WO2022065969A1 - 아시네토박터 바우마니에 대한 사멸능을 가지는 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

아시네토박터 바우마니에 대한 사멸능을 가지는 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물 Download PDF

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bacteriophage
endolysin
present
acinetobacter baumannii
potential
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PCT/KR2021/013191
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신민상
이제철
김정민
김경민
마이둘 이슬람엠디.
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경북대학교 산학협력단
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    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/00032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/91—Cell lines ; Processes using cell lines

Definitions

  • the present invention relates to a bacteriophage having a killing ability against Acinetobacter baumani and a composition comprising the same, and more particularly, to a novel bacteriophage Ab1656-2 isolated from Acinetobacter baumani clinical strain and Acinetobacter bow comprising the same It relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating Mani infection, an antibiotic and an antiseptic.
  • Acinetobacter baumannii is a gram-negative bacterium belonging to Gammaproteobacteria that is widely distributed in natural environments such as soil and water, and shows weak pathogenicity to healthy people with strong immunity, but when the immune system is damaged or It is an opportunistic pathogen with high toxicity in weakened individuals.
  • MDR multiple drug resistance
  • hospitals such as intensive care unit infections It is attracting attention as a major pathogen of hospital-acquired infection, and Acinetobacter baumani infection causes various infections including pneumonia, endocarditis, bloodstream infection, urinary tract infection, and peritonitis.
  • Antibiotics such as colistin, tigecycline, imipenem, and meropenem are mainly prescribed to treat Acinetobacter baumani infection, but even these antibiotics show resistance when used for a long time. The development of new antibiotics against Acinetobacter baumani is still required.
  • Bacteriophages are very small microorganisms that infect bacteria. After infection with bacteria, they proliferate inside the cells of the bacteria, and after proliferation, when progeny bacteriophages come out of the bacteria, they destroy bacteria in a way that destroys the cell wall of the host bacteria. have the ability
  • the bacterial infection method of bacteriophages is very specific, so the types of bacteriophages that can infect specific bacteria are limited to some. Due to this bacterial specificity, the bacteriophage provides an antibacterial effect only to the target bacteria and has the advantage that it does not affect the environment or the flora in the animal.
  • An object of the present invention is to provide a novel bacteriophage having the ability to kill Acinetobacter baumani.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating Acinetobacter baumani infection comprising the bacteriophage.
  • Another object of the present invention is to provide an antibiotic comprising the bacteriophage.
  • an object of the present invention is to provide a disinfectant comprising the bacteriophage.
  • One aspect of the present invention has the ability to kill Acinetobacter baumani, and provides a bacteriophage Ab1656-2 having a genome consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Bacteriophage as used in the present invention is a bacteria-specific virus that inhibits and inhibits the growth of a specific bacterium by infecting the bacterium, and a virus containing single or double-stranded DNA or RNA as a genetic material.
  • Bacteriophage Ab1656-2 in the present invention was first isolated and identified by the present inventors, and the sequence of the genome was also revealed for the first time by the present inventors.
  • the bacteriophage Ab1656-2 was isolated from the domestic clinical isolated strain, multidrug-resistant Acinetobacter baumannii (Multidrug-resistant A. baumannii ) 1656-2 strain.
  • Acinetobacter baumannii Multidrug-resistant A. baumannii
  • the entire genome of the bacteriophage Ab1656-2 was isolated and sequenced by sequencing to confirm the nucleotide sequence (see SEQ ID NO: 1) and it was confirmed that it was composed of double-stranded DNA with a size of about 51 kb.
  • the bacteriophage Ab1656-2 has a killing ability against Acinetobacter baumani standard strain (ATCC 17978).
  • the bacteriophage may be one of accession number KCTC 14314BP.
  • the present inventors selected a novel bacteriophage having a killing ability against Acinetobacter baubani from the clinically isolated strain 1656-2 of the antibiotic multidrug-resistant Acinetobacter baubani, and the isolated bacteriophage Ab1656-2 ( ⁇ Ab1656-2) It was deposited in the Korean Collection for Type Cultures of the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology on September 17, 2020.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating Acinetobacter baumani infection comprising the bacteriophage Ab1656-2.
  • Acinetobacter baumani infection refers to a disease caused by an Acinetobacter baumani infection.
  • healthy people have a very low risk of infection, but those with weakened immunity, such as immunocompromised, chronic lung disease, and diabetes patients, are vulnerable to infection.
  • appear high Acinetobacter baumani infection causes pneumonia, bloodstream infection, and wound infection, showing various symptoms depending on the route of infection.
  • prevention or “treatment” refers to the prevention, suppression and alleviation of infections caused by Acinetobacter baumani.
  • Bacteriophage Ab1656-2 in the present invention only exhibits a lytic action only on the Acinetobacter baumani strain, and has excellent selective toxicity that does not act on eukaryotic cells. can be
  • the pharmaceutical composition may include Ab endolysin protein isolated from bacteriophage Ab1656-2 as an active ingredient.
  • the Ab endolysin protein uses peptidoglycan, a component of the cell wall of bacteria, as a substrate, and decomposes and disintegrates the cell wall to kill the bacteria. Since the peptidoglycan exists only in bacteria and not in humans or animals, the protein of the present invention does not affect humans and animals, so it is safe and applicable to the pharmaceutical industry and biotechnology, as well as antibiotic multidrug resistance. There is an advantage in that bacteria can be effectively killed at a target site or target material without any problems.
  • the Ab endolysin protein may consist of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the Ab endolysin protein may be composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • a recombinant plasmid containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 was prepared to produce Ab endolysin protein, and transformed into a host cell, and finally an Ab endolysin recombinant protein of about 22 kD was produced.
  • the pharmaceutical composition may further include Zn 2+ as a cofactor.
  • the cofactor refers to a material necessary to exhibit the enzymatic action of the Ab endolysin protein, and may be an inorganic material such as a metal ion or iron-sulfur complex, or an organic material such as a vitamin.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent in addition to the active ingredients described above.
  • the carrier, excipient and diluent include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is formulated in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories, or sterile injection solutions according to conventional methods, respectively.
  • oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories, or sterile injection solutions according to conventional methods, respectively.
  • a diluent or excipient such as a filler, a weight agent, a binder, a wetting agent, a disintegrant, and a surfactant commonly used.
  • Solid preparations for oral administration include, but are not limited to, tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like.
  • Such a solid preparation may be prepared by mixing at least one or more excipients, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin, etc. in addition to the active ingredient.
  • excipients for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • It can be prepared by adding various excipients, for example, wetting agents, sweetening agents, fragrances, preservatives, and the like, in addition to liquids for oral use and liquid paraffin.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized formulations and tasks.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used.
  • base of the suppository Witepsol, Macrosol, Tween 61, cacao butter, laurin fat, glycero gelatin, etc. can be used.
  • a suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the patient's condition and weight, the degree of disease, drug form, and time, but may be appropriately selected by those skilled in the art, and the daily dosage of the composition is preferably It is 0.001 mg/kg to 1,000 mg/kg, and may be administered once a day or divided into several times a day as needed.
  • Another aspect of the present invention provides an antibiotic comprising the bacteriophage Ab1656-2.
  • antibiotic refers to cosmetic or pharmaceutical preservatives, bactericides and antibacterial agents.
  • Bacteriophage Ab1656-2 of the present invention shows an excellent killing ability of Acinetobacter baumani compared to conventional antibiotics. Because it has an important advantage of not inducing resistance, it can be provided as a new antibiotic with a longer life cycle compared to existing antibiotics. While most antibiotics have to decrease their range of use as they face increased resistance, the antibiotic containing the bacteriophage of the present invention as an active ingredient can fundamentally solve the problem of antibiotic resistance, so it is expected that the product lifespan as an antibiotic will be longer. do.
  • the antibiotic may include, as an active ingredient, Ab endolysin protein isolated from the bacteriophage Ab1656-2 as an active ingredient.
  • Another aspect of the present invention provides a disinfectant comprising the bacteriophage Ab1656-2.
  • the disinfectant according to the present invention can be usefully used as a disinfectant for hospitals and public health to prevent hospital acquired infections by including the bacteriophage Ab1656-2 of the present invention, which exhibits effective killing ability against Acinetobacter baumani. .
  • the bacteriophage used in the disinfectant of the present invention is naturally decomposed, it is eco-friendly and can be prepared in a liquid form, so it is very useful as a disinfectant for removing Acinetobacter baumani strains present in general environments or medical devices.
  • the cost of producing bacteriophages is also much more economical than the development and production of antibacterial agents, so it can be said that the utility of bacteriophages in the health industry is very large.
  • the disinfectant may include, as an active ingredient, Ab endolysin protein isolated from the bacteriophage Ab1656-2 as an active ingredient.
  • Bacteriophage Ab1656-2 is a novel bacteriophage having a killing ability against Acinetobacter baumani, and Ab endolysin isolated therefrom also shows excellent killing ability against clinical isolated strains of Acinetobacter baumani. Not only can it prevent or treat infectious diseases caused by Tobacter baumani infection, but it can also be used for various purposes such as antibiotics and disinfectants.
  • Figure 2 is a result of confirming the form of the bacteriophage Ab1656-2 according to an embodiment of the present invention with an electron microscope.
  • Figure 3 is a result of confirming the genomic DNA of the bacteriophage Ab1656-2 according to an embodiment of the present invention by 1% agarose (agarose) electrophoresis.
  • Figure 4 is a structural schematic diagram of the full-length genome of the bacteriophage Ab1656-2 according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of a recombinant plasmid pB4_Ab endolysin according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6 relates to Ab endolysin produced and purified from the recombinant plasmid pB4_Ab endolysin according to an embodiment of the present invention, (a) is the result of confirming the Ab endolysin bound to unpurified MBP by electrophoresis, (b) is a schematic diagram showing the purification process of Ab endolysin from which MBP has been removed using TEV protase, and (c) is the result of confirming Ab endolysin purified with TEV protase by electrophoresis.
  • Multidrug-resistant A. baumannii 1656-2 strain a domestic clinical isolate, was inoculated into LB (Luria Bertani) liquid medium and cultured at 37 ° C.
  • Mitomycin C Mitomycin C (Mitomycin C) C) was treated at a concentration of 1 ⁇ g/ml and incubated with shaking at 37° C. overnight.
  • the culture medium was centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes to collect the supernatant, then 2% (v/v) chloroform of the supernatant volume was added and centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes. Then, the supernatant was filtered using a 0.45 ⁇ m filter, and the filtrate was stored at 4°C.
  • Bacteria were centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes to collect the supernatant, 2% (v/v) chloroform of the supernatant volume was added, and centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes. Then, the supernatant was filtered using a 0.45 ⁇ m filter, diluted with SM buffer at a ratio of 1:1, and stored at 4°C or -70°C. It was confirmed that the bacteriophage was properly harvested through the plaque formation test of the purely isolated bacteriophage, and the results are shown in FIG. 1 .
  • the bacteriophage Ab1656-2 was confirmed to be a bacteriophage belonging to the Siphoviridae (Siphoviridae).
  • the genome of the obtained bacteriophage Ab1656-2 was purified according to the manufacturer's protocol using a Phage DNA isolation kit (NORGEN). The corresponding DNA was confirmed through 1% agarose electrophoresis, and the results are shown in FIG. 3 .
  • the genome was commissioned to Macrogen and the entire sequence was analyzed through Next Generation Sequencing.
  • the genome of the bacteriophage Ab1656-2 was confirmed to be about 51 kb (SEQ ID NO: 1) in size as double-stranded DNA.
  • the present inventors deposited the bacteriophage Ab1656-2 at the Bioresource Center (Korean Collection for Type Cultures) of the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology on September 17, 2020 and were given an accession number KCTC 14314BP.
  • a recombinant plasmid was prepared to produce the protein Ab endolysin of the novel bacteriophage Ab1656-2 having the ability to kill Acinetobacter baumani.
  • the endolysin gene of bacteriophage 1656-2 was amplified through PCR.
  • the gene was cloned into the pB4 plasmid through the LIC method, and the structure of the recombinant plasmid prepared therefrom is shown in FIG. 5 (see SEQ ID NO: 4).
  • the newly constructed plasmid was confirmed by DNA sequencing at the request of Macrogen.
  • the primers in Table 1 below were used for PCR amplification and DNA sequencing.
  • the pB4_Ab endolysin prepared in 2-1 above was transformed into E. coli BL21 DE3 star strain.
  • Transformed E. coli was selected on LB solid medium supplemented with ampicillin (100 ⁇ g/ml) antibiotic.
  • ampicillin 100 ⁇ g/ml
  • the strain was collected 2 hours after IPTG (Isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside) (0.2 mM/ml) was added and protein electrophoresis was confirmed as
  • the disrupted bacteria were centrifuged at 15,000 rpm for 30 minutes to take the supernatant, filtered using a 0.45 um filter, and injected into a Ni-NTA column through FPLC (Fast-protein liquid chromatography), elution buffer Histidine-tagged MBP-Ab endolysin present at the N-terminus was harvested using (20 mM Tris pH 7.0, containing 0.5 M NaCl and 0.5 M imidazole).
  • TEV protease By adding TEV protease to the harvested protein, artificial dialysis and TEV site digestion (20 mM Tris pH 7.0, 0.5 M NaCl, 10 mM ⁇ -mercaptoethanol and 1 mM EDTA containing) were performed to obtain MBP (His-tag) and Ab endolysin. separated. After that, the solution was again injected into the secondary Ni-NTA column to filter out TEV protease and MBP having a histidine tag to separate Ab endolysin (see FIG. 6b ). Purified Ab endolysin was confirmed by protein electrophoresis.

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Abstract

본 발명은 아시네토박터 바우마니에 대한 사멸능을 가지는 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 박테리오파지 Ab1656-2는 아시네토박터 바우마니에 대한 사멸능을 갖는 신규한 박테리오파지로, 이로부터 분리된 Ab endolysin 또한 아시네토박터 바우마니의 임상 분리 균주에 대하여 탁월한 사멸능을 나타내므로 아시네토박터 바우마니 감염에 의해 유발되는 감염성 질환을 예방 또는 치료할 수 있을 뿐만 아니라 항생제, 소독제 등 다양한 용도로 활용 가능하다.

Description

아시네토박터 바우마니에 대한 사멸능을 가지는 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물
본 발명은 아시네토박터 바우마니에 대한 사멸능을 가지는 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 아시네토박터 바우마니 임상균주로부터 분리된 신규 박테리오파지 Ab1656-2 및 이를 포함하는 아시네토박터 바우마니 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물, 항생제 및 소독제에 관한 것이다.
아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)는 감마프로테오박테리아(Gammaproteobacteria)에 속하는 그람음성균으로서 토양, 물 등의 자연 환경에 널리 분포하며, 면역력이 강한 건강한 사람에게는 약한 병원성을 보이나, 면역 시스템이 손상 또는 약화된 사람들에게서 높은 독성을 보이는 기회감염균이다. 특히, 카바페넴계(carbapenems), 아미노글리코사이드계(aminoglycosides), 플로로퀴놀론계(fluoroquinolones) 등의 항생제에 내성을 갖는 다제내성(multiple drug resistance, MDR) 특성으로 인해 중환자실 환자 감염과 같은 원내 감염(hospital-acquired infection)의 주요 병원균으로 주목 받고 있으며, 아시네토박터 바우마니 감염 시 폐렴, 심내막염, 혈류감염, 요로감염, 복막염 등을 포함한 다양한 감염증을 일으킨다. 아시네토박터 바우마니 감염증을 치료하기 위해서 콜리스틴(colistin), 티지사이클린(tigecycline), 이미페넴(imipenem), 메로페넴(meropenem)과 같은 항생제들이 주로 처방되지만, 이들에 대해서도 장기간 사용 시 저항성이 나타나므로 아시네토박터 바우마니에 대한 새로운 항생물질의 개발이 여전히 요구되고 있다.
최근 세균성 감염질환의 대처 방안으로 박테리오파지(bacteriophage)의 활용이 크게 주목을 받고 있다. 특히 항생제 내성균에 대한 우수한 항균력 때문에 더욱 큰 관심을 받고 있다. 박테리오파지는 세균에 감염하는 아주 작은 미생물로서 세균에 감염(infection)한 후에 세균의 세포 내부에서 증식을 하고, 증식 후 자손 박테리오파지들이 세균 밖으로 나올 때 숙주인 세균의 세포벽을 파괴하는 방식으로 세균을 사멸시키는 능력을 갖고 있다. 박테리오파지의 세균 감염 방식은 매우 특이성이 높아서 특정 세균에 감염할 수 있는 박테리오파지의 종류는 일부로 한정된다. 이러한 세균 특이성으로 인하여 박테리오파지는 대상으로 하는 세균에 대해서만 항균 효과를 제공하고 환경이나 동물 내의 상재균들에는 영향을 초래하지 않는다는 장점이 있어, 최근에는 기존 항생제의 대체 물질로의 개발 가능성이 부각되면서 박테리오파지를 이용한 항균제의 개발이 주목을 받고 있다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
한국공개특허 제10-2019-0138025호
한국공개특허 제10-2020-0081594호
본 발명은 아시네토박터 바우마니에 대한 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 박테리오파지를 포함하는 아시네토박터 바우마니 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 박테리오파지를 포함하는 항생제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 박테리오파지를 포함하는 소독제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양상은 아시네토박터 바우마니에 대한 사멸능을 가지며, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 유전체를 가지는 박테리오파지(bacteriophage) Ab1656-2를 제공한다.
본 발명에서 사용된 "박테리오파지"는 특정 세균에 감염하여 당해 세균의 성장을 억제하고 저해하는 세균 특이적 바이러스로, 단일(single) 혹은 이중(double) 사슬의 DNA 또는 RNA를 유전 물질로 포함하는 바이러스를 의미한다.
본 발명에서의 박테리오파지 Ab1656-2는 본 발명자들에 의해 처음으로 분리 동정된 것으로, 그 유전체의 서열 또한 본 발명자들에 의해 처음으로 밝혀졌다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 국내 임상 분리 균주인 항생제 다제내성 아시네토박터 바우바니(Multidrug-resistant A. baumannii) 1656-2 균주로부터 박테리오파지 Ab1656-2를 분리하였다. 분리된 박테리오파지 Ab1656-2를 전자현미경으로 관찰한 결과 시포비리대(Siphoviridae)에 속하는 것을 확인하였고, 박테리오파지 Ab1656-2의 전장 유전체를 분리하고 시퀀싱(sequencing)하여 염기서열 (서열번호 1 참조)을 확인하였고, 약 51 kb의 크기인 이중 가닥 DNA로 구성됨을 확인하였다. 또한, 박테리오파지 Ab1656-2는 아시네토박터 바우마니 표준균주 (ATCC 17978)에 대해 사멸능을 가지는 것을 확인하였다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 박테리오파지는 수탁번호 KCTC 14314BP인 것일 수 있다.
본 발명자들은 항생제 다제내성 아시네토박터 바우바니의 임상 분리 균주 1656-2로부터 아시네토박터 바우바니에 대하여 사멸능을 가지고 있는 신규한 박테리오파지를 선별하였고, 분리된 박테리오파지 Ab1656-2 (ΦAb1656-2)를 한국생명공학연구원의 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures)에 2020년 9월 17일자로 기탁하였다.
본 발명의 다른 양상은 상기 박테리오파지 Ab1656-2를 포함하는 아시네토박터 바우마니 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 "아시네토박터 바우마니 감염증"은 아시네토박터 바우마니의 감염에 의해 생기는 질환을 의미한다. 일반적으로 건강한 사람은 감염 위험이 매우 적으나 면역저하자, 만성 폐질환자, 당뇨병 환자 등 면역력이 약화된 사람에게는 감염이 취약하며, 입원환자, 특히 인공 호흡기구 착용자, 장기간 입원 환자는 감염 위험성이 매우 높게 나타난다. 아시네토박터 바우마니에 감염될 경우에는 폐렴, 혈류감염, 창상감염을 유발하여 감염 경로에 따라 다양한 증상을 나타낸다.
본 발명에서 사용된 "예방" 또는 "치료"는 아시네토박터 바우마니에 의해 유발되는 감염증의 예방, 억제 및 경감을 의미한다.
본 발명에서의 박테리오파지 Ab1656-2는 아시네토박터 바우마니 균주에만 용균(lytic) 작용을 나타낼 뿐, 진핵세포에는 작용하지 않는 선택적 독성이 우수하므로 인체와 동물에 무해하기 때문에 항생물질로서 감염병 치료에 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 약학 조성물은 박테리오파지 Ab1656-2로부터 분리된 Ab endolysin 단백질을 유효성분으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 Ab endolysin 단백질은 세균의 세포벽 성분인 펩티도글리칸(peptidoglycan)을 기질로 하여 세포벽을 분해하고 와해시켜 세균을 사멸시킨다. 상기 펩티도글리칸은 세균에만 존재하고 사람이나 동물에는 존재하지 않는 바, 본 발명의 단백질은 사람과 동물에 영향을 미치지 않아 안전하면서도 의약산업, 생명공학 등에 응용이 가능할 뿐 아니라 항생제 다제내성에 대한 문제점 없이 세균을 목표장소 또는 목표물질에서 효과적으로 사멸시킬 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 Ab endolysin 단백질은 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 Ab endolysin 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, Ab endolysin 단백질을 생산하기 위하여 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 제조하였고, 이를 숙주세포에 형질전환시켜 최종적으로 약 22 kD의 Ab endolysin 재조합 단백질을 생산하였다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 약학 조성물은 보조인자(cofactor)로 Zn2+를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 보조인자는 Ab endolysin 단백질의 효소 작용을 나타내기 위해 필요한 물질을 의미하며, 금속이온, 철-황 복합체와 같이 무기물이거나 비타민과 같이 유기물일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, A. baumannii 표준균주 (ATCC 17978)에 재조합 단백질 Ab endolysin과 보조인자로서 Mg2+, Ca2+ 또는 Zn2+을 처리한 결과, Zn2+를 처리한 경우에서 A. baumannii의 생장이 억제된 것을 확인하였다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당 업자에 의해 적절하게 선택될 수 있는 바, 상기 조성물의 일일 투여량은 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 1,000 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 박테리오파지 Ab1656-2를 포함하는 항생제를 제공한다.
본 발명에서 사용된 "항생제"는 화장품용 또는 의약용 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭한다.
본 발명의 박테리오파지 Ab1656-2는 기존 항생제에 비하여 탁월한 아시네토박터 바우마니의 사멸능을 나타내는 것으로, 이러한 박테리오파지 Ab1656-2를 항생제로 이용할 경우에는 기존의 항생제를 이용하는 것과는 달리 황색포도상구균의 내성 또는 저항성(resistance)을 유도하지 않는다는 중요한 장점을 갖기 때문에 기존의 항생물질에 비하여 제품 수명(life cycling)이 긴 신규 항생제로서 제공될 수 있다. 대부분의 항생 물질들은 내성 증가에 직면함에 따라 갈수록 사용범위가 줄어들 수밖에 없는데 반해, 본 발명의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제는 항생제 내성 문제를 근본적으로 해결할 수 있기에 그만큼 항생제로서의 제품 수명이 길어질 것으로 기대된다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 항생제는 유효성분으로서 박테리오파지 Ab1656-2로부터 분리된 Ab endolysin 단백질을 유효성분으로 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 박테리오파지 Ab1656-2를 포함하는 소독제를 제공한다.
본 발명에 따른 소독제는 아시네토박터 바우마니에 대해 효과적인 사멸능을 나타내는 본 발명의 박테리오파지 Ab1656-2를 포함함으로써 원내 감염(hospital acquired infections)을 막기 위한 병원 및 보건용의 소독제로 유용하게 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 소독제에 사용되는 박테리오파지는 자연 분해되므로 친환경적이고 액상으로 준비 가능하기 때문에 일반 환경 또는 의료 기구에 존재하는 아시네토박터 바우마니 균주를 제거하기 위한 소독제의 용도로서 매우 유용하다는 장점이 있으며, 박테리오파지를 생산하는 비용 또한 항균제 개발 및 생산에 비해 훨씬 경제적이기 때문에 보건산업에서의 박테리오파지의 효용성은 매우 크다고 할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 소독제는 유효성분으로서 박테리오파지 Ab1656-2로부터 분리된 Ab endolysin 단백질을 유효성분으로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 박테리오파지 Ab1656-2는 아시네토박터 바우마니에 대한 사멸능을 갖는 신규한 박테리오파지로, 이로부터 분리된 Ab endolysin 또한 아시네토박터 바우마니의 임상 분리 균주에 대하여 탁월한 사멸능을 나타내므로 아시네토박터 바우마니 감염에 의해 유발되는 감염성 질환을 예방 또는 치료할 수 있을 뿐만 아니라 항생제, 소독제 등 다양한 용도로 활용 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 아시네토박터 바우바니 표준균주 (ATCC 17978) 배지에서 발생한 파지 플라크(phage plaque)를 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리오파지 Ab1656-2의 형태를 전자현미경으로 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리오파지 Ab1656-2의 유전체 DNA를 1% 아가로스(agarose) 전기영동으로 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리오파지 Ab1656-2의 전장 유전체의 구조 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 플라스미드 pB4_Ab endolysin의 모식도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 플라스미드 pB4_Ab endolysin로부터 생산 및 정제된 Ab endolysin에 관한 것으로, (a)는 정제되지 않은 MBP와 결합된 Ab endolysin을 전기영동으로 확인한 결과이고, (b)는 TEV protase를 이용한 MBP가 제거된 Ab endolysin의 정제 과정을 나타낸 모식도이며, (c)는 TEV protase로 정제된 Ab endolysin을 전기영동으로 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 단백질 Ab endolysin의 활성에 관한 것으로, (a)는 Ab endolysin의 cofactor를 확인한 결과이며, (b)는 아시네토박터 바우바니 표준균주 (ATCC 17978) 및 임상 분리 균주 (643, 2496, 3097, 3680 및 4316)에 대한 Ab endolysin의 활성을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 박테리오파지 Ab1656-2의 생산 및 분리
1-1. 박테리오파지 Ab1656-2의 생산
국내 임상 분리균주인 항생제 다제내성 아시네토박터 바우바니(Multidrug-resistant A. baumannii) 1656-2 균주를 LB(Luria Bertani) 액체 배지에 접종하여 37℃에서 배양한 후 지수성장기에서 미토마이신 C(Mitomycin C)를 1 μg/ml 농도로 처리하고 37℃에서 하룻밤 동안 진탕 배양하였다. 배양액을 5,000 rpm로 10분간 원심분리하여 상층액을 수집한 후 상층액 볼륨의 2% (v/v) 클로로포름을 첨가하고 5,000 rpm 10분간 원심분리 하였다. 이후 상층액을 0.45 μm의 필터를 사용하여 여과하고, 그 여과액을 4℃에 보관하였다.
1-2. 박테리오파지 Ab1656-2의 분리
굳지 않은 액체 상태의 5 ml의 0.75% BHI 고체 배지에 상기 1-1에서 보관된 용액 500 μl와 LB 액체 배지에서 하룻밤 배양한 아시네토박터 바우마니 표준균주 (ATCC 17978) 균액 100 μl을 섞어준 후 1.5 % BHI 고체배지 위에 부어 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 다음날 세균 용혈을 확인하고 해당 용혈된 단일 플라크(Single plaque)를 100 μl의 SM buffer에 풀어준 후 13,500 rpm에서 5분 원심분리하여 상측액을 수득하고 해당 용액을 LB 액체 배지에서 지수생장기 단계의 아시네토박터 바우마니 표준균주 (ATCC 17978)에 추가 접종하여 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 세균은 5,000 rpm로 10분간 원심분리하여 상층액을 수집하고 상층액 볼륨의 2% (v/v) 클로로포름을 첨가하고 5,000 rpm 10분간 원심분리 하였다. 이후 상층액을 0.45 μm의 필터를 사용하여 여과한 후 SM buffer와 1:1의 비율로 희석하여 4℃ 또는 -70℃에 보관하였다. 순수 분리된 박테리오파지의 플라크 형성 시험을 통해 박테리오파지가 제대로 수확되었는지 확인하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
1-3. 전자현미경을 이용한 박테리오파지 Ab1656-2의 형태 관찰
상기 수득한 박테리오파지 Ab1656-2의 형태를 관찰하기 위하여 바이오 투과전자현미경 (Bio-TEM, Bio Transmision Electron Microscope)를 통해 관찰하였다. 약 108 pfu의 순수분리된 박테리오파지를 탄소로 코팅된 구리판에 바른 후, 2% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 염색하고 바이오 투과전자현미경을 사용하여 관찰하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 박테리오파지 Ab1656-2는 시포비리대(Siphoviridae)에 속하는 박테리오파지인 것으로 확인되었다.
1-4. 박테리오파지 Ab1656-2의 유전체 서열 분석
상기 수득한 박테리오파지 Ab1656-2의 유전체를 Phage DNA isolation kit (NORGEN)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 정제를 하였다. 해당 DNA를 1% 아가로스(agarose) 전기영동을 통해 확인하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
해당 유전체를 마크로젠(Macrogen)에 의뢰하여 차세대 염기서열 분석(Next Generation Sequencing)을 통한 전체 서열 분석을 진행하였다. 해당 차세대 염기서열 분석은 일루미나 플랫폼(Illumina platform)의 시퀀서 유형과 De novo assembly의 분석 유형을 통해 진행되었다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 박테리오파지 Ab1656-2의 유전체는 이중가닥 DNA로 크기가 약 51 kb (서열번호 1)인 것으로 확인되었다.
본 발명자들은 박테리오파지 Ab1656-2를 한국생명공학연구원의 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures)에 2020년 9월 17일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 14314BP를 부여받았다.
실시예 2. 박테리오파지 Ab1656-2 유래 재조합 단백질 Ab endolysin 생산 및 정제
2-1. 재조합 플라스미드 pB4_Ab endolysin 제조
아시네토박터 바우마니에 대해 사멸능을 가지는 신규 박테리오파지 Ab1656-2의 단백질 Ab endolysin을 생산하기 위해 재조합 플라스미드를 제조하였다.
먼저, pB4 플라스미드에 클로닝 하기 위하여, 박테리오파지 1656-2의 엔도라이신(endolysin) 유전자를 PCR을 통하여 증폭시켜 주었다. 상기 유전자를 pB4 플라스미드에 LIC method를 통하여 클로닝 하였고, 이로부터 제조된 재조합 플라스미드의 구조는 도 5와 같다 (서열번호 4 참조). 새롭게 구축된 플라스미드는 마크로젠(Macrogen)에 의뢰하여 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였다. PCR 증폭 및 DNA 시퀀싱에서는 하기 표 1의 프라이머를 사용하였다.
프라이머
(서열번호)		 프라이머 서열 (5'→3') 용도
Ab_endolysin_LIC_F
(서열번호 5)		 GGGCGGCGGTGGTGGCGGCATGCCGCCTTCGGGCG Ab endolysin
증폭
Ab_endolysin_LIC_R
(서열번호 6)		 GTTCTTCTCCTTTGCGCCCTATATAACAACTCGATTGGCGATC
pB4_seq_F
(서열번호 7)		 GTCAGACTGTCGATGAAG pB4 vector
시퀀싱
pB4_seq_R
(서열번호 8)		 CATCACCATCTAATTCAAC
2-2. 재조합 플라스미드 pB4_Ab endolysin으로부터 Ab endolysin 발현
Ab endolysin을 발현하기 위하여, 상기 2-1에서 제조된 pB4_Ab endolysin를 E. coli BL21 DE3 star 균주에 형질전환 시켰다. 형질전환된 E. coli는 암피실린(ampicillin) (100 μg/ml) 항생제가 첨가된 LB 고체배지에서 선별하였다. 상기 선별 과정을 통해 구축된 단백질 발현 균주가 Ab endolysin을 발현하는지 확인하기 위해 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) (0.2 mM/ml)를 첨가한지 2시간 후 해당 균주를 수집하여 단백질 전기영동으로 확인하였다.
그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, IPTG 첨가하여 약 64kD의 단백질 밴드를 확인하였다.
2-3. Ab endolysin 정제
상기 2-2에서 발현이 확인된 Ab endolysin를 대량 정제하기 위하여, 상기 형질전환된 단백질 정제 균주를 암피실린 (100 μg/ml) 항생제가 첨가된 LB 액체배지 1 L에 접종한 후 37℃ 진탕 배양기에서 OD600 = 0.7까지 키운 후 IPTG를 최종 농도 0.2 mM/ml가 되도록 첨가하고서 18℃에서 18시간 배양하였다. 이후 배양된 균주를 원심분리하여 수확하고 100 ml의 용해 버퍼(lysis buffer) (20 mM Tris pH 7.0 및 0.5 M NaCl 함유)에 풀어 주었다. 수확된 세균을 초음파 파쇄기로 파쇄하였다. 파쇄된 세균을 30분 동안 15,000 rpm으로 원심분리 하여 상등액을 취한 후 0.45 um의 필터를 사용하여 여과하고 FPLC(Fast-protein liquid chromatography)를 통해 Ni-NTA 컬럼에 주입하였으며, 용출 버퍼(elution buffer) (20 mM Tris pH 7.0, 0.5 M NaCl 및 0.5 M imidazole 함유)를 사용하여 N-말단에 존재하는 히스티딘 태그(His-tag)된 MBP-Ab endolysin을 수확하였다. 수확된 단백질에 TEV protease를 첨가하여 인공투석 및 TEV site 절단 (20 mM Tris pH 7.0, 0.5 M NaCl, 10 mM β-mercaptoethanol 및 1 mM EDTA 함유)을 진행하여 MBP(His-tag)와 Ab endolysin을 분리시켰다. 이후 해당 용액을 다시 2차 Ni-NTA 컬럼에 주입하여 히스티딘 태그가 존재하는 TEV protease 및 MBP를 걸러 내어 Ab endolysin을 분리하였다 (도 6b 참조). 정제된 Ab endolysin은 단백질 전기영동으로 확인하였다.
그 결과, 도 6c에 나타낸 바와 같이, MBP(His-tag)가 제거된 Ab endolysin은 약 22 kD의 단백질 밴드로 확인되었다.
실시예 3. Ab endolysin 활성 분석
3-1. Ab endolysin의 활성을 위한 보조인자(cofactor) 확인
정제된 Ab endolysin의 활성에 영향을 미치는 cofactor를 확인하기 위하여, A. baumannii 표준균주 1주 (ATCC 17978)를 대상으로 다음과 같이 진행하였다.
먼저, U-type 96-웰 플레이트(well plate)에 well 당 최종 볼륨(volume) 200 ul가 되도록 Ab endolysin 100, 50, 25, 12.5 ug/well을 넣어주었으며, Cofactor로서 2가 양이온인 Mg2+, Ca2+, Zn2+을 최종 농도 1 mM/ml가 되도록 넣어주었다. 또한 A. baumannii 표준균주 1주 (ATCC 17978)는 4Х105 CFU/well의 세균수가 되도록 넣어 주고 37℃에서 18시간 배양하여 Ab endolysin의 활성을 확인하였다.
그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이, Mg2+ 또는 Ca2+를 처리한 경우에는 A. baumannii의 생장이 관찰된 반면, Zn2+를 처리한 경우에는 Ab endolysin의 농도 의존적으로 A. baumannii의 생장이 억제되어 투명하게 보이는 것으로 확인되었다.
3-2. A. baumannii 임상 분리 균주에 대한 활성 확인.
A. baumannii 임상 분리 균주의 성장 억제 실험을 진행하기 위하여, U-type 96-웰 플레이트에 well 당 최종 볼륨 200 ul가 되도록 Ab-edolysin 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.12, 1.56 ug/well을 넣어주었다. 이후 Zn2+을 최종 농도 1 mM/ml가 되도록 넣어준 후 대조군인 A. baumannii 표준균주 (ATCC 17978) 및 A. baumannii 임상 분리 균주 (643, 2496, 3097, 3680, 4316)를 각 4Х105 CFU/well의 세균수가 되도록 넣어 주고 37℃에서 18시간 배양하여 Ab endolysin의 활성을 확인하였다.
그 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이, A. baumannii 표준균주 (ATCC 17978) 및 A. baumannii 임상 분리 균주 5종에서는 모두 Ab endolysin의 농도 의존적으로 균주의 생장이 억제된 것으로 확인되었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC14314BP
수탁일자 : 20200917
Figure PCTKR2021013191-appb-I000001

Claims (8)

  1. 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)에 대한 사멸능을 가지며, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 유전체를 가지는 박테리오파지(bacteriophage) Ab1656-2.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 박테리오파지는 수탁번호 KCTC 14314BP인 것인, 박테리오파지 Ab1656-2.
  3. 청구항 1의 박테리오파지 Ab1656-2를 포함하는 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii) 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 약학 조성물은 박테리오파지 Ab1656-2로부터 분리된 Ab endolysin 단백질을 유효성분으로 포함하는 것인, 약학 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 Ab endolysin 단백질은 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것인, 약학 조성물.
  6. 청구항 3에 있어서,
    상기 약학 조성물은 보조인자(cofactor)로 Zn2+를 더 포함하는 것인, 약학 조성물.
  7. 청구항 1의 박테리오파지 Ab1656-2를 포함하는 항생제.
  8. 청구항 1의 박테리오파지 Ab1656-2를 포함하는 소독제.
PCT/KR2021/013191 2020-09-28 2021-09-28 아시네토박터 바우마니에 대한 사멸능을 가지는 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물 WO2022065969A1 (ko)

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