和应用

技术领域

本发明涉及重组蛋白领域，具体地，本发明提供了一种来源于多重耐药鲍曼不动杆菌噬菌体的重组溶媒蛋白，及其制备和应用。

背景技术

鲍曼不动杆菌广泛存在于自然界，是一类非发酵的、氧化酶阴性、无动力的、需氧的革兰阴性杆菌。作为一种全球分布广泛的条件致病菌，它经常感染免疫力低下的人群，通常是老年患者、ICU患者，它可引起伤口感染、医院获得性肺炎、菌血症、脑膜炎等。近几年来，由于鲍曼不动杆菌的广泛耐药性，特别是“全耐药”鲍曼不动杆菌的出现，使临床治疗越来越困难，在医学界引起了高度警惕。19世纪七十年代的时候，鲍曼不动杆菌对一般的传统抗生素是敏感的，然而在今天，大多数的临床菌株对一线抗生素都产生了耐药性，所以多重耐药鲍曼不动杆菌(MDR-AB)在今天是十分普遍的。MDR-AB指的是至少对以下五类抗菌药物中的三种产生耐药的鲍曼不动杆菌菌株：头孢菌素类、碳青霉烯类、β-内酰胺酶抑制剂(包括哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦和氨苄西林/舒巴坦)、喹诺酮类和氨基糖苷类。MDR-AB的治疗对当今世界是一个挑战，这种发展趋势迫使临床使用新型抗生素进行治疗，包括新一代甘氨四环素类中的替加环素、粘菌素、多粘菌素抗生。不幸的是，仍然出现了耐替加环素和多粘菌素菌株的报道，这表明鲍曼不动杆菌耐药性的获得十分迅速。

噬菌体是一种细菌病毒，它广泛存在于自然界，数量是细菌的十多倍，它可以裂解和杀死细菌。噬菌体在其发现之初就被运用于治疗感染性疾病，在二战之前，人们对噬菌体治疗做了大量研究，并取得了积极的治疗效果，可是当抗生素出现后，关于噬菌体的研究日益冷落。直到今天，抗生素的滥用使细菌感染的治疗步入窘境，噬菌体治疗的研究再一次引起了研究者的高度关注。

已经有很多关于噬菌体制剂成功治疗疾病的报道，但噬菌体严格的宿主专一性使得噬菌体的裂解谱狭窄，成为了噬菌体制剂研发过程中的阻碍。随着多重耐药菌株在全球不断的出现，而新型抗生素的研发越来越困难，寻找治疗细菌感染的新策略十分迫切。

综上所述，本领域尚缺乏针对细菌感染，尤其是针对多重耐药菌感染的非抗生素类治疗剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对细菌感染，尤其是针对多重耐药鲍曼不动杆菌感染的重组体内溶酶蛋白。

本发明基于噬菌体抗菌的独特优势，以临床分离得到的一株多重耐药鲍曼不动杆菌为宿主菌，从污水中分离得到一株鲍曼不动杆菌噬菌体TC3，通过对TC3生物学特性的研究，发现其中溶菌酶蛋白TCLys119具有裂解耐药鲍曼不动杆菌和破坏生物膜活性的能力，希望TC3中溶菌酶蛋白TCLys119有机会能成为新的耐药菌治疗药物。

本发明的第一方面，提供了一种TCLys119溶酶体蛋白，所述的蛋白具有如SEQ IDNo.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

在本发明的其他实施方式下，所述的蛋白是由SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所述蛋白经过一个或数个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有SEQ ID No.1或SEQ IDNo.2所述蛋白的功能的衍生蛋白，上述改变形式不破坏该蛋白的功能，因此属于本发明的溶酶体蛋白的等效替代形式。

在另一优选例中，所述的重组蛋白是由SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所述蛋白经过一个或数个氨基酸残基的添加而形成的(例如，包括合适的表达标签等)，且具有SEQ IDNo.1或SEQ ID No.2所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在另一优选例中，所述的衍生蛋白是由SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所述氨基酸序列经过1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成且具有SEQ ID No.2所述寡肽的功能的衍生蛋白。

在另一优选例中，所述的蛋白为来源于TC3噬菌体的结构蛋白。

本发明的第二方面，提供了一种编码如本发明第一方面所述蛋白的多核苷酸。

本发明的第三方面，提供了一种包含如本发明第二方面所述多核甘酸的表达载体。

本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如本发明第三方面所述的表达载体，或其基因组上整合有如本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为大肠杆菌。

本发明的第六方面，提供了一种如本发明第一方面所述的蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)在适合产生所述蛋白的条件下培养如本发明第四方面所述的宿主细胞，从而产生如本发明第一方面所述的蛋白；和

(2)从步骤(1)的培养物中分离产生的所述蛋白。

本发明的第七方面，提供了一种如本发明第一方面所述的蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的表达载体或者如本发明第四方面所述的宿主细胞在制备治疗鲍曼不动杆菌感染引发的疾病或病症的药物组合物中的用途。

在另一优选例中，所述的鲍曼不动杆菌为多重耐药性鲍曼不动杆菌。

在另一优选例中，所述的鲍曼不动杆菌为对于选自下组的一种或多种抗生素耐药的鲍曼不动杆菌：庆大霉素、阿莫西林/克拉维酸、氨曲南、环丙沙星、头孢曲松、头孢唑啉、呋喃妥因、亚胺培南、氨苄西林、头孢西丁、左旋氧氟沙星、复方新诺明、妥布霉素、哌拉西林/他唑巴坦、替加环素、头孢匹美。

本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有如本发明第一方面所述的蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的表达载体或者如本发明第四方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或辅料。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为空斑试验结果；

图2为噬菌体基因组DNA限制性酶切实验。泳道1:1kb DNA ladder；泳道2:没有经过限制性酶切的TC3噬菌体全基因组DNA；泳道3-6:TC3噬菌体全基因组DNA依次经过限制性内切酶DraⅠ，EcoRⅠ，HindⅢ和NdeⅠ酶切之后的产物；泳道7:经过HindⅢ消化的λ噬菌体全基因组DNA；

图3为噬菌体结构蛋白SDS-PAGE胶电泳图。M:已知分子量蛋白质标准；实心箭头指向三个主要蛋白质条带；空心箭头指向次要蛋白质条带；

图4为TCLys119的SDS-PAGE图谱；

图5为平板法测定TCLys119重组蛋白抑菌效果图；

图6为肉汤稀释法测定TCLys119重组蛋白抑菌图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1宿主菌的耐药性分析

宿主菌Ab3是从中南大学湘雅三医院肾移植ICU病人的痰标本中分离得到，由法国生物梅里埃公司VITEK-2Compact全自动微生物分析鉴定***鉴定为鲍曼不动杆菌。

1.1鲍曼不动杆菌Ab3的药敏结果

表1Ab3的药敏结果

其药敏结果(表1)显示Ab3对氨基糖苷类、碳青霉稀类、喹诺酮类、头孢菌素类耐药，对四环素类中的替加环素中介。说明Ab3是一株多重耐药鲍曼不动杆菌。

实施例2鲍曼不动杆菌噬菌体的分离

2.1.试剂

(1)3倍LB液体培养基：胰蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母粉5.0g，加蒸馏水330ml，121℃，高压蒸气灭菌15min。

(2)LB琼脂：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，葡萄糖1g，琼脂13g，加蒸馏水1000ml，121℃，高压蒸气灭菌15min。

(3)LB半固体培养基：等体积的LB液体培养基与LB琼脂混合

2.2噬菌体分离

(1)宿主菌的准备：用三区划线法复苏用甘油保存的鲍曼不动杆菌，挑取单个菌落置于20mlLB液体培养基中培养5h，得到处于对数生长期的菌液，备用。

(2)污水标本的收集及处理：取西湖公园的水200ml，6000rpm离心10min，将大部分的细菌和杂质离心除去，留取上清备用。

本实验采用双层琼脂空斑试验从污水中分离出出四株鲍曼不动杆菌噬菌体，其中第三株，被命名为TC3，有裂解Ab3的能力，后续对TC3的生物学特性及其裂解Ab3的能力进行验证和评估。

2.3空斑试验

取离心后的污水上清15ml与鲍曼不动杆菌的菌液等体积混合，37℃，震荡过夜培养约20小时，加入1ml氯仿杀菌，震荡十分钟后，6000rpm离心10min，取上清再次与准备好的对应的鲍曼不动杆菌的菌液混合37℃震荡培养过夜，如此重复三次，取第三次加入氯仿杀菌离心得到的上清备用。将LB半固体培养基放入微波炉中加热至沸腾，倒5ml至无菌试管中，将试管置于42℃水浴箱中冷却，温度太高会影响噬菌体活性，温度太低会使LB半固体培养基凝固。待试管冷却至42℃，向其加入鲍曼不动杆菌菌液100ul，混匀后，均匀铺板于LB琼脂平板上，制备双层琼脂平板，向平板上滴上清。将平板放入37℃温箱中培养，次日观察滴上清的部位有无圆形空斑的出现，结果如图1中所示。

在空斑试验中，双层琼脂平板上形成了清晰透明的空斑，这说明分离的噬菌体对指示菌有裂解作用。单个空斑经过倍比稀释与宿主菌铺板，在双层琼脂平板上形成了圆形、透明、清晰的噬菌斑，直径在1-2mm左右(图1)。

实施例3噬菌体基因组DNA提取及限制性酶切实验

参考《分子克隆实验指南》噬菌体DNA提取方法提取TC3噬菌体DNA，纯化的噬菌体培养物用DNaseI(100U/ml)和RNaseA(10μg/ml)在37℃下处理30分钟以去除宿主细菌核酸；然后向混合物中加入乙二胺四乙酸(EDTA)(20mM)、十二烷基硫酸钠(SDS)(0.5％)、蛋白酶K(50μg/ml)，在56℃下孵育1小时；再向混合物中加入等体积的苯酚/氯仿(1:1)来提取DNA。用异丙醇(AR级)沉淀噬菌体DNA后用70％乙醇洗涤沉淀，空气干燥后用去离子水溶解基因组DNA。

得到的噬菌体基因组DNA用几种限制酶进行限制性消化：BamHⅠ、DraⅠ、EcoRⅠ、EcoRⅤ、HindⅢ、NdeⅠ、PstⅠ、XbalⅠ(NewEnglandBiolabs，USA)。酶切条件根据酶切说明书进行，酶切产物在TAE电泳缓冲液中电泳后通过凝胶扫描仪观察酶切图谱。用1kbDNAladder(FroggaBio，Canada)和HindⅢ消化的λ噬菌体DNA作为分子标记，结果如图2中所述。

使用8种限制性核酸内切酶消化TC3基因组DNA后通过凝胶扫描仪分析酶切图谱。结果表明，TC3基因组DNA可被DraⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ和NdeⅠ酶切，而不能被BamHⅠ、EcoRⅤ、PstⅠ和XbalⅠ酶切。琼脂糖凝胶电泳显示，DraⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ和NdeⅠ酶将DNA切割成多条DNA片段(图2)。噬菌体TC3能被HindⅢ酶酶切开，因HindⅢ为双链DNA酶，从而表明噬菌体的核酸为双链DNA，总结限制性片段大小时，将其各酶切条带相加粗略估计TC3基因组的长度约为48kb。

实施例4噬菌体结构蛋白SDS-PAGE电泳

噬菌体蛋白质包括结构蛋白和非结构蛋白两大类。非结构蛋白是指由噬菌体基因组编码的，在噬菌体复制或基因表达调控过程中具有一定的功能，但不结合于噬菌体颗粒中的蛋白质，包括一些调节蛋白和辅助蛋白等；而结构蛋白则是指构成一个形态成熟的有感染性的噬菌体颗粒所必需的蛋白质，包括衣壳蛋白和尾部蛋白等。结构蛋白的主要功能是：(1)决定噬菌体的外形并保护内部的核酸；(2)参与噬菌体的吸附和侵入，决定噬菌体的宿主特异性；(3)构成噬菌体的表面抗原。通过SDS-PAGE电泳对噬菌体TC3的结构蛋白进行分离，为后续该噬菌体的生物信息学研究奠定基础。

将纯化的TC3噬菌体蛋白进行SDS-PAGE电泳再进行考马斯亮蓝R-250染色后分析结构蛋白的数量与大小，结果如图3中所示。从图3可见，在中分子量蛋白质标准范围内，凝胶上至少出现了10条蛋白条带，表明噬菌体TC3中至少含有10个结构蛋白。其中三个主要蛋白质条带，七个为次要蛋白质条带，分子量范围约为18-220kDa。其中45kD所对应的结构蛋白含量最大，说明这种蛋白质在TC3颗粒构成中占有的拷贝数最多，是主要的结构蛋白。而通常说来，噬菌体衣壳蛋白的拷贝数最高，因此推测编码45kD结构蛋白的基因是噬菌体TC3的主要衣壳蛋白。

实施例5噬菌体内溶酶(命名为TCLys119)重组蛋白的制备与纯化

蛋白组合物包括但不限于噬菌体TC3培养液、噬菌体TC3提取液和重组蛋白纯化液等。重组蛋白亦可以通过常规的技术手段，将其基因序列导入工程菌的方式进行发酵、分离和纯化的方式制取。本发明中具体的制取重组蛋白的方法包括如下步骤：

通过PCR扩增编码重组蛋白的基因序列，将这段序列通过酶切酶连的方法克隆到pET-28a载体上，构建N-端融合6×His标签的重组蛋白的表达质粒，利用大肠杆菌工程菌BL21(DE3)菌株进行异源表达，该菌株在LB+KanR抗性的平板上过夜培养，挑选单克隆抗体，转接在含有100μg/ml KanR的5ml LB培养液中，于37℃，180rpm培养4小时，在指数中期(OD600＝0.6)时1:100添加IPTG至终浓度0.5～2mM，于18℃，180rpm诱导过夜。取菌液于8,000rpm离心5分钟沉淀细胞，于-20℃下保存菌体。

菌体在10倍体积超声裂解液中混匀，加入4ml含有溶菌酶、DNase/Rnase和终浓度1mM的PMSF，混匀，冰上放置超声90min裂解破碎至溶液彻底清亮，将细胞裂解液离心12,000rpm、30min、4℃，收集上清放于冰上，即得到重组蛋白，通过Ni-16NTA His·Bind树脂亲和层析纯化得到重组蛋白，209个氨基酸，约23KD，分装，储存在-80℃待用时配成合适的浓度。SDS-PAGE图谱如图4中所示。

TCLys119序列(SEQ ID No.1)：MILLFKGVNAPKEVKQLQTLLKTLGYYSGRIDGVFGTGTEKAVIQYQKDNGLTPDGKVGKATAGRIGLHTGLEVSDEFVLNDASKKRLKGIHPDLVKVVERAIRISPIQFQVGEGLRTAERQKELMASGATQTLNSRHLTGHAVDLFAYPDGKLSWDWKYYYQIEEAVKQAAKELKVSIEWGGDWKSFKDGPHWQLPWNKYPK*

TCLys119重组蛋白序列(SEQ ID No.2)：

LVPRGSMILLFKGVNAPKEVKQLQTLLKTLGYYSGRIDGVFGTGTEKAVIQYQKDNGLTPDGKVGKATAGRIGLHTGLEVSDEFVLNDASKKRLKGIHPDLVKVVERAIRISPIQFQVGEGLRTAERQKELMASGATQTLNSRHLTGHAVDLFAYPDGKLSWDWKYYYQIEEAVKQAAKELKVSIEWGGDWKSFKDGPHWQLPWNKYPK*

实施例6TCLys119重组蛋白抑菌实验

培养基的制备：采用江门市凯林贸易有限公司生产的MH平板或MH肉汤。

菌的制备：将多重耐药鲍曼不动杆菌Ab3用生理盐水调菌液0.5麦氏比浊。

TCLys119重组蛋白浓度梯度制备：纯化后，SEQ ID No.2所示的TCLys119重组蛋白原始浓度经测定为48mg/ml，采用对倍稀释用MH肉汤按照下列表格将TCLys119重组蛋白进行稀释。

表2TCLys119重组蛋白对倍稀释

平板法：用棉签将0.5麦氏比浊的Ab3菌液均匀涂布MH平板，再将稀释好的蛋白在对应浓度标记的位置滴加10ul不同浓度的TCLys119重组蛋白，37度温箱培养过夜后观察抑菌效果，结果如图5中所示。

肉汤稀释法：用MH肉汤将TCLys119重组蛋白稀释后浓度分别为12ug/ml，6ug/ml，3ug/ml，1.5ug/ml四个浓度，用未加TCLys119重组蛋白作为对照，然后每个稀释孔加入准备好的菌液，使菌液终浓度约为5*109CFU/ml，37度温箱培养，每小时测定595nm波长下OD值，结果如图6中所示。

从图5和图6中可以看出，TCLys119重组蛋白在蛋白浓度3ug/ml及以上的浓度对多重耐药鲍曼不动杆菌Ab3具有很好的抑菌效果，提示该蛋白可以用于多重耐药鲍曼不动杆菌的抑制以及由鲍曼不动杆菌感染引发的疾病的治疗。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种TCLys119溶酶体蛋白，其特征在于，所述的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2所示。

2.编码如权利要求1所述蛋白的多核苷酸。

3.包含权利要求2所述多核甘酸的表达载体。

4.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求3所述的表达载体，或其基因组上整合有权利要求2所述的多核苷酸。

5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为大肠杆菌。

6.如权利要求1所述的蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)在适合产生所述蛋白的条件下培养如权利要求4所述的宿主细胞，从而产生如权利要求1所述的蛋白；和

(2)从步骤(1)的培养物中分离产生的所述蛋白。

7.权利要求1所述的蛋白、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的表达载体或者权利要求4所述的宿主细胞在制备治疗鲍曼不动杆菌感染引发的疾病或病症的药物组合物中的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的鲍曼不动杆菌为多重耐药性鲍曼不动杆菌。

9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的鲍曼不动杆菌为对于选自下组的一种或多种抗生素耐药的鲍曼不动杆菌：庆大霉素、阿莫西林/克拉维酸、氨曲南、环丙沙星、头孢曲松、头孢唑啉、呋喃妥因、亚胺培南、氨苄西林、头孢西丁、左旋氧氟沙星、复方新诺明、妥布霉素、哌拉西林/他唑巴坦、替加环素、头孢匹美。

10.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有权利要求1所述的蛋白、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的表达载体或者权利要求4所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或辅料。