CN116410929A - 一种肺癌类器官培养液、培养试剂组合以及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种肺癌类器官培养液、培养试剂组合以及培养方法，其中肺癌类器官培养液包括基础培养基、复合抗生素以及生长因子，基础培养基包括Advanced DMEM/F12，HEPES 10mM和Glutamax 1.0x，复合抗生素包括Primocin 200μg/mL、青霉素‑链霉素1x和奥硝唑5μg/mL，此外在培养试剂组合中还包括酶解液，酶解液包括基础培养基、Ⅰ型胶原酶、Ⅲ型胶原酶、I型DNA酶和Primocin。通过本发明肺癌类器官的培养方法，能够加快肺癌类器官细胞的生长，提高培养速度，而且体外培养的肺癌类器官能够保留肿瘤相关免疫细胞，与体内生长状况更加相似。
Description
技术领域
本发明涉及生物组织工程技术领域，尤其涉及一种肺癌类器官培养液、培养试剂组合以及培养方法。
背景技术
肺癌是我国的十大恶性肿瘤之一。如今肺癌的病因尚未完全清楚，目前认为主要是环境因素与遗传因素综合作用的结果。肺癌类器官对研究具有很重要的意义，目前虽有一些肺癌类器官培养基的研究报道，但是其培养过程生长慢，增加时间投入成本，且仿生性低。
现有肺癌类器官的培养过程中，每次传代至少需要培养14天，甚至更多天，才达到传代要求。而且获得的细胞量也非常少，为了收获更多的细胞，进行下游试验，需要时间更长，使得整个器官的构建过程缓慢，导致肺癌类器官研究的时间成本高，除此之外，更为重要的是，类器官体外培养一段时间后，类器官中的肿瘤微环境细胞组份如T细胞、B细胞等出现大量丢失，跟体内真实的肿瘤特性差异会比较大。
肿瘤微环境(TME)细胞类型的巨大异质性对治疗反应产生了关键影响。最近，肿瘤浸润免疫细胞疗法的广阔前景对再现TME的多样性人类癌症模型创造十分迫切。然而，现阶段缺乏2D或3D模型来重现TME中肿瘤和免疫细胞的体内相互作用。来自血液或患者肿瘤的免疫细胞已在传统单层、球形或原代类器官培养物中用异源建立的癌细胞系进行重组。然而，这种体外肿瘤免疫模型并不能很好地保持TME的复杂多样性和物理结构，尤其是不允许原代肿瘤上皮细胞与其自身浸润免疫人群的整体共培养。使用含有免疫细胞的人肿瘤悬浮液衍生类器官的定制微流控装置对免疫疗法有反应，但没有肿瘤免疫特异性。综上所述，重现肿瘤类器官TME的结构复杂性显得尤为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一种肺癌类器官培养液、培养试剂组合以及培养方法。
本发明是通过以下技术方案予以实现：
一种肺癌类器官培养液，包括基础培养基、复合抗生素以及生长因子，所述基础培养基包括Advanced DMEM/F12，HEPES 10mM和Glutamax 1.0x，所述复合抗生素包括Primocin 200μg/mL、青霉素-链霉素1x和奥硝唑5μg/mL，所述生长因子包括IL2 3000U/ml、IL4 500U/ml、IL10 500U/mL、IL15 250U/ml、g-CSF 500U/mL、M-CSF 300U/ml、CD28mAb5ug/mL、OX-40mAb 10ug/mL、PD-1mAb 10ug/m和人A/B血清(v/v％)5％。
根据上述技术方案，优选地，包括如下成分：1mM N-Acetylcysteine(Sigma),10mMNicotinamide(Sigma),50ng/mL recombinant human EGF(Peprotech),100ng/mL FGF-10,25ng/mL HGF(Peprotech),500ng/mL R-Spondin(Peprotech),10μM Forskolin(BioGems,CA,USA),5μM SB431542(Cayman Chemical,Michigan,USA)and 10nM Gastrin(BioGems)，10μM Y-27632(Tocris Bioscience),25ng/mL hNoggin(Peprotech)and 100ng/mL Wnt-3a(Peprotech)。
同时，本专利还公开了一种肺癌类器官培养试剂组合，包括上述肺癌类器官培养液，还包括酶解液，所述酶解液包括所述基础培养基，酶解液还包括Ⅰ型胶原酶、Ⅲ型胶原酶、I型DNA酶和Primocin。
根据上述技术方案，优选地，所述Ⅰ型胶原酶的浓度为2mg/mL，所述Ⅲ型胶原酶的浓度为1mg/mL，所述I型DNA酶的浓度为0.1mg/mL，所述Primocin的浓度为1mg/mL。
此外，本专利公开了一种肺癌类器官培养方法，基于上述肺癌类器官培养试剂组合，包括如下步骤：
S1.将肺癌样本进行预处理，得到样本组织碎块；
S2.将所述样本组织碎块进行酶解预处理，过滤获得滤过液，将所述滤过液离心处理，获得细胞沉淀；
S3.采用基质胶重悬所述细胞沉淀，获得混有细胞的凝胶；
S4.然后将所述凝胶接种于培养孔，于37℃细胞培养箱静置培养；
S5.向培养孔内加入所述肺癌类器官培养液进行培养，获得原代肺癌类器官；
S6.采用所述肺癌类器官培养液对所述原代肺癌类器官进行传代培养，获得相应代肺癌类器官。
根据上述技术方案，优选地，步骤S2包括：所述样本组织碎块加入所述酶解液；在37℃摇床、200r/min的条件下孵育预设孵育时间后，加入酶解中止剂；中止酶解后，过滤，获取所述滤过液；将所述滤过液离心处理，获得细胞沉淀。
根据上述技术方案，优选地，步骤S2中的所述预设孵育时间为15-25min，所述酶解中止剂的加入体积与酶解液的加入体积的比例为2﹕1。
根据上述技术方案，优选地，步骤S4中静置培养时间为15-40min。
本发明的有益效果是：
本发明公开了的肺癌类器官培养液的多种分泌因子与复合抗生素以及各生长因子之间相互协同作用，同时配合复合抗生素的种类和浓度的控制，在防止污染的同时还能够保持细胞活性；而且加快了肺癌类器官细胞的形成和生长，提高培养速度，在传代培养过程中，培养7天即可达到传代要求，同时免疫组分维持因子的加入，使得培养获得的肺癌类器官细胞更加仿生，可以体外维持体内的肿瘤特性，肿瘤微环境可以很好地维持；
同时，本发明公开的肺癌类器官培养试剂组合中，酶解液利用Ⅰ型胶原酶和Ⅲ型胶原酶进行酶解，能够缩短酶解时间，获得的细胞活性高，还可有效降低样本污染，然后利用肺癌类器官培养液对肺癌肿瘤样本进行培养，能够加快肺癌类器官细胞的生长，提高培养速度；
此外，本发明还公开了一种肺癌类器官的培养方法，能够有效缩减了原代类器官形成与生长时间，在传代培养时，每代培养时间能够缩短至5-7天，且培养5-7天类器官直径可达80～110μm，传代周期稳定缩短，而且在采用肺癌类器官培养试剂进行原代提取培养过程中，培养3天后即可见大量肺癌类器官形成，同时获得的肺癌类器官更加仿生，可以体外维持体内的肿瘤特性。
附图说明
图1是本发明实施例4中，原代培养7天后的肺癌类器官的光镜图。
图2是本发明对比例中，原代培养7天后的肺癌类器官的光镜图。
图3是本发明实施例4中传代培养7天时的肺癌类器官的ATP含量发光强度与对比例中类器官的ATP含量发光强度比较。
图4是对比例1中类器官培养14天后类器官中巨噬细胞(Macrophages)、B淋巴细胞(CD19)、T淋巴细胞(CD3)、CD8+T淋巴细胞、PD1+T淋巴细胞表达情况。
图5是实施例4中类器官培养(+IL2)21天后类器官中巨噬细胞(Macrophages)、B淋巴细胞(CD19)、T淋巴细胞(CD3)、CD8+T淋巴细胞、PD1+T淋巴细胞表达情况。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。基于发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于发明保护的范围。
实施例1:本发明包括基础培养基、复合抗生素以及生长因子，所述基础培养基包括Advanced DMEM/F12，HEPES 10mM和Glutamax 1.0x，所述复合抗生素包括Primocin 200μg/mL、青霉素-链霉素1x和奥硝唑5μg/mL，所述生长因子包括IL2 3000U/ml、IL4 500U/ml、IL10 500U/mL、IL15 250U/ml、g-CSF 500U/mL、M-CSF 300U/ml、CD28 mAb 5ug/mL、OX-40mAb 10ug/mL、PD-1mAb 10ug/m和人A/B血清(v/v％)5％。
根据上述实施例，优选地，包括如下成分：1mM N-Acetylcysteine(Sigma),10mMNicotinamide(Sigma),50ng/mL recombinant human EGF(Peprotech),100ng/mL FGF-10,25ng/mL HGF(Peprotech),500ng/mL R-Spondin(Peprotech),10μM Forskolin(BioGems,CA,USA),5μM SB431542(Cayman Chemical,Michigan,USA)and 10nM Gastrin(BioGems)，10μM Y-27632(Tocris Bioscience),25ng/mL hNoggin(Peprotech)and 100ng/mL Wnt-3a(Peprotech)。
实施例2:本专利还公开了一种肺癌类器官培养试剂组合，包括上述肺癌类器官培养液，还包括酶解液，所述酶解液包括所述基础培养基，酶解液还包括Ⅰ型胶原酶、Ⅲ型胶原酶、I型DNA酶和Primocin。
根据上述实施例，优选地，所述Ⅰ型胶原酶的浓度为2mg/mL，所述Ⅲ型胶原酶的浓度为1mg/mL，所述I型DNA酶的浓度为0.1mg/mL，所述Primocin的浓度为1mg/mL。
实施例3:本专利公开了一种肺癌类器官培养方法，基于上述肺癌类器官培养试剂组合，包括如下步骤：
S1.将肺癌样本进行预处理，得到样本组织碎块。具体地，将肺癌肿瘤样本采用含5％双抗(青霉素-链霉素)和50ng/mL庆大霉素的PBS缓冲液清洗后(清洗次数不限定，达到充分清洗目的即可)，将样本组织转移至培养皿中，然后剪碎，获得样本组织碎块。
S2.将所述样本组织碎块进行酶解预处理，过滤获得滤过液，将所述滤过液离心处理，获得细胞沉淀。具体地：
S2-1.样本组织碎块加入所述酶解液，其中酶解液的加入量与样本大小相关，优选地，每1g样本加入5-15mL酶解液，本例中优选为，样本组织碎块的重量为0.5g时，酶解液的加入量为5mL，此时酶解中止剂的加入量为10mL。通过控制酶解液的加入量，进而可以控制酶解孵育时间；
S2-2.在37℃摇床、200r/min的条件下孵育预设孵育时间后，预设孵育时间为15-25min，加入酶解中止剂，本例中酶解中止剂可以采用4℃的Advanced DMEM/F12，酶解中止剂的加入体积与酶解液的加入体积的比例为2﹕1，在加入酶解中止剂后，用移液枪进行充分吹打，中止酶解；
S2-3.中止酶解后，采用100μm细胞筛进行过滤，获取滤过液；
S2-4.将滤过液离心处理，滤过液离心处理条件为离心力300g，离心时间为5min，获得细胞沉淀。
S3.采用基质胶重悬所述细胞沉淀，获得混有细胞的凝胶，其中凝胶凝固的标准为竖直放置培养板凝胶不可自由流动即可。具体地：
S3-1.采用Advanced DMEM/F12培养基吹散后，离心处理(优选离心力为300g，离心时间为5min)，获得基质胶与细胞混合沉淀；
S3-2.将混合沉淀重悬获得重悬液；
S3-3.将重悬液置于37℃水浴8-10min，然后向重悬液中加入两倍体积的4℃的Advanced DMEM/F12培养基中止消化，离心处理(优选离心力为300g，离心时间为5min)，获得二次细胞沉淀；
S3-4.将二次细胞沉淀采用冻存液重悬，然后使用程序性梯度降温盒进行冻存，一天后转移至液氮中进行长期保存。其中二次细胞沉淀与冻存液的重悬比例为每1×105-5×106个细胞团用1mL冻存液重悬。经过上述步骤处理进行液氮冻存的类器官12个月后复苏仍然可以稳定生长，且保持了类器官活性与干性，复苏后类器官生长状态良好。
S4.然后将所述凝胶接种于培养孔，于37℃细胞培养箱静置培养。其中，以每孔100μL的接种量将该凝胶接种于孔板中，其中孔板的孔数不限，本例中可优选12孔板。此外，静置培养时间为15-40min，本例中优选静置培养时间为30min。
S5.向培养孔内加入所述肺癌类器官培养液进行培养，获得原代肺癌类器官；
S6.采用所述肺癌类器官培养液对所述原代肺癌类器官进行传代培养，每次传代培养的培养周期为5～7天，获得相应代肺癌类器官。
此外，为表征本申请的技术效果，通过实施例4和对比例，对获得的原代肺癌类器官进行免疫组份维持情况的检测，同时对获得的原代肺癌类器官进行传代处理。
实施例4:
S101.将肺癌肿瘤样本(重量为0.5g)采用含5％双抗(青霉素-链霉素)的PBS缓冲液震荡清洗5次后，将样本组织转移至培养皿(例如，60mL培养皿)中，然后用眼科剪剪碎至2～4mm组织碎块，获得样本组织碎块。并将组织碎块转移至离心管中。
S102.将步骤S101获得的样本组织碎块进行酶解预处理获得滤过液；将滤过液离心处理(离心力为300g，离心时间为5min)，获得细胞沉淀。其中，酶解预处理，包括以下步骤：向样本组织碎块加入5mL酶解液，在37℃摇床(200r/min)上孵育15～25min后，加入10mL酶解中止剂(4℃的Advanced DMEM/F12)，用移液枪进行充分吹打，中止酶解，采用100μm细胞筛进行过滤，获取滤过液。
S103.采用基质胶重悬步骤S102获得的细胞沉淀，获得混有细胞的凝胶；然后以每孔50μL的接种量将该凝胶接种24孔板的培养孔中，再静置培养30min，使得该凝胶凝固。
S104.向培养孔内加入上述肺癌类器官培养液进行培养，获得原代肺癌类器官；且培养7天后，即可进行传代。本步骤S104中，培养3天后可见肺癌类器官形成，且肺癌类器官的最大直径达100μm以上，且原代培养7天即可以进行传代。本实施例中，对步骤S102中采用酶解液Ⅲ进行酶解处理，并在步骤S104中具体采用培养液Ⅱ-Ⅱ进行原代培养7天后的肺癌类器官进行检测，获得如图1所示的光镜图。可见，培养7天的肺癌类器官的最大直径达100μm以上，则原代培养7天即可以进行传代。
S105.将步骤S104中培养7天获得的原代肺癌类器官进行传代培养，在传代培养过程中采用上述肺癌类器官培养液进行培养，每次传代培养的培养周期为5～7天，获得相应代肺癌类器官。
S106.将步骤S104中培养7天获得的的原代肺癌类器官进行消化，
发光法细胞活力检测试剂盒通过对ATP的定量来测定3D培养细胞的细胞活力。
对比例:
S101.将肺癌肿瘤样本(重量为0.5g)采用含5％双抗(青霉素-链霉素)的PBS缓冲液震荡清洗5次后，将样本组织转移至培养皿(例如，60mL培养皿)中，然后用眼科剪剪碎至2～4mm组织碎块，获得样本组织碎块。并将组织碎块转移至离心管中。
S102.将步骤S101获得的样本组织碎块进行酶解预处理获得滤过液；将滤过液离心处理(离心力为300g，离心时间为5min)，获得细胞沉淀。其中，酶解预处理，包括以下步骤：向样本组织碎块加入5mL酶解液，在37℃摇床(200r/min)上孵育15～25min后，加入10mL酶解中止剂(4℃的Advanced DMEM/F12)，用移液枪进行充分吹打，中止酶解，采用100μm细胞筛进行过滤，获取滤过液。
S103.采用基质胶重悬步骤S102获得的细胞沉淀，获得混有细胞的凝胶；然后以每孔50μL的接种量将该凝胶接种24孔板的培养孔中，再静置培养30min，使得该凝胶凝固。
S104.向培养孔内加入普通的肺癌类器官培养液(不含免疫组份维持因子)进行培养，获得原代肺癌类器官；且培养7天后，即可进行传代。本步骤S104中，培养3天后可见肺癌类器官形成，且肺癌类器官的最大直径达100μm以上，且原代培养7天即可以进行传代。本实施例中，对步骤S102中采用上述酶解液Ⅲ进行酶解处理，并在步骤S104中具体采用上述培养液Ⅱ-Ⅱ进行原代培养7天后的肺癌类器官进行检测，获得如图2所示的光镜图。可见，培养7天的肺癌类器官的最大直径达100μm以上，则原代培养7天即可以进行传代。
S105.将步骤S104中培养7天获得的原代肺癌类器官进行传代培养，在传代培养过程中采用上述肺癌类器官培养液进行培养，每次传代培养的培养周期为5～7天，获得相应代肺癌类器官。
S106.将步骤S104中培养7天获得的的原代肺癌类器官进行消化，
发光法细胞活力检测试剂盒通过对ATP的定量来测定3D培养细胞的细胞活力。
与此同时，对实施例4获得的原代肺癌类器官进行免疫组份维持情况的检测，具体地：
收集细胞：当类器官生长7天后100μm直径以上的类器官数量增多，类器官最小直径达80μm以上，消化酶消化后收集细胞，注意要合并上清和消化下来的细胞；
清洗细胞：用预冷的PBS洗2遍细胞；
分组：每一次实验分为不染组、单染CD3组、单染CD8组以及CD3和CD8双染组；
染色：用PBS把10×binding buffer稀释到1×缓冲液，吸净离心管残余的PBS后，每管加入100μL的1×的binding buffer，用移液枪吹打细胞使细胞充分重悬，避光条件下加入染料；
上机检测：室温避光孵育15分钟后，加入1×的binding buffer 300μL并混匀后避光下将细胞悬液转移到5mL的流式管中，1h内在流式细胞仪上机检测。
数据分析：通过软件分析，绘制双色散点图，进行数据分析。
除此之外，在实施例4的基础上，对获得的原代肺癌类器官进行传代处理，具体地：
(1)对实施例4中基质胶包埋的原代肺癌类器官，每孔使用1mL 4℃AdvancedDMEM/F12培养基吹散，回收于离心管中，离心处理(离心力为300g，离心时间为5min)，获得基质胶与细胞混合沉淀。
(2)将获得的沉淀采用TrypLE(Gibco)重悬获得重悬液；将该重悬液置于37℃水浴8～10min；然后向重悬液中加入两倍体积的4℃的Advanced DMEM/F12培养基中止消化，用移液枪反复吹打数次。离心处理(离心力为300g，离心时间为5min)，获得二次细胞沉淀。其中，TrypLE的使用量以包埋类器官的基质胶量为准，理论上每100μL基质胶包埋的类器官使用1mL TrypLE进行重悬。此外，中止消化后使用移液枪反复吹打情况与类器官的消化程度直接相关。使用1mL移液枪吹打10-20次，然后用1mL移液枪头套200μL移液枪头再次吹打10-20次，可以将所有类器官消化为均一大小的细胞团，一般的，细胞团中含2-10个细胞。
(3)用Advanced DMEM/F12重悬二次细胞沉淀，吹打均匀，离心处理(离心力为300g，离心时间为5min)，获得三次细胞沉淀。若杂质较多，可重复此步骤。
(4)采用基质胶重悬三次细胞沉淀，获得混有细胞的凝胶；然后以每孔50μL的接种量将该凝胶接种24孔板中，37℃培养箱孵育30min，使得该凝胶凝固。
(5)向凝固后的类器官培养孔中加入肺癌类器官培养液进行培养。如图1所示，培养7天后类器的光镜照片，可见，类器官大小均一，长势良好。生长直径近100μM。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种肺癌类器官培养液，其特征在于，包括基础培养基、复合抗生素以及生长因子，所述基础培养基包括Advanced DMEM/F12，HEPES10mM和Glutamax 1.0x，所述复合抗生素包括Primocin 200μg/mL、青霉素-链霉素1x和奥硝唑5μg/mL，所述生长因子包括IL2 3000U/ml、IL4500U/ml、IL10 500U/mL、IL15 250U/ml、g-CSF 500U/mL、M-CSF300U/ml、CD28 mAb5ug/mL、OX-40mAb 10ug/mL、PD-1mAb 10ug/m和人A/B血清(v/v％)5％。
2.根据权利要求1所述一种肺癌类器官培养液，其特征在于，包括如下成分：1mM N-Acetylcysteine(Sigma),10mM Nicotinamide(Sigma),50ng/mL recombinant human EGF(Peprotech),100ng/mL FGF-10,25ng/mL HGF(Peprotech),500ng/mL R-Spondin(Peprotech),10μM Forskolin(BioGems,CA,USA),5μM SB431542(Cayman Chemical,Michigan,USA)and 10nM Gastrin(BioGems)，10μM Y-27632(Tocris Bioscience),25ng/mL hNoggin(Peprotech)and 100ng/mL Wnt-3a(Peprotech)。
3.一种肺癌类器官培养试剂组合，包括权利要求1或2所述肺癌类器官培养液，其特征在于，还包括酶解液，所述酶解液包括所述基础培养基，酶解液还包括Ⅰ型胶原酶、Ⅲ型胶原酶、I型DNA酶和Primocin。
4.根据权利要求3所述一种肺癌类器官培养试剂组合，其特征在于，所述Ⅰ型胶原酶的浓度为2mg/mL，所述Ⅲ型胶原酶的浓度为1mg/mL，所述I型DNA酶的浓度为0.1mg/mL，所述Primocin的浓度为1mg/mL。
5.一种肺癌类器官培养方法，基于权利要求3所述肺癌类器官培养试剂组合，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将肺癌样本进行预处理，得到样本组织碎块；
S2.将所述样本组织碎块进行酶解预处理，过滤获得滤过液，将所述滤过液离心处理，获得细胞沉淀；
S3.采用基质胶重悬所述细胞沉淀，获得混有细胞的凝胶；
S4.然后将所述凝胶接种于培养孔，于37℃细胞培养箱静置培养；
S5.向培养孔内加入所述肺癌类器官培养液进行培养，获得原代肺癌类器官；
S6.采用所述肺癌类器官培养液对所述原代肺癌类器官进行传代培养，获得相应代肺癌类器官。
6.根据权利要求5所述一种肺癌类器官培养方法，其特征在于，步骤S2包括：所述样本组织碎块加入所述酶解液；在37℃摇床、200r/min的条件下孵育预设孵育时间后，加入酶解中止剂；中止酶解后，过滤，获取所述滤过液；将所述滤过液离心处理，获得细胞沉淀。
7.根据权利要求6所述一种肺癌类器官培养方法，其特征在于，步骤S2中的所述预设孵育时间为15-25min，所述酶解中止剂的加入体积与酶解液的加入体积的比例为2﹕1。
8.根据权利要求5至7中任意一项的所述一种肺癌类器官培养方法，其特征在于，步骤S4中静置培养时间为15-40min。
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