CN114292804B

CN114292804B - 一种血管化脂肪类器官培养方法

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Publication number: CN114292804B
Application number: CN202111511138.4A
Authority: CN
Inventors: 王新霞; 骆曜骏; 刘有华; 陈雨诗; 刘禹熙; 汪以真
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2021-12-11
Filing date: 2021-12-11
Publication date: 2024-05-10
Anticipated expiration: 2041-12-11
Also published as: CN114292804A

Abstract

本发明提供了一种血管化脂肪类器官培养的方法，所述方法包括小鼠内脏脂肪干细胞分离扩增和血管化脂肪类器官培养两个部分。本发明使用促血管生长因子和血管化脂肪类器官培养基在三维培养条件下诱导小鼠内脏脂肪干细胞自发形成血管化脂肪类器官，改进了传统脂肪三维培养方法。本方法可操作性强，实验可重复性高，成本较低，为脂肪生物学和肥胖研究提供操作简便，易于定量分析，并能反映动物体内脂肪发育模式的体外新模型。

Description

一种血管化脂肪类器官培养方法

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种脂肪类器官的培养方法。

背景技术

肥胖及其引发的糖尿病，脂肪肝，高血脂症等疾病已成为威胁人类健康的世界性问题。研究脂肪发育及其代谢机制对于研发减脂药物，抑制肥胖具有重要意义。哺乳动物的脂肪组织按照沉积的位置不同，主要分为皮下脂肪和内脏脂肪，内脏脂肪又可以分为肠系膜脂肪、网膜脂肪和性腺旁脂肪等，而皮下脂肪可细分为肩甲内脏脂肪，腹股沟内脏脂肪等，此外脂肪细胞还能异位沉积于其他器官，如沉积于肌肉中形成肌内脂肪。脂肪组织根据功能不同，又可分为白色脂肪组织和棕色脂肪组织。白色脂肪细胞主要通过合成甘油三脂储存机体代谢过剩的能量，而棕色脂肪细胞中富含线粒体，能通过消耗脂肪酸中的能量产热。现有的研究表明，动物脂肪细胞主要由中胚层细胞发育而来，中胚层细胞发育形成血管，随后处于血管旁基质细胞在成脂信号的诱导下发育形成脂肪细胞。能发育形成脂肪细胞的血管旁基质细胞通常表达CD29，CD34，SCA1，PDGFRα等标志物。但是这些基质细胞之间存在异质性，目前对于这种异质性的研究及其成脂过程中发生的变化还不够深入。动物脂肪沉积主要包括脂肪细胞的增生和肥大，相较于皮下脂肪，动物内脏脂肪组织随年龄增长更易沉积，引起胰岛素抵抗、糖尿病、血管粥样硬化等代谢疾病。因此研究内脏脂肪中脂肪干细胞的发育及脂肪沉积及代谢规律对于研究减脂药物，促进人类健康具有更重要的意义。

目前，体外研究脂肪生物学的模型主要是从小鼠胚胎中分离构建的3T3-L1，3T3-F442A前体脂肪细胞系，从小鼠附睾旁脂肪组织中分离构建的Ob17前体脂肪细胞系，以及从小鼠和人体脂肪组织中分离得到的原代脂肪血管基质组分（stromal vascularfractions，SVF）。现已成功构建的前体脂肪细胞系较少，且这些前体脂肪细胞系组成单一，很难模拟体内脂肪组织中多种细胞共同形成的微环境，同时原代脂肪SVF细胞又难以在体外进行高代次的增殖，并维持较强的成脂分化能力。传统的二维细胞培养也很难重现动物体内脂肪组织中单腔室成熟脂肪细胞及其分泌特性。

虽然小鼠作为一种模式动物，其个体小，生长速度快，遗传背景明确，是研究人类肥胖的良好动物模型。但由于脂肪组织内富含油脂，成熟脂肪细胞体积过大等特点，很难对体内的脂肪细胞进行实时观察和定量检测，同时在动物体内脂肪发育过程相较于体外细胞培养较为缓慢，研究其生物学功能所需的实验周期相对较长。这些都阻碍了人们对脂肪发育及功能的研究。

近年来，随着类器官技术的不断发展成熟，它已成为研究器官发育、组织微环境、药物有效性和安全性的重要工具（KIM J， KOO B K， KNOBLICH J A. Human organoids:model systems for human biology and medicine[J]. Nat Rev Mol Cell Bio， 2020，21(10): 571-84.SHAMIR E R， EWALD A J.Three-dimensional organotypic culture:experimental models of mammalian biology and disease [J]. Nat Rev Mol CellBio， 2014， 15(10): 647-64.）。但是在脂肪研究领域，还缺乏成熟的类器官模型。尽管已有人利用磁珠、水凝胶等材料三维培养人和小鼠脂肪细胞系和脂肪来源血管基质组分（LOUIS F， PANNETIER P， SOUGUIR Z， et al. A biomimetic hydrogel functionalizedwith adipose ECM components as a microenvironment for the 3Dculture of humanand murine adipocytes [J]. Biotechnology and Bioengineering， 2017， 114(8):1813-24.），并进行成脂诱导，但这些模型还不能有效模拟出体内脂肪组织中细胞的发育时序、多种细胞类型及其所处的微环境，而且操作较为复杂，培养批次性明显，尚缺乏规范化的培养方案。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种低成本、规范化的脂肪类器官的培养方法。

为了达到上述的实验目的，本发明提供的技术方案为：

本发明所述的培养方法中的胎牛血清（FBS）、DMEM/F12、TrypLE、I型胶原酶购自ThermoFisher；本发明所述的血管内皮生长因子，碱性成纤维生长因子，表皮生长因子，R3-***-1，抗坏血酸，氢化可的松，庆大霉素/两性霉素，血管内皮细胞基础培养基EBM-2购自Lonza公司；本发明所述的超低吸附板、基质胶购自康宁公司。

所述的一种血管化脂肪类器官培养方法，包括i，ii两个部分：

i.分离获取小鼠内脏脂肪干细胞：

在分离小鼠内脏脂肪干细胞之前，首先配制脂肪组织消化液和冲洗液，脂肪组织消化液含体积比为2%双抗、97%HBSS缓冲液，质量分数为1%的BSA、及质量浓度为1mg/ml的I型胶原酶，冲洗液包含体积比为2%胎牛血清、2%青霉素/链霉素双抗和96%HBSS缓冲液。

优选地，配制好脂肪组织消化液和冲洗液之后用0.22μm滤膜过滤后4℃冰箱备用。

更优选的，脂肪组织消化液和冲洗液中的青霉素/链霉素双抗可用庆大霉素/两性霉素替代，二者对应比例：10000U青霉素/10mg链霉素：3mg庆大霉素/1.5μg两性霉素。

在无菌条件下打开小鼠腹腔，分离小鼠附睾旁白色脂肪组织，置于装有冲洗液的10cm细胞培养皿，将其转移进超净台，用冲洗液冲洗2~3次去除内脏脂肪组织的污物。然后将内脏脂肪组织转入5ml离心管，用手术剪充分剪碎后加入等体积内脏脂肪组织消化液，置于37℃，150 rpm摇床消化30min。取出含有脂肪组织的消化液，用等体积的含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，经过100μm和70μm的滤网两次过滤后，300g，5min离心去上清，然后DMEM/F12培养基重悬洗涤沉淀细胞两次，最后用含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基重悬细胞后，将其移入细胞培养板后置于37℃，5%CO₂的条件下培养4-6h，根据脂肪干细胞强贴壁性的特性，4-6h后进行换液，得到小鼠内脏脂肪干细胞。

ii. 血管化脂肪类器官培养：

血管化脂肪类器官培养前需配制血管化脂肪类器官培养基，包括脂肪干细胞维持培养基，脂肪干细胞血管化诱导培养基，血管化脂肪类器官成脂定向诱导培养基，血管化脂肪类器官成脂诱导维持培养基和血管化脂肪类器官维持培养基。

脂肪干细胞维持培养基包括DMEM/F12培养基、胎牛血清、碱性成纤维生长因子、青霉素和链霉素。青霉素浓度10U/ml，链霉素10μg/ml，胎牛血清的体积分数为12%，碱性成纤维生长因子在培养基中的质量浓度为10ng/ml。

脂肪干细胞血管化诱导培养基：包括胎牛血清、血管内皮生长因子、碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、R3-***-1、抗坏血酸、氢化可的松、庆大霉素/两性霉素和血管内皮细胞基础培养基EBM-2。培养基中胎牛血清的体积比为5%，血管内皮生长因子、表皮生长因子、R3-***、抗坏血酸、氢化可的松、庆大霉素、两性霉素的质量浓度分别为0.5ng/ml、5ng/ml、20ng/ml、1μg/ml、 0.2μg/ml、 30μg/ml、15ng/ml。

血管化脂肪类器官成脂定向诱导培养基由DMEM/F12、胰岛素、***、罗格列酮、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗组成，培养基中胎牛血清体积比为15%、胰岛素、***、罗格列酮、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、青霉素、链霉素的浓度分别为10μg/ml、1μM、1μM、0.5mM、10U/ml、10μg/ml，其余成分为DMEM/F12；

血管化脂肪类器官成脂诱导维持培养基由DMEM/F12、胰岛素、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗组成，培养基中胎牛血清体积比为12%，胰岛素、青霉素、链霉素的浓度分别为5μg/ml、10U/ml、10μg/ml，其余成分DMEM/F12；

血管化脂肪类器官维持培养基包括体积比为10%胎牛血清、体积比为1%青霉素/链霉素双抗，其余成分为DMEM/F12培养基。

采用脂肪干细胞维持培养基在37℃，5%CO₂条件下培养扩增分离得到的小鼠内脏脂肪干细胞。

优选地，将小鼠内脏脂肪干细胞置于5%O₂低氧环境下进行培养。

在小鼠内脏脂肪干细胞培养扩增至2至3代，细胞数量达10⁶以上时进行三维内脏脂肪干细胞球制备，采用的方法为悬滴法。

将培养扩增的小鼠内脏脂肪干细胞用0.25%胰蛋白酶消化1min，然后用两倍体积的完全培养基中止消化，吹打混匀后得到的单细胞悬液，取20μL进行细胞计数。300g，5min离心去上清，根据细胞计数结果，向细胞沉淀中加入适量的完全培养基重悬，调整细胞悬液浓度为4×10⁵~5×10⁵/ml，使用移液枪，按20μL每个悬滴的量将制备悬滴于10cm细胞培养板顶盖内侧，并在细胞培养板的底部加入无菌水，以维持湿度。

优选地，采用TrypLE替代胰蛋白酶对小鼠内脏脂肪干细胞进行消化传代，可减少对其增殖活性的影响。

将已形成细胞球的脂肪干细胞用1mL枪头转移至含有500μL脂肪干细胞血管化诱导培养基的24孔超低吸附板中，每孔3-4个细胞球，将超低吸附板置于37℃，5%CO₂条件下2天，诱导小鼠内脏脂肪干细胞向血管内皮细胞定向。

取Paraflim封口膜置于384孔PCR板压制构建多孔模具，将三维脂肪干细胞球转移至模具内，采用8-12mg/ml浓度基质胶包埋细胞球，之后将模具移入37℃细胞培养箱30min，待其固化后转移至超低吸附板中使用促血管内皮培养基继续诱导4~5天，期间换液一次，诱导其形成分支状血管结构。

采用血管化脂肪类器官成脂诱导定向培养基培养已形成血管结构的脂肪类器官3天，诱导血管旁基质细胞向脂肪细胞定向。

采用血管化脂肪类器官成脂诱导维持培养基培养脂肪类器官10-12天，每2到3天换液，诱导其形成直径超过40μm的成熟脂肪细胞。

使用脂肪类器官维持培养基继续培养已形成成熟脂肪细胞的血管化脂肪类器官。

本发明的有益效果如下：

（1）通过本发明培养方法培养血管化脂肪类器官，成本低，每次培养所需基质胶用量较少。

（2）通过本发明培养方法得到的血管化脂肪类器官，具有与动物体内脂肪组织相似的血管结构，并且包含血管内皮细胞，成熟脂肪细胞等多种动物脂肪组织中的细胞类型。

（3）通过本发明构建得到的血管化脂肪类器官模型中含有直径超过40微米的成熟脂肪细胞。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1为实施例1和实施例2中小鼠内脏脂肪干细胞分离及血管化脂肪类器官的培养的流程。

图2为实施例1中培养血管化脂肪类器官使用的小鼠内脏脂肪干细胞。

图3.1、图3.2分别为实施例1中得到的小鼠内脏脂肪干细胞差异贴壁前后流式分析鉴定图(CD45、CD31分别为免疫细胞和血管内皮细胞标志物，SCA1为脂肪干细胞标志物)。

图4为实施例2血管化内脏脂肪类器官血管化诱导4天后的免疫荧光图。

图5为实施例2中小鼠血管化内脏脂肪类器管血管化诱导7天后的血管形态图。

图6为实施例2血管化脂肪类器官成脂诱导11天后的形态图。

图7为实施例2血管化脂肪类器官培养24天后的免疫荧光图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围。

实施例1：分离获取小鼠内脏脂肪干细胞

如图1所示，在分离小鼠内脏脂肪干细胞之前，首先配制脂肪组织消化液和冲洗液，脂肪组织消化液含质量浓度为1mg/ml的I型胶原酶，质量分数为1%的BSA，体积比为2%青霉素/链霉素的双抗和97%的HBSS缓冲液，脂肪冲洗液包含体积比为2%胎牛血清，2%青霉素/链霉素双抗和96%HBSS缓冲液。

经浙江大学动物伦理委员会批准，将4-6只C57BL6/J小鼠颈椎脱臼处死，然后浸入75%酒精中灭菌10min。在无菌条件下打开小鼠腹腔，分离小鼠附睾旁白色脂肪组织。然后将小鼠内脏脂肪组织转入5ml离心管，用手术剪充分剪碎后加入等体积内脏脂肪组织消化液，置于37℃，150 rpm摇床消化30min。取出含有脂肪组织的消化液，用等体积含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，经过100μm和70μm的滤网两次过滤后重悬，300g，5min离心去上清，然后用DMEM/F12培养基重悬洗涤细胞沉淀两次。向洗涤后的细胞沉淀中加入1ml红细胞裂解液，重悬细胞，裂解1-2min，去除红细胞，300g，5min离心去上清，最后用1ml含12%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基重悬细胞后，将其移入细胞培养板后置于37℃，5%CO₂的条件下培养，根据脂肪干细胞强贴壁性的特点，4-6h后更换脂肪干细胞维持培养基，得到贴壁的小鼠内脏脂肪干细胞，如图2所示。

优选地，小鼠内脏脂肪干细胞置于5%O₂低氧条件下培养，细胞增殖能力更强。

对上述方法得到的小鼠内脏脂肪干细胞进行鉴定，因为小鼠脂肪组织基质血管组分中含有单核/巨噬细胞等免疫细胞、血管内皮细胞和脂肪干细胞等多种细胞，为了以较低成本获得更高纯度的内脏脂肪干细胞，本例采用差异贴壁法获取内脏脂肪干细胞，并进行流式分析鉴定。

小鼠内脏脂肪干细胞鉴定步骤：（1）使用0.25%胰蛋白酶消化小鼠内脏脂肪干细胞1min，然后用两倍体积的完全培养基中止消化，移液枪吹打制备单细胞悬液，取10μL单细胞悬液进行细胞计数；（2）300g，5min离心去上清，根据细胞计数结果，用流式缓冲液（含2%胎牛血清、1mM EDTA的PBS）重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至0.5-1×10⁶/ml左右；（3）使用Fc受体阻断剂剂(anti-mouse CD16/32，Biolegend)封闭细胞10-15min；（4）向已封闭好的单细胞悬液中加入特异性的荧光偶联流式抗体（CD31/PECAM-1-PE-Cy7，Invitrogen、CD45-PE-Cy7，invitrogen、SCA1/Ly6a-APC，Biolegend），避光孵育20至30min；（5）用流式缓冲液离心（300g，5min）洗涤细胞两次后(6)流式细胞仪上机检测。

如图3.1、图3.2所示，流式分析的结果显示在未进行差异贴壁前，脂肪SVF中CD45+CD31+比例为 44.2%，CD45-CD31-SCA1+的脂肪干细胞比例为48.7%；差异贴壁后得到的脂肪干细胞中CD45+CD31+比例为 11.4%， CD45-CD31-SCA1+的脂肪干细胞比例为78.7%，通过差异贴壁法得到了较高纯度的小鼠内脏脂肪干细胞。

实施例2：血管化脂肪类器官培养

如图1所示，采用脂肪干细胞维持培养基在37℃，5%CO₂条件下培养扩增分离得到小鼠内脏脂肪干细胞。

脂肪干细胞维持培养基，具体成分如表1：

表1

小鼠内脏脂肪干细胞培养扩增至2至3代，细胞数量达10⁶以上时进行三维内脏脂肪干细胞球制备，采用的方法为悬滴法。

将培养扩增的小鼠内脏脂肪干细胞用0.25%胰蛋白酶消化1min，然后用两倍体积的完全培养基中止消化，吹打混匀后取20μL单细胞悬液进行细胞计数，同时将单细胞悬液300g，5min离心去上清，根据细胞计数结果，向细胞沉淀中加入适量的完全培养基重悬，调整细胞悬液浓度为4×10⁵~5×10⁵/ml，然后使用移液枪，按20μL每个悬滴的量将悬滴置于10cm细胞培养板顶盖内侧，并在细胞培养皿的底部加入无菌水，以维持湿度，将含有小鼠内脏脂肪干细胞的悬滴的细胞培养皿置于37℃ 5%CO₂条件下对小鼠内脏脂肪干细胞进行悬滴培养。

优选地，采用TryPLE替代胰蛋白酶对小鼠内脏脂肪干细胞进行消化。

悬滴培养小鼠内脏脂肪干细胞2-3天，以形成的形态较规则的细胞球。

配制小鼠内脏脂肪干细胞血管化诱导培养基（表2）：其中VEGF浓度在1-2 ng/ml内：

表2

取Paraflim封口膜置于384孔PCR板上，封口膜上叠加一块384孔超低吸附板，用力压制构建多孔模具，去除封口膜上纸片，将三维脂肪干细胞球转移至模具内，每孔1个细胞球，使用6-8μL浓度为8-12mg/ml基质胶包埋细胞球，之后将模具置于10cm细胞培养皿底部，并移入37℃细胞培养箱30min，待其固化后用200μL移液枪吸取脂肪干细胞血管化诱导培养基，小心吹打模具中凝固的基质胶团块使其落入24孔超低吸附板中，补足血管内皮细胞培养基继续培养4~5天，期间换液一次，诱导其形成分支状血管结构。血管化脂肪类器官血管化诱导7天后的形态图如图5所示。

配制血管化脂肪类器官成脂定向诱导培养基（表3）和血管化脂肪类器官成脂诱导维持培养基（表4），血管化脂肪类器官成脂定向诱导培养基亦可仅使用以胰岛素或胰岛素+***+3-异丁基-1-甲基黄嘌呤做为成脂诱导剂的DMEM/F12完全培养基对血管化脂肪类器官进行成脂诱导。

表3

表4

使用血管化脂肪类器官成脂定向诱导培养基和成脂诱导维持培养基，对其进行13天至15天的成脂诱导，每两到三天进行换液，诱导其形成含有成熟脂肪细胞的脂肪类器官。血管化脂肪类器官成脂诱导11天后的形态图如图6所示。

配制血管化脂肪类器官维持培养基，组成成分如下：89%DMEM/F12培养基，10%胎牛血清，1%青霉素/链霉素双抗。

使用血管化脂肪类器官维持培养基培养小鼠脂肪类器官6天，每两到三天换液。最后采用死活染料对类器官细胞进行死活染色，检测死活细胞比例，结果显示脂肪类器官中活细胞比例在90%以上。

血管化脂肪类器官免疫荧光染色鉴定：

（1）在血管化脂肪类器官血管化诱导4天后。使用200μL枪头小心移除超低吸附板内培养基，然后使用1ml枪头吸取脂肪类器官，将其转移至35mm共聚焦皿（Cellvis D35-10-0-N）中心。将含有血管化脂肪类器官的共聚焦皿置于4℃冰箱，使包埋血管化脂肪类器官的基质胶溶解。

用移液枪吹打血管化脂肪类器官两到三次，去除血管化脂肪类器官上多余的基质胶，将共聚焦皿中血管化脂肪类器官的周围的多余的培养基吸去，用200ul 4%多聚甲醛室温固定血血管化脂肪类器官30min，然后去除多聚甲醛，使用PBS冲洗血管化脂肪类器官两到三次。加入0.2%的TritonX-100溶液室温通透血管化脂肪类器官10-15min，再用PBS冲洗血管化脂肪类器官两到三次。然后使用含2.5%BSA的PBS封闭液将血管化脂肪类器官封闭30min-45mim，PBST缓冲液冲洗两到三次去除封闭液。用100μL PBS浸没血管化脂肪类器官后，向PBS中加入1%的anti-mouse CD31抗体，置于4℃孵育过夜。使用PBST缓冲液冲洗血管化脂肪类器官两到三次。用含1% Alexa Flour594或Dylight549的荧光二抗的PBS溶液孵育血管化脂肪类器官2小时，PBST冲洗两到三次之后，用100μL PBS浸没血管化脂肪类器官。

使用LSM880（Zeiss，Germany）20倍空气镜和40倍水镜对免疫荧光染色后的血管化脂肪类器官进行成像。如图4所示。

（2）在血管化脂肪类器官成脂诱导15天后。使用200μL枪头小心移除超低吸附板内培养基，然后使用1ml枪头吸取脂肪类器官，将其转移至35mm共聚焦皿（Cellvis D35-10-0-N）中心。将含有血管化脂肪类器官的共聚焦皿置于4℃冰箱，使包埋血管化脂肪类器官的基质胶溶解。

用移液枪吹打血管化脂肪类器官两到三次，去除血管化类器官上多余的基质胶，将共聚焦皿中血管化脂肪类器官的周围的多余的培养基吸去，用200ul 4%多聚甲醛室温固定血管化脂肪类器官30min，然后去除多聚甲醛，使用PBS冲洗血管化脂肪类器官两到三次。加入0.2%的TritonX-100溶液室温通透血管化脂肪类器官10-15min，再用PBS冲洗血管化脂肪类器官两到三次。然后使用含2.5%BSA的PBS封闭液将血管化脂肪类器官封闭30min-45mim，PBST缓冲液冲洗血管化脂肪类器官两到三次去除封闭液。用100μL PBS浸没血管化脂肪类器官后，向PBS中加入1%的anti-mouse CD31抗体，置于4℃孵育过夜。使用PBST缓冲液冲洗血管化脂肪类器官两到三次。用含1% Alexa Flour594或Dylight549的荧光二抗的PBS溶液孵育血管化脂肪类器官2小时，PBST冲洗两到三次之后，加入含1μg/ml Bodipy的PBS溶液对血管化脂肪类器官的脂滴染色30min，PBS冲洗两到三次之后，用含有1μg/mlDAPI的PBS溶液对血管化脂肪类器官细胞核染色10分钟，最后使用PBS冲洗两遍，用100μLPBS浸没血管化脂肪类器官。

使用LSM880（Zeiss，Germany）20倍空气镜和40倍水镜对免疫荧光染色后的血管化脂肪类器官进行成像。如图7所示。

上述描述中的实施方案可以进一步组合或者替换，且实施方案仅仅是对本发明的优选实施例进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变化和改进，均属于本发明的保护范围。本发明的保护范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

1.一种血管化脂肪类器官培养方法，其特征在于，包括小鼠内脏脂肪干细胞分离扩增和血管化脂肪类器官培养两个部分，具体步骤如下：

人道处死小鼠；

获取小鼠脂肪组织：无菌条件下打开小鼠腹腔获取内脏脂肪组织，并使用2-8℃的脂肪组织冲洗液冲洗小鼠内脏脂肪2~3次去除污物；

消化脂肪组织：眼科剪剪碎脂肪组织，使用包括1mg/ml的I型胶原酶，体积比为2%青霉素/链霉素双抗，体积比1%的BSA和体积比为97%HBSS缓冲液脂肪组织消化液37℃，30min，150rpm恒温摇床消化脂肪组织；

得到单细胞悬液：等体积DMEM/F12完全培养基终止消化，100μm和70μm细胞滤网过滤脂肪组织消化液两次后，300g，5min离心去上清，使用红细胞裂解液裂解红细胞，培养基重悬细胞得到单细胞悬液；

2D培养扩增脂肪干细胞：将得到的单细胞悬液接种于组织处理细胞培养皿，补足培养基，放入37℃，5%CO₂或37℃，5%CO_2，5%O₂培养箱中，4-6h后换液得到高纯度脂肪干细胞，2-3天后传代继续培养扩增脂肪干细胞；

悬滴培养：将培养扩增后的脂肪干细胞胰酶或TrypLE消化后，完全培养基终止消化，采用悬滴法使小鼠内脏脂肪干细胞形成三维脂肪干细胞球，悬滴培养2-3天，每个细胞球含有的细胞数为8000-10000；

血管化诱导：使用脂肪干细胞血管化诱导培养基在超低吸附板中悬浮培养诱导小鼠内脏脂肪干细胞2天，诱导小鼠内脏脂肪干细胞向血管内皮细胞定向，使用Paraflim封口膜和384孔PCR板构建多孔模具，将脂肪干细胞血管化诱导培养基培养两天的小鼠内脏脂肪干细胞球转移至模具内，模具中每孔放置一个脂肪干细胞球，采用8~12mg/ml浓度基质胶包埋细胞球，将模具置于细菌或细胞培养皿皿底，倒置放入37℃细胞培养箱30min，待基质胶固化后用脂肪干细胞血管化诱导培养基将含有小鼠内脏脂肪干细胞球的基质胶转移至超低吸附板中继续悬浮诱导4~5天，2~3天换液，使其形成分支状血管结构；

成脂诱导：使用血管化脂肪类器官成脂定向诱导培养基对小鼠脂肪类器官进行3天的成脂诱导定向，之后使用血管化脂肪类器官成脂诱导维持培养基对血管化脂肪类器官继续成脂诱导10-12天，使之形成具有直径超过40μm成熟脂肪细胞的血管化脂肪类器官；

维持培养：使用血管化脂肪类器官维持培养基培养血管化脂肪类器官6天，用于后续细胞活力及表型检测，培养得到的血管化脂肪类器官含有血管内皮细胞和成熟脂肪细胞；

所述的2D培养扩增脂肪干细胞使用脂肪干细胞维持培养基，包括体积比为12%胎牛血清、体积比为1%青霉素/链霉素双抗、10ng/ml碱性成纤维生长因子和体积比为87%的DMEM/F12培养基；

所述的悬滴培养所使用的完全培养基包括体积比为15%胎牛血清，体积比为1%青霉素/链霉素双抗和体积比为84% DMEM/F12；

血管化诱导使用的脂肪干细胞血管化诱导培养基包括1ng/ml血管内皮生长因子，5ng/ml表皮生长因子，20ng/mlR3-***-1，1μg/ml抗坏血酸， 0.2μg/ml氢化可的松，30μg/ml庆大霉素，15ng/ml两性霉素和体积比为5%胎牛血清的血管内皮细胞基础培养基EBM-2；

血管化诱导三维脂肪干细胞球2天后采用基质胶包埋小鼠内脏脂肪干细胞球，包埋每个细胞球使用的基质胶用量为6-8μL；

血管化脂肪类器管成脂定向诱导培养基包括体积比为15%的胎牛血清、1% 青霉素/链霉素双抗、10μg/ml胰岛素、1μM***，1μM罗格列酮、0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和体积比为84%的DMEM/F12培养基；血管化脂肪类器官成脂诱导维持培养基包括体积比为12%的胎牛血清、1% 青霉素/链霉素双抗、5μg/ml胰岛素和体积比为87%的DMEM/F12培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脂肪组织冲洗液包括体积比为2%胎牛血清，体积比为2%青霉素/链霉素双抗和体积比为96%HBSS缓冲液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的悬滴培养前胰酶消化制备2D培养扩增脂肪干细胞，制备单细胞悬液，细胞浓度为4×10⁵~5×10⁵/ml，以20μL单细胞悬液接种于细胞培养皿顶盖内侧，制备悬滴，在细菌或细胞培养板的底部加入无菌水，以维持湿度。