CN116463365A - CasФ编码基因、紧凑型植物基因组定向修饰***及植物基因组表观编辑*** - Google Patents
CasФ编码基因、紧凑型植物基因组定向修饰***及植物基因组表观编辑*** Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因工程领域，具体涉及新的CasФ编码基因、紧凑型植物基因组定向修饰***及植物基因组表观编辑***。本发明要解决的技术问题是构建适用于植物的紧凑型CRISPR‑CasФ植物基因组定向编辑***，使其能在植物中实现基因组定向修饰。本发明的技术方案是一种新的CasФ核酸酶的编码基因，以及基于该基因构建的植物基因组定向修饰***。基于紧凑型CasФ的基因定向修饰工具可以针对植物进行简单、快捷、高效的基因组定向敲除编辑、基因定向激活和定向表观编辑，在植物基因组敲除编辑和调控方面，尤其是表观编辑调控方面，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及新的CasФ编码基因、紧凑型植物基因组定向修饰***及植物基因组表观编辑***。
背景技术
基因组定向编辑技术是生物学研究的前沿与热点领域，通过对基因组特定区域进行缺失、置换、敲入或核苷酸修正等方式来实现基因组精确定向编辑。2012年报道的CRISPR-Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR-associated 9)***，因其设计操纵简便、编辑高效与通用性广等优势而被广泛应用于动、植物及微生物基因功能解析、新种质创制及遗传改良中。继CRISPR-Cas9(PAM：5’-NGG-3’)***之后，研究者发展了新的V-A型CRISPR-Cas***，CRISPR-Cas12a(PAM：5’-TTTV-3’)。然而，现有CRISPR-Cas9、Cas12a核酸酶尺寸较大(>1000Aa)，使它们面临递送困难、PAM识别有限的问题。因此，进一步开发识别多样化PAM、尺寸较小的紧凑型Cas核酸酶基因组编辑***，可以有效提升编辑工具递送效率，进而扩宽植物基因组编辑工具应用范围，。
最近，研究者报道了一种存在于巨大噬菌体中的V-J型紧凑型CRISPR-CasФ核酸酶***(Pausch etal.,2020)。该CRISPR-CasФ***包含一个约700氨基酸编码的核酸酶蛋白和一个CRISPR阵列，可以实现单crRNA(CRISPR RNA)引导的DNA切割。CRISPR-CasФ分子量只有Cas9和Cas12a基因组编辑酶的一半，为基因组编辑工具递送提供了优势。然而，目前CRISPR-CasФ仅显示了在哺乳动物细胞中的编辑活性，而在植物中尚未实现有效的基因组编辑工具开发(拟南芥原生质体中仅在一个位点检测到0.85％的编辑数据)，编辑活性低。因此，CRISPR-CasФ***在植物基因组编辑中的应用前景仍不明朗。
由于Cas9、Cas12a的蛋白尺寸较大大、递送困难，很大程度上限制了基于此的植物基因组编辑工具应用范围。因此，开发新的紧凑型植物基因组CRISPR-Cas编辑***具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是构建适用于植物的紧凑型CRISPR-CasФ植物基因组定向编辑***，使其能在植物中实现基因组定向修饰。
本发明首先提供了一种编码CasФ核酸酶的编码基因。其编码氨基酸序列如SeqID No.12(nCasФ)所述的CasФ核酸酶。
其中，上述的CasФ核酸酶编码基因的核苷酸序列如Seq ID No.07所示。
在使用中，上述的CasФ核酸酶编码基因可以与转录激活元件的编码基因相连接。两者组合得到的元件可用于构建定向转录激活的CRISPR-CasФ***的构建。
进一步的，所述的转录激活元件为TAL-VP128、VP64、2xTAD、2xTAD-VP64或VPR等转录激活结构域中的至少一种。
此外，上述的CasФ核酸酶编码基因还可以与甲基转移酶编码基因相连接。两者组合得到的元件可用于构建定向转录激活的CRISPR-CasФ***。
其中，上述的所述甲基转移酶编码基因为Dnmt3A-Dnmt3L、Dnmt3A-Dnmt3L-KRAB或KRAB-Dnmt3A-Dnmt3L等甲基转移酶(或其甲基化转移酶活性结构域)的编码基因中的至少一种。
进一步的，上述的编码基因中，与转录激活元件或者甲基转移酶编码基因的连接通过链接序列进行。其中，上述的链接序列为XTEN80、XTEN-3xFLAG、SGGSSGGS-XTEN-SGGSSGGS(SGGSSGGS，Seq ID No.47)或6xGGGGS(GGGGS，Seq ID No.48)中的至少一种。
本发明还提供了一种CasФ核酸酶蛋白表达单元。此CasФ核酸酶蛋白表达单元其从5’到3’方向依次为：启动子-CasФ核酸酶编码基因-终止子。所述的CasФ核酸酶编码基因编码氨基酸序列如Seq ID No.12(nCasФ)的CasФ核酸酶。所述的CasФ核酸酶的编码核苷酸序列如Seq ID No.07所示。
或者，为了转录激活的目的，该CasФ核酸酶蛋白表达单元具有如下结构，启动子-CasФ核酸酶编码基因-转录激活元件-终止子，或者为启动子-转录激活元件-CasФ核酸酶编码基因-终止子。所述的转录激活元件可以为1个，也可以为多个相同的转录激活元件的组合，或者多个不同的转录激活元件的组合。进一步的所述的多个为2、3、4、5、6、7、8、9或10个。根据具体情况，可以位于CasФ核酸酶编码基因的上游、下游或者两侧。
或者，为了表观编辑的目的时，该CasФ核酸酶蛋白表达单元具有如下结构：启动子-CasФ核酸酶编码基因-甲基转移酶编码基因-终止子，或者为启动子-甲基转移酶编码基因-CasФ核酸酶编码基因-终止子。所述的甲基转移酶编码基因可以为1个，也可以为多个相同的甲基转移酶编码基因的组合，或者多个不同的甲基转移酶编码基因的组合。进一步的所述的多个为2、3、4、5、6、7、8、9或10个。根据具体情况，可以位于CasФ核酸酶编码基因的上游、下游或者两侧。一般来说，甲基转移酶编码基因需要与CasФ核酸酶编码基因融合表达，得到CasФ核酸酶-甲基转移酶融合蛋白以更好地发挥作用。
其中，上述的CasФ核酸酶蛋白表达单元中所述的启动子为Pol II型启动子。
其中，上述的CasФ核酸酶蛋白表达单元中所述的Pol II型启动子为ZmUbi1、OsUbi1、CaMV35S或AtUb10等中的至少一种。
其中，上述的CasФ核酸酶蛋白表达单元中所述的终止子为Nos T、35s T、HSP T或pinIIT等中的至少一种。
进一步的，上述的CasФ核酸酶蛋白表达单元从5’到3’方向依次为启动子-NLS-CasФ-NLS-终止子。
更进一步的，上述的CasФ核酸酶蛋白表达单元从5’到3’方向依次为ZmUbi1-NLS-CasФ-NLS-AtHSP T。其中，该CasФ核酸酶蛋白表达单元的核苷酸序列为Seq ID No.02+Seq ID No.16+Seq ID No.03。
上述的CasФ核酸酶蛋白表达单元中可以加入转录激活元件
其中，为了转录激活的目的，上述的CasФ核酸酶蛋白表达单元从5’到3’方向依次为启动子-NLS-CasФ-NLS-转录激活元件编码基因-终止子，或启动子-转录激活元件-NLS-CasФ-NLS-终止子。
进一步的，上述CasФ核酸酶蛋白表达单元，从5’到3’方向依次为ZmUbi1-NLS-CasФ-NLS-6TAL-VP128-AtHSP T(其核苷酸序列为Seq ID No.02+Seq ID No.16+Seq IDNo.09+Seq ID No.03)，或ZmUbi1-6TAL-VP128-NLS-CasФ-NLS-AtHSP T(其核苷酸序列为Seq IDNo.02+Seq ID No.09+Seq ID No.16+Seq ID No.03)。
进一步的，上述CasФ核酸酶蛋白表达单元，从5’到3’方向依次为启动子-KRAB-NLS-CasФ-NLS-链接序列-甲基转移酶编码基因-终止子，或启动子-甲基转移酶编码基因-链接序列-NLS-CasФ-KRAB-NLS-终止子。
进一步的，上述的CasФ核酸酶蛋白表达单元，从5’到3’方向依次为ZmUbi1-KRAB-NLS-CasФ-NLS-XTEN-Dnmt3A-Dnmt3L-AtHSP T(核苷酸序列为Seq ID No.02+Seq IDNo.14+Seq ID No.16+Seq ID No.15+Seq ID No.10+Seq ID No.03)，或ZmUbi1-Dnmt3A-Dnmt3L-XTEN-NLS-CasФ-NLS-KRAB-AtHSP T(核苷酸序列为Seq ID No.02+Seq ID No.10+Seq ID No.15
+Seq ID No.16+Seq ID No.14+Seq ID No.03)。
基于上述的CasФ核酸酶蛋白表达单元，本发明还提供了CRISPR-CasФ植物基因组定向修饰功能单元。其包括CasФ核酸酶蛋白表达单元和crRNA转录表达克隆单元两个结构单元；所述的CasФ核酸酶蛋白表达单元采用上述的各种CasФ核酸酶蛋白表达单元。当其采用上述的不同功能的CasФ核酸酶蛋白表达单元时，即可用于不同的定向修饰目的。比如，基因组编辑、转录激活以及表观编辑。
其中，上述CRISPR-CasФ植物基因组定向修饰功能单元中所述的crRNA转录表达克隆单元从5’到3’方向依次为：启动子-核酶A编码序列-crRNA克隆单元的编码序列-核酶B编码区序列-终止子。
其中，上述CRISPR-CasФ植物基因组定向修饰功能单元中所述的crRNA转录表达克隆单元的启动子为Pol II型启动子。
其中，上述CRISPR-CasФ植物基因组定向修饰功能单元中所述的Pol II型启动子为ZmUbi1、OsUbi1、CaMV35S或AtUb10中的至少一种。
其中，上述CRISPR-CasФ植物基因组定向修饰功能单元中所述的的终止子为NosT、35sT或HSP T中的至少一种。
其中，上述CRISPR-CasФ植物基因组定向修饰功能单元中所述的核酶A为I类内含子核酶、RNaseP、发夹状核酶、VS核酶、HH核酶或HDV核酶中的至少一种。所述的核酶B也可为I类内含子核酶、RNaseP、发夹状核酶、VS核酶、HH核酶或HDV核酶中的至少一种。
其中，上述CRISPR-CasФ植物基因组定向修饰功能单元中所述的核酶A为HH核酶或HDV核酶。所述的核酶B为HDV核酶或HH核酶。
进一步的，上述CRISPR-CasФ植物基因组定向修饰功能单元中所述的crRNA转录表达克隆单元从5’到3’方向依次为OsUbi1-HH Ribozyme-crRNA scaffold-ccdB-HDVRibozyme-NOS T(核苷酸序列为Seq ID No.4+Seq ID No.5+Seq ID No.6)。
进一步的，上述所述的植物基因组定向修饰功能单元中，crRNA转录表达克隆单元可位于CRISPR-CasФ核酸酶表达单元的上游，也可位于其下游。
比如从5’到3’方向依次可为：CRISPR-CasФ核酸酶表达单元-crRNA转录表达克隆单元；或者为：crRNA转录表达克隆单元-CRISPR-CasФ核酸酶表达单元。
同时，本发明也提供了一种载体。该载体含有上述的CasФ核酸酶编码基因、上述的述的CasФ核酸酶蛋白表达单元或上述的CRISPR-CasФ植物基因组定向修饰功能单元中的至少一种。
其中，上述的载体为植物转基因骨架载体。
其中，上述的植物转基因骨架载体为pCambia系列、pBI系列、pMDC系列或pGreen系列中的至少一种。
其中，上述的植物转基因骨架载体pTrans_210d。
本发明还提供了上述的CasФ核酸酶编码基因、CasФ核酸酶蛋白表达单元、CRISPR-CasФ植物基因组定向修饰功能单元或上述的载体在进行植物基因组定向修饰中的用途。
上述的植物基因组定向修饰为基因组定向编辑、基因定向激活或基因组表观编辑中的至少一种。本领域技术人员在实现不同的定向修饰目的时，可以在上述的CasФ核酸酶蛋白表达单元、CRISPR-CasФ植物基因组定向修饰功能单元或上述的载体中进行选择。
其中，上述的植物为单子叶植物或双子叶植物。所述的单子叶植物为禾本科植物。本发明的一个实施例中使用了常见的禾本科植物水稻作为基因组定向修饰的对象。
针对不同的基因组定向修饰目的，本发明也提供了相应的的CRISPR-CasФ重组表达载体的制备方法。
其中，针对目标位点的定向编辑的CRISPR-CasФ重组表达载体的制备方法包括如下步骤：
a、明确待修饰植物基因组的目标DNA区域，分析其中的具有CasФ核酸酶蛋白识别PAM位点特征区域，选择PAM结构3’端相邻的18～24bpDNA序列作为特异性修饰靶序列；所述的PAM位点特征5’-TBN-3’,B表示T、G、C中的任一种。
b、按照选定的特异性修饰靶序列，分别合成具有5’-GGAC-NX-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-GGCC-NX-3’特征的反向寡核苷酸链，N表示A、G、C、T中的任一种，X为整数，且18≤X≤24，其中所述正向寡核苷酸链中的NX和反向寡核苷酸中的NX具有反向互补特征；通过退火获得互补寡核苷酸双链片段；
c、将上述骨架载体与步骤b得到的互补寡核苷酸双链片段混合，进行基于BsaI的Golden Gate组装，得到针对目标位点进行特异性修饰的CRISPR-CasФ重组载体。
进一步的，上述方法中的步骤a中特异性靶序列长度为20bp。
其中，针对定向转录激活功能的CRISPR-CasФ重组表达载体的制备方法包括如下步骤：
a、针对待激活植物的目标基因的转录起始位点上游，分析其中的具有nCasФ核酸酶蛋白识别PAM位点特征区域，选择PAM结构3’端相邻的16bp DNA序列作为特异性修饰靶序列；所述的PAM位点特征5’-TTV-3’,V表示A、G、C中的任一种；
b、按照选定的特异性修饰靶序列，分别合成具有5’-GGAC-NX-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-GGCC-NX-3’特征的反向寡核苷酸链，N表示A、G、C、T中的任一种，X为整数，且X＝16，其中所述正向寡核苷酸链中的NX和反向寡核苷酸中的NX具有反向互补特征，通过退火获得互补寡核苷酸双链片段；
c、将用于定向转录激活功能的含有转录激活元件编码基因的CRISPR-CasФ骨架载体与步骤b得到的片段混合，进行基于BsaI的Golden Gate组装，得到针对目标位点进行定向转录激活的CRISPR-CasФ重组载体。
其中，用于植物基因组定向表观编辑的CRISPR-CasФ载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
a、针对待表观编辑的植物的目标基因区域，分析其中的具有nCasФ核酸酶蛋白识别PAM位点特征区域，选择PAM结构3’端相邻的DNA序列作为特异性修饰靶序列；所述的PAM位点特征5’-TTV-3’,V表示A、G、C中的任一种；
b、单crRNA位点编辑载体按照选定的特异性修饰靶序列，分别合成具有5’-GGAC-NX-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-GGCC-NX-3’特征的反向寡核苷酸链，N表示A、G、C、T中的任一种，X为整数，且X＝16，其中所述正向寡核苷酸链中的NX和反向寡核苷酸中的NX具有反向互补特征，通过退火获得互补寡核苷酸双链片段；所述序列为BsaI识别位点-HHRibozyme-crRNA scaffold-crRNA-HDV Ribozyme-BsaI识别位点；
多crRNA位点编辑载体按照选定的多个特异性修饰靶序列，分别由核酶A和核酶B将靶向位点间隔开，并在序列5’和3’分别添加BsaI识别位点(GGTCTCC)后合成最终的核苷酸序列；如4个crRNA位点时，所述序列的结构可为BsaI识别位点-HH Ribozyme-crRNAscaffold-crRNA01-HDV Ribozyme-HH Ribozyme-crRNA scaffold-crRNA02-HDVRibozyme-HH Ribozyme-crRNA scaffold-crRNA03-HDV Ribozyme-HH Ribozyme-crRNAscaffold-crRNA04-HDV Ribozyme-BsaI识别位点；
c、将用于植物基因组定向表观编辑的含有甲基转移酶编码基因的CRISPR-CasФ骨架载体与步骤b得到的片段混合，进行基于BsaI的Golden Gate组装，得到针对目标位点进行特异性修饰的CRISPR-CasФ重组载体。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种V-J型CRISPR-CasФ***，区别于目前常用的Cas12a和Cas9 CRISPR工具，其蛋白更小(仅为前者的1/3-1/2)，有利于有效递送；空间结构更紧凑，有利于融合其他调控元件，进而实现多样化基因修饰的目的。此外，根据植物密码子偏好性对其基因序列进行了密码子优化，在植物细胞中对该蛋白PAM识别特异性和编辑特性分析，明确该CasФ能识别多样化的PAM(5’-TTV-3’)。由于CasФ区别于Cas9、CasФ，识别A/T富集PAM，更适合应用于编辑非编码区；同时，区别于Cas12a需要识别严格的TTTV PAM，能识别多样化TTV PAM的CasФ在基因修饰中适用的编辑范围更宽。进一步对CasФ关键氨基酸进行突变，得到了一种具有高效编辑活性的CasФ变体蛋白nCasФ。基于以上***优化后，构建了一种新的高效的CRISPR-CasФ植物基因组定向编辑骨架载体，并进一步地得到了基因定向激活骨架载体和定向表观编辑骨架载体，如本专利的实验结果所示，证明基于紧凑型CasФ的基因定向修饰工具可以针对植物进行简单、快捷、高效的基因组定向敲除编辑、基因定向激活和定向表观编辑，在植物基因组敲除编辑和调控方面，尤其是表观编辑调控方面，具有很好的应用前景。
附图说明
图1CasФ的有效PAM鉴定。A.评估CasФ在TTA、TTC、TTG、TTT、TCN、TGN6种PAM类型的基因敲除活性；B.基于图A的多个位点CasФ基因敲除活性分析。
图2CasФ***的spacer有效长度分析。
图3CasФ及其变体在TTV PAM识别位点的编辑活性分析。A.评估CasФ、vCasФ及nCasФ在水稻内源基因位点的敲除活性；B.基于图A的多个位点CasФ、vCasФ及nCasФ基因敲除活性比较分析。
图4水稻内源基因定向激活。A.评估基因转录激活编辑器在水稻内源基因的激活活性；B.NGS分析转录激活编辑器在水稻内源基因位点的剪切活性；C.评估基因转录激活编辑器在稳定植株中的OsER1位点定向激活活性；D.评估基因转录激活编辑器在稳定植株中的OsNRT1.1A位点定向激活活性。
图5OsGBSS1 mRNA表达水平分析及其启动子区域甲基化水平分析。A.评估5mC表观编辑器的靶基因OsGBSS1 mRNA表达水平；B.OsGBSS1启动子区域甲基化水平分析。
具体实施方式
本发明前期对来源于巨大噬菌体的CRISPR-CasФ基因再植物中的应用进行了大量的研究。在前期对野生型CasФ核酸酶及其变体nCasФ(其氨基酸序列如Seq ID No.12所示)和vCasФ(其氨基酸序列如Seq ID No.13所示)进行的工作中，发现nCasФ及其一条经优化的编码基因能在植物的基因编辑中表现出好的效果，可用于构建适用于植物的紧凑型CRISPR-CasФ植物基因组定向编辑***。基于此，在进一步的研究后，得到本发明的各技术方案。
所述经优化的nCasФ编码基因(Seq ID No.7)为：
ACTTGTTTGGGATGGTTCCTGGGCTGGAGTCTGATCCTCCCTCTCCGCCGGCGGCGCCTTGGACTTGCTAGCCTTCTTCGTTTTTCTGGCCGGGGCCGTCCCTTGTGCATCCCTAGGTTCCTCTCTCTTCGGCATTGTTTTGCCTGTGAGAGCCACCTGAGTGAGATTATGCGTAGCCACATCAAGATCCGCATTACAGGTCTTCCCGCACGAAAGGCATTGAAAGGCCTCACCGTCCCGGTTCCCGACTTCACAATGTCCACACTTTGGGCATGTGATGGACGTTCTTTCCGGcCTCACCTCGAAGACATAAAAGGAGCGATGCGTCCGGAGATCACTAAAGGCCTTGTGCAATCCTTGTATGAACCAGCGGTTTTCTTTTTTAGCTGTAAAGAAATTGTCCCATCCGGGCAACCGCTTTCCAGAACCATGAAAGAAGCGAACATTGAGGTCTTCGATGACCGGAATAACAATTTGACACTGAGTCCTCCGGCGTGTCTTCTCTATAACGTAATTAATCGACCTTCTACAGAGTTCTTCCTTTCTCCTGGAGAGTTTAAGATACTCTGGAGATGTCCGCTTCAAGGCCCAAAGTGCTTCGTTCTTCAATTTCTGCGCTTCAACTGACAGTCTCGGTTTGTAAGCGCGTGCCCATGTGCGGTCTTTCCTCATAACTTCCACCGGAGCTTTCTTTTTCGCGCCTTTTTTCGGGGCGGGTGTGAAAAAGACTTGGTCGCGACTAACGCTGTTACTAAGCAGGGCCTCGGAGATGAAGGTAGTATTCGACGACATTTTATCCCAAGGGAGTCTCTTAGGATCAAGCCCAAAATCAGCACACAATTGAGTTCTGGCAGTCTCTTTAGAAACGCCATCCAGTGCCCTAACCTCAGCCTGCTGTGCTTCTGGCAAGGCTTCAACACTGCGAGCGCGGAGTTCCTCCTCGTTCCGGTCCCAGGCGATTCTGTAGGCACTGATGTCTTTAAGAAGATCATCGGGGAGTGTAAAGCGATCGAGAGGCTCGCACTGAAGTGCACCATTCTCCTGAGTAACCCTGCTGATCCCGGCACTAATTGGGTTGGTTTGCCCAAGGTCTATGGCCACCAAAGCGACTGTCTGCGTGGCTGTCAACTTATCCAGTGTGGCCTTAGTCTGCTTTCCTTTCAGGGTCCACTTGCGAGCGTATGTTCCGCATGCGTCCAGAGTATAAGTAAAGGTGACTATGTTCCGCCTCACATCAATAACTGGGTCGCCAGTGAACAGATCGAGAAGCGCGTTCAGACTAATGTCCTTCGGCGCAATAGTCCTCCACCGTGCGTTCCTCAAAAGCCCTCTAACGTCAATGACGACCCAATCCGTGCCTATCCTCACGGTGACAAGGAGTGCATCTTGGGCCTTCTCCTTCTCTGACCGCCAATACCTCCTCATTCTCTTATTTTTTTTAGGACTCAATCCCGGCACCGTAACGGCTTTGCCGGTTTTAGGTGATATCGCAGTCCCAGCCTCGCGCTGCCACTCGGGTATATACCCTGGGCAGCCTTTCTGTATATCGCATCTATTCCTAACGACGCCCAACGGTATAGGCGCGTTTGGGTCCCTAACGTAGCCAGCGTACTCAGGCGGAAGGACGATCTCATCGCGGGGGCGATAAGCCTGAGGGCTGATAGTCTGATAAACATAAAAGGAAGGGTTTATTCCGGGTGGCTGCAGCAAGTGTCCCGTCTCATTCGTTGCAACTTCTTCTTCTTCTGCCTTGATTTCCGGGAGTCCggctgcAGCGCGagcCGCGTTGATggctgcAAGGCGCGCTCTTGCTTTTTCATTCCTCAGTTGAACCTTCTTCAACACCCCATCGTAGCGTCCCAGTGTATGGTCAAAGATCAGGTTAAGACCCTGAACATGGCTATATCCATGATTAGACACCCCTGTAGCAGCAAACCATGCCGCGTGCGACTCAGAGGATTTTCCAGGCTTACACGCCGCTCTTTCAGTAGTGCTAAGGGCGTAGATATAGCGCTGTATGGCTTCACTTGCCTTCATGATTGGCCACTCCGCAAAATCCCGGGACTTCGTGACCACATGGCACTTTGCTGGAGGTTGAAAGTTCGGTGGTTCCTCCTCGGATTTGCCCTGGAGATATGCCACGACGGCTTCCTCTCCTTGAGCCGCCAGAATCTTCCCCCCTCTTTTCATGTAGGATGATCTGAATCTCTCGCCAGGGAAGTGCTTTTTCAACACTTTAGAGAATTCGCTTTCGACAGCCGGTTTAGG。
本发明通过对来源于巨大噬菌体的CRISPR-CasФ基因的利用，特别是其变体nCasФ的编码基因，根据植物细胞基因组结构及表达特性，构建CRISPR-CasФ植物基因组定向编辑功能单元，其包括CasФ核酸酶蛋白表达单元和crRNA转录表达克隆单元两个核心区域。
首先，CasФ核酸酶蛋白表达单元(典型结构可为ZmUbi1-NLS-CasФ-NLS-AtHSP)的组装。在本发明的一个实施例中，根据水稻基因密码子特性对CRISPR-CasФ基因进行了密码子优化，然后合成5’端和3’端含NLS编码序列的CasФ核酸酶蛋白(即NLS-CasФ-NLS)，DNA序列如Seq ID No.01(其中序列52-2319是CasФ的蛋白编码区)。然后通过GibsonAssembly的方法将NLS-CasФ-NLS单元、来自玉米的组成型启动子ZmUbi1元件(Seq IDNo.02)和拟南芥AtHSP终止子元件(Seq ID No.03)组装成CasФ核酸酶蛋白表达单元。经过优化和进一步的筛选研究，本发明发现nCasФ(Seq ID No.07)的编码基因的效果最优，在一些实施例中，选择使用了NLS-n CasФ-NLS(Seq ID No.16)构建编辑***。
本发明上述的CasФ核酸酶编码基因可以与转录激活元件的编码基因相连接。两者组合得到的元件可用于构建定向转录激活的CRISPR-CasФ***的构建。所述的转录激活元件为TAL-VP128、VP64、2xTAD、2xTAD-VP64或VPR等转录激活结构域中的至少一种。
此外，上述的CasФ核酸酶编码基因还可以与甲基转移酶编码基因相连接。两者组合得到的元件可用于构建定向转录激活的CRISPR-CasФ***。所述甲基转移酶编码基因可为Dnmt3A-Dnmt3L、Dnmt3A-Dnmt3L-KRAB或KRAB-Dnmt3A-Dnmt3L等甲基转移酶(或其甲基化转移酶活性结构域)的编码基因中的至少一种。
上述的编码基因中，与转录激活元件或者甲基转移酶编码基因的连接通过链接序列进行。其中，上述的链接序列为XTEN80、XTEN-3xFLAG、SGGSSGGS-XTEN-SGGSSGGS或6xGGGGS中的至少一种。
典型的CasФ核酸酶蛋白表达单元的结构从5’到3’方向依次为启动子-NLS-CasФ-NLS-终止子。
为了转录激活的目的，CasФ核酸酶蛋白表达单元可具有如下结构，启动子-CasФ核酸酶编码基因-转录激活元件-终止子，或者为启动子-转录激活元件-CasФ核酸酶编码基因-终止子。所述的转录激活元件可以为1个，也可以为多个相同的转录激活元件的组合，或者多个不同的转录激活元件的组合。根据具体情况，可以位于CasФ核酸酶编码基因的上游、下游或者两侧。比如本发明实施例中用于转录激活编辑***中的CasФ核酸酶蛋白表达单元从5’到3’方向依次为ZmUbi1-NLS-nCasФ-NLS-6TAL-VP128-AtHSP T(其核苷酸序列为Seq ID No.02+Seq ID No.16+Seq ID No.09+Seq ID No.03)。
为了表观编辑的目的时，CasФ核酸酶蛋白表达单元可具有如下结构：启动子-CasФ核酸酶编码基因-甲基转移酶编码基因-终止子，或者为启动子-甲基转移酶编码基因-CasФ核酸酶编码基因-终止子。所述的甲基转移酶编码基因可以为1个，也可以为多个相同的甲基转移酶编码基因的组合，或者多个不同的甲基转移酶编码基因的组合。根据具体情况，可以位于CasФ核酸酶编码基因的上游、下游或者两侧。一般来说，甲基转移酶编码基因需要与CasФ核酸酶编码基因融合表达，得到CasФ核酸酶-甲基转移酶融合蛋白以更好地发挥作用。其结构从5’到3’方向依次为启动子-KRAB-NLS-CasФ-NLS-链接序列-甲基转移酶编码基因-终止子，或启动子-甲基转移酶编码基因-链接序列-NLS-CasФ-KRAB-NLS-终止子。本发明实施例中用于表观编辑的编辑***的CasФ核酸酶蛋白表达单元的结构从5’到3’方向依次为ZmUbi1-Dnmt3A-Dnmt3L-XTEN-NLS-CasФ-NLS-KRAB-AtHSP T。KRAB为转录阻遏物结构域，常与甲基转移酶结构域配合以达成表观编辑的目的。本发明表观编辑是指改变基因组上的表观修饰的状态，如甲基化修饰的状态。
基于上述的CasФ核酸酶蛋白表达单元，本发明还提供了CRISPR-CasФ植物基因组定向修饰功能单元。其包括CasФ核酸酶蛋白表达单元和crRNA转录表达克隆单元两个结构单元；所述的CasФ核酸酶蛋白表达单元上述的各种CasФ核酸酶蛋白表达单元。当其采用上述的不同功能的CasФ核酸酶蛋白表达单元时，即可用于不通的定向修饰目的。比如，基因组编辑、转录激活以及表观编辑。
而RNA转录表达克隆单元则可以使用常见的结构。本发明实施例中的组装了一种RNA转录表达克隆单元(OsUbi1-HH Ribozyme-crRNA scaffold-ccdB-HDV Ribozyme-NOST)。通过Gibson Assembly的方法将水稻OsUbi1启动子(Seq ID No.04)、HH Ribozyme-crRNA scaffold-ccdB-HDV Ribozyme单元(Seq ID No.05)和NOS终止子(Seq ID No.06)组装成crRNA转录表达克隆单元。其中，HH Ribozyme-crRNA scaffold-ccdB-HDV Ribozyme单元设计有BsaI-ccdB-BsaI序列，其作用是作为多克隆位点酶切CRISPR-CasФ定向修饰骨架载体，以便克隆目标向导crRAN特异性靶序列(protospacer)。HH核酶编码序列如SeqIDNo.05中1-43。核酶HDV编码序列如Seq ID No.05中704-771。crRNA scaffold序列如SeqID No.05中44-68所示的核苷酸序列。在多位点编辑载体时，可设置选定的多个特异性修饰靶序列，再分别由核酶A和核酶B将靶向位点序列间隔开，并在序列5’和3’分别添加BsaI识别位点后合成最终的核苷酸序列。如编辑4个位点，则所述crRNA转录表达克隆单元的结构为：BsaI识别位点-HH Ribozyme-crRNA scaffold-crRNA01-HDV Ribozyme-HH Ribozyme-crRNA scaffold-crRNA02-HDV Ribozyme-HH Ribozyme-crRNA scaffold-crRNA03-HDVRibozyme-HH Ribozyme-crRNA scaffold-crRNA04-HDV Ribozyme-BsaI识别位点。
最后，通过Golden Gate的方法将上述CRISPR-CasФ植物基因组定向功能单元即CasФ核酸酶蛋白表达单元和crRNA转录表达克隆单元克隆入各种本领域可用的骨架载体，比如可用pTrans_210d(Addgene Plasmid#91109)，然后转化细菌感受态，单克隆PCR验证，提取重组质粒，Sanger测序验证获得细菌(卡那霉素抗性)和植物(潮霉素抗性)双元表达的CRISPR-CasФ植物基因组定向编辑骨架载体。
本发明还提供了基于CRISPR-CasФ的植物基因组定向编辑***在植物中的应用
包括如下步骤：
a、明确特定植物基因组目标DNA区域，分析其中的具有nCasФ核酸酶蛋白识别PAM位点特征区域，选择PAM结构3’端相邻的20bp DNA序列作为特异性修饰靶序列；所述的PAM位点特征5’-TBN-3’,B表示T、G、C中的任一种。扫描水稻基因组，得到PAM位点TBN的基因位点(表1)。
b、按照选定的特异性修饰靶序列，分别合成具有5’-GGAC-NX-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-GGCC-NX-3’特征的反向寡核苷酸链，N表示A、G、C、T中的任一种，X为整数，且18≤X≤24，其中所述正向寡核苷酸链中的NX和反向寡核苷酸中的NX具有反向互补特征(表1)；通过退火获得互补寡核苷酸双链片段；
c、将上述的CRISPR-nCasФ骨架载体与步骤b得到的互补寡核苷酸双链片段混合，进行基于BsaI的Golden Gate组装，得到针对目标位点进行特异性修饰的CRISPR-CasФ重组载体。
d、本发明中，利用原生质体转化方法，将本发明构建的CasФ+crRNA重组表达载体转入植物细胞，转化后在32℃暗培养48小时，收集转化细胞，CTAB方法提取水稻原生质体基因组DNA，以该DNA为模板，进行PCR扩增及通量测序(NGS)分析(所用PCR引物和通量测序引物表2)，获得基因定向编辑的效率。
本发明通过CasФ蛋白基因密码子优化，以及根据蛋白结构半理性设计，构建了一种新的高效的CasФ编码基因(nCasФ)，并以之为基础构建了新的植物基因组定向编辑载体，可以针对植物进行简单、快捷、高效的基因组定向修饰。CRISPR-CasФ在检测的TTV PAM位点有编辑活性，然而当PAM为TTT,TCN,TGN时，CasФ的编辑活性很低，甚至没有(图1)。重新定义了CasФ在植物基因组编辑中偏好的PAM类型。此外通过对spacer长度影响CasФ***介导的植物基因组编辑活性分析，发现当spacer长度位于18-24nt之间时，CasФ有很高的编辑活性。以此为基础提供了一种新的高效的植物基因组定向编辑工具。
本发明提供的基于CRISPR-nCasФ的植物基因组定向编辑***的构建和使用包括如下步骤：
a、明确特定植物基因组目标DNA区域，分析其中的具有nCasФ核酸酶蛋白识别PAM位点特征区域，选择PAM结构3’端相邻的20bp DNA序列作为特异性修饰靶序列；所述的PAM位点特征5’-TBN-3’,B表示T、G、C中的任一种。扫描水稻基因组，得到PAM位点TBN的各个基因位点。
b、按照选定的特异性修饰靶序列，分别合成具有5’-GGAC-NX-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-GGCC-NX-3’特征的反向寡核苷酸链，N表示A、G、C、T中的任一种，X为整数，且18≤X≤24，其中所述正向寡核苷酸链中的NX和反向寡核苷酸中的NX具有反向互补特征；通过退火获得互补寡核苷酸双链片段；
c、将植物基因组定向编辑的CRISPR-nCasФ骨架载体与步骤b得到的互补寡核苷酸双链片段混合，进行基于BsaI的Golden Gate组装，得到针对目标位点进行特异性修饰的CRISPR-CasФ重组载体。
d、本发明中，利用原生质体转化方法，将本发明构建的CasФ+crRNA重组表达载体转入植物细胞，转化后在32℃暗培养48小时，收集转化细胞，CTAB方法提取水稻原生质体基因组DNA，以该DNA为模板，进行PCR扩增及通量测序(NGS)分析，获得基因定向编辑的效率。
本发明提供了基于CRISPR-CasФ的基因定向激活***并应用于植物基因转录激活。其构建和使用包括如下步骤：
a、针对水稻基因的转录起始位点上游，分析其中的具有nCasФ核酸酶蛋白识别PAM位点特征区域，选择PAM结构3’端相邻的16bp DNA序列作为特异性修饰靶序列；所述的PAM位点特征5’-TTV-3’,V表示A、G、C中的任一种。扫描水稻基因组，得到PAM位点TTV的crRNA位点。
b、按照选定的特异性修饰靶序列，分别合成具有5’-GGAC-NX-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-GGCC-NX-3’特征的反向寡核苷酸链，N表示A、G、C、T中的任一种，X为整数，且X＝16，其中所述正向寡核苷酸链中的NX和反向寡核苷酸中的NX具有反向互补特征，通过退火获得互补寡核苷酸双链片段。
c、将用于基因转录激活的CRISPR-nCasФ骨架载体与步骤b得到的片段混合，进行基于BsaI的Golden Gate组装，得到针对目标位点进行特异性修饰的CRISPR-CasФ重组载体。
d、利用原生质体转化方法，将本发明构建的CasФ+crRNA重组表达载体转入植物细胞，转化后在32℃暗培养48小时，收集转化细胞，分别以CTAB方法提取水稻原生质体基因组DNA，以RNA提取试剂盒提取RNA(AG21019,ACCURATE BIOLOGY)，使用ChamQ UniversalSYBR qPCR Master Mix(Q711-02,Vazyme)试剂和实时PCR检测***(QTOWER3G,Analytikjena)进行qPCR实验，以检测转录物表达水平。
实施例结果表明，本发明构建了一种新的高效的CRISPR-CasФ植物基因转录调控***，可以针对植物进行简单、快捷、高效的基因定向激活。在水稻细胞中OsGBSS1实现了极显著的转录激活，激活效率高达53倍；OsCHS,OsER1,OsNRT1.1A 3个基因实现了显著的转录激活，激活效率分别达到3倍、4.5倍、2倍。提供了一种高效的CRISPR-CasФ植物基因组定向激活工具。
本发明提供了CRISPR-CasФ植物基因组定向表观编辑载体并应用于植物基因组定向表观编辑。其构建和使用包括如下步骤：
a、针对水稻OsGBSS1基因启动子区域，分析其中的具有nCasФ核酸酶蛋白识别PAM位点特征区域，选择PAM结构3’端相邻的DNA序列作为特异性修饰靶序列；所述的PAM位点特征5’-TTV-3’,V表示A、G、C中的任一种。扫描水稻基因组，得到PAM位点TTV的crRNA位点的4个基因位点(表9)。
b、单位点编辑载体按照选定的特异性修饰靶序列，分别合成具有5’-GGAC-NX-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-GGCC-NX-3’特征的反向寡核苷酸链，N表示A、G、C、T中的任一种，X为整数，且X＝16，其中所述正向寡核苷酸链中的NX和反向寡核苷酸中的NX具有反向互补特征，通过退火获得互补寡核苷酸双链片段；
当多位点修饰时，则按照选定的多个特异性修饰靶序列，分别由核酶A和核酶B将靶向位点间隔开，并在序列5’和3’分别添加BsaI识别位点(GGTCTCC)经公司合成最终的核苷酸序列，所述序列为BsaI识别位点-HH Ribozyme-crRNA scaffold-crRNA01-HDVRibozyme-HH Ribozyme-crRNA scaffold-crRNA02-HDV Ribozyme-HH Ribozyme-crRNAscaffold-crRNA03-HDV Ribozyme-HH Ribozyme-crRNA scaffold-crRNA04-HDVRibozyme-BsaI识别位点(以4个位点为例)。
c、将制备的植物基因组定向表观编辑的nCRISPR-CasФ骨架载体与步骤b得到的片段混合，进行基于BsaI的Golden Gate组装，得到针对目标位点进行特异性修饰的CRISPR-CasФ重组载体。
d、利用原生质体转化方法，将本发明构建的CasФ+crRNA重组表达载体转入植物细胞，转化后在32℃暗培养48小时，收集转化细胞，分别以CTAB方法提取水稻原生质体基因组DNA，以RNA提取试剂盒提取RNA(AG21019,ACCURATE BIOLOGY)。提取的DNA使用EpiTectBisulfite Kit(59104；QIANGEN)进行重亚硫酸氢盐处理。然后使用亚硫酸氢盐处理的DNA使用表10中列出的条形码引物扩增目标区域。将PCR产物汇集在一起并通过琼脂糖凝胶电泳纯化。然后PCR扩增子由Novogene(中国天津)采用NovaSeq6000-PE250测序策略进行测序。通过Bismark软件(Krueger and Andrews,2011)分析测序结果，计算每个胞嘧啶位点的甲基化百分比；同时使用qPCR检测目的基因mRNA表达水平。
实施例结果表明，本发明构建了一种新的高效的CRISPR-CasФ植物基因组定向表观编辑骨架载体，可以针对植物进行简单、快捷、高效的基因组定向表观编辑。在检测的OsGBSS1基因启动子区域甲基化程度增加，相应的OsGBSS1表达量显著降低。提供了一种高效的CRISPR-CasФ植物基因组定向表观编辑应用工具。
实施例1CRISPR-CasФ植物基因组定向修饰骨架载体的构建
前期研究中，先对CasФ密码子进行优化，采用不同模块组装的方式进行构建新CRISPR-CasФ基因编辑骨架载体。首先，设计模块1(MOD_A)为5’端和3’端含NLS编码序列的CasФ核酸酶蛋白表达单元(ZmUbi1-NLS-CasФ-NLS-AtHSP)，其中CasФ经密码子优化后并交由生物公司合成NLS-CasФ-NLS。然后通过Gibson Assembly的方法将NLS-CasФ-NLS单元、来自玉米的组成型启动子ZmUbi1元件和拟南芥AtHSP终止子元件组装成模块1(NLS-CasФ-NLS序列如Seq ID No.1所示)。其次，设计模块2(MOD_B)为crRNA转录表达克隆单元OsUbi1-HH Ribozyme-crRNA scaffold-ccdB-HDV Ribozyme-NOS。通过Gibson Assembly的方法将水稻OsUbi1启动子、crRNA array和NOS终止子组装成模块2。最后，通过Golden Gate方法将模块1、模块2组装进入pTrans_210d。通过转化细菌感受态，单克隆PCR验证，提取重组质粒，Sanger测序验证，最后获得新CasФ基因编辑骨架载体。为了进一步提高CasФ在植物基因组编辑中的效率，我们根据CasФ的蛋白结构进行半理性设计，对其PAM区域的部分氨基酸进行突变，得到2个CasФ变体，分别是nCasФ(其DNA序列如Seq ID No.07)和vCasФ(其DNA序列如Seq ID No.08)。CasФ的2个变体蛋白编码序列交由生物公司合成，然后通过Gibson Assembly的方法将NLS-CasФ变体-NLS单元、来自玉米的组成型启动子ZmUbi1元件和拟南芥AtHSP终止子元件组装成模块1。其次，设计模块2(MOD_B)为crRNA转录表达克隆单元OsUbi1-HH Ribozyme-crRNA scaffold-ccdB-HDV Ribozyme-NOS。通过Gibson Assembly的方法将水稻OsUbi1启动子、crRNA阵列和NOS终止子组装成模块2。最后，通过Golden Gate方法将模块1，模块2组装进入pTrans_210d。通过转化细菌感受态，单克隆PCR验证，提取重组质粒，Sanger测序验证，最后获得新vCasФ和nCasФ变体的基因编辑骨架载体(其中NLS-nCasФ-NLS序列如Seq ID No.16所示，NLS-vCasФ-NLS序列如Seq ID No.17所示)。
此外，本发明还构建了基于6TAL-VP128转录激活元件的转录激活***。6TAL-VP128交由生物公司合成(DNA序列如Seq ID No.09所示)，然后通过Gibson Assembly的方法将NLS-CasФ-NLS单元、来自玉米的组成型启动子ZmUbi1元件和拟南芥AtHSP终止子元件组装成模块1，构建包含CasФ核酸酶蛋白及6TAL-VP128转录激活元件的表达单元ZmUbi1-NLS-CasФ-NLS-6TAL-VP128-AtHSP。其次，设计模块2为crRNA转录表达克隆单元OsUbi1-HHRibozyme-crRNA scaffold-ccdB-HDV Ribozyme-pinII。通过Gibson Assembly的方法将水稻OsUbi1启动子、crRNA阵列和NOS终止子组装成模块2。最后，通过Golden Gate方法将模块1，模块2组装进入pTrans_210d。通过转化细菌感受态，单克隆PCR验证，提取重组质粒，Sanger测序验证，最后获得新CRISPR-CasФ的转录激活骨架载体CRISPR-CasФactive。
然后，本发明还构建了基于Dnmt3A-Dnmt3L甲基转移酶及转录阻遏物结构域KRAB的表观编辑***。Dnmt3A-Dnmt3L及KRAB序列经密码子优化后并交由生物公司合成(DNA序列如Seq ID No.10所示(其中Dnmt3A-Dnmt3LDNA序列如Seq ID No.10所示，序列1-906是Dnmt3A，序列907-1632是Dnmt3L；KRABDNA序列如Seq ID No.14所示)，然后通过GibsonAssembly的方法将NLS-CasФ-NLS单元、来自玉米的组成型启动子ZmUbi1元件和拟南芥AtHSP终止子元件组装成模块1，构建包含CasФ核酸酶蛋白、KRAB及Dnmt3A-Dnmt3L的甲基转移酶表达单元，结构为ZmUbi1-Dnmt3A-Dnmt3L-XTEN-NLS-CasФ-NLS-KRAB-AtHSP T。其次，设计模块2为crRNA转录表达克隆单元OsUbi1-HH Ribozyme-crRNA scaffold-ccdB-HDVRibozyme-pinII。通过Gibson Assembly的方法将水稻OsUbi1启动子、crRNA阵列和pinII终止子(Seq ID No.11)组装成模块2。最后，通过Golden Gate方法将模块1，模块2组装进入pTrans_210d。通过转化细菌感受态，单克隆PCR验证，提取重组质粒，Sanger测序验证，最后获得新CRISPR-CasФ的表观编辑骨架载体CRISPR-CasФmethy。
实施例2基于CRISPR-CasФ***构建水稻内源基因定向编辑及PAM重新定义
1、水稻内源基因组定向编辑向导crRNA设计
为了测试所构建的CRISPR-CasФ***对植物基因组的编辑活性，扫描水稻基因组，得到PAM为TBN(其中B代表：A、C、G；N代表：A、C、G、T)的13个spacer位点(见表1)来设计crRNA。依据设计的crRNA位点核酸序列，人工合成对应的正、反向寡核苷酸链。
2、CasФ+crRNA重组表达载体构建
基于CasФ骨架载体的表达载体构建：分别将crRNA01-F/R,crRNA02-F/R,crRNA03-F/R,crRNA04-F/R，crRNA05-F/R,crRNA06-F/R,crRNA07-F/R,crRNA08-F/R,crRNA09-F/R，crRNA10-F/R，crRNA11-F/R，crRNA12-F/R，crRNA13-F/R等比例混合，沸水浴10min，而后自然降温退火，形成具有粘性末端的双链DNA，作为构建重组载体的***片段。于200uL PCR管中加入不同CRISPR-CasФ植物基因组定向修饰骨架载体、粘末端***片段、BsaI内切酶、T4 DNA连接酶，在“37℃5min→16℃10min(15个循环)→37℃10min→80℃10min→4℃10min”进行酶切连接，取反应产物进行大肠杆菌转化。通过卡那霉素抗性筛选、菌落PCR及酶切鉴定阳性转化子，最终通过经测序验证得到CasФ-crRNA01、CasФ-crRNA02、CasФ-crRNA03、CasФ-crRNA04、CasФ-crRNA05、CasФ-crRNA06、CasФ-crRNA07、CasФ-crRNA08、CasФ-crRNA09、CasФ-crRNA10、CasФ-crRNA11、CasФ-crRNA12、CasФ-crRNA13重组表达载体。
3、CRISPR-CasФ重组表达载体的水稻原生质体转化
CRISPR-CasФ重组表达载体在水稻日本晴原生质体分离、转化及DNA提取的具体过程参考文献(Tang X,Zheng X,Qi Y,Zhang D,Cheng Y,Tang A,Voytas DF,ZhangY.2006.A Single Transcript CRISPR-Cas9System for Efficient Genome Editing inPlants.Mol Plant,9(7):1088-1091.)中公开的实验方法。
4、定向编辑结果检测
基因组NHEJ编辑事件检测及分析方法如下：水稻原生质体转化后，32℃暗培养48小时，收集转化细胞，CTAB方法提取水稻原生质体基因组DNA，以该DNA为模板，进行PCR扩增及NGS验证分析。具体实验方法流程参考文献(Zhong Z,ZhangY,You Q,Tang X,Ren Q,LiuS,Yang L,Wang Y,Liu X,Liu B,Zhang T,Zheng X,Le Y,Zhang Y,Qi Y.2018.MolecularPlant.Plant genome editing using FnCpf1 and LbCpf1 nucleases at redefined andaltered PAM sites.Mol Plant,11:999-1002)中公开的实验方法。PCR产物经凝胶纯化，然后由Novogene(中国天津)采用NovaSeq 6000-PE150测序策略进行测序。数据通过CRISPRMatch软件(You,Q.,Zhong,Z.,Ren,Q.,Hassan,F.,Zhang,Y.,and Zhang,T.2018.CRISPRMatch:an automatic calculation and visualization tool for high-throughput CRISPR genome-editing data analysis.Int.J.Biol.Sci.14:858–862.)进行分析，计算出突变效率。
由图1可知：基于本发明构建的CasФ植物基因组编辑载体，在水稻中检测的13个位点中，CasФ在PAM为TTV(TTA、TTC、TTG)的9个位点(TTA-crR01、TTA-crR02、TTA-crR03、TTC-crR01、TTC-crR02、TTC-crR03、TTG-crR01、TTG-crR02、TTG-crR03)均具有较高的编辑活性，编辑效率均>10％(图1A)，然而当PAM为TTT、TCN、TGN时，未检测到明显CasФ编辑活性(图1A，1B)。这与之前基于体外切割实验报道的CasФ识别PAM位点为TBN的结果明显不同，说明CasФ在植物基因组内源位点编辑中具备明显不同的PAM位点选择特性。
实施例3基于CRISPR-CasФ***的pacer有效长度分析
1、水稻内源基因组定向编辑向导crRNA设计
为了测试CRISPR-CasФ***在植物基因组编辑中spacer的使用有效长度，针对TTG-cR03和TTC-cR03这2个位点，分别设计了长度为14nt、16nt、18nt、20nt、22nt、24nt(序列如表3所示)6个不同长度的spacer序列，并在水稻原生质体中检测了这些不同长度spacer载体的编辑活性。依据设计的crRNA位点核酸序列，人工合成对应的正、反向寡核苷酸链。
2、CasФ+crRNA重组表达载体构建
基于CasФ骨架载体的表达载体构建：分别将crRNA14-F/R、crRNA15-F/R、crRNA16-F/R、crRNA17-F/R、crRNA18-F/R、crRNA19-F/R等比例混合，沸水浴10min，而后自然降温退火，形成具有粘性末端的双链DNA，作为构建重组载体的***片段。于200uL PCR管中加入不同CRISPR-CasФ植物基因组定向修饰骨架载体、粘末端***片段、BsaI内切酶、T4DNA连接酶，在“37℃5min→16℃10min(15个循环)→37℃10min→80℃10min→4℃10min”进行酶切连接，取反应产物进行大肠杆菌转化。通过卡那霉素抗性筛选、菌落PCR及酶切鉴定阳性转化子，最终通过经测序验证得到CasФ-crRNA14、CasФ-crRNA15、CasФ-crRNA16、CasФ-crRNA17、CasФ-crRNA18、CasФ-crRNA19重组表达载体。
3、CRISPR-CasФ重组表达载体的水稻原生质体转化
CRISPR-CasФ重组表达载体在水稻日本晴原生质体分离、转化及DNA提取的具体过程参考文献(Tang X,Zheng X,Qi Y,Zhang D,Cheng Y,Tang A,Voytas DF,ZhangY.2006.A Single Transcript CRISPR-Cas9System for Efficient Genome Editing inPlants.Mol Plant,9(7):1088-1091.)中公开的实验方法。
4、定向编辑结果检测
基因组NHEJ编辑事件检测及分析方法如下：水稻原生质体转化后，32℃暗培养48小时，收集转化细胞，CTAB方法提取水稻原生质体基因组DNA，以该DNA为模板，进行PCR扩增及NGS验证分析。具体实验方法流程参考文献(Zhong Z,ZhangY,You Q,Tang X,Ren Q,LiuS,Yang L,Wang Y,Liu X,Liu B,Zhang T,Zheng X,Le Y,Zhang Y,Qi Y.2018.MolecularPlant.Plant genome editing using FnCpf1 and LbCpf1nucleases at redefined andaltered PAM sites.Mol Plant,11:999-1002)中公开的实验方法。PCR产物经凝胶纯化，然后由Novogene(中国天津)采用NovaSeq 6000-PE150测序策略进行测序。数据通过CRISPRMatch软件(You,Q.,Zhong,Z.,Ren,Q.,Hassan,F.,Zhang,Y.,and Zhang,T.2018.CRISPRMatch:an automatic calculation and visualization tool for high-throughput CRISPR genome-editing data analysis.Int.J.Biol.Sci.14:858–862.)进行分析，计算出突变效率。
由图2可知：spacer长度对CasФ***介导的植物基因组DNA剪切编辑活性影响显著：当spacer长度是18nt时，CasФ有较高剪切编辑活性，且随spacer长度增加到20nt、22nt、24nt时，编辑活性达到最高；当spacer长度低于18nt时，随着spacer长度的减少，剪切编辑活性逐渐降低，当spacer长度为14nt时，编辑活性降到最低(图2)。基于此结果，在进行剪切编辑时考虑到有效的敲除活性，优先使用18-24nt长度的spacer，而在使用其他不需要保留剪切活性的编辑策略时，14nt spacer虽然剪切活性最低，然而与Cas核酸酶的结合活性进一步降低，因此考虑到降低剪切活性的同时且保留与核酸酶的结合活性，优先考虑选择16nt的spacer。
实施例4改进CRISPR-CasФ***提高编辑活性
1、水稻内源基因组定向编辑向导crRNA设计
为了进一步提高CasФ对植物基因组编辑的效率，我们根据CasФ蛋白的PAM互作结构域进行氨基酸突变等设计，得到了2个CasФ变体：vCasФ和nCasФ。为了测试所构建的CRISPR-CasФ***对植物基因组的编辑活性，扫描水稻基因组，得到PAM为TTV的spacer位点(表1)来设计crRNA。依据设计的crRNA位点核酸序列，人工合成对应的正、反向寡核苷酸链，具体序列如表3(5’端前4个碱基序列代表与骨架载体互补的粘性末端，后面的序列是设计的特异性向导crRNA位点)。
表1基因组编辑crRNA设计位点、序列
2、CasФ+crRNA重组表达载体构建
基于CasФ骨架载体的表达载体构建：分别将crRNA20-F/R,crRNA21-F/R,crRNA22-F/R,crRNA23-F/R,crRNA23-F/R,crRNA24-F/R,crRNA25-F/R,crRNA26-F/R,crRNA27-F/R,crRNA28-F/R等比例混合，沸水浴10min，而后自然降温退火，形成具有粘性末端的双链DNA，作为构建重组载体的***片段。于200uL PCR管中加入不同CRISPR-CasФ植物基因组定向修饰骨架载体、粘末端***片段、BsaI内切酶、T4 DNA连接酶，在“37℃5min→16℃10min(15个循环)→37℃10min→80℃10min→4℃10min”进行酶切连接，取反应产物进行大肠杆菌转化。通过卡那霉素抗性筛选、菌落PCR及酶切鉴定阳性转化子，最终通过经测序验证得到CasФ-crRN20、CasФ-crRNA21、CasФ-crRNA22、CasФ-crRNA23、CasФ-crRNA24、CasФ-crRNA25、CasФ-crRNA26、CasФ-crRNA27、CasФ-crRNA28重组表达载体。
基于vCasФ骨架载体的表达载体构建：分别将crRNA20-F/R,crRNA21-F/R,crRNA22-F/R,crRNA23-F/R,crRNA23-F/R,crRNA24-F/R,crRNA25-F/R,crRNA26-F/R,crRNA27-F/R,crRNA28-F/R等比例混合，沸水浴10min，而后自然降温退火，形成具有粘性末端的双链DNA，作为构建重组载体的***片段。于200uL PCR管中加入不同CRISPR-vCasФ植物基因组定向修饰骨架载体、粘末端***片段、BsaI内切酶、T4 DNA连接酶，在“37℃5min→16℃10min(15个循环)→37℃10min→80℃10min→4℃10min”进行酶切连接，取反应产物进行大肠杆菌转化。通过卡那霉素抗性筛选、菌落PCR及酶切鉴定阳性转化子，最终通过经测序验证得到CasФ-crRNA31、CasФ-crRNA32、CasФ-crRNA33、CasФ-crRNA34、CasФ-crRNA35、CasФ-crRNA36、CasФ-crRNA37、CasФ-crRNA38、CasФ-crRNA39重组表达载体。
基于nCasФ骨架载体的表达载体构建：分别将crRNA20-F/R,crRNA21-F/R,crRNA22-F/R,crRNA23-F/R,crRNA23-F/R,crRNA24-F/R,crRNA25-F/R,crRNA26-F/R,crRNA27-F/R,crRNA28-F/R等比例混合，沸水浴10min，而后自然降温退火，形成具有粘性末端的双链DNA，作为构建重组载体的***片段。于200uL PCR管中加入不同CRISPR-nCasФ植物基因组定向修饰骨架载体、粘末端***片段、BsaI内切酶、T4 DNA连接酶，在“37℃5min→16℃10min(15个循环)→37℃10min→80℃10min→4℃10min”进行酶切连接，取反应产物进行大肠杆菌转化。通过卡那霉素抗性筛选、菌落PCR及酶切鉴定阳性转化子，最终通过经测序验证得到CasФ-crRNA42、CasФ-crRNA43、CasФ-crRNA44、CasФ-crRNA45、CasФ-crRNA46、CasФ-crRNA47、CasФ-crRNA48、CasФ-crRNA49、CasФ-crRNA50重组表达载体。
3、CRISPR-CasФ重组表达载体的水稻原生质体转化
CRISPR-CasФ重组表达载体在水稻日本晴原生质体分离、转化及DNA提取的具体过程参考文献(Tang X,Zheng X,Qi Y,Zhang D,Cheng Y,Tang A,Voytas DF,ZhangY.2006.A Single Transcript CRISPR-Cas9System for Efficient Genome Editing inPlants.Mol Plant,9(7):1088-1091.)中公开的实验方法。水稻稳定转化方法如之前文献报道所述(Zhong等,2019)。简单而言，水稻愈伤组织是从种子在N6-D培养基上于32℃光照下生长7天诱导而来的。将T-DNA载体转化到根癌农杆菌菌株EHA105中。将每个转化的农杆菌EHA105在25℃培养并重悬于含有100mM乙酰丁香酮的AAM-AS培养基(OD600＝0.1)中。与农杆菌共培养3天后，将愈伤组织用无菌水洗涤并转移到含有400mg/l特美汀和50mg/l潮霉素的N6-S培养基中培养2周。将抗性愈伤组织转移到含有400mg/l特美汀和50mg/l潮霉素的REIII培养基中以获得再生植物。
4、定向编辑结果检测
基因组NHEJ编辑事件检测及分析方法如下：水稻原生质体转化后，32℃暗培养48小时，收集转化细胞，CTAB方法提取水稻原生质体基因组DNA，以该DNA为模板，进行PCR扩增及NGS验证分析。具体实验方法流程参考文献(Zhong Z,ZhangY,You Q,Tang X,Ren Q,LiuS,Yang L,Wang Y,Liu X,Liu B,Zhang T,Zheng X,Le Y,Zhang Y,Qi Y.2018.MolecularPlant.Plant genome editing using FnCpf1 and LbCpf1 nucleases at redefined andaltered PAM sites.Mol Plant,11:999-1002)中公开的实验方法。PCR产物经凝胶纯化，然后由Novogene(中国天津)采用NovaSeq 6000-PE150测序策略进行测序。数据通过CRISPRMatch软件(You,Q.,Zhong,Z.,Ren,Q.,Hassan,F.,Zhang,Y.,and Zhang,T.2018.CRISPRMatch:an automatic calculation and visualization tool for high-throughput CRISPR genome-editing data analysis.Int.J.Biol.Sci.14:858–862.)进行分析，计算出突变效率。
由图3可知：在检测的9个位点中，基于本发明构建的CasФ、vCasФ、nCasФ编辑载体均具有编辑活性。vCasФ变体在这9个位点的编辑活性与CasФ相似(图3A，3B)，而nCasФ变体在这9个位活性都高于CasФ和vCasФ变体(图3A，3B)，编辑活性较前2个***有了显著的提升。在检测的9个TTV位点中,nCasФ在其中7个位点(TTG-cR05、TTG-cR06、TTG-cR08、TTG-cR09、TTG-cR11、TTG-cR12、TTG-cR13)编辑活性大于20％(图3A)。而vCasФ变体在这9个位点中，只有3个位点(TTG-cR06、TTG-cR08、TTG-cR12)活性大于20％(图3A)。CasФ也仅有3个位点(TTG-cR06、TTG-cR08、TTG-cR13)的活性>20％(图3A)。与野生型CasФ相比，nCasФ编辑活性显著提高，在TTG-cR05位点编辑活性从10％提高到22％、TTG-cR06位点编辑活性从46％提高到66％、TTG-cR08位点编辑活性从18％提高到38％、TTG-cR09位点编辑活性从5％提高到30％、TTG-cR10位点编辑活性从3.5％提高到10％、TTG-cR11位点编辑活性从10％提高到25％、TTG-cR12位点编辑活性从3％提高到30％、TTG-cR13位点编辑活性从19％提高到32％)。基于CasФ***在水稻原生质体中展现了高效的编辑效率，我们选取了水稻内源基因LOC_Os03g40840作为靶基因进行定向敲除。首先构建了靶向LOC_Os03g40840的克隆载体，通过农杆菌介导的水稻稳定转化，获得转基因植株。在转基因T1代植株中检测到了88.9％的编辑效率。然而在野生型CasФ***编辑的植株中未检测到突变事件。进一步，针对CasФ有限活性的可能研究报道(https://doi.org/10.3390％2Fijms23105755)，本发明平行测试了野生型CasФ全长crRNA结构及培养基中额外添加10mM MgCl2条件下，测试了CasФ***在水稻TTG-cR11、TTG-cR13稳定转化的编辑活性，基于NGS高通量测序没有检测到突变事件发生。综合水稻原生质体瞬时表达及农杆菌介导的稳定转化数据，可知本发明基于nCasФ构建了一种新型、紧凑型、高效的植物基因组编辑工具。
实施例5基于CRISPR-CasФ***的水稻内源基因转录激活
1、水稻内源基因激活向导crRNA设计
基于以上编辑***的层层优化，我们选取最优的编辑***测试其转录激活活性。鉴于16nt的spacer长度不仅有效降低NHEJ活性且最大程度保留了DNA结合活性，我们将选取16nt的crRNA来进行转录激活。针对4个水稻内源基因OsER1，OsNRT1.1A,OsCHS,OsGBSS1转录起始位点上游分别设计长度为16nt的靶向位点。依据设计的crRNA位点核酸序列，人工合成对应的正、反向寡核苷酸链，具体序列如表1(5’端前4个碱基序列代表与骨架载体互补的粘性末端，后面的序列是设计的特异性向导crRNA位点)。
2、CasФ+crRNA重组表达载体构建
分别将cRER1-F/R,cRNRT1.1A-F/R,cRCHS-F/R,cRGBSS1-F/R等比例混合，沸水浴10min，而后自然降温退火，形成具有粘性末端的双链DNA，作为构建重组载体的***片段。于200uL PCR管中加入不同CRISPR-CasФ植物基因组定向修饰骨架载体、粘末端***片段、BsaI内切酶、T4 DNA连接酶，在“37℃5min→16℃10min(15个循环)→37℃10min→80℃10min→4℃10min”进行酶切连接，取反应产物进行大肠杆菌转化。通过卡那霉素抗性筛选、菌落PCR及酶切鉴定阳性转化子，最终通过经测序验证得到新CasФ-ER1、CasФ-NRT1.1A、CasФ-CHS、CasФ-GBSS1重组表达载体。
3、CRISPR-CasФ重组表达载体的水稻原生质体转化及水稻稳定转化
CRISPR-CasФ重组表达载体在水稻日本晴原生质体分离、转化及DNA提取的具体过程参考文献(Tang X,Zheng X,Qi Y,Zhang D,Cheng Y,Tang A,Voytas DF,ZhangY.2006.A Single Transcript CRISPR-Cas9System for Efficient Genome Editing inPlants.Mol Plant,9(7):1088-1091.)中公开的实验方法。水稻稳定转化方法如之前文献报道所述(Zhong等,2019)。简而言之，水稻愈伤组织是从种子在N6-D培养基上于32℃光照下生长7天诱导而来的。将T-DNA载体转化到根癌农杆菌菌株EHA105中。将每个转化的农杆菌EHA105在25℃培养并重悬于含有100mM乙酰丁香酮的AAM-AS培养基(OD600＝0.1)中。与农杆菌共培养3天后，将愈伤组织用无菌水洗涤并转移到含有400mg/l特美汀和50mg/l潮霉素的N6-S培养基中培养2周。将抗性愈伤组织转移到含有400mg/l特美汀和50mg/l潮霉素的REIII培养基中以获得再生植物。
4、定向激活结果检测
水稻原生质体转录激活事件检测及分析方法如下：8×10^5水稻原生质体用于RNA提取。根据制造商的使用手册，使用Steady Pure Plant RNA Extraction Kit(AG21019,ACCURATE BIOLOGY)实现总RNA提取和DNA去除。然后，使用HiScript III RT SuperMix forqPCR试剂盒(R323-01,Vazyme)将400ng总RNA用于cDNA合成。使用ChamQ Universal SYBRqPCR Master Mix(Q711-02,Vazyme)试剂和实时PCR检测***(QTOWER3G,Analytikjena)进行qPCR实验，以检测转录物表达水平。OsActin被用作水稻的内源内参基因。通过2-ΔΔCt方法计算目标基因倍数变化。
水稻稳定植株转录激活事件检测及分析方法如下：1μg叶片用于RNA提取。根据制造商的使用手册，使用Steady Pure Plant RNA Extraction Kit(AG21019,ACCURATEBIOLOGY)实现总RNA提取和DNA去除。然后，使用HiScript III RT SuperMix for qPCR试剂盒(R323-01,Vazyme)将400ng总RNA用于cDNA合成。使用ChamQ Universal SYBR qPCRMaster Mix(Q711-02,Vazyme)试剂和实时PCR检测***(QTOWER3G,Analytikjena)进行qPCR实验，以检测转录物表达水平。OsActin被用作水稻的内源内参基因。通过2-ΔΔCt方法计算目标基因倍数变化。
为了测试基于本发明构建的CasФ***水稻目标基因定向激活能力，选取了OsER1、OsNRT1.1A、OsCHS、OsGBSS1 4个基因进行激活，在水稻原生质体中4个目的基因均实现了显著的定向激活：其中在OsGBSS1实现了极显著的转录激活，激活效率高达53倍；OsER1、OsNRT1.1A、OsCHS 3个基因实现了显著的转录激活，激活效率分别达到4.5倍、2倍及3倍(图4A)。进一步，对16nt spacer介导转录激活位点的剪切活性进行高通量数据分析，结果发现4个基因位点均没有产生剪切事件(图4B)。此结果进一步表明基于16nt spacer介导CasФ转录激活编辑器是有效的基因定向激活工具，能定向激活靶向基因且不产生剪切编辑。
后续我们检测了基于CasФ的基因定向激活在稳定植株中的激活能力。选取针对OsER1和OsNRT1.1A定向激活的克隆载体，通过农杆菌介导的水稻稳定转化，获得具有转录激活载体的转基因植株，分别对3株植株进行靶基因mRNA表达水平分析。通过对转基因植株叶片RNA提取及后续的qPCR检测发现，在稳定植株中也实现了对目标基因的定向激活，其中针对OsER1基因，植株1、2、3激活了4-11倍(图4C)；针对OsNRT1,1A基因，植株1、2、3激活了2.5-4.0倍(4D)。
综上所述，本发明的CRISPR-CasФ基因编辑***能与转录激活调控元件6TAL-VP128融合，构建一种定向激活目的基因的转录调控编辑***。
实施例6基于CRISPR-CasФ***的水稻内源基因表观编辑
1、水稻内源基因组定向编辑向导crRNA设计
基于以上优化的编辑***，我们选取16nt crRNA的***来进行表观编辑，其中的甲基转移酶表达单元包含CasФ核酸酶蛋白、KRAB及Dnmt3A-Dnmt3L的编码序列，结构为ZmUbi1-Dnmt3A-Dnmt3L-XTEN-NLS-nCasФ-NLS-KRAB-AtHSP T。。针对水稻内源基因OsGBSS1启动子区设计了4个靶向位点(引物序列见表2)构建了相应的表观编辑***。
表2crRNA设计位点、序列
2、CasФ+crRNA重组表达载体构建
表观编辑载体按照选定的特异性修饰靶序列，通过PCR扩增，分别在4个crRNA片段两端加上BpiI识别位点，扩增产物于200uL PCR管中加入BpiI内切酶、T4 DNA连接酶，在“37℃5min→16℃10min(15个循环)→37℃10min→80℃10min→4℃10min”进行酶切连接，将四个片段连接在一起。然后于200uL PCR管中加入不同CRISPR-CasФ植物基因组定向修饰骨架载体、粘末端***片段、BsaI内切酶、T4 DNA连接酶，在“37℃5min→16℃10min(15个循环)→37℃10min→80℃10min→4℃10min”进行酶切连接，取反应产物进行大肠杆菌转化。通过卡那霉素抗性筛选、菌落PCR及酶切鉴定阳性转化子，最终通过经测序验证得到CasФ-methy重组表达载体。
3、CRISPR-CasФ重组表达载体的水稻原生质体转化
CRISPR-CasФ重组表达载体在水稻日本晴原生质体分离、转化及DNA提取的具体过程参考文献(Tang X,Zheng X,Qi Y,Zhang D,Cheng Y,Tang A,Voytas DF,ZhangY.2006.A Single Transcript CRISPR-Cas9System for Efficient Genome Editing inPlants.Mol Plant,9(7):1088-1091.)中公开的实验方法。
4、定向编辑结果检测
基因组表观编辑事件检测及分析方法如下：水稻原生质体转化后，32℃暗培养48小时，收集转化细胞，采用CTAB法从水稻原生质体中提取基因组DNA。根据说明书使用EpiTect Bisulfite Kit(59104；QIANGEN)进行重亚硫酸盐处理。然后将处理过的BS-DNA使用表3中列出的引物扩增目标区域。将PCR产物汇集在一起并通过琼脂糖凝胶电泳纯化。然后PCR扩增子由Novogene(中国天津)采用NovaSeq6000-PE250测序策略进行测序。用Bismark软件(Krueger and Andrews,2011)分析测序结果，计算每个胞嘧啶位点的甲基化百分比。
表3PCR引物序列及产物信息
基于本发明构建的CasФ植物基因组表观编辑载体，针对OsGBSS1启动子区域设计了4个靶向位点，并且组合这些位点，构建了3个表观编辑器。其中5mC1含4个位点(5mC1-cR01、cR02、cR03、cR04)、5mC2(5mC1-cR01)及5mC3(5mC1-cR04)均含1个位点。qPCR结果表明3个表观基因组编辑器5mC1，5mC2，5mC3导致水稻细胞中OsGBSS1的mRNA水平急剧降低(图5A)。进一步基于亚硫酸氢盐PCR(BS-PCR)NGS测序，发现OsGBSS1启动子区域甲基化水平显著提高(图5B)。
Claims (12)
1.一种CasФ核酸酶编码基因，其特征在于其核苷酸序列如Seq ID No.07所示，编码氨基酸序列如Seq ID No.12所述的CasФ核酸酶。
2.根据权利要求1所述的CasФ核酸酶编码基因，其特征在于：与转录激活元件的编码基因相连接；或者与甲基转移酶编码基因相连接；进一步的，所述的转录激活元件为TAL-VP128、VP64、2xTAD、2xTAD-VP64或VPR中的至少一种；或者所述甲基转移酶为Dnmt3A-Dnmt3L、Dnmt3A-Dnmt3L-KRAB或KRAB-Dnmt3A-Dnmt3L甲基转移酶中的至少一种；更进一步的，与转录激活元件或者甲基转移酶编码基因的连接通过链接序列进行，所述的链接序列为XTEN80、XTEN-3xFLAG、SGGSSGGS-XTEN-SGGSSGGS或6xGGGGS中的至少一种。
3.CasФ核酸酶蛋白表达单元，其特征在于所述的CasФ核酸酶蛋白表达单元从5’到3’方向依次为：启动子-CasФ核酸酶编码基因-终止子；所述的CasФ核酸酶编码基因为权利要求1或2任一项所示。
4.根据权利要求6所述的CasФ核酸酶蛋白表达单元，其特征在于：所述的启动子为PolII型启动子；进一步的，所述Pol II型启动子为ZmUbi1、OsUbi1、CaMV35S或AtUb10中的至少一种；或者，所述的终止子为Nos T、35s T、AtHSP T或pinII T中的至少一种；进一步的，CasФ核酸酶蛋白表达单元从5’到3’方向依次为启动子-NLS-CasФ-NLS-终止子，所述CasФ为CasФ核酸酶编码基因；再进一步的，CasФ核酸酶蛋白表达单元从5’到3’方向依次为ZmUbi1-NLS-CasФ-NLS-AtHSP T，所述CasФ为CasФ核酸酶编码基因。
5.根据权利要求6所述的CasФ核酸酶蛋白表达单元，其特征在于：从5’到3’方向依次为启动子-NLS-CasФ-NLS-转录激活元件编码基因-终止子，或启动子-转录激活元件-NLS-CasФ-NLS-终止子；进一步的从5’到3’方向依次为ZmUbi1-NLS-CasФ-NLS-6TAL-VP128-AtHSP T，或ZmUbi1-6TAL-VP128-NLS-CasФ-NLS-AtHSP T。
6.根据权利要求5所述的CasФ核酸酶蛋白表达单元，其特征在于：从5’到3’方向依次为启动子-KRAB-NLS-CasФ-NLS-链接序列-甲基转移酶编码基因-终止子，或启动子-甲基转移酶编码基因-链接序列-NLS-CasФ-KRAB-NLS-终止子；进一步的从5’到3’方向依次为ZmUbi1-KRAB-NLS-CasФ-NLS-XTEN-Dnmt3A-Dnmt3L-AtHSP T，或ZmUbi1-Dnmt3A-Dnmt3L-XTEN-NLS-CasФ-NLS-KRAB-AtHSP T。
7.CRISPR-CasФ植物基因组定向修饰功能单元，其特征在于：包括CasФ核酸酶蛋白表达单元和crRNA转录表达克隆单元两个结构单元；所述的CasФ核酸酶蛋白表达单元为权利要求3～6任一项所述的CasФ核酸酶蛋白表达单元进一步的：所述的crRNA转录表达克隆单元从5’到3’方向依次为：启动子-核酶A编码序列-crRNA克隆单元的编码序列-核酶B编码区序列-终止子；更进一步的，所述crRNA转录表达克隆单元的启动子为Pol II型启动子；更进一步，所述的Pol II型启动子为ZmUbi1、OsUbi1、CaMV35S或AtUb10中的至少一种；或者，所述终止子为Nos T、35s T或HSP T中的至少一种；更进一步，所述的核酶A为I类内含子核酶、RNaseP、发夹状核酶、VS核酶、HH核酶或HDV核酶中的至少一种；或者所述的核酶B为I类内含子核酶、RNaseP、发夹状核酶、VS核酶、HH核酶或HDV核酶中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的CRISPR-CasФ植物基因组定向修饰功能单元，其特征在于：所述的crRNA转录表达克隆单元从5’到3’方向依次为OsUbi1-HH Ribozyme-crRNA scaffold-ccdB-HDV Ribozyme-NOS T。
9.含有权利要求1或2任一项所述的CasФ核酸酶编码基因、权利要求3～6任一项所述的CasФ核酸酶蛋白表达单元或权利要求7～8任一项所述的CRISPR-CasФ植物基因组定向修饰功能单元的载体；进一步的，所述的载体为植物转基因骨架载体；更进一步的，所述的植物转基因骨架载体为pCambia系列、pBI系列、pMDC系列或pGreen系列中的至少一种；优选的，所述的植物转基因骨架载体为pTrans_210d。
10.权利要求1或2任一项所述的CasФ核酸酶编码基因、权利要求3～6任一项所述的CasФ核酸酶蛋白表达单元、权利要求7～8任一项所述的CRISPR-CasФ植物基因组定向修饰功能单元或权利要求9所述的载体在进行植物基因组定向修饰中的用途；优选的，所述的定向修饰为基因组定向敲除编辑、基因定向激活、基因定向抑制或基因组表观编辑中的至少一种；进一步的，所述的植物为单子叶植物或双子叶植物；更进一步的，所述的单子叶植物为禾本科植物；优选的，所述禾本科植物为水稻。
11.针对目标位点特异性修饰CRISPR-CasФ重组表达载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
a、明确待修饰植物基因组的目标DNA区域，分析其中的具有CasФ核酸酶蛋白识别PAM位点特征区域，选择PAM结构3’端相邻的18～24bp DNA序列作为特异性修饰靶序列；所述的PAM位点特征5’-TBN-3’,B表示T、G、C中的任一种；
b、按照选定的特异性修饰靶序列，分别合成具有5’-GGAC-NX-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-GGCC-NX-3’特征的反向寡核苷酸链，N表示A、G、C、T中的任一种，X为整数，且18≤X≤24，其中所述正向寡核苷酸链中的NX和反向寡核苷酸中的NX具有反向互补特征；通过退火获得互补寡核苷酸双链片段；
c、将权利要求9所述的载体与步骤b得到的互补寡核苷酸双链片段混合，进行基于BsaI的Golden Gate组装，得到针对目标位点进行特异性修饰的CRISPR-CasФ重组载体；优选的，步骤a中特异性靶序列长度为20bp。
12.植物基因组定向表观编辑CRISPR-CasФ载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
a、针对待表观编辑的植物的目标基因区域，分析其中的具有CasФ核酸酶蛋白识别PAM位点特征区域，选择PAM结构3’端相邻的DNA序列作为特异性修饰靶序列；所述的PAM位点特征5’-TTV-3’,V表示A、G、C中的任一种；
b、单个crRNA位点编辑载体按照选定的特异性修饰靶序列，分别合成具有5’-GGAC-NX-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-GGCC-NX-3’特征的反向寡核苷酸链，N表示A、G、C、T中的任一种，X为整数，且X＝16，其中所述正向寡核苷酸链中的NX和反向寡核苷酸中的NX具有反向互补特征，通过退火获得互补寡核苷酸双链片段；多个位点编辑载体按照选定的4个特异性修饰靶序列，分别由核酶A和核酶B将靶向位点间隔开，并在序列5’在和3’在分别添加BsaI识别位点合成最终的核苷酸序列；
c、将权利要求9所述的可用于植物基因组定向表观编辑的CRISPR-CasФ骨架载体与步骤b得到的片段混合，进行基于BsaI的Golden Gate组装，得到针对目标位点进行特异性修饰的CRISPR-CasФ重组载体。
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