CN116410938B

CN116410938B - β-丙氨酸连接酶突变体及其应用

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Publication number: CN116410938B
Application number: CN202310421142.4A
Authority: CN
Inventors: 赵弘; 丁颖; 段晓伟; 丁小妹; 陈淋转; 于铁妹; 潘俊锋; 刘建
Original assignee: Zhuhai Ruidelin Biology Co ltd; Shenzhen Readline Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhuhai Ruidelin Biology Co ltd; Shenzhen Readline Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-04-14
Filing date: 2023-04-14
Publication date: 2024-03-12
Anticipated expiration: 2043-04-14
Also published as: CN116410938A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及β‑丙氨酸连接酶突变体及其应用。本发明提供了连接酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明利用放线杆菌体内的一个L‑氨基酸连接酶能催化连接β‑丙氨酸与其他氨基酸的特点，通过对其催化活性口袋以及其他相关部位氨基酸残基进行突变，最终获得高催化活性生产肌肽。该方法大大优于化学合成制备工艺，在生产成本、能耗、产品品质以及绿色指数方面都表现出突出的优势。因此该方法的规模化生产将是肌肽生产的优先选项。

Description

β-丙氨酸连接酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及β-丙氨酸连接酶突变体及其应用。

背景技术

β-丙氨酸是一种天然存在的β氨基酸，其氨基连接至丙氨酸的β-碳，而不是更常见的α-碳。β-丙氨酸通常被用作运动补充剂和耐力辅助剂，它可以提高运动表现并促进整体健康，与此同时，β-丙氨酸也是肌肽等很多其它短肽的组成部分。肌肽(L-Carnosine)是一种有助于缓冲肌肉酸的分子，具有调节免疫、维持人体内分泌平衡以及滋养身体等作用。

目前市面上报道的肌肽制备方法有化学合成法和生物法。

传统的化学合成法是目前该类二肽产品主要的生产工艺，制备过程为先用邻苯二甲酸酐保护β-丙氨酸氨基，然后利用氯化亚砜活化羧基，再与三甲基氯硅烷保护的L-组氨酸缩合得保护的肌肽，最后再脱保护。化学合成法通常需要经过繁琐的官能团化学保护/脱保护的步骤，由于合成路线长，直接导致该类产品生产成本太高，整体收率低且过程中容易外消旋，进而大大地制约其进一步推广应用。

现有的利用生物法制备肌肽，主要的生产工艺为酶法，制备过程为采用氨肽酶催化β-丙氨酸甲酯与L-组氨酸合成肌肽，该方法需要酯化的β-丙氨酸，同时由于氨肽酶反应为可逆反应，所以转化不完全，这直接导致整体收率低，最终产品分离纯化困难；同时也有报道利用分离的活性微生物培养发酵，然后对发酵液进行分离纯化的方法，但由于产品浓度不高，且细胞培养液成分复杂，这导致最终分离纯化困难。

综上所述，利用化学合成法进行肌肽(L-carnosine)的制备，存在制备路线长，有机溶剂用量大，最终收率低且产品质量差的问题；而利用酶法制备肌肽(L-carnosine)，在工业放大过程中存在转化不完全、整体收率低、分离纯化困难等问题。因此，探索改造L-氨基酸连接制备肌肽具有很大的竞争优势及实际应用价值，开发新的、更优的生产工艺是目前生产肌肽产品比较现实的需求。

发明内容

有鉴于此，本发明提供的β-丙氨酸连接酶突变体及其应用，其优于化学合成制备工艺，在生产成本、能耗、产品品质以及绿色指数方面都表现出突出的优势。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了Uniprot ID为B0BTG0的氨基酸连接酶的突变体，突变位点包括：

第13位氨基酸残基突变为赖氨酸；和/或

第14位氨基酸残基突变为苏氨酸；和/或

第87位氨基酸残基突变为丝氨酸；和/或

第291位氨基酸残基突变为谷氨酰胺；和/或

第317位氨基酸残基突变为甲硫氨酸。

在本发明的一些具体实施方案中，上述突变体的突变位点还包括：

第91位氨基酸残基突变为甲硫氨酸；和/或

第239位氨基酸残基突变为天冬酰胺；和/或

第287位氨基酸残基突变为亮氨酸。

在本发明的一些具体实施方案中，上述β-丙氨酸连接酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明的一些具体实施方案中，上述β-丙氨酸连接酶突变体，具有：

(1)、如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能相同或相似；或

(2)、与如(1)所示的氨基酸序列至少有70％同源性的氨基酸序列；

所述多个为2个至60个。

本发明还提供了编码上述β-丙氨酸连接酶突变体的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明的一些具体实施方案中，上述核酸分子具有：

(3)、如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能相同或相似；或

(4)、与如(3)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；

所述多个为2个至200个。

本发明还提供了表达载体，包括上述核酸分子。

本发明还提供了宿主细胞，包括上述核酸分子或上述表达载体。

本发明还提供了组合物，其为三磷酸腺苷和上述β-丙氨酸连接酶突变体。

在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物为三磷酸腺苷、多聚磷酸激酶、六偏磷酸和上述β-丙氨酸连接酶突变体。

在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物中所述多聚磷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物中所述多聚磷酸激酶具有：

(5)、如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能相同或相似；或

(6)、与如(5)或(6)所示的氨基酸序列至少有70％同源性的氨基酸序列；

所述多个为2个至80个。

在本发明的一些具体实施方案中，上述β-丙氨酸连接酶突变体在合成肌肽中的应用。

本发明还提供了如下任意项在合成肌肽中的应用：

(I)、上述核酸分子；

(II)、上述表达载体；

(III)、上述宿主细胞；

(IV)、上述组合物。

本发明还提供了肌肽的合成方法，取上述β-丙氨酸连接酶突变体与β-丙氨酸、L-组氨酸混合反应，获得所述肌肽。

在本发明的一些具体实施方案中，上述合成方法，取上述组合物与β-丙氨酸、L-组氨酸、三磷酸腺苷、多聚磷酸激酶、六偏磷酸混合反应，获得所述肌肽。

在本发明的一些具体实施方案中，上述肌肽的合成方法还包括：

(a)、表达上述核酸分子，获得的蛋白产物与氨基酸混合，获得肌肽；或

(b)、表达上述表达载体，获得的蛋白产物与氨基酸混合，获得肌肽；或

(c)、培养上述宿主细胞，获得的蛋白产物与氨基酸混合，获得肌肽；

所述氨基酸包括β-丙氨酸和/或L-组氨酸。

本发明的突变体有如下效果：

本发明利用放线杆菌体内的一个L-氨基酸连接酶能催化连接β-丙氨酸与其他氨基酸的特点，通过对L-氨基酸连接酶的催化活性口袋以及其他相关部位氨基酸残基进行突变，最终获得高催化活性生产肌肽。该方法大大优于化学合成制备工艺，在生产成本、能耗、产品品质以及绿色指数方面都表现出突出的优势。因此该方法的规模化生产将是肌肽生产的优先选项。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示连接酶(Ligase AH1)催化合成肌肽反应4小时的HPLC液相检测结果；

图2示实施例1反应产物的质谱图；

图3示野生连接酶(B0BTG0)合成肌肽的HPLC液相检测结果；

图4示连接酶突变体(B0BTG0-101)制备肌肽的HPLC液相检测结果。

具体实施方式

本发明公开了β-丙氨酸连接酶突变体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明拟公开采用一种新颖简便的β-丙氨酸连接酶方案廉价高效制备肌肽。

通过大量的氨基酸连接酶催化底物活性筛选结果显示，放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)体内存在的一个L-氨基酸连接酶(Uniprot：B0BTG0)具有连接β-丙氨酸与其他多种氨基酸的能力，如β-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-组氨酸等。然而其催化活力仍然太弱，催化底物还是太窄，因此无法直接应用于工业化生产。本申请以该酶作为改造模板，结合利用理性的定点突变以及非理性的随机突变，最终从6000个突变体库中筛选到对β-丙氨酸与L-组氨酸高催化活性的连接酶，再结合实际的催化工艺优化，最终成功实现肌肽的放大生产。

本发明氨基酸连接酶法制备路线如下：

该路线利用廉价的、无需保护基团的氨基酸作为原料，在等当量的三磷酸腺苷(ATP)以及对应的氨基酸连接酶作用下高收率的转化成肌肽。为进一步节省成本，反应体系中引入ATP循环再生体系则可以进一步降低ATP使用量。因此，该制备路线精简、收率高、产品品质好、生产中绿色指数高且易规模化生产。

本发明利用相应的氨基酸连接酶在缓冲液中可一步直接将两个目标氨基酸原料连接转化成肌肽。反应过程中所需要的三磷酸腺苷(ATP)可以是等当量的，或者催化剂量的(通过配上ATP再生体系，采用的是多聚磷酸激酶PPK与六偏磷酸)。

酶相关信息：

氨基酸连接酶(Ligase AH1)：模板基因来源于放线杆菌(Actinobacilluspleuropneu moniae)体内存在的一个L-氨基酸连接酶(Uniprot：B0BTG0)；以它为模板进行改造。Ligase AH1具体突变位点信息：H13K，F14T，N87S，L91M，P239N，P287L，T291Q，Y317M。

多聚磷酸激酶(PPK)：来源于红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)(Uniprot ID：M9XB82)。

酶的序列信息如表1、表2所示。

表1

表2

附酶的发酵生产：本发明所需的酶都是通过商业公司合成相应基因后构建在特定的表达质粒上再通过大肠杆菌发酵生产制得，具体包含以下步骤：将以上酶所对应的基因进行序列优化后再下单到通用生物公司合成(安徽滁州)，再引进NdeI/XhoI酶切位点并亚克隆到pET-28a表达载体上；确认序列正确的质粒转入E.coli(BL21)感受态细胞进行平板培养(擎科生物)以及单克隆小量液体培养，蛋白表达正确的菌最终进行逐级放大液体培养。具体包括将单菌落转入5ml含50μM卡那霉素的LB培养液中(37℃)进行培养，当细胞生长至对数期后接种到250ml含同样抗菌素的LB培养液中，同样生长到对数期时转入5L培养发酵罐里进行培养并进行最终的蛋白表达。在5L发酵罐培养中，当细胞OD～20时加入0.5mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)25℃诱导蛋白表达6小时，最后高速离心收集细胞(4000rpm，20min)获得酶过量表达湿细胞25～50g。取少量细胞先与三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)缓冲液(50mM，pH 8.0)在冰盆上混合均匀，然后利用冻融法破碎细胞、高速离心除细胞壁后清液跑SDS-PAGE凝胶电泳(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定蛋白表达。蛋白表达正确的菌体细胞用以进行下一步催化实验，具体来说，将剩余细胞与Tris.HCl缓冲液(50mM，pH 8.0)在低温混合均匀(以～10克湿细胞：200ml缓冲液混合)，然后进行低温高压破碎细胞壁，高速离心(16000rpm，45min)除细胞壁后获得含酶清液备用(得到的酶活力在500～1000U/ml，U是室温一分钟转化1μmol的底物所需酶量)。LB培养基构成为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉，1％NaCl，1％磷酸氢二钾、1％磷酸氢二钾以及5％的甘油。

附酶活统计表如表3所示。

表3

性质	Ligase AH1	PPK
			单位活力	1200～1800U/mg	950～1400U/mg
热稳定性(30℃)	T_1/2＝50min	T_1/2＝80min
			酶的表达量mg纯蛋白/升培养液	400～600	700～900

如无特殊说明，本发明涉及的原料、试剂、耗材以及仪器皆为普通市售品，均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：利用连接酶(Ligase AH1)制备肌肽(L-carnosine)

在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入23.2克L-组氨酸(150mM)，14.7克β-丙氨酸(165mM)，87.5克三磷酸腺苷单钠盐(ATP，165mM)，然后通过NaOH水溶液将反应体系pH值调节到8.0后，加入连接酶Ligase AH1 2000U启动反应，在30℃轻微搅拌并维持反应体系pH在7.0～9.0之间，4小时后通过HPLC检测到原料基本反应完全。HPLC液相检测反应，见图1。然后用HCl水溶液调节pH到2.0将反应体系中的酶变性沉淀并离心除去蛋白固体，再将反应溶液pH调至7.0后，直接上样D201阴离子交换树脂纯化柱，去除二磷酸腺苷及游离磷酸杂质，最后粗产品利用反渗透膜除盐、浓缩并结晶(乙醇:水，2:1，v:v)得31.8克白色肌肽固体(收率94％)。经送样质谱确认产物为肌肽。质谱结果图见图2。

实施例2：利用连接酶(Ligase AH1)及ATP再生***制备肌肽(L-Carnosine)

同样在1L 100mM pH 7.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入23.2克L-组氨酸(150mM)，14.7克L-丙氨酸(165mM)，2.7克三磷酸腺苷单钠盐(ATP，5mM)，33.6克六偏磷酸钠(55mM)，调节溶液pH值到7.5后加入多聚磷酸激酶PPK酶3000U、连接酶Ligase AH12000U，在30℃轻微搅拌并维持反应体系pH在7.0～8.5之间，3小时后通过HPLC检测到组氨酸基本反应完全。然后用HCl水溶液调节pH到2.0将反应体系中的酶变性沉淀并离心除去蛋白固体，再将反应溶液pH调至7.0后，直接上样D201阴离子交换树脂纯化柱，去除二磷酸腺苷及游离磷酸杂质，最后粗产品利用反渗透膜除盐、浓缩并结晶(乙醇:水，2:1，v:v)得32.2克白色肌肽(收率95％)。

对比例

(一)对照组1——利用野生连接酶(B0BTG0)制备肌肽(L-carnosine)

在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入23.2克L-组氨酸(150mM)，14.7克β-丙氨酸(165mM)，87.5克三磷酸腺苷单钠盐(ATP，165mM)，然后通过NaOH水溶液将反应体系pH值调节到8.0后，加入野生连接酶B0BTG0 2000U启动反应，在30℃轻微搅拌并维持反应体系pH在7.0～9.0之间，2小时后反应停止，通过HPLC检测到很多组氨酸原料还剩余，约37％的转化率，HPLC液相结果见图3。

(二)对照组2——利用改造的连接酶(B0BTG0-101)制备肌肽(L-carnosine)

在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入23.2克L-组氨酸(150mM)，14.7克β-丙氨酸(165mM)，87.5克三磷酸腺苷单钠盐(ATP，165mM)，然后通过NaOH水溶液将反应体系pH值调节到8.0后，加入野生连接酶B0BTG0-101 2000U启动反应，在30℃轻微搅拌并维持反应体系pH在7.0～9.0之间，2小时后反应停止，通过HPLC检测到很多组氨酸原料还剩余，约57％的转化率，HPLC液相结果见图4。

表4：野生连接酶B0BTG0，突变体B0BTG0-101和本专利突变酶的对比总结

突变体101和野生型酶对比，转化率提高了20％。突变体Ligase AH1的转化率提高了57％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.Uniprot ID为B0BTG0的氨基酸连接酶的突变体，其特征在于，突变为：

第13位氨基酸残基突变为赖氨酸；和

第14位氨基酸残基突变为苏氨酸；和

第87位氨基酸残基突变为丝氨酸；和

第291位氨基酸残基突变为谷氨酰胺；和

第317位氨基酸残基突变为甲硫氨酸。

2.Uniprot ID为B0BTG0的氨基酸连接酶的突变体，其特征在于，突变为：

第13位氨基酸残基突变为赖氨酸；和

第14位氨基酸残基突变为苏氨酸；和

第87位氨基酸残基突变为丝氨酸；和

第91位氨基酸残基突变为甲硫氨酸；和

第239位氨基酸残基突变为天冬酰胺；和

第287位氨基酸残基突变为亮氨酸；和

第291位氨基酸残基突变为谷氨酰胺；和

第317位氨基酸残基突变为甲硫氨酸。

3.编码如权利要求2所述的突变体的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示。

4.表达载体，其特征在于，包括如权利要求3所述的核酸分子，以及可接受的基因元件。

5.宿主细胞，其特征在于，包括如权利要求3所述的核酸分子或如权利要求4所述的表达载体。

6.组合物，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的突变体和三磷酸腺苷。

7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，还包括多聚磷酸激酶和多聚磷酸；

所述多聚磷酸包括六偏磷酸。

8.如下任意项在肌肽合成中的应用：

(i)、如权利要求1或2所述的突变体；

(ii)、如权利要求3所述的核酸分子；

(iii)、如权利要求4所述的表达载体；

(iv)、如权利要求5所述的宿主细胞；

(v)、如权利要求6或7所述的组合物。

9.肌肽的制备方法，其特征在于，为：

(a)、取原料与如权利要求1或2所述的突变体混合，获得所述肌肽；或

(b)、表达如权利要求3所述的核酸分子，取获得的蛋白产物与原料混合，获得所述肌肽；或

(c)、表达如权利要求4所述的表达载体，取获得的蛋白产物与原料混合，获得所述肌肽；或

(d)、培养如权利要求5所述的宿主细胞，取获得的蛋白产物与原料混合，获得所述肌肽；或

(e)、取原料与如权利要求6或7所述的组合物混合，获得所述肌肽；

所述原料包括三磷酸腺苷、β-丙氨酸和L-组氨酸。