CN111019946B

CN111019946B - 一种短小型小核rna启动子及其构建方法和在基因组编辑中的应用

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Publication number: CN111019946B
Application number: CN201911338845.0A
Authority: CN
Inventors: 刘耀光; 郭晶心; 祝钦泷; 郝雨; 宗伍辈
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2020-12-11
Anticipated expiration: 2039-12-23
Also published as: CN111019946A

Abstract

本发明提供了一种短小型小核RNA启动子及其构建方法和应用。所述短小型小核RNA启动子的长度为150‑300bp，3’端至5’端方向依次含有1个TATA box保守元件，1个USE保守元件，以及至少一个MSP保守元件。相比现有野生型小核RNA基因启动子，本发明所构建的短小型小核RNA启动子转录活性更强，具有明显更高的驱动sgRNA的编辑效率，而且长度较短，可以减少每个sgRNA表达盒的长度，提高多靶点sgRNA克隆构建载体的效率，利于进行多靶点多基因的同时编辑，在基因组编辑方面具有很好的应用前景。

Description

一种短小型小核RNA启动子及其构建方法和在基因组编辑中的应用

技术领域

本发明属于植物生物技术领域。更具体地，涉及一种短小型小核RNA启动子及其构建方法和在基因组编辑中的应用。

背景技术

近年以来，以CRISPR/Cas9为代表的基因组编辑技术以及其多种衍生基因编辑***(如单碱基编辑器)发展迅速，在动物、植物等多种生物得到了广泛应用。CRISPR/Cas9***需要表达Cas9蛋白和单导向RNA(single guider RNA，sgRNA，其5’含有约19-21碱基的特异靶点序列)，它们结合成Cas9/sgRNA复合体靶向目标基因的靶点序列，由Cas9对靶点DNA进行切割产生双链断裂，并诱发DNA修复时产生碱基变异，达到基因特异突变的目的。如果在受体生物细胞同时表达或导入多个不同靶点的sgRNA，就可以同时进行多靶点编辑(Conget al.,2013,Science 339:819-823)，达到同时突变多个基因的目的。

在植物中以CRISPR/Cas9进行基因组编辑，通常需要构建表达Cas9蛋白和转录sgRNA的表达盒的转化载体，如以农杆菌介导转化的双元载体。通常用于驱动sgRNA转录的启动子为小核RNA(small nuclear RNA,snRNA)基因如U3和U6的启动子，因为snRNA基因启动子利用RNA聚合酶III进行转录，所产生的RNA(sgRNA)存在于细胞核中，利于引导Cas9到核基因组靶点对靶序列进行切割。植物U3、U6启动子在近3’端含有一个保守的TATA box元件，紧接其5’上游有一个保守的USE(upstream sequence element)元件，以及在USE上游区域分散存在3～4个MSP(monocot-specific promoter element,RGCCCR,R＝G,A)；这些保守元件是U3、U6启动子活性所必需的，其中TATA box和USE的相对位置较固定(间隔24-25bp)，但USE上游区域的多个MSP的位置不确定(Connelly et al.,1994,Molecular CellBiology 14:5910-5919)。

在植物进行多个靶点编辑主要采用2种策略：(1)在转化载体中连接上多个独立的U3、U6启动子-sgRNA表达盒，每个表达盒独立转录产生一种sgRNA(Ma et al.,2015,Molecular Plant,8:1274-1284)；(2)在一个U3、U6启动子驱动下转录产生一串sgRNA-linker-sgRNA-lingker-sgRNA-linker-sgRNA…重复单元，这里的linker是指能够自催化剪切的核酶，或者在细胞内能够被加工剪切的pre-tRNA或基因内含子RNA序列，经加工剪切后释放出多种成熟的sgRNA(Xie et al.,2015,Proc Natl Acad Sci USA,112:3570-3575；Cermak et al.,2017,Plant Cell 29,1196-1217；Ding et al.,2017,Molecular Plant,11:542-552)。第(2)种方法的主要局限性在于，当串联的sgRNA-linker重复单元较多(如>10)时，U3、U6启动子能够产生全长RNA的能力有限，排列在后面的sgRNA单元可能得不到高效转录。目前文献报道最多是8个sgRNA-linker重复单元(Xie et al.,2015,Proc NatlAcad Sci USA,112:3570-3575)。第(1)种方法的每种sgRNA都能独立有效地转录，但目前使用的植物U3(U6)启动子长度较大，如水稻OsU3,OsU6a,OsU6b,OsU6c长约400-740bp(Ma etal.,2015，Molecular Plant,8:1274-1284)，整个表达盒长度为约550-900bp，即使利用连接效率较高的“金门(Golden Gate)”方法同时连接较多表达盒(>10)时，其克隆效率仍然很低(Xie et al.,2015,Proc Natl Acad Sci USA,112:3570-3575)。在克隆DNA片段到质粒载体的操作中，同时连接的片段数越多，各片段的长度越长，克隆效率就越低。

因此，如果能够改造创建长度较短且转录活性相当或更强的U3、U6启动子，就可以减少每个sgRNA表达盒的长度，提高多靶点sgRNA克隆构建载体的效率，利于进行多靶点多基因的同时编辑，促进分子生物学发展和生物技术应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有的U3和U6启动子的MSP位置较分散，造成使用的这类启动子长度较长，不利于在植物基因组编辑中克隆多个sgRNA表达盒的局限性，旨在创建一种短小型修饰U3和U6启动子，并将其应用于植物的多基因靶点编辑。

本发明的目的是提供一种短小型小核RNA启动子及其构建方法。

本发明另一目的是提供所述短小型小核RNA启动子在基因组编辑中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种短小型小核RNA启动子，其长度为150-300bp，其3’端至5’端方向依次含有1个TATA box保守元件，1个USE保守元件，以及至少一个MSP保守元件。

优选地，所述短小型小核RNA启动子的长度为170-230bp。

另外优选地，所述MSP保守元件的数量为至少2个。

更优选地，MSP保守元件的数量为2-5个。

基于植物小核RNA启动子的特征，作为一种可选择的实施方案，所述短小型小核RNA启动子可以以现有的野生型小核RNA基因启动子为基础进行人为改造得到，具体构建方法如下：将生物的野生型小核RNA基因启动子序列从5’端截去一段，使得留用的启动子部分保留有1个TATA box保守元件，1个USE保守元件，以及至少1个MSP保守元件，得到新的具有转录活性的短小型小核RNA启动子。

本发明构建短小型小核RNA启动子的原则是：将生物的野生型小核RNA基因启动子序列从5’端截去一段，在保留TATA-BOX、USE和至少1个MSP元件的前提下，启动子要尽可能的短，并且可尽可能多的MSP元件；当原始MSP元件数量较少时，可以人为在USE的5’上游***至少1个MSP。多个MSP元件可以增强启动子的活性。

优选地，所述短小型小核RNA启动子的长度可控制在150-300bp。更优选地长度为170-230bp。

优选地，使MSP保守元件的数量为至少2个，当按照上述原则截去5’端一段后MSP数量不足时，人为在USE的5’上游增加至少1个MSP保守元件，使得启动子上至少有2个MSP保守元件。更优选地，使MSP保守元件的数量为2-5个，以提高其转录活性。

本发明的技术中，用于改造的野生型小核RNA基因启动子可以来源于植物，优先地来源于水稻。如野生型小核RNA启动子OsU3、OsU6a、OsU6b或OsU6c。

具体地作为一种实施方案，以来源于水稻的野生型小核RNA启动子OsU3、OsU6a、OsU6b或OsU6c为基础，按照上述构建方法所得短小型小核RNA启动子为mOsU3、mOsU6a、mOsU6b或mOsU6c，其序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

SEQ ID NO.1(短小型小核RNA启动子mOsU3的DNA序列，170bp)：GGCCCAATCGGCAGCAAAGGAGTGGCCCATGAAGCCCATCAGGACATGTATTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGGCTAGTATTAGTACCACCTCGGCTATCCACATAGATCAAAGCTGGTTTAAAAGAGTTGTGCAGATGATCCGTGGCA

SEQ ID NO.2(短小型小核RNA启动子mOsU6a的DNA序列，223bp)：GGCCCAATCGGCAGCAAAGGAGGCCCAGGACGGAATAGGGGAAAAAGTTGGCCCGATAGGAGGGAAAGGCCCAGGTGCTTACGTGCGAGGTAGGCCTGGGCTCTCAGCACTTCGATTCGTTGGCACCGGGGTAGGATGCAATAGAGAGCAACGTTTAGTACCACCTCGCTTAGCTAGAGCAAACTGGACTGCCTTATATGCGCGGGTGCTGGCTTGGCTGCCG

SEQ ID NO.3(短小型小核RNA启动子mOsU6b的DNA序列，189bp)：GGCCCAATCGGCAGCAAAGGAGGCCCACGAGCGTGTACTACGGCCCGGGATGCCGCTGGGCGCTGCGGGGGCCGTTGGATGGGGATCGGTGGGTCGCGGGAGCGTTGAGGGGAGACAGGTTTAGTACCACCTCGCCTACCGAACAATGAAGAACCCACCTTATAACCCCGCGCGCTGCCGCTTGTGTTG

SEQ ID NO.4(短小型小核RNA启动子mOsU6c的DNA序列，194bp)：GGCCCAATCGGCAGCAAAGGAGGCCCACTTTTCTCCGTGGTGGGCCGATCCAGCTAGAGGTCCGGCCCACAAGTGGCCCTTGCCCCGTGGGACGGTGGGATTGCAGAGCGCGTGGGCGGAAACAACAGTTTAGTACCACCTCGCTCACGCAACGACGCGACCACTTGCTTATAAGCTGCTGCGCTGAGGCTCAG

本发明上述构建的短小型小核RNA启动子驱动sgRNA具有很高的编辑效率，且明显优于野生型启动子，更重要的是，相比野生型启动子，所构建的短小型小核RNA启动子克服了现有U3、U6启动子的MSP位置较分散造成使用的这类启动子长度较长而不利于在植物基因组编辑中克隆多个sgRNA表达盒的局限性，是一种长度较短且转录活性更强的U3、U6启动子，可以减少每个sgRNA表达盒的长度，提高多靶点sgRNA克隆构建载体的效率，利于进行多靶点多基因的同时编辑。

因此，含有所述短小型小核RNA启动子的质粒载体等材料，以及所述短小型小核RNA启动子在基因组编辑中的应用，均应在本发明的保护范围之内。

更具体地，所述短小型小核RNA启动子可应用于驱动基因组编辑所需的sgRNA的转录；尤其是应用于构建多靶点基因组编辑载体，可以提高连接克隆多个sgRNA表达盒的效率，利于进行多靶点同时编辑。

优选地指应用于单子叶植物尤其水稻的多靶点基因组编辑。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种短小型小核RNA启动子的构建方法，构建原则是：将生物的野生型小核RNA基因启动子序列从5’端截去一段，在保留TATA-BOX、USE和至少1个MSP元件的前提下，启动子要尽可能的短，并且尽可能多的MSP元件；当原始MSP元件数量较少时，可以人为在TATA-BOX和USE前***至少1个MSP，构建所得短小型小核RNA启动子长度优选控制在150-300bp。

相比野生型小核RNA基因启动子，本发明所构建的短小型小核RNA启动子转录活性更强，具有明显更高的驱动sgRNA的编辑效率，而且长度较短，可以减少每个sgRNA表达盒的长度，提高多靶点sgRNA克隆构建载体的效率，利于进行多靶点多基因的同时编辑，应用前景好。

附图说明

图1为小核RNA基因的野生型启动子和改造的短小型启动子的结构比较。MSP，单子叶特异性启动子元件；USE，保守的上游序列元件；保守的TATA box元件。

图2为短小型启动子的序列结构。下划线为MSP(RGCCCR，R＝G or A，任一方向)；斜体为USE；斜体+下划线为TATA box；小写字符为人为改变的碱基。

图3为小核RNA基因修饰的短小型启动子(A)和野生型启动子(B)的编辑效率的比较。括号的数字，左边代表编辑的为点数，右边代表分析的转基因植株总数。

图4为利用野生型或修饰的短小型启动子连接多个sgRNA表达盒的克隆效率比较。(A)利用短小型启动子构建的12个或20个sgRNA表达盒的双元载体结构示意图；(B)不同数量的野生型或短小型启动子驱动sgRNA表达盒的克隆效率比较。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规分子生物学方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1小核RNA基因短小型启动子的改造

利用含有水稻小核RNA基因野生型启动子的质粒pYLgRNA-OsU6a、pYLgRNA-OsU6b、pYLgRNA-OsU6c和pYLgRNA-OsU3(Ma et al.,2015，Molecular Plant,8:1274-1284)作为模板，分别用引物对(表1)进行反向PCR扩增，纯化PCR产物，通过Gibson反应分别获得含短小型启动子mOsU6a、mOsU6b、mOsU6c、mOsU3、和sgRNA的质粒pYLgRNA-mOsU6a、pYLgRNA-mOsU6b、pYLgRNA-mOsU6c和pYLgRNA-mOsU3，最后测序确定短小型启动子序列(图1和图2)。

表1用于小核RNA基因启动子改造

具体程序如下：

1.短小型启动子mOsU6a的改造

使用mU6a F/mU6aR(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO 6)为引物，pYLgRNA-OsU6a质粒为模板。

PCR体系(50μl)：2×Phanta Max Buffer 25.0μl，10mM dNTPs Mix 1.0μl，PhantaMax Polymerase 1.0μl，pYLgRNA-U6a 3ng，10μM U6a F1.0μl，10μM U6a R 1.0μl，ddH₂O补足到50μl。

PCR程序：预变性95℃2min，32个PCR循环(95℃10s,56℃15s,72℃3min)，延伸72℃2min。

用Genstar纯化试剂盒，纯化PCR产物，用于Gibson组装反应(NEB#E5510S)：2×Mix3μl，PCR纯化产物3μl，50℃30min。取1.5μlGibson反应产物，电激转化大肠杆菌DH10B，在氨苄抗性(Amp)LB平板上，筛选转化单克隆。最后用U-F引物(SEQ ID NO.13)测序，获得含改造的短小型启动子mOsU6a和gRNA的质粒pYLgRNA-mOsU6a。

2.短小型启动子mOsU6b的改造

使用mU6b F/mU6b R(SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8)为引物，pYLgRNA-OsU6b质粒为模板。其余PCR体系(50μl)、PCR程序、PCR产物纯化、Gibson组装反应、转化与Amp的LB平板筛选，均同mOsU6a启动子改造。最后用U-F引物(SEQ ID NO.13)测序，获得含改造的短小型启动子mOsU6b和gRNA的质粒pYLgRNA-mOsU6b。

3.短小型启动子mOsU6c的改造

使用mU6c F/mU6c R(SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10)为引物，pYLgRNA-OsU6c质粒为模板。其余PCR体系(50μl)、PCR程序、PCR产物纯化、Gibson组装反应、转化与Amp的LB平板筛选，均同mOsU6a启动子改造。最后用U-F引物(SEQ ID NO.13)测序，获得含改造的短小型启动子mOsU6c和gRNA的质粒pYLgRNA-mOsU6c。

4.短小型启动子mOsU3的改造

使用mU3 F/mU3 R(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)为引物，pYLgRNA-OsU3质粒为模板。其余PCR体系(50μl)、PCR程序、PCR产物纯化、Gibson组装反应、转化与Amp的LB平板筛选，均同mOsU6a启动子改造。最后用U-F引物(SEQ ID NO.13)测序，获得含改造的短小型启动子mOsU3和gRNA的质粒pYLgRNA-mOsU3。

实施例2、短小型启动子驱动sgRNA具有高的编辑效率

参考本发明人团队前期发表的文献(Ma et al.,2015，Molecular Plant,8:1274-1284；Ma and Liu,2016，Current Protocols in Molecular Biology,115:31.6.1-31.6.21；曾栋昌等，2018，中国科学:生命科学,48:783-794)，分别构建短小型启动子(mOsU6a、mOsU6b、mOsU6c和mOsU3)和作为对照的野生型小核RNA基因启动子(OsU6a、OsU6b、OsU6c和OsU3)驱动不同靶点的sgRNA表达盒，用“金门组装，Golden Gate”方式***pYLCRISPR/Cas9Pubi-H双元载体(Ma et al.,2015，Molecular Plant,8:1274-1284)，转化水稻，并对转化体靶点测序，分析短小型启动子驱动sgRNA编辑效率。

1.不同靶点的引物设计

利用我们开发的网上程序CRISPR-GE网页(http://skl.scau.edu.cn/)(Xie etal.,2018,Molecular plant,11:720-735),进入引物设计(PrimerDesign)子程序，primerDesign-V分支程序，选择对应启动子，勾上复选框，并选择method2，点击design,自动生成不同的靶点引物gR-T#与U#-T#。

2.不同sgRNA表达盒的Overlapping PCR拼接

按照我们前期发表的文献(Ma et al.,2015，Molecular Plant,8:1274-1284；Maand Liu,2016，Current Protocols in Molecular Biology,115:31.6.1-31.6.21；曾栋昌等，2018，中国科学:生命科学,48:783-794)操作，通过两轮PCR，获得两侧具有Bsa I酶切位点的小RNA启动子驱动的sgRNA表达盒。

第一轮PCR，利用设计的U#-T#/gR-T#引物将靶点序列引入到mU3/mU6或U3/U6启动子下游和sgRNA序列的上游。在一个PCR体系中，利用U-F引物(SEQ ID NO.13，表2)与gR-T#引物配对，PCR扩增获得含靶点的启动子序列；利用gRNA-R引物(SEQ ID NO.14，表2)与U#-T#引物配对，PCR扩增获得含靶点的sgRNA序列。PCR体系(20μl)：2×Phanta Max Buffer10.0μl，10mM dNTPs Mix 0.4μl，Phanta Max Polymerase 0.3μl，pYLgRNA-mOsU6/3(含启动子和sgRNA质粒)3ng，10μM U-F0.4μl，10μM gR-T#0.2μl，10μM gRNA-R0.4μl，10μM U#-T#0.2μl，ddH₂O补足到20μl。PCR程序：预变性95℃1min，28个PCR循环(95℃10s,58℃15s,72℃20s)，延伸72℃1min。

第二轮PCR，拼接小RNA启动子驱动的sgRNA表达盒，并在PCR产物两侧加上Bsa I酶切位点。PCR体系(50μl)：2×Phanta Max Buffer 25.0μl，10mM dNTPs Mix 1.0μl，PhantaMax Polymerase 1.0μl，10×稀释上一轮PCR产物1.0μl，10μM Pps-L(SEQ ID NO.15)1.0μl，10μM Pgs-R(SEQ ID NO.16)1.0μl，ddH₂O补足到50μl。PCR程序同上述第一轮PCR。使用Genstar纯化试剂盒纯化PCR产物。

3.含不同靶点sgRNA表达盒的敲除载体的构建

使用基于Bsa I酶切和连接的“金门”克隆方法，以“边切边连接”方式(Ma andLiu,2016，Current Protocols in Molecular Biology,115:31.6.1-31.6.21；曾栋昌等，2018，中国科学:生命科学,48:783-794)，分别组装不同小核RNA启动子驱动的sgRNA表达盒到双元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H上。15μl反应体系：10×CutSmart Buffer 1.5μl，10mMATP 1.5μl，pYLCRISPR/Cas9Pubi-H质粒80～100ng，纯化后的sgRNA表达盒10～15ng，BsaI-HF 10U，T4 DNA ligase 35U，ddH₂O补足到15μl。用PCR仪变温循环进行酶切连接反应：37℃10min，接着10-12循环(37℃5min,10℃3min,20℃5min)；最后37℃3min。透析连接产物后，电激转化进入DH10B细胞，在卡拉抗性(Kan)LB板上筛选，用引物对SP-L1/SP-R1(SEQ IDNO.17和SEQ ID NO.18)，根据文献(Ma and Liu,2016，Current Protocols in MolecularBiology,115:31.6.1-31.6.21；曾栋昌等，2018，中国科学:生命科学,48:783-794)，做菌落PCR，筛选阳性克隆，最终用引物SP-L1测序确定。

4.短小型启动子驱动sgRNA编辑效率

利用农杆菌介导的水稻愈伤转化，把上述含不同小RNA启动子驱动的sgRNA的正确载体转化入水稻，提取T0代转化植株的叶片DNA作为模板，扩增含敲出位点的DNA片段，直接测序，按照文献方法对编辑位点进行解码(Liu et al.,2015)，统计、比较不同短小型启动子与其对应野生型启动子的编辑效率，结果表明创建的短小型启动子总体编辑效率(Sum)为84％，比野生型总体编辑效率(82％)略高，除mOsU6c启动子编辑效率(72.7％)略低于野生型OsU6c启动子编辑效率(78.9％)外，其余短小型启动子mOsU3、mOsU6a和mOsU6b编辑效率都高于相应的野生型启动子编辑效率(图3)。

实施例3、短启动子提高连接克隆多个sgRNA表达盒效率

“金门组装”方法，能够进行多个DNA片段的组装，其连接片段数、连接效率与连接片段的大小有关，当连接片段越小，其连接的DNA片段数越多、连接效率越高。为验证利用短启动子提高连接克隆多个sgRNA表达盒的效率，根据本发明人团队前期发表的文献(Ma andLiu,2016，Current Protocols in Molecular Biology,115:31.6.1-31.6.21；曾栋昌等，2018，中国科学:生命科学,48:783-794)，利用“金门组装”在pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体中同时克隆12个或20个不同启动子驱动的sgRNA表达盒(图4A)，统计成功连接多个sgRNA表达盒的克隆的比例，并与野生型启动子连接克隆多个sgRNA表达盒效率比较。

1.不同靶点的引物设计

利用我们开发的网上程序CRISPR-GE网页(http://skl.scau.edu.cn/)(Xie etal.,2018,Molecular plant,11:720-735)，操作同上述实施例2的第1点。

2.sgRNA表达盒的Overlapping PCR拼接

按照我们前期发表的文献(Ma and Liu,2016，Current Protocols in MolecularBiology,115:31.6.1-31.6.21；曾栋昌等，2018，中国科学:生命科学,48:783-794)操作，通过两轮PCR，获得两侧具有Bsa I酶切位点的不同启动子驱动的sgRNA表达盒。对于连接多个sgRNA表达盒时，不同短小型启动子按mOsU6a-mOsU6a-mOsU6b-mOsU6b-mOsU6c-mOsU6c-mOsU3-mOsU3的顺序循环重复使用(图4A)，第二轮PCR使用的含Bsa I酶切位点的具体引物见表2。

表2多个sgRNA表达盒组装的引物序列

注：加粗的黑色大写字母为Bsa I位点酶切后产生的非回文结构的粘性末端。加粗的下划线的黑色小写字母为MSP(单子叶特异启动子元件)元件。

第一轮PCR，操作步骤同上所述实施例2的第2点。

第二轮PCR，以稀释10倍的第一轮PCR产物为模板，按照表3的引物组合，进行PCR扩增、纯化，获得用于“金门组装”的多个不同sgRNA表达盒。每一个表达盒Overlapping拼接的PCR体系(100.0μl)：2×Phanta Max Buffer 50.0μl，10mM dNTPs Mix 2.0μl，Phanta MaxPolymerase 2.0μl，10×稀释上一轮PCR产物1μl，10μM Pps 2.0μl，10μM Pgs2.0μl，ddH₂O补足到100μl。PCR程序：预变性95℃1min，32个PCR循环(95℃10s,58℃15s,72℃20s)，延伸72℃1min。使用Genstar纯化试剂盒纯化PCR产物。

表3组装不同数量sgRNA表达盒的第二轮PCR引物组合

3.多个sgRNA表达盒“金门组装”一步克隆到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H上的克隆效率

使用基于Bsa I的“边切边连接”方式(Ma and Liu,2016，Current Protocols inMolecular Biology,115:31.6.1-31.6.21；曾栋昌等，2018，中国科学:生命科学,48:783-794)，一步组装不同小核RNA启动子驱动的sgRNA表达盒到双元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H上对应位点。15μl PCR反应体系：10×CutSmart Buffer1.5μl，10mM ATP 1.5μl，pYLCRISPR/Cas9Pubi-H质粒140～200ng，纯化后的每个sgRNA表达盒30～50ng，Bsa I-HF10U，T4 DNA ligase 35U，ddH₂O补足到15μl。用PCR仪变温循环进行酶切连接反应：37℃10min，接着25-32循环(37℃5min,10℃3min,20℃5min)；最后37℃5min。透析连接产物后，电激转化进入DH10B细胞，在卡拉抗性(Kan)LB板上筛选抗性克隆。

根据文献(Ma and Liu,2016，Current Protocols in Molecular Biology,115:31.6.1-31.6.21；曾栋昌等，2018，中国科学:生命科学,48:783-794)，用引物对SP-L1/SP-R1(SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18)做菌落PCR，筛选阳性克隆。20μl PCR反应体系：普通TaqMix 10.0μl，10μM SP-L1 0.4μl，10μM SP-R1 0.4μl，Phanta Max Polymerase 0.03μl，ddH₂O补足到20μl。PCR程序：预变性95℃5min，28个PCR循环(95℃25s,56℃20s,72℃20s/表达盒)，最后延伸72℃5min。每一小核RNA基因短小型启动子驱动的sgRNA表达盒的大小约300bp左右，而小核RNA基因野生型启动子驱动的sgRNA表达盒较大小约550～900bp左右。统计具有预期PCR条带大小的克隆数除以总的检测的克隆数，得到连接效率。结果如图4B显示，短小启动子能够有效地进行20个sgRNA表达盒的拼接，而野生型启动子用于10个及以上sgRNA表达盒的拼接时，不能获得阳性克隆。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种短小型小核RNA启动子及其构建方法和在基因组编辑中的应用

<130>

<160> 56

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 170

<212> DNA

<213> 短小型小核RNA启动子mOsU3

<400> 1

ggcccaatcg gcagcaaagg agtggcccat gaagcccatc aggacatgta ttgcagtatg 60

ggccggccca ttacgcaatt ggacgacaac aaaggctagt attagtacca cctcggctat 120

ccacatagat caaagctggt ttaaaagagt tgtgcagatg atccgtggca 170

<210> 2

<211> 223

<212> DNA

<213> 短小型小核RNA启动子mOsU6a

<400> 2

ggcccaatcg gcagcaaagg aggcccagga cggaataggg gaaaaagttg gcccgatagg 60

agggaaaggc ccaggtgctt acgtgcgagg taggcctggg ctctcagcac ttcgattcgt 120

tggcaccggg gtaggatgca atagagagca acgtttagta ccacctcgct tagctagagc 180

aaactggact gccttatatg cgcgggtgct ggcttggctg ccg 223

<210> 3

<211> 189

<212> DNA

<213> 短小型小核RNA启动子mOsU6b

<400> 3

ggcccaatcg gcagcaaagg aggcccacga gcgtgtacta cggcccggga tgccgctggg 60

cgctgcgggg gccgttggat ggggatcggt gggtcgcggg agcgttgagg ggagacaggt 120

ttagtaccac ctcgcctacc gaacaatgaa gaacccacct tataaccccg cgcgctgccg 180

cttgtgttg 189

<210> 4

<211> 194

<212> DNA

<213> 短小型小核RNA启动子mOsU6c

<400> 4

ggcccaatcg gcagcaaagg aggcccactt ttctccgtgg tgggccgatc cagctagagg 60

tccggcccac aagtggccct tgccccgtgg gacggtggga ttgcagagcg cgtgggcgga 120

aacaacagtt tagtaccacc tcgctcacgc aacgacgcga ccacttgctt ataagctgct 180

gcgctgaggc tcag 194

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 引物mU6a F

<400> 5

ggcccaggac ggaatagggg aaaaagttgg cccgat 36

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 引物mU6a R

<400> 6

ccctattccg tcctgggcct cctttgctgc cgattcc 37

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物mU6b F

<400> 7

ggcccacgag cgtgtactac ggcccgg 27

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 引物mU6b R

<400> 8

tagtacacgc tcgtgggccc ctttgctgcc gattcc 36

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物mU6c F

<400> 9

ggcccacttt tctccgtggt gggccgatcc 30

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 引物mU6c R

<400> 10

ccacggagaa aagtgggccc ctttgctgcc gattcc 36

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物mU3 F

<400> 11

gtggcccatg aagcccatca gg 22

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> 引物mU3 R

<400> 12

gatcggcttc atgggccact cctttgctgc cgattcc 37

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物U-F

<400> 13

ctccgtttta cctgtggaat cg 22

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物gR-R

<400> 14

cggaggaaaa ttccatccac 20

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 引物Pps-L

<400> 15

ttcagaggtc tctctcgccc gggcccaatc ggcagcaaag ga 42

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> 引物Pgs-R

<400> 16

agtgtaggtc tctaccgtcc cgggtccatc cactccaagc t 41

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物SP-L1

<400> 17

gcggtgtcat ctatgttact ag 22

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物SP-R1

<400> 18

tgcaataact tcgtataggc t 21

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物Pgs-2

<400> 19

agcgtgggtc tcgtcagtcc atccactcca agctc 35

<210> 20

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物Pps-2

<400> 20

ttcagaggtc tctctgaggc ccaatcggca gcaaagga 38

<210> 21

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物Pgs-3

<400> 21

agcgtgggtc tcgtctttcc atccactcca agctc 35

<210> 22

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物Pps-3

<400> 22

ttcagaggtc tctaagaggc ccaatcggca gcaaagga 38

<210> 23

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物Pgs-4

<400> 23

agcgtgggtc tcgagtctcc atccactcca agctc 35

<210> 24

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物Pps-4

<400> 24

ttcagaggtc tctgactggc ccaatcggca gcaaagga 38

<210> 25

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物Pgs-5

<400> 25

agcgtgggtc tcggtcctcc atccactcca agctc 35

<210> 26

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物Pps-5

<400> 26

ttcagaggtc tctggacggc ccaatcggca gcaaagga 38

<210> 27

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物Pgs-6

<400> 27

agcgtgggtc tcgcagatcc atccactcca agctc 35

<210> 28

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物Pps-6

<400> 28

ttcagaggtc tcttctgggc ccaatcggca gcaaagga 38

<210> 29

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物Pgs-7

<400> 29

agcgtgggtc tcgaccttcc atccactcca agctc 35

<210> 30

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物Pps-7

<400> 30

ttcagaggtc tctaggtggc ccaatcggca gcaaagga 38

<210> 31

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物Pgs-8

<400> 31

agcgtgggtc tcgagcgtcc atccactcca agctc 35

<210> 32

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物Pps-8

<400> 32

ttcagaggtc tctcgctggc ccaatcggca gcaaagga 38

<210> 33

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物Pgs-9

<400> 33

agcgtgggtc tcggagctcc atccactcca agctc 35

<210> 34

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物Pps-9

<400> 34

ttcagaggtc tctgctcggc ccaatcggca gcaaagga 38

<210> 35

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物Pgs-10

<400> 35

agcgtgggtc tcgcaggtcc atccactcca agctc 35

<210> 36

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物Pps-10

<400> 36

ttcagaggtc tctcctgggc ccaatcggca gcaaagga 38

<210> 37

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物Pgs-11

<400> 37

agcgtgggtc tcgatcgtcc atccactcca agctc 35

<210> 38

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物Pps-11

<400> 38

ttcagaggtc tctcgatggc ccaatcggca gcaaagga 38

<210> 39

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物Pgs-12

<400> 39

agcgtgggtc tcgacattcc atccactcca agctc 35

<210> 40

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物Pps-12

<400> 40

ttcagaggtc tctatgtggc ccaatcggca gcaaagga 38

<210> 41

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物Pgs-13

<400> 41

agcgtgggtc tcgcacttcc atccactcca agctc 35

<210> 42

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物Pps-13

<400> 42

ttcagaggtc tctagtgggc ccaatcggca gcaaagga 38

<210> 43

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物Pgs-14

<400> 43

agcgtgggtc tcgtgcctcc atccactcca agctc 35

<210> 44

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物Pps-14

<400> 44

ttcagaggtc tctggcaggc ccaatcggca gcaaagga 38

<210> 45

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物Pgs-15

<400> 45

agcgtgggtc tcggcgttcc atccactcca agctc 35

<210> 46

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物Pps-15

<400> 46

ttcagaggtc tctacgcggc ccaatcggca gcaaagga 38

<210> 47

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物Pgs-16

<400> 47

agcgtgggtc tcggtgctcc atccactcca agctc 35

<210> 48

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物Pps-16

<400> 48

ttcagaggtc tctgcacggc ccaatcggca gcaaagga 38

<210> 49

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物Pgs-17

<400> 49

agcgtgggtc tcggatgtcc atccactcca agctc 35

<210> 50

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物Pps-17

<400> 50

ttcagaggtc tctcatcggc ccaatcggca gcaaagga 38

<210> 51

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物Pgs-18

<400> 51

agcgtgggtc tcgcacgtcc atccactcca agctc 35

<210> 52

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物Pps-18

<400> 52

ttcagaggtc tctcgtgggc ccaatcggca gcaaagga 38

<210> 53

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物Pgs-19

<400> 53

agcgtgggtc tcgtcactcc atccactcca agctc 35

<210> 54

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物Pps-19

<400> 54

ttcagaggtc tctgtgaggc ccaatcggca gcaaagga 38

<210> 55

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物Pgs-20

<400> 55

agcgtgggtc tcgtgcgtcc atccactcca agctc 35

<210> 56

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物Pps-20

<400> 56

ttcagaggtc tctcgcaggc ccaatcggca gcaaagga 38

Claims

1.一种短小型小核RNA启动子，其特征在于，所述短小型小核RNA启动子为mOsU3、mOsU6a、mOsU6b或mOsU6c，其序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4所示。

2.含有权利要求1所述短小型小核RNA启动子的质粒载体。

3.权利要求1所述短小型小核RNA启动子在基因组编辑中的应用。