CN112011525B

CN112011525B - 具有降解k64荚膜型肺炎克雷伯菌胞外聚合物的能力的解聚酶

Info

Publication number: CN112011525B
Application number: CN202010910803.6A
Authority: CN
Inventors: 祝先潮; 何平; 李佳茵; 杜娟
Original assignee: Shanghai Ruizhou Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Ruizhou Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-09-02
Filing date: 2020-09-02
Publication date: 2022-10-04
Anticipated expiration: 2040-09-02
Also published as: CN112011525A

Abstract

本发明涉及生物医疗领域，具体而言，涉及一种具有降解K64荚膜型肺炎克雷伯菌胞外聚合物的能力的解聚酶。本发明所提供的解聚酶能够有效分解K64荚膜型肺炎克雷伯菌胞外聚合物，从而利于能够杀伤该菌的药物与该菌进行接触进而发挥药效。

Description

具有降解K64荚膜型肺炎克雷伯菌胞外聚合物的能力的解聚酶

技术领域

本发明涉及生物医疗领域，具体而言，涉及一种具有降解K64荚膜型肺炎克雷伯菌胞外聚合物的能力的解聚酶。

背景技术

肺炎克伯菌是一种革兰氏阴性的具有荚膜包被的肠道细菌，是最常见的机会致病菌，可引起广泛的医院感染，包括败血症、肺炎、***(UTI)和肝脓肿。近年来，肺炎克雷伯菌也作为一种潜在的社区获得性病原体，是世界各地特别是亚洲范围内，社区获得性肝脓肿的重要原因。在大量使用抗生素的情况下，肺炎克雷伯菌的多重耐药现象在过去十年中越来越多地出现在医院中。自2013年以来，肺炎克雷伯菌已被公认为碳青霉烯类耐药肠杆菌科(CRE)的主要成员，具有多耐药表型，并作为一类耐抗生素细菌，目前急需新的治疗方法。

多糖是肺炎克雷伯菌最重要的致病因子之一，可在细胞周围形成荚膜多糖(CPS)或作为胞外多糖(EPS)释放。荚膜多糖(CPS)由4-6个单糖和糖醛酸组成的荚膜重复单位，通过血清型分型方法，肺炎克雷伯菌目前可分为至少78个荚膜血清型。CPS主要用于在感染过程中协助细菌逃避宿主免疫***的检测，保护细菌免受调理吞噬和血清杀伤作用，并赋予其对抗生素的内在抵抗力。此外，它还可以作为物理屏障防止环境中的有害元素和噬菌体的入侵。

噬菌体疗法作为一种新的治疗方法，在耐抗生素细菌感染方面得到了越来越多的关注。最近，噬菌体衍生的荚膜解聚酶正成为治疗肺炎克雷伯菌感染的一种替代药物。多糖解聚酶通常位于噬菌体尾部或基板的尖端，主要用于消化细菌荚膜多糖，促进细胞进一步感染。该酶的结构特点主要是同源三聚体结构。由于具有丰富的螺旋结构，酶的活性非常稳定。这些酶主要作用于CPS的糖苷键，通过释放糖聚合物的重复单位来破坏荚膜，使细菌失去其自然屏障，因此，更容易受到宿主免疫***的攻击。研究发现解聚酶可以通过降解多糖来降低革兰氏阴性肠道细菌，如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼氏菌的毒力，增强血清对细菌的体外杀灭作用。实验表明，解聚酶在体内也能发挥功能，在解聚酶治疗后，分别提高了被感染的小鼠和大蜡螟幼虫的存活率。因此，噬菌体解聚酶与其他治疗药物的结合为治疗细菌感染带来了新的曙光。

在本发明申请人之前的工作中，经过大量筛选，曾意外地获得能够裂解肺炎克雷伯菌胞外聚合物的解聚酶Dpo42、Dpo43(公开号CN111481660A，优先权日2020年04月20日，公开日2020年08月04日)；这两种解聚酶能够有效裂解肺炎克雷伯菌K47的胞外聚合物。最近，在CRKP菌株中，K64被鉴定为比K47更为常见的荚膜型，在巴西、新加坡、中国台湾、美国和欧洲中均有发现。但是，噬菌体具有非常特异的宿主谱，且Dpo42、Dpo43的裂解能力同样是特异的，它们对K64荚膜型的肺炎克雷伯菌胞外聚合物难以产生令人满意的裂解作用。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明第一方面在于提供一种解聚酶，其具有SEQ ID NO:1所示序列，或是与之具有至少80％同源性且具有降解K64荚膜型肺炎克雷伯菌胞外聚合物活性、来源于肺炎克雷伯杆菌噬菌体的酶。

本发明第二方面在于提供一种核酸，其编码如上所述的解聚酶。本发明还包括包含所述核酸的载体。

本发明第三方面在于提供一种宿主细胞，其含有如上所述核酸，和/或如上所述载体。

本发明第四方面在于提供一种肺炎克雷伯杆菌噬菌体，其能够表达如上所述解聚酶。

本发明第五方面在于提供一种制备解聚酶的方法，其包括：

1)培养如上所述的宿主细胞，2)表达所述解聚酶，3)由所述宿主细胞分离所述解聚酶；

或；

1')以K64荚膜型肺炎克雷伯菌为底物培养如上所述肺炎克雷伯杆菌噬菌体，2')裂解所述K64荚膜型肺炎克雷伯杆菌噬菌体并分离所述解聚酶。

本发明第六方面在于提供一种药物组合物，其包括：

i)如上所述解聚酶，或如上所述肺炎克雷伯杆菌噬菌体；以及

ii)任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

本发明第七方面在于提供一种治疗肺炎克雷伯菌所导致的疾病的方法，所述方法包括对宿主给予有效量的如上所述的药物组合物的步骤。

本发明的有益效果为：

本发明所提供的解聚酶能够有效分解K64荚膜型肺炎克雷伯菌胞外聚合物，从而利于能够杀伤该菌的药物与该菌进行接触进而发挥药效。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中噬菌体SH-KP152410在Kp2410双层琼脂平板上形成的噬菌斑和晕圈；

图2为本发明一个实施例中噬菌体SH-KP152410的透射电镜图片；

图3为本发明一个实施例中噬菌体SH-KP152410的基因组分析；

图4为本发明一个实施例中ORF41的基因结构分析；

图5为本发明一个实施例中重组SUMO-Dpo41融合蛋白经过Ni柱纯化后SDS-PAGE电泳图M：蛋白marker；泳道1：收集到的融合蛋白SUMO-Dpo41；泳道2-4：酶切后的目的蛋白Dpo41；

图6为本发明一个实施例中梯度稀释的Dpo41对宿主菌Kp2410的点滴实验，其中PBS为对照；

图7为本发明一个实施例中Dpo41孵育后的Kp2410胞外多糖的SEC-HPLC分析；Ⅰ表示纯化的Kp2410胞外多糖，Ⅱ表示37℃下，Dpo41孵育后Kp2410胞外多糖，Ⅲ表示25℃下，Dpo41孵育后Kp2410胞外多糖，Ⅳ表示37℃下，SUMO蛋白孵育后Kp2410胞外多糖；

图8为本发明一个实施例中pH和温度对解聚酶活性和稳定性的影响；A不同pH对酶活性的影响；B不同温度对酶活性的影响；C不同pH下酶活的稳定性；D不同温度下酶活的稳定性；

图9为本发明一个实施例中多糖解聚酶处理后的血清杀伤实验；Control：Kp2410；enzyme：Kp2410+Dpo41；Control-75％：Kp2410+75％血清；enzyme-75％：Kp2410+Dpo41+75％血清。

本申请提供的肺炎克雷伯杆菌噬菌体(Klebsiella pneumoniaebacteriophage)，毒株名为SH-KP152410，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保存编号GDMCC No：61131，该毒株于2020年8月8日由保藏中心收到并登记入册；经保藏中心于2020年8月12日检测为存活毒株。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

本发明涉及一种解聚酶，其具有SEQ ID NO:1所示序列，或是与之具有至少99％同源性且具有降解K64荚膜型肺炎克雷伯菌胞外聚合物活性，且来源于肺炎克雷伯杆菌噬菌体的酶。

为方便表述，SEQ ID NO:1所示的解聚酶在后文中分别以“Dpo41”指代。在本发明中K64荚膜型肺炎克雷伯菌是指肺炎克雷伯菌根据wzi分型法确定为K64荚膜型。

该酶能够特异性降解肺炎克雷伯菌的胞外荚膜多糖，不仅能够抑制肺炎克雷伯菌生物膜的形成，而且可以一定程度地去除生物膜，并在抵抗生物膜的形成过程中表现出剂量依赖的活性。

所述解聚酶也可以为与SEQ ID NO:1所示的全长序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％同源性且具有降解肺炎克雷伯菌胞外聚合物活性的酶。

此外，鉴于本申请进一步限定了所述解聚酶具有降解肺炎克雷伯菌胞外聚合物活性，因而，本领域技术人员容易想到对SEQ ID NO:1或2所示序列的保守区中作出仅保守置换的蛋白序列改造得到实质上相似的序列。优选地，实质上相似的序列亦保留多肽的独特活性。通常视为保守置换的置换是在脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile中的彼此置换、羟基残基Ser和Thr的互换、酸性残基Asp和Glu的交换、酰胺残基Asn和Gln之间的置换、碱性残基Lys和Arg的交换以及芳香残基Phe、Tyr间的置换。

在本发明中，“具有降解肺炎克雷伯菌胞外聚合物活性”或者“具有解聚酶活性”，可以被理解为具有至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的降解肺炎克雷伯菌胞外聚合物的能力，该百分比是与野生型在其最适转录酶解条件下测得数据比较得到的。

在本发明中，“胞外聚合物”可以与“Extracellular Polymeric Substances”、“胞外荚膜多糖”等术语通用，它可以是在一定环境条件下由微生物，主要是细菌，分泌于体外的一些高分子聚合物。主要成分与微生物的胞内成分相似，是一些高分子物质，如多糖、蛋白质和核酸等聚合物。

在一些实施方式中，所述肺炎克雷伯杆菌噬菌体的保藏编号为GDMCC No：61131。

在一些实施方式中，所述解聚酶在pH＝5～9之间具有解聚酶活性。

在一些实施方式中，所述解聚酶在25℃～70℃之间具有解聚酶活性。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及编码如上所述解聚酶的核酸。

所述核酸可以是DNA或RNA。

在一些实施方式中，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还涉及载体，所述载体包含如上所述核酸的载体。

术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸***其中的一种核酸运载工具。当载体能使***的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒(如SV40)。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。

本发明还涉及宿主细胞，所述宿主细胞包含如上所述的核酸序列，和/或如上所述的载体。

术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。宿主细胞优选为原核细胞，更优选为大肠杆菌。

核酸可以整合于所述宿主细胞的基因组中，也可以外源转入基因的形式(例如质粒)存在。

本发明还涉及肺炎克雷伯杆菌噬菌体，其能够表达如上所述解聚酶。

本发明请求保护上述保藏编号的肺炎克雷伯杆菌噬菌体，以及在适度范围内发生突变或改造，且仍然能够表达如上所述的解聚酶、或仍然具有很强的肺炎克雷伯菌裂解能力的变体毒株。

所谓“变体毒株”，可由现有技术的噬菌体经公知的基因编辑技术***如上所述的核酸改造得到，或者将保藏编号为GDMCC No：61131所示的噬菌体进行适度突变，或将保藏编号为GDMCC No：61131所示的噬菌体与其它噬菌体进行融合而得到的毒株。

对于适度突变的毒株，是指基因组高度类似SH-KP152410毒株基因组的噬菌体。在本申请中，表述“适度突变的毒株”可以通过基因组方面高度类似涵盖：

一种噬菌体毒株的基因组同SH-KP152410毒株的基因组相比，包含至多150个突变事件，优选包含至多140个、130个、120个、110个、100个、90个、80个、70个、60个、50个、40个、30个或20个突变事件。突变事件被限定为SNP(单核苷酸多态性)或INDEL(***、缺失，及两者的组合)。按如下方式确定突变事件的数量：将SH-KP152410毒株的基因组视为对照，鉴定存在于突变株基因组中的突变事件，每种突变事件(SNP或INDEL)代表一个突变事件(即，例如，***含若干个核苷酸的序列只视作一个突变事件)。在该语境中，本发明的突变株的基因组序列由同SH-KP152410毒株相比所含突变事件的数量限定，除这种限定方式外，还可额外由其与SH-KP152410毒株的基因组序列的同一性百分比限定，其中同一性百分比在本文表示在一种毒株的基因组中发现存在于另一种毒株的基因组中的序列的百分比，具体地讲：a)在SH-KP152410毒株的基因组中发现并存在于突变毒株的基因组中的序列的百分比，或b)在突变毒株的基因组序列中发现并存在于SH-KP152410毒株的基因组中的序列的百分比。因此，与SH-KP152410毒株的不同之处只有***(一个或多个)或只有缺失(一个或多个)的突变毒株，具有的基因组与SH-KP152410毒株的基因组的同一性百分比为100％，因为在一种毒株的基因组中完全发现了另一种毒株的整个基因组序列。在一个具体实施例中，由突变事件数量限定的本发明的突变株的基因组序列，与SH-KP152410毒株的基因组序列的同一性百分比为至少90％、为至少91％、为至少92％、为至少93％、为至少94％、为至少95％、为至少96％、为至少97％、为至少98％、为至少99％、为至少99.1％、为至少99.2％、为至少99.3％、为至少99.4％、为至少99.5％、为至少99.6％、为至少99.7％、为至少99.8％、为至少99.9％、为至少99.92％、为至少99.94％、为至少99.96％、为至少99.98％或为至少99.99％，其中同一性百分比表示在一种毒株的基因组中发现并存在于另一种毒株的基因组中的序列的百分比；同一性是按照将两种基因组序列在它们的全长范围内相比较(全局比对)的方式作出描述的，并且可使用基于Needleman-Wunsch算法的任一种程序来计算。

本发明还涉及制备解聚酶的方法，其包括：

1)培养如上所述的宿主细胞，2)表达所述解聚酶，3)由所述宿主细胞分离所述解聚酶；或；

本发明还涉及药物组合物，其包括：

该药物组合物可有效抑制K64荚膜型肺炎克雷伯杆菌的能力。

在一些实施方式中，所述药物组合物还包括解聚酶Dpo42和/或Dpo43。

在一些实施方式中，所述药物组合物还包括对肺炎克雷伯菌胞具有杀伤或抑制作用的抗生素类药物。

在一些实施方式中，所述抗生素类药物选自：

氨苄西林、舒巴坦、哌拉西林、他唑巴坦、头孢唑啉、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、头孢西丁、氨曲南、环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、多粘菌素、厄他培南、亚胺培南、美罗培南、复方新诺明和替加环素中的一种或多种。

本发明还涉及一种抑制或灭杀肺炎克雷伯菌，或称之为治疗肺炎克雷伯菌所导致的感染的方法，所述方法包括对宿主给予有效量的药物的步骤。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

所述药物可以为如上所述的药物组合物所定义。

“宿主”此概念通常指被肺炎克雷伯菌所感染的动物，或该动物的器官(特别是呼吸道相关器官)，或该动物的细胞(特别是来源于呼吸道的细胞)。

本发明中所述的术语“有效量”是指该术语所对应的组分在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明中所述疾病或病症的剂量。

在本发明中，术语“呼吸道”可以包括下述的三部分：

·上呼吸道：鼻、鼻道、鼻窦、喉和咽。

·气管：喉结、气管、支气管和次级支气管。

·肺：小支气管、肺泡管和肺泡。

这样的动物通常是哺乳动物，进一步为灵长类动物，进一步为人。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例

一.实验方法

1.1菌株分离鉴定

肺炎克雷伯菌2410作为宿主菌，分离自复旦大学附属华山医院，保存于本实验室。其他肺炎克雷伯菌临床菌株也来自华山医院。根据Brisse(Wzi gene sequencing,a rapidmethod for determination of capsular type for Klebsiellastrains.J.Clin.Microbiol.51,4073–4078.)的方法，采用wzi测序法测定菌株荚膜类型。这些临床分离株在37℃的的LB培养基中培养，加入甘油保存在-80℃。

1.2噬菌体分离

利用肺炎克雷伯菌临床分离株2410从生物处理的污水中分离得到噬菌体。将未处理的水样离心，在LB液体培养基中感染肺炎克雷伯菌2410株，37℃过夜培养。离心后，将含有噬菌体的上清液用0.22μm过滤器过滤，采用SM缓冲液(100mM NaCl，8mM MgSO₄·7H₂O，50mM Tris-HCl，pH＝7.5)梯度稀释后，铺板于1.5％琼脂LB培养基之上，待上层凝固后，置于37℃温箱过夜培养，次日，在覆盖肺炎克雷伯菌2410的双层琼脂平板上发现噬菌体斑块。挑选单一的斑块进行噬菌体的纯化。根据Pires(Use of newly isolated phages forcontrol of Pseudomonas aeruginosa PAO1 and ATCC 10145bioflms.Res.Microbiol.162,798–806.)的方法得到纯化后的噬菌体。用双层琼脂平板法进行噬菌体效价测定。获得该裂解噬菌体命名为SH-KP152410。纯化后的噬菌体经扩增后保存于4℃的SM缓冲液中。

1.3透射电子显微镜

将噬菌体滴于含有碳膜的铜网上，自然沉淀后，再加一滴2％磷钨酸染色。在自然状态下干燥后，使用透射电子显微镜观察噬菌体的形态。

1.4宿主谱测定

通过斑点试验和双层琼脂平板试验，对在本实验室获得的54株临床菌株进行SH-KP152410的宿主谱检测。简而言之，取400μL细菌培养物与0.75％琼脂LB充分混匀，铺板于1.5％琼脂LB培养基之上，待顶部琼脂凝固后。将5μL纯化的噬菌体混悬液滴入在菌苔上，在37℃过夜孵育后，观察噬菌体对细菌的作用。

1.5基因组DNA测序和注释

噬菌体基因组DNA的提取采用前面描述的标准方案。向含有噬菌体的SM缓冲液中加入10μg/mL脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶A，37℃下处理1h，随后加入25mmol/mL乙二胺四乙酸(EDTA)。将提取好的噬菌体DNA送至上海派森诺生物科技有限公司进行基因组测序，利用Illumina高通量测序平台(Illu minaHiseq 3000)完成。使用SOAP denovo2软件进行基因组装和结果优化。GeneMark软件和Glimmer 3.02软件用于预测分析噬菌体基因组的开放阅读框(open reading frame，ORF)。通过使用NCBI网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上的BLAST在线工具与已知序列进行比较，并对这些预测基因进行注释。

1.6重组解聚酶的克隆、表达和纯化

利用引物K64-ORF41-F(5’-CAGCAGCAGACGGGAGGATCCATGGACCAAGATACTAAAACAATC-3’)和K64-ORF41-R(5’-CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTATGCGTTCAGGTACACCC-3’)从纯化的噬菌体SH-KP152410的DNA中扩增ORF41基因。将3054个碱基的PCR扩增产物经BamH I和Hind III酶切位点克隆到N末端6×His标记的pSumo3表达载体上。重组质粒经DNA测序验证，转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。随后为了得到重组ORF41蛋白，在0.1mM IPTG中37℃下诱导表达4h，收菌进行蛋白表达纯化。细菌沉淀重悬在含PMSF的20mL裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，500mM NaCl，10％甘油，20mM咪唑，pH＝7.5)中，超声冰上裂解；在4℃下、以12000rpm离心1h，取上清随后采用镍离子柱进行蛋白纯化，平衡Ni柱后，分别用20mM、40mM裂解缓冲液洗涤，最后用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl，50mM NaCl，300mM咪唑，pH＝7.5)洗脱，得到融合蛋白SUMO-Dpo41。将得到的蛋白进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色，并在30KD滤膜上离心富集(Thermo，USA)，最后将样品保存在-80℃。最后加入SUMO蛋白酶去除his标记的SUMO蛋白，得到纯化后的蛋白，并在-80℃保存。

1.7解聚酶活性分析

通过点滴实验测定Dpo41解聚酶活性。简单地说，将400μL对数生长期的肺炎克雷伯菌2410与3.6mL 0.75％的软琼脂培养基混合，然后将混合物倒在1.5％LB的琼脂上，形成双层琼脂平板。随后在平板上滴加5μL稀释成不同浓度梯度的多糖解聚酶，37℃孵育过夜，通过观察其是否有透明晕圈的形成来检测Dpo41的酶活性。此外，其他肺炎克雷伯菌株对Dpo41解聚酶的敏感性也通过点滴实验测定。

1.8胞外多糖的纯化

将肺炎克雷伯2410菌株在新鲜的TSB培养基中培养过夜，于37℃不搅拌培养5天。进行胞外多糖纯化，具体步骤如下：

向10mL细菌培养物中加入60μL甲醛溶液(36.5％)，100rpm室温孵育1h；加入1MNaOH，搅拌3h，在16800g下离心1h以分离多糖(上清)和菌体沉淀；上清液加入三氯乙酸(TCA，20％w/v)沉淀上清以去除蛋白质和核酸，将溶液在16800g下离心1h，收集上清液；加入1.5倍体积的96％乙醇，-20℃下放置24h析出胞外多糖EPS；再经16800g离心1h，将沉淀重悬于双蒸水(ddH₂O)中；胞外多糖混合物在4℃使用12～14kDa透析袋于ddH₂O中过夜透析，以去除小分子杂质，最后对透析得到的胞外多糖进行冻干称重。

1.9用解聚酶Dpo41解聚细菌胞外多糖

为了证明重组蛋白Dpo41具有降解胞外多糖的活性，我们采用高效液相色谱(SEC-HPLC)进行解聚实验。将纯化后的胞外多糖溶解于50mM Na₂HPO₄(pH7.0)中至终浓度0.5mg/mL，与Dpo41(10μg/mL)或SUMO(10μg/mL)在37℃孵育30min，孵育后在100℃加热15min终止反应。

进行HPLC分析：加样体积为20μL，30min内采用溶液A(0.2M磷酸盐缓冲液)作为流动相，以0.5mL/min流速进行色谱分析，对比降解前后的峰图，可以分析解聚酶活性。

1.10解聚酶Dpo41稳定性的测定

分析在不同的pH和温度下，Dpo41酶的活性和稳定性。根据在多糖解聚酶的作用下，外膜多糖可以降解成还原糖，通过Miller法(二硝基水杨酸试剂测定还原糖)来测定还原糖的生成量，从而推定多糖解聚酶的酶活水平。用葡萄糖作为标准品，葡萄糖的浓度梯度为0.2-1.0mg/mL。每管中加入溶液500μL，再加入1.5mL的DNS试剂，充分混匀，于37℃孵育30min，反应结束后，在100℃水浴锅中煮沸10min以终止反应，迅速冷却至室温，以1:5(vol/vol)比例加入ddH₂O稀释后于550nm处测吸光度值，制作标准曲线。通过标曲计算酶作用后释放出的单糖量来检测酶活。首先，测定不同pH条件下解聚酶Dpo41的活力，设置不同pH缓冲体系如下，50mM醋酸钠(pH 2.0～5.0)，50mM Na₂HPO₄(pH 6.0～7.0)，50mM Tris-HCl(pH8.0～9.0)，100mM NaHCO₃(pH10.0～11.0)，从而得到最适反应pH。类似地，在测定不同温度下解聚酶Dpo41的活力时，将解聚酶Dpo41分别在25℃、37℃、50℃、70℃、80℃、90℃下分别作用，缓冲液为50mM Na₂HPO₄(pH 6.0)。不同条件下的酶活力用与最适条件相比较的相对酶活来表示。为了确定在不同条件下的酶活稳定性，将Dpo41预先在不同的温度、pH条件下进行孵育30min，然后再按照上述方法测定酶活。

1.11抗血清检测

如前所述，进行了肺炎克雷伯菌的血清敏感性试验。将2.5×10⁵CFU菌离心，重悬于25μL生理盐水中，加入解聚酶Dpo41(终浓度为100μg/ml)在37℃下预处理1h。随后，将其与75μL健康志愿者的血清混合。混合物在37℃下孵育1小时。随后将菌液稀释涂板，37℃过夜培养后测定活菌数，计算活菌率，将未加入解聚酶和血清的处理的细菌作为对照。

二、结果

2.1细菌菌株和培养

54株临床菌株均对多种抗生素耐药，包括头孢呋辛(CXM)、头孢噻肟(CTX)、阿米卡星(AMK)、头孢唑林(CZO)、美罗培南(MEM)、亚胺培南(IPM)、GEN和哌拉西林(PIP)。这些菌株在37℃的LB培养基中培养。次日将培养基1:100稀释至新鲜培养基中，培养至所需生长阶段。采用wzi测序法对临床分离的菌株进行分型测定。所有菌株均为K64型，其中以肺炎克雷伯菌2410为噬菌体的寄主菌株。

2.2感染肺炎K.2410菌株的噬菌体的分离

将肺炎克雷伯菌2410菌株与华山医院收集的污水在LB液体培养基中共培养过夜。从医院的污水中分离出特异性的噬菌体(命名为SH-KP152410)将噬菌体悬液利用双层琼脂平板法铺到Kp2410细菌的半固体平板，能够形成透明的噬菌斑，在噬菌斑周围可见淡淡的晕圈(图1)。

2.3SH-KP152410的微生物学特性和裂解谱

透射电子显微镜观察到，噬菌体具有直径为50nm的六角形头部和直径为20nm的尾巴。根据这些形态特征，噬菌体属于短尾噬菌体家族的一员(图2)。以往的研究表明，出现的半透明光环意味着多糖解聚酶的存在，这是噬菌体的荚膜多糖降解酶。因此，我们推断这种噬菌体的感染可能与细菌荚膜类型有关。为了证实这一假设，我们根据点滴实验，评估了SH-KP152410噬菌体对54株K64型临床菌株的感染情况。除四株临床菌株既不出现噬菌斑也不出现晕圈外，大多数细菌都产生噬菌斑和晕圈。结果表明，SH-KP152410噬菌体对K64型菌株具有高度敏感性。

将Dpo41、Dpo42、Dpo43同时作用于K64型临床菌株(表1)，只有Dpo41对其有裂解作用。Dpo42、Dpo43对K64型临床菌株无作用。因此进一步证明了Dpo41对K64型菌株具有高度特异性。

表1.噬菌体SH-KP152410和解聚酶Dpo41、Dpo42、Dpo43的裂解谱

2.4噬菌体SH-KP152410的基因组分析

全基因组测序结果显示，该噬菌体具有40945碱基对的线性双链基因组，GC含量为53.08％。基因组序列的注释表明，该噬菌体基因组预计包含47个开放阅读框(ORFs)。除了一个ORF外，其他所有的ORF都有相同的方向。这些ORFs的平均长度为777bp。BLAST结果显示，该噬菌体编码蛋白与两种噬菌体具有高度相似性，分别是肺炎克雷伯菌噬菌体vB_Kp1(覆盖性＝85.00％，一致性＝94％)和克雷伯菌噬菌体vB_KpnP_BIS33(覆盖性＝79.00％，一致性＝95％)。基因组结构分析和序列相似性比对表明SH-KP152410属于短尾噬菌体家族。根据功能不同，噬菌体编码蛋白可分为5类：DNA包装和形态发生蛋白(8个)、DNA复制/重组/修饰蛋白(16个)、宿主裂解蛋白(3个)、未分类蛋白(4个)，其余都是假设蛋白，无毒力基因和耐药基因。(图3)。

Dpo41的氨基酸序列为：

MDQDTKTIIQYPTSGDEYDIPFDYLSRKFVRVSLVSNTQRVLLDNITDYRYVSRTRVKLLVSTDGYSRVEIRRFTSASEMVVDFSDGSVLRATDLNVSALQSAHIAEEARDLFSTSLSIGQLSYFDAKGLQIKNVAAGVDNTDAVTVQQLNKIIADVVTTIPDSVADNIRGLWARVLGDIGITLVDGSFETGATITTRTQALWSISGRKCYTWAGALPKVVPENSTPESTGGISETAWVDSSSKALGVLLAGPSGAERVGLKQGGTVQDAINWLTFDSFDIVKDGSKDVTADIMAACVVANDLGLDIKQNDGTYLVSGNPVWPVYNSLDLNGVTLKLAAGFTGYFALTQKDSTTVYGPTSPIVQAINAAGGRTAGSGVLEGLVNSTELNGKFLFMEGADVLYYSRGTAKYWWTNTYLSNRGKLSDNLKYGVSAITKITAVTPRTKIVYYRLPNLDFGNGPANNGVIRVLNNTRFIMQGGSISNRPLKDVSKSPVIISLNYCAAFKAYDFFDPYPAFAVDSNNSLVYSYTLNFNDIADAVFENFNSQGYGWGVVGGQRSTNITYRDCNLNRVDMHNPYMGYLKVLDTRLGTWGINASGMGDMYLERVTVDLDDSAHGGHREHEGIINARGDFGGFHDGGLYIKDLTIVGEASAFEATSGHPVALVSAYSFNASLAYIPESSPVTPWGFKEVIVEGLHCPFKRTGRRFNSIISAPSIQFTVYHPMRVKLEDCNFNSTAFEKFDLRGWRVTPYNPSKVGIANTLAFRPTNFVDVKDCSMVGLEFTRPTSAYDYSNFDVNLVNVKNVEEHSLSPFTLYTNQCGRYNLVGCGLQQIVDKSMTSGERANRRSTFSVTGGTWNSLSGNPTDITYGNGYDIPVVATGVMFVGPYSQTEVTGANLNVAEFVQASGCKFLSSGPTYIQPLLWSGAGGPTGASANFNVARGNTLGLNISAVNGETSQVIAATLVIPQGFSTGPAAGTTYGFAVEKNINYQLGLNARSLKANVGLVRCSDTITGVYLNA(SEQ ID NO:1)

Dpo41的DNA序列为：

ATGGACCAAGATACTAAAACAATCATCCAATACCCCACCAGTGGTGACGAATATGATATCCCCTTTGACTACCTGTCGCGTAAGTTTGTCCGTGTGTCTCTCGTATCGAATACCCAGCGCGTCTTACTGGATAACATCACAGATTACCGTTACGTCTCCAGAACGCGCGTCAAGCTGCTTGTAAGTACCGATGGGTATAGCCGTGTAGAGATTCGACGCTTCACCTCTGCGTCCGAGATGGTCGTGGACTTCAGCGATGGGTCCGTTCTCCGCGCGACCGACCTTAACGTGTCCGCTCTACAGTCTGCACACATCGCAGAGGAGGCTCGTGACTTATTCAGCACATCCCTGAGCATTGGCCAACTTAGCTACTTTGACGCTAAAGGCTTGCAGATAAAGAATGTAGCAGCAGGTGTTGACAATACCGATGCAGTAACCGTTCAGCAGCTCAACAAGATAATCGCTGACGTCGTGACCACCATCCCTGACAGTGTGGCAGATAACATCCGGGGCCTTTGGGCGCGAGTTTTAGGTGACATCGGAATCACGCTTGTTGACGGTAGCTTCGAGACTGGTGCAACCATTACTACCAGAACTCAAGCACTGTGGTCCATAAGTGGCCGTAAGTGCTATACATGGGCTGGTGCTCTGCCTAAGGTTGTCCCAGAGAACTCTACCCCAGAGTCTACAGGCGGTATTTCCGAAACGGCGTGGGTGGATAGTTCCTCCAAGGCCCTCGGTGTACTTTTGGCTGGACCATCTGGAGCTGAGCGCGTCGGTCTCAAGCAGGGCGGTACCGTTCAGGACGCCATTAATTGGTTGACGTTCGACTCCTTCGACATCGTAAAGGATGGTTCAAAAGATGTCACGGCAGATATTATGGCAGCCTGCGTTGTAGCCAACGACCTCGGGCTGGACATTAAGCAGAACGATGGGACATACCTAGTGTCTGGGAACCCTGTGTGGCCTGTGTACAACTCTCTTGACCTCAACGGTGTGACGCTGAAGTTGGCTGCCGGTTTCACTGGGTACTTCGCCCTGACCCAGAAAGACTCCACAACGGTTTACGGACCAACCAGTCCTATCGTTCAGGCCATCAATGCGGCTGGTGGGCGAACCGCTGGTTCAGGGGTTTTGGAAGGTCTGGTGAACTCTACCGAGCTGAATGGGAAGTTCCTGTTCATGGAGGGGGCCGATGTGCTTTACTACTCCCGAGGAACCGCGAAGTATTGGTGGACGAACACCTACCTGTCAAACCGTGGGAAACTGAGCGACAACCTTAAGTATGGTGTGTCGGCTATCACGAAGATAACTGCGGTTACCCCGCGAACGAAGATTGTCTACTACCGTCTACCAAATCTGGACTTTGGTAACGGCCCTGCAAACAACGGTGTGATTCGCGTACTGAACAACACCCGGTTCATTATGCAAGGCGGCTCAATCTCCAACCGTCCACTTAAGGATGTGTCAAAGAGTCCGGTCATAATCAGCCTCAACTACTGTGCAGCCTTCAAGGCGTACGACTTCTTCGACCCCTATCCGGCCTTTGCGGTGGATTCCAATAACTCACTCGTCTACTCCTACACCCTGAACTTCAACGACATCGCTGACGCTGTGTTTGAGAACTTCAACTCTCAGGGATATGGTTGGGGTGTGGTTGGCGGACAGCGCTCTACCAACATAACCTATCGTGACTGTAACCTTAACAGGGTGGATATGCACAACCCTTACATGGGGTACCTGAAGGTTCTGGACACCCGCTTGGGTACTTGGGGTATCAATGCTTCAGGCATGGGTGATATGTACTTGGAGCGCGTCACGGTCGATTTGGACGATTCGGCACATGGCGGCCACCGAGAGCACGAGGGCATCATTAACGCTCGTGGTGACTTTGGCGGGTTCCATGATGGTGGTCTGTACATTAAGGACCTGACAATCGTCGGCGAGGCTTCCGCATTCGAGGCAACATCTGGACACCCAGTGGCGCTGGTCTCTGCGTACTCCTTCAACGCATCCCTTGCGTATATCCCCGAGTCCTCTCCGGTTACGCCGTGGGGCTTCAAGGAGGTAATCGTTGAGGGACTGCACTGCCCGTTCAAGCGGACTGGTCGTCGGTTCAACTCTATCATCTCCGCCCCAAGTATTCAGTTCACTGTGTATCACCCGATGCGGGTTAAACTGGAGGACTGTAACTTCAACTCTACGGCGTTCGAGAAGTTCGACCTGAGGGGCTGGAGGGTTACTCCGTACAACCCCTCGAAGGTTGGTATCGCGAACACTCTGGCATTCCGTCCTACGAACTTTGTTGATGTGAAGGACTGCTCGATGGTTGGCCTTGAGTTCACCCGACCGACTAGTGCATACGACTACTCTAACTTTGACGTAAACCTCGTTAACGTTAAGAATGTAGAGGAACACTCCCTGTCGCCGTTCACTCTGTACACTAACCAGTGTGGTCGTTATAACTTGGTTGGGTGCGGTCTGCAACAGATTGTGGACAAGTCGATGACCTCGGGTGAGCGCGCAAACCGTCGGAGCACGTTCTCGGTGACTGGCGGTACTTGGAACTCACTTTCCGGTAACCCTACGGATATAACCTACGGTAACGGCTACGACATCCCTGTGGTGGCGACTGGTGTTATGTTCGTTGGTCCGTACTCCCAGACTGAAGTGACAGGCGCAAACTTGAACGTTGCAGAGTTTGTTCAGGCATCCGGCTGCAAGTTCCTCAGTTCCGGCCCGACCTACATCCAGCCGTTACTCTGGAGTGGTGCAGGTGGTCCAACTGGAGCGAGTGCTAACTTCAACGTGGCACGCGGGAACACTCTGGGCCTGAACATCTCTGCGGTGAACGGTGAGACGTCTCAGGTTATCGCGGCGACTCTGGTGATTCCGCAAGGGTTCTCAACTGGACCGGCTGCTGGTACAACCTACGGGTTCGCCGTGGAAAAGAACATCAACTACCAATTAGGGCTTAACGCCCGCAGCCTGAAGGCGAACGTTGGTTTAGTGCGTTGTAGTGATACCATAACCGGGGTGTACCTGAACGCATAA(SEQ ID NO:2)

2.5解聚酶的克隆和表达

实验中观察到被半透明晕圈包围的清晰噬菌斑，表明噬菌体SH-KP152410具有多糖解聚酶活性。噬菌体解聚酶常存在于尾丝蛋白或尾尖蛋白中，可在感染过程中将细菌荚膜多糖降解为低聚糖。因此，我们试图在体外分离纯化该噬菌体解聚酶。根据基因组分析，推测的尾纤维蛋白ORF41可能是候选基因。该基因(长度3,054bp)位于噬菌体基因组的核苷酸33513到36566之间。ORF41基因产物的Blast结果显示，其N-末端区域与T7样噬菌体的N-末端序列一致，起到于噬菌体基底部位相连的作用。虽然用BlastP对比，没有在中心区域和C端区域发现明显的序列相似性；但利用HHpred的一致序列比较方法在蛋白数据库(PDB)中鉴定出一个中等相似的同源物。这个来自phiAB6 tailspike的同源蛋白在结构上与我们预测的蛋白相似，并且含有β-螺旋结构的果胶裂解酶区域(图4)，据报道，phiAB6 tailspike是不动杆菌的解聚酶。综上所述，所有信息表明ORF41基因的产物可能对应于噬菌体SH-KP152410中的一种多糖解聚酶。

我们将ORF41克隆到pSUMO3表达载体中。将得到的K64-ORF41-pSUMO3质粒转入大肠杆菌BL21细胞，表达并纯化重组含有his标记ORF41蛋白。我们将ORF41克隆到pSUMO3表达载体中。将得到的K64-ORF41-pSUMO3质粒转入大肠杆菌BL21细胞，表达并纯化重组his标记ORF41蛋白。纯化后的重组蛋白Dpo41大小为127kDa，如图3所示。SUMO蛋白酶将SUMO-Dpo41蛋白酶切，通过Ni-NTA柱去除SUMO标记。最后，经SDS-PAGE凝胶分析，纯化后的Dpo41(约110kDa)纯度在90％以上。(图5)。

2.6解聚酶活性的验证

为确认ORF41基因产物具有多糖解聚酶活性，将纯化后的重组蛋白，稀释到不同的浓度(0.5ug/ml～5mg/ml)，分别点滴到到铺有Kp2410的双层琼脂平板上培养过夜，可以观察到有透明晕圈的产生(图6)。此外，我们将Dpo41与针对K47型菌株有特异性解聚活性的Dpo42、Dpo43同时对不同的K64型菌株进行了点滴实验，通过解聚酶的宿主点滴实验显示，多糖解聚酶Dpo41对肺炎克雷伯菌的识别谱与其噬菌体的宿主谱完全一致，且具有较好的对K64型菌株的特异性(表1)。

随后，我们从肺炎克雷伯菌2410菌株中提取纯化了胞外多糖，来进一步验证其酶活性。从SEC-HPLC中可以看出，未处理EPS样品出现了一个单峰，时间为11～13min。与Dpo41(10μg/mL)在37℃孵育30min后，11～13min高分子的多糖峰消失，说明Dpo41降解了纯化得到的胞外多糖。在对照中，SUMO无降解能力(图7)。这些结果表明，Dpo41可以降解肺炎克雷伯菌2410菌株的EPS。

2.7解聚酶活性的表征

多糖解聚酶可以将荚膜多糖降解成还原糖，通过DNS法测定还原糖的生成量，进一步研究了多糖解聚酶Dpo41在不同pH和温度下的最佳酶活性。培养0.5h后，在pH 6.0、25℃条件下观察到最适酶活，相对酶活性以最佳酶活的百分比表示(图8)。从图8A可以看出，解聚酶Dpo41在pH 6.0～7.0之间保持较高的活性，相对活性分别为85.4±0.50～100.5±0.38％。从图8B可以看出，该酶在25～80℃保持较高的活性，相对活性分别为100.0±0.51～60.5±0.56％。温度达到80℃后，酶活性开始逐渐下降。图8C解聚酶Dpo41在不同pH条件下放置30min后酶的剩余活力如图所示，当pH＝5.0～9.0时，该酶仍具有较高的活性，说明其pH稳定性范围较广，图8D显示在25～70℃预孵育30min,该酶能保留绝大部分的酶活性；当温度高于70℃，该酶的活性明显降低，说明其温度稳定性的范围较广。这些数据表明，在不同条件下，Dpo41仍具有稳定的酶活性。

2.8酶处理细菌的血清敏感性检测

测定K64型菌株Kp2410经多糖解聚酶Dpo41孵育后的血清杀伤效果。为了确定Dpo41是否能够通过降解细菌表面的荚膜多糖促进细菌对血清的敏感性，我们通过血清杀伤实验分析了经酶处理后菌的存活率(图9)。结果表明，用Dpo41酶处理后的Kp2410与未处理的细菌相比，血清杀伤后存活率明显降低。因此，解聚酶可以提高细菌对血清杀灭的敏感性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 上海瑞宙生物科技有限公司

<120> 具有降解K64荚膜型肺炎克雷伯菌胞外聚合物的能力的解聚酶

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1017

<212> PRT

<213> Klebsiella pneumoniae bacteriophage

<400> 1

Met Asp Gln Asp Thr Lys Thr Ile Ile Gln Tyr Pro Thr Ser Gly Asp

1 5 10 15

Glu Tyr Asp Ile Pro Phe Asp Tyr Leu Ser Arg Lys Phe Val Arg Val

20 25 30

Ser Leu Val Ser Asn Thr Gln Arg Val Leu Leu Asp Asn Ile Thr Asp

35 40 45

Tyr Arg Tyr Val Ser Arg Thr Arg Val Lys Leu Leu Val Ser Thr Asp

50 55 60

Gly Tyr Ser Arg Val Glu Ile Arg Arg Phe Thr Ser Ala Ser Glu Met

65 70 75 80

Val Val Asp Phe Ser Asp Gly Ser Val Leu Arg Ala Thr Asp Leu Asn

85 90 95

Val Ser Ala Leu Gln Ser Ala His Ile Ala Glu Glu Ala Arg Asp Leu

100 105 110

Phe Ser Thr Ser Leu Ser Ile Gly Gln Leu Ser Tyr Phe Asp Ala Lys

115 120 125

Gly Leu Gln Ile Lys Asn Val Ala Ala Gly Val Asp Asn Thr Asp Ala

130 135 140

Val Thr Val Gln Gln Leu Asn Lys Ile Ile Ala Asp Val Val Thr Thr

145 150 155 160

Ile Pro Asp Ser Val Ala Asp Asn Ile Arg Gly Leu Trp Ala Arg Val

165 170 175

Leu Gly Asp Ile Gly Ile Thr Leu Val Asp Gly Ser Phe Glu Thr Gly

180 185 190

Ala Thr Ile Thr Thr Arg Thr Gln Ala Leu Trp Ser Ile Ser Gly Arg

195 200 205

Lys Cys Tyr Thr Trp Ala Gly Ala Leu Pro Lys Val Val Pro Glu Asn

210 215 220

Ser Thr Pro Glu Ser Thr Gly Gly Ile Ser Glu Thr Ala Trp Val Asp

225 230 235 240

Ser Ser Ser Lys Ala Leu Gly Val Leu Leu Ala Gly Pro Ser Gly Ala

245 250 255

Glu Arg Val Gly Leu Lys Gln Gly Gly Thr Val Gln Asp Ala Ile Asn

260 265 270

Trp Leu Thr Phe Asp Ser Phe Asp Ile Val Lys Asp Gly Ser Lys Asp

275 280 285

Val Thr Ala Asp Ile Met Ala Ala Cys Val Val Ala Asn Asp Leu Gly

290 295 300

Leu Asp Ile Lys Gln Asn Asp Gly Thr Tyr Leu Val Ser Gly Asn Pro

305 310 315 320

Val Trp Pro Val Tyr Asn Ser Leu Asp Leu Asn Gly Val Thr Leu Lys

325 330 335

Leu Ala Ala Gly Phe Thr Gly Tyr Phe Ala Leu Thr Gln Lys Asp Ser

340 345 350

Thr Thr Val Tyr Gly Pro Thr Ser Pro Ile Val Gln Ala Ile Asn Ala

355 360 365

Ala Gly Gly Arg Thr Ala Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Leu Val Asn

370 375 380

Ser Thr Glu Leu Asn Gly Lys Phe Leu Phe Met Glu Gly Ala Asp Val

385 390 395 400

Leu Tyr Tyr Ser Arg Gly Thr Ala Lys Tyr Trp Trp Thr Asn Thr Tyr

405 410 415

Leu Ser Asn Arg Gly Lys Leu Ser Asp Asn Leu Lys Tyr Gly Val Ser

420 425 430

Ala Ile Thr Lys Ile Thr Ala Val Thr Pro Arg Thr Lys Ile Val Tyr

435 440 445

Tyr Arg Leu Pro Asn Leu Asp Phe Gly Asn Gly Pro Ala Asn Asn Gly

450 455 460

Val Ile Arg Val Leu Asn Asn Thr Arg Phe Ile Met Gln Gly Gly Ser

465 470 475 480

Ile Ser Asn Arg Pro Leu Lys Asp Val Ser Lys Ser Pro Val Ile Ile

485 490 495

Ser Leu Asn Tyr Cys Ala Ala Phe Lys Ala Tyr Asp Phe Phe Asp Pro

500 505 510

Tyr Pro Ala Phe Ala Val Asp Ser Asn Asn Ser Leu Val Tyr Ser Tyr

515 520 525

Thr Leu Asn Phe Asn Asp Ile Ala Asp Ala Val Phe Glu Asn Phe Asn

530 535 540

Ser Gln Gly Tyr Gly Trp Gly Val Val Gly Gly Gln Arg Ser Thr Asn

545 550 555 560

Ile Thr Tyr Arg Asp Cys Asn Leu Asn Arg Val Asp Met His Asn Pro

565 570 575

Tyr Met Gly Tyr Leu Lys Val Leu Asp Thr Arg Leu Gly Thr Trp Gly

580 585 590

Ile Asn Ala Ser Gly Met Gly Asp Met Tyr Leu Glu Arg Val Thr Val

595 600 605

Asp Leu Asp Asp Ser Ala His Gly Gly His Arg Glu His Glu Gly Ile

610 615 620

Ile Asn Ala Arg Gly Asp Phe Gly Gly Phe His Asp Gly Gly Leu Tyr

625 630 635 640

Ile Lys Asp Leu Thr Ile Val Gly Glu Ala Ser Ala Phe Glu Ala Thr

645 650 655

Ser Gly His Pro Val Ala Leu Val Ser Ala Tyr Ser Phe Asn Ala Ser

660 665 670

Leu Ala Tyr Ile Pro Glu Ser Ser Pro Val Thr Pro Trp Gly Phe Lys

675 680 685

Glu Val Ile Val Glu Gly Leu His Cys Pro Phe Lys Arg Thr Gly Arg

690 695 700

Arg Phe Asn Ser Ile Ile Ser Ala Pro Ser Ile Gln Phe Thr Val Tyr

705 710 715 720

His Pro Met Arg Val Lys Leu Glu Asp Cys Asn Phe Asn Ser Thr Ala

725 730 735

Phe Glu Lys Phe Asp Leu Arg Gly Trp Arg Val Thr Pro Tyr Asn Pro

740 745 750

Ser Lys Val Gly Ile Ala Asn Thr Leu Ala Phe Arg Pro Thr Asn Phe

755 760 765

Val Asp Val Lys Asp Cys Ser Met Val Gly Leu Glu Phe Thr Arg Pro

770 775 780

Thr Ser Ala Tyr Asp Tyr Ser Asn Phe Asp Val Asn Leu Val Asn Val

785 790 795 800

Lys Asn Val Glu Glu His Ser Leu Ser Pro Phe Thr Leu Tyr Thr Asn

805 810 815

Gln Cys Gly Arg Tyr Asn Leu Val Gly Cys Gly Leu Gln Gln Ile Val

820 825 830

Asp Lys Ser Met Thr Ser Gly Glu Arg Ala Asn Arg Arg Ser Thr Phe

835 840 845

Ser Val Thr Gly Gly Thr Trp Asn Ser Leu Ser Gly Asn Pro Thr Asp

850 855 860

Ile Thr Tyr Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Pro Val Val Ala Thr Gly Val

865 870 875 880

Met Phe Val Gly Pro Tyr Ser Gln Thr Glu Val Thr Gly Ala Asn Leu

885 890 895

Asn Val Ala Glu Phe Val Gln Ala Ser Gly Cys Lys Phe Leu Ser Ser

900 905 910

Gly Pro Thr Tyr Ile Gln Pro Leu Leu Trp Ser Gly Ala Gly Gly Pro

915 920 925

Thr Gly Ala Ser Ala Asn Phe Asn Val Ala Arg Gly Asn Thr Leu Gly

930 935 940

Leu Asn Ile Ser Ala Val Asn Gly Glu Thr Ser Gln Val Ile Ala Ala

945 950 955 960

Thr Leu Val Ile Pro Gln Gly Phe Ser Thr Gly Pro Ala Ala Gly Thr

965 970 975

Thr Tyr Gly Phe Ala Val Glu Lys Asn Ile Asn Tyr Gln Leu Gly Leu

980 985 990

Asn Ala Arg Ser Leu Lys Ala Asn Val Gly Leu Val Arg Cys Ser Asp

995 1000 1005

Thr Ile Thr Gly Val Tyr Leu Asn Ala

1010 1015

<210> 2

<211> 3054

<212> DNA

<213> Klebsiella pneumoniae bacteriophage

<400> 2

atggaccaag atactaaaac aatcatccaa taccccacca gtggtgacga atatgatatc 60

ccctttgact acctgtcgcg taagtttgtc cgtgtgtctc tcgtatcgaa tacccagcgc 120

gtcttactgg ataacatcac agattaccgt tacgtctcca gaacgcgcgt caagctgctt 180

gtaagtaccg atgggtatag ccgtgtagag attcgacgct tcacctctgc gtccgagatg 240

gtcgtggact tcagcgatgg gtccgttctc cgcgcgaccg accttaacgt gtccgctcta 300

cagtctgcac acatcgcaga ggaggctcgt gacttattca gcacatccct gagcattggc 360

caacttagct actttgacgc taaaggcttg cagataaaga atgtagcagc aggtgttgac 420

aataccgatg cagtaaccgt tcagcagctc aacaagataa tcgctgacgt cgtgaccacc 480

atccctgaca gtgtggcaga taacatccgg ggcctttggg cgcgagtttt aggtgacatc 540

ggaatcacgc ttgttgacgg tagcttcgag actggtgcaa ccattactac cagaactcaa 600

gcactgtggt ccataagtgg ccgtaagtgc tatacatggg ctggtgctct gcctaaggtt 660

gtcccagaga actctacccc agagtctaca ggcggtattt ccgaaacggc gtgggtggat 720

agttcctcca aggccctcgg tgtacttttg gctggaccat ctggagctga gcgcgtcggt 780

ctcaagcagg gcggtaccgt tcaggacgcc attaattggt tgacgttcga ctccttcgac 840

atcgtaaagg atggttcaaa agatgtcacg gcagatatta tggcagcctg cgttgtagcc 900

aacgacctcg ggctggacat taagcagaac gatgggacat acctagtgtc tgggaaccct 960

gtgtggcctg tgtacaactc tcttgacctc aacggtgtga cgctgaagtt ggctgccggt 1020

ttcactgggt acttcgccct gacccagaaa gactccacaa cggtttacgg accaaccagt 1080

cctatcgttc aggccatcaa tgcggctggt gggcgaaccg ctggttcagg ggttttggaa 1140

ggtctggtga actctaccga gctgaatggg aagttcctgt tcatggaggg ggccgatgtg 1200

ctttactact cccgaggaac cgcgaagtat tggtggacga acacctacct gtcaaaccgt 1260

gggaaactga gcgacaacct taagtatggt gtgtcggcta tcacgaagat aactgcggtt 1320

accccgcgaa cgaagattgt ctactaccgt ctaccaaatc tggactttgg taacggccct 1380

gcaaacaacg gtgtgattcg cgtactgaac aacacccggt tcattatgca aggcggctca 1440

atctccaacc gtccacttaa ggatgtgtca aagagtccgg tcataatcag cctcaactac 1500

tgtgcagcct tcaaggcgta cgacttcttc gacccctatc cggcctttgc ggtggattcc 1560

aataactcac tcgtctactc ctacaccctg aacttcaacg acatcgctga cgctgtgttt 1620

gagaacttca actctcaggg atatggttgg ggtgtggttg gcggacagcg ctctaccaac 1680

ataacctatc gtgactgtaa ccttaacagg gtggatatgc acaaccctta catggggtac 1740

ctgaaggttc tggacacccg cttgggtact tggggtatca atgcttcagg catgggtgat 1800

atgtacttgg agcgcgtcac ggtcgatttg gacgattcgg cacatggcgg ccaccgagag 1860

cacgagggca tcattaacgc tcgtggtgac tttggcgggt tccatgatgg tggtctgtac 1920

attaaggacc tgacaatcgt cggcgaggct tccgcattcg aggcaacatc tggacaccca 1980

gtggcgctgg tctctgcgta ctccttcaac gcatcccttg cgtatatccc cgagtcctct 2040

ccggttacgc cgtggggctt caaggaggta atcgttgagg gactgcactg cccgttcaag 2100

cggactggtc gtcggttcaa ctctatcatc tccgccccaa gtattcagtt cactgtgtat 2160

cacccgatgc gggttaaact ggaggactgt aacttcaact ctacggcgtt cgagaagttc 2220

gacctgaggg gctggagggt tactccgtac aacccctcga aggttggtat cgcgaacact 2280

ctggcattcc gtcctacgaa ctttgttgat gtgaaggact gctcgatggt tggccttgag 2340

ttcacccgac cgactagtgc atacgactac tctaactttg acgtaaacct cgttaacgtt 2400

aagaatgtag aggaacactc cctgtcgccg ttcactctgt acactaacca gtgtggtcgt 2460

tataacttgg ttgggtgcgg tctgcaacag attgtggaca agtcgatgac ctcgggtgag 2520

cgcgcaaacc gtcggagcac gttctcggtg actggcggta cttggaactc actttccggt 2580

aaccctacgg atataaccta cggtaacggc tacgacatcc ctgtggtggc gactggtgtt 2640

atgttcgttg gtccgtactc ccagactgaa gtgacaggcg caaacttgaa cgttgcagag 2700

tttgttcagg catccggctg caagttcctc agttccggcc cgacctacat ccagccgtta 2760

ctctggagtg gtgcaggtgg tccaactgga gcgagtgcta acttcaacgt ggcacgcggg 2820

aacactctgg gcctgaacat ctctgcggtg aacggtgaga cgtctcaggt tatcgcggcg 2880

actctggtga ttccgcaagg gttctcaact ggaccggctg ctggtacaac ctacgggttc 2940

gccgtggaaa agaacatcaa ctaccaatta gggcttaacg cccgcagcct gaaggcgaac 3000

gttggtttag tgcgttgtag tgataccata accggggtgt acctgaacgc ataa 3054

Claims

1.序列如SEQ ID NO:1所示，且具有降解K64荚膜型肺炎克雷伯菌胞外聚合物活性的酶在制备降解K64荚膜型肺炎克雷伯菌胞外聚合物的药物组合物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，所述药物组合物包括：

i)所述的酶；以及

3.根据权利要求2所述的应用，所述药物组合物还包括对肺炎克雷伯菌胞具有杀伤或抑制作用的抗生素类药物。