CN116406381A - 工程化抗***干细胞抗原融合蛋白及其用途 - Google Patents

工程化抗***干细胞抗原融合蛋白及其用途 Download PDF

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Abstract

公开了工程化抗***干细胞抗原(PSCA)融合蛋白及其检测和治疗表达PSCA的癌症的用途。

Description

工程化抗***干细胞抗原融合蛋白及其用途
优先权声明
本申请要求于2020年05月19日提交的美国临时专利申请号63/027,184的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
关于联邦政府资助的研究或开发的声明
本发明在国立卫生研究院授予的批准号R01CA174294的政府支持下完成。政府享有本发明的某些权利。
序列表
本申请包含经由EFSWeb以ASCII格式提交并通过引用整体并入本文的序列表。该ASCII副本创建于2021年05月18日，名为SequenceListing.txt，大小为11KB。
背景
人***干细胞抗原(PSCA)是一种小的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的细胞表面糖蛋白，在***，膀胱，肾脏，胃，和胎盘的上皮细胞中表达。PSCA在***癌中过度表达，表达水平与格里森评分和不良预后相关。PSCA在转移至***和骨的***癌中也高度表达。PSCA表达在膀胱癌和胰腺癌中升高。之前的工作描述了抗人PSCA抗体1G8，它特异性靶向表达PSCA的细胞并在临床前模型中抑制肿瘤生长。小鼠IgG 1G8通过CDR移植(2B3)人源化，并使用酵母展示进行亲和力成熟。基于两个亲和力成熟的变体(A2和A11)，工程化小的二价抗体片段；80kDa微抗体(A11 Mb)，scFv-CH3二聚体和cys-双抗体(A2cDb)，具有C-末端半胱氨酸残基的50kDa scFv二聚体功能体(functionalism)。这些抗体片段显示出最适合分子成像应用的药代动力学，如短血浆半衰期和良好的肿瘤渗透性。然而，由于肾毒性，肾清除率阻止了放射免疫治疗的使用。全长IgG主要通过肝胆途径进行清除(除靶标介导外)，且肝脏对放射的敏感性较低。然而，IgG的长血浆半衰期(在人体内长达三周)在用于放射免疫治疗时会导致血液学毒性。因此，需要开发具有适合诊断和治疗用途的改进特性的抗体。
发明内容
在一个方面，本公开涉及基因工程化抗***干细胞抗原(PSCA)scFv-Fc融合蛋白。该抗PSCA scFv-Fc融合蛋白包含形成同源二聚体的两个肽，每个肽包含抗PSCA抗体的可变结构域VH和VL，和截短的铰链和片段可结晶(Fc)区域。在一些实施例中，该可变结构域以VH-VL的顺序排列。在一些实施例中，该可变结构域VH和VL由富含甘氨酸的接头连接。在一些实施例中，该接头是约10-25个氨基酸，如10个氨基酸，11个氨基酸，12个氨基酸，13个氨基酸，14个氨基酸，15个氨基酸，16个氨基酸，17个氨基酸，18个氨基酸，19个氨基酸，20个氨基酸，21个氨基酸，22个氨基酸，23个氨基酸，24个氨基酸，或25个氨基酸。在一些实施例中，该接头具有((G4S)2-GGSAQ)(SEQ ID NO：1)的序列。在一些实施例中，该Fc区域的FcRn结合区域包含两个点突变H310A和H435Q。在一些实施例中，该截短的铰链和Fc区域衍生自人IgG2。在一些实施例中，该scFv-Fc融合蛋白的每个肽具有与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，或至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，该scFv-Fc融合蛋白与效应子部分和治疗部分缀合，该效应子部分包括标记部分，如包括放射性标记或荧光标记的可检测标志物。在某些实施例中，该治疗部分包括细胞毒性剂，抗肿瘤药物，毒素，放射性剂，细胞因子，第二蛋白质，抗体，放射性核素，或酶。
在有关方面，本公开涉及包含有效量的本文公开的一个或多个scFv-Fc融合蛋白，或scFv-Fc融合蛋白和效应子部分缀合物的药物组合物。在一些实施例中，该药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体，赋形剂，和/或稳定剂。在一些实施例中，该药物组合物还包含一种或多种额外的治疗剂，包括例如，化疗剂，细胞毒性剂，细胞因子，生长抑制剂，放射性核素，和抗激素剂。该治疗剂可以缀合至scFv-Fc融合蛋白。在一些实施例中，该药物组合物配制成适合于静脉内，肌内，腹膜内，脑脊髓内(intracerobrospinal)，皮下，关节内，滑膜内，鞘内，口服，外用，或吸入施用。
在另一个方面，公开了一种治疗或预防表达PSCA的癌症的方法，包括向受试者施用有效量的本文公开的一个或多个scFv-Fc融合蛋白，scFv-Fc融合蛋白和效应子部分缀合物，或药物组合物。在一些实施例中，该方法还需要向该受试者施用一种或多种额外的治疗剂，包括例如，化疗剂，细胞毒性剂，细胞因子，生长抑制剂，放射性核素，和抗激素剂。在一些实施例中，表达PSCA的癌症包括***癌，胰腺癌，和膀胱癌。
在另一个方面，本文公开了一种检测在受试者中表达PSCA的癌症的方法。该方法需要向受试者施用本文公开的一个或多个scFv-Fc融合蛋白，测量该受试者中scFv-Fc融合蛋白的水平，将该scFv-Fc融合蛋白的水平与健康受试者的水平或与健康人群的平均水平进行比较，其中该受试者中scFv-Fc融合蛋白水平升高表示癌症的存在。在一些实施例中，该scFv-Fc融合蛋白与标记部分缀合。在一些实施例中，该标记部分包含一种或多种放射性同位素，如32p，99mTc，111In，18F，64Cu，和89Zr，荧光染料，电子致密试剂，酶，生物素，异羟基洋地黄毒甙元(digoxigenin)，或可检测的半抗原和蛋白质。在一些实施例中，该表达PSCA的癌症包括***癌，胰腺癌，和膀胱癌。
在另一个方面，本文公开了一种确定治疗在受试者中表达PSCA的癌症的预后的方法。该方法需要向受试者施用本文公开的一个或多个scFv-Fc融合蛋白，测量该受试者中scFv-Fc融合蛋白的水平，比较该受试者接受癌症治疗前后的scFv-Fc融合蛋白的水平，其中接受该癌症治疗后的该受试者中scFv-Fc融合蛋白的水平降低表示该癌症治疗有效。在一些实施例中，该scFv-Fc融合蛋白与标记部分缀合。在一些实施例中，该标记部分包含一种或多种放射性同位素，如32P，99mTc，111In，18F，64Cu，和89Zr，荧光染料，电子致密试剂，酶，生物素，异羟基洋地黄毒甙元，或可检测的半抗原和蛋白质。在一些实施例中，该表达PSCA的癌症包括***癌，胰腺癌，和膀胱癌。
在另一个方面，本文公开了一种对在受试者中表达PSCA的癌症成像的方法。该方法需要向受试者施用本文公开的一个或多个scFv-Fc融合蛋白，并对该受试者成像以确定肿瘤的位置和大小。在一些实施例中，该scFv-Fc融合蛋白与标记部分缀合。在一些实施例中，该标记部分包含一种或多种放射性同位素，如32P，99mTc，111In，18F，64Cu，和89Zr，荧光染料，电子致密试剂，酶，生物素，异羟基洋地黄毒甙元，或可检测的半抗原和蛋白质。在一些实施例中，该表达PSCA的癌症包括***癌，胰腺癌，和膀胱癌。
附图简要说明
本申请包含至少一张彩色绘制的附图。具有一张或多张彩色附图的本申请的副本将在请求并支付必要费用后由专利商标局(the Office)提供。
图1示出了编码单链Fv-Fc2融合蛋白的基因和所得蛋白二聚体的设计示意图。左小图示出了编码单链Fv-Fc融合蛋白的基因的示意图。全长人γ(gamma)2铰链的序列如SEQID NO：5所示：
Figure BDA0004113634760000041
其中较低的铰链由CH2编码。截短的残基(E)RKCC以删除线示出，在同源二聚化蛋白中形成二硫键桥的半胱氨酸(C)残基以粗体和下划线示出。根据文献，Fc-效应子功能的强度使用+和-进行描绘。IgG2的半衰期在人体内为21天，在小鼠体内为10-12天。右小图示出了scFv-Fc2蛋白组装成同源二聚体的示意图。蓝点代表在用红色描绘的人序列上操作的原始鼠CDR。
图2示出了纯化的A2scFv-Fc2和A2scFv-Fc2DM。非还原和还原条件下的SDS-PAGE分析(2μg/泳道)。
图3示出了纯化的A2scFv-Fc2和A2scFv-Fc2DM的尺寸排阻层析(左小图)和未知分子量的线性校准曲线(log MW/(Ve/V0))的插值(右小图)。
图4示出了hPSCA-mFc的免疫印迹(0.5μg/泳道，非还原和还原)。用山羊抗小鼠IgG-HRP探测免疫印迹以显示抗原的存在(第一小图)。A2scFv-Fc2(第二小图)和A2scFv-Fc2DM(第三小图)浓度为5μg/mL，然后是山羊抗人IgGFc-AP(Sigma-Aldrich I2136)。仅检测抗体(第四小图，山羊抗人IgGFc-AP)。使用BCIP/NBT(Millipore)使印迹显影。
图5示出了通过ELISA的抗PSCA scFv-Fc与所固定抗原hPSCA-mFc的结合。使用山羊抗人IgGFc-AP抗体检测抗PSCA scFv-Fc的结合，并使用碱性磷酸酶黄(pNPP)液体底物(Sigma-Aldrich P7998)显影。
图6示出了3个独立实验中1个的ELISA饱和结合曲线，使用单位点特异性结合模型(GraphPad Prism 8)拟合重复实验(duplicates)。
图7示出了SEQ ID NO：2的序列。
图8示出了SEQ ID NO：3的序列。
图9A-9C示出了A2scFvFc2/DM与表达PSCA的细胞系结合的流式细胞术分析。图9A：未观察到抗PSCA抗体片段的非特异性结合，而与***癌细胞系22Rvl-PSCA的强结合表明抗原特异性。图9B：抗体与恒定细胞数结合的滴定用于确定表观细胞上亲和力(半数最大结合)。图9C：A2scFv-Fc2用于确认转导的小鼠细胞系RM9和KPC的PSCA表达，以及人Capan-1的内源性PSCA表达。
图10A-10D示出了A2scFvFc2/DM的放射性标记。图10A：DFO缀合和未缀合的抗体片段在非还原和还原条件下的SDS-PAGE(考马斯亮蓝染色)。图10B：未缀合和DFO缀合的A2scFvFc2/DM的SEC洗脱曲线。图10C：放射性标记过程和放射性标记结果的示意图。图10D：未缀合和89Zr-DFO缀合的抗体片段的SEC。
图11A-11B示出了89Zr-A2scFvFc2/DM在裸(nude)小鼠中的离体生物分布。图11A：p.i.4，24，和96小时的离体生物分布，描绘为盒须图(最小到最大)。星号表示通过Tukey(多重比较检验)校正的双向ANOVA所分析的显著性。图11B：清除组织中的离体生物分布值(平均值±SEM)和所得比率。
图12示出了体内生物分布和肿瘤靶向。注射89Zr-A2scFv-Fc2DM(上小图)或89Zr-A2scFv-Fc2(下小图)的裸小鼠(22Rv1-PSCA，右肩)的免疫PET成像。描绘的是作为全身最大强度投影PET/CT叠加的代表性扫描。
图13示出了hPSCA KI小鼠同基因***癌模型中的免疫PET。将89Zr-A2scFv-Fc2或89Zr-A2scFv-Fc2DM(10μg/70μCi)注射到携带双侧PSCA-/+RM9皮下肿瘤(左小图)或单侧RM9-PSCA s.c.肿瘤(右小图)的hPSCA KI小鼠中。在p.i.4，24，和96小时对小鼠成像。描绘的是作为全身最大强度投影PET/CT叠加的代表性扫描。
图14A-14B示出了89Zr-A2scFvFc2/DM在hOPSCA KI小鼠中的离体生物分布。图14A：p.i.24和96小时的离体生物分布，描绘为盒须图(最小到最大)。星号表示通过Tukey(多重比较检验)校正的双向ANOVA所分析的显著性。图14B：清除组织中的离体生物分布值(平均值±SEM)和所得比率。
图15A-15B示出了89Zr-A2scFv-Fc2/DM在荷瘤裸小鼠中的终末半衰期。
发明详述
scFv-Fc融合蛋白
本文公开了一种基因工程化抗***干细胞抗原(PSCA)scFv-Fc融合蛋白。在多个实施例中，该抗PSCA scFv-Fc融合蛋白包含形成同源二聚体的两个肽，每个肽包含抗PSCA抗体的可变结构域VH和VL，以VH-VL的顺序排列，工程化人IgG2 Fc结构域，具有降低的效应子功能(如低抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC))，和Fc区域的FcRn结合区域中的点突变如H310A和H435Q，用于施用于受试者后从循环中快速清除。该可变结构域由富含甘氨酸的接头连接以形成scFv。
术语“抗体”指包含来自特异性结合和识别抗原的免疫球蛋白基因或其片段的框架区的多肽。已知的免疫球蛋白基因包括κ(kappa)，λ(lambda)，α(alpha)，γ，δ(delta)，ε(epsilon)，和μ(mu)恒定区基因，以及大量的免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ，μ，α，δ，或ε，它们又分别定义免疫球蛋白类别，IgG，IgM，lgA，IgD，和IgE。通常，抗体的抗原结合区域在结合的特异性和亲和力方面最为关键。
示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻链”(约25kD)和一条“重链”(约50-70kD)。每条链的N-末端限定约100至110个或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别是指这些轻链和重链。
在一些实施例中，本文公开的该scFv-Fc融合蛋白包含衍生自美国专利号9,527,919中公开的抗PSCA抗体A2的可变结构域，其内容通过引用整体并入本文，特别是关于其公开的抗体和抗体片段，如VH，VL，和CDR序列，scFv和scFv-Fc的结构，制造它们的方法，和它们的药物组合物和制剂。
在一些实施例中，本文公开的该scFv-Fc融合蛋白的VH和VL结构域具有与美国专利号9,527,919中公开的A2抗体的VH和VL结构域基本上相同的序列。
术语“基本上相同”在两个或更多个核酸或氨基酸序列的上下文中是指当与比较窗口或指定区域针对最大对应性进行比较和比对时，如使用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过手动比对和目视检查(参见例如，NCBI网站等)所测量的，与参考序列或部分相同或具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基(即约80％同一性，优选至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或更高的同一性)的两个或更多个序列或子序列。该定义还包括具有缺失和/或添加以及取代的序列。优选地，两个参考结构域之间的序列同一性为至少85％，90％，95％，97％，98％，或99％。在一些实施例中，相对于参考序列或结构域而言，序列上的差异仅为一个，两个，三个或四个，或五个至十二个氨基酸。如下面所述，优选算法可以考虑间隙等问题。优选地，同一性存在于长度为至少约15个氨基酸或核苷酸的区域上，或更优选地存在于长度为15-50个氨基酸或核苷酸的区域上。在其他实施例中，同一性可存在于至少约50，100，150，200，或更多个氨基酸的区域上。
关于氨基酸序列，本领域普通技术人员将认识到，对所编码序列中改变，添加，或缺失单个氨基酸或小百分比的氨基酸的核酸，肽，多肽，或蛋白质序列的个别取代，缺失，或添加是“被保守修饰的变体”，其中该变化导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能上相似的氨基酸的保守取代为本领域已知。此类被保守修饰的变体是对本公开的多态性变体，种间同源物，和等位基因的补充但不排除。
以下八组各自含有彼此保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见例如，Creighton，《蛋白质》(1984))。
在一些实施例中，该scFv-Fc融合蛋白为A2scFv-Fc2，VH-接头-VL-(hg2)铰链-CH2-CH3，各肽具有SEQ ID NO：2所示的序列：
Figure BDA0004113634760000091
在一些实施例中，该scFv-Fc融合蛋白为A2scFv-Fc2DM(具有双突变H310A/H435Q)，VH-接头-VL-(hg2)铰链-CH2-CH3DM，各肽具有SEQ ID NO：3所示的序列：
Figure BDA0004113634760000092
在一些实施例中，所公开的融合蛋白的抗体片段和/或结构域被修饰，即通过将任何类型的分子共价连接至该抗体片段和/或结构域。例如，该修饰包括但不限于糖基化，乙酰化，聚乙二醇化，磷酸化，酰胺化，已知保护/阻断基团的衍生化，蛋白水解裂解，与细胞配体或其他蛋白质的连接等。许多化学修饰中的任何一种均可以通过已知技术进行，包括但不限于特定的化学裂解，乙酰化，甲酰化，衣霉素的代谢合成等。另外地，该修饰包括一个或多个非天然氨基酸。
所公开的工程化融合蛋白以高亲和力识别并特异性结合PSCA。这些基因工程化融合蛋白专为体内使用而定制，用于靶向和检测表达PSCA的多个癌症，例如，***癌，胰腺癌，和膀胱癌。
短语“特异性结合”是指工程化融合蛋白与特定靶蛋白如PSCA的结合至少是背景的两倍，更通常是超过背景的10至100倍。多种免疫试验形式可用于选择与PSCA特异性结合的融合蛋白。例如，固相ELISA免疫试验通常用于选择与靶蛋白特异性结合的抗体(参见例如，Harlow&Lane，使用抗体，《实验室手册》(1998)，其中描述可用于确定特异性免疫反应性的免疫试验格式和条件)。
PSCA及其在***癌，膀胱癌，和胰腺癌中的表达公开于美国专利号6,756,036，其通过引用整体并入本文。人PSCA翻译的氨基酸序列由SEQ ID NO：4(UniProtKB-O43653)表示，其中信号肽以下划线示出，前肽以粗体和斜体示出：
Figure BDA0004113634760000101
还公开了包含编码本发明抗体及其片段的核苷酸序列的多核苷酸。在某些实施例中，本公开提供了编码本文公开的该融合蛋白的表达载体。在某些实施例中，本公开提供了编码本文公开的该融合蛋白的多核苷酸，用于基因治疗或体内施用。
在某些实施例中，本文公开的该融合蛋白缀合至“效应子”部分。该效应子部分可以是多种分子，包括标记部分，如包括放射性标记或荧光标记的可检测标志物，或者可以是治疗部分。此类效应子部分包括但不限于细胞毒性剂，抗肿瘤药物，毒素，放射性剂，细胞因子，第二蛋白质，抗体，或酶。此外，本文公开的该融合蛋白可以与将前药转化为细胞毒性剂的酶连接。
细胞毒性剂的示例包括但不限于蓖麻毒素，多柔比星，柔红霉素，TAXOL，溴化乙锭，丝裂霉素，依托泊苷，替尼泊苷(tenoposide)，长春新碱，长春花碱，秋水仙碱，二羟基蒽二酮，放线菌素D，白喉毒素，假单胞菌外毒素(PE)A，PE40，相思子毒素，和糖皮质激素和其他化疗剂，以及放射性同位素。合适的可检测标志物包括但不限于放射性同位素，荧光化合物，生物发光化合物，化学发光化合物，金属螯合剂，或酶。该第二蛋白质可包括但不限于酶，淋巴因子，抑瘤素，或毒素。合适的毒素包括多柔比星，柔红霉素，TAXOL，溴化乙锭，丝裂霉素，依托泊苷，替尼泊苷，长春新碱，长春花碱，秋水仙碱，二羟基蒽二酮，放线菌素D，白喉毒素，假单胞菌外毒素(PE)A，PE40，蓖麻毒素，相思子毒素，糖皮质激素和放射性同位素。
将治疗剂与根据本发明的构建体缀合的技术是已知的(参见例如，Amon等人，“用于药物免疫靶向的单克隆抗体.在癌症治疗中”，《单克隆抗体和癌症治疗》，Reisfeld等人(编者)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)Hellstrom等人，“受控药物递送中的‘药物递送抗体’”(第2版)，Robinson等人(编者)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“细胞毒性剂的抗体携带者.在癌症治疗中：综述”《单克隆抗体84：生物学和临床，应用》，Pinchera等人(编者)，pp.475-506(1985)和Thorpe等人，“抗体-毒素缀合物的制备和细胞毒性特性.《免疫学评论》，62：119-58(1982))。
药物组合物
还公开了包含有效量的本文公开的一个或多个抗PSCA scFv-Fc融合蛋白或一个或多个PSCA scFv-Fc融合蛋白和效应子部分缀合物的药物组合物。该药物组合物还可包含一种或多种额外的治疗剂，和/或一种或多种药学上可接受的载体，赋形剂，和稳定剂。
可接受的载体，赋形剂，或稳定剂可以是醋酸盐，磷酸盐，柠檬酸盐，和其他有机酸；抗氧化剂(例如，抗坏血酸)防腐剂低分子质量多肽；蛋白质，如血清白蛋白或明胶，或亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；和氨基酸，单糖，双糖，和其他碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂；和离子和非离子表面活性剂(例如，聚山梨醇酯)；成盐抗衡离子如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂。该融合蛋白或该缀合物可以配制成0.5-200mg/ml或10-50mg/ml的浓度。
额外的治疗剂包括例如，化疗剂，细胞毒性剂，细胞因子，生长抑制剂，抗激素剂，和放射性核素，包括发射α或β的放射性同位素如At-211，Ac-225，Cu-67，Y-90，Lu-177，和I-131。该治疗剂也可以制备成缓释配制品(例如，固体疏水性聚合物(例如，聚酯，水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)，或聚(乙烯醇)的半透性基质)，聚乳酸。该融合蛋白或缀合物也可以包埋在例如，通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如，分别在胶体药物递送***(例如，脂质体，白蛋白微球，微乳剂，纳米颗粒，和纳米胶囊)或粗乳剂(macroemulsions)中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。在某些实施例中，该治疗剂与抗PSCA scFv-Fc融合蛋白缀合。
如本文所用，术语“有效量”，“治疗有效量”，或“治疗有效剂量”是指产生想要的效果的组合物的量。有效量的融合蛋白，缀合物，或药物组合物可用于在受试者中产生治疗效果，如预防或治疗目标病症，减轻与该病症相关联的症状，或产生想要的生理作用。在这种情况下，有效量是“治疗有效量”，“治疗有效浓度”，或“治疗有效剂量”。精确有效量或治疗有效量是该融合蛋白，该缀合物，或该药物组合物的量，其将在给定受试者的治疗功效方面产生最有效的结果。该量将根据多种因素而变化，包括但不限于活性剂的特性(包括活性，药代动力学，药效动力学，和生物利用度)，该受试者的生理状况(包括年龄，性别，疾病类型和阶段，一般身体状况，对给定剂量的反应度，和药物类型)，该制剂中一种或多种药学上可接受的载体的性质，和施用途径。此外，有效或治疗有效量可根据该融合蛋白，该缀合物，或该药物组合物是单独施用还是与另一种组合物，药物，治疗，或其他治疗方法或方式联合施用而变化。临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验确定有效量或治疗有效量，即通过监测该受试者对施用该融合蛋白，该缀合物，或该药物组合物的反应并相应地调整剂量。有关其他指导，参见Remington：药学的科学与实践，第21版，费城科学大学(USIP)，Lippincott Williams&Wilkins，费城，PA，2005，其通过引用并入本文，如同在本文完全阐述。
该药物配制品优选为单位剂型。在这种形式中，该配制品被细分为含有合适量的活性成分的单位剂量。该单位剂型可以是已包装的配制品，该包装含有离散量的配制品，如小瓶或安瓿中的包装片剂，胶囊，和粉剂。此外，该单位剂型本身可以是胶囊，片剂，扁囊剂(cachet)，或锭剂，或者可以是呈包装形式的合适数量的任何这些剂型。如果需要，该药物组合物还可以包含其他相容性治疗剂。
优选的药物配制品在缓释制剂中递送本文公开的一个或多个融合蛋白，或缀合物，任选地与一种或多种化疗剂或免疫治疗剂联合。本文公开的该融合蛋白或缀合物可作为敏化剂治疗性施用，其增加肿瘤细胞对其他细胞毒性癌症疗法的敏感性，包括化学疗法，放射疗法，免疫疗法，和激素疗法。
scFv-Fc融合蛋白的用途
本文公开的该scFv-Fc融合蛋白可用于过表达PSCA的癌症的诊断，预后，和治疗，例如，***癌，胰腺癌，和膀胱癌。因此，本公开还涉及一种通过向受试者施用有效量的本文公开的该scFv-Fc融合蛋白或该药物组合物来诊断，预后，或治疗过表达PSCA的癌症的方法。在某些实施例中，该方法应用于激素难治性或治疗抗性癌症。在某些实施例中，该方法应用于转移癌。
病症的“治疗(Treating)”或“治疗(treatment)”可指预防该病症，减缓该病症的发作或发展速度，降低该病症发展的风险，预防或延迟与该病症相关联的症状的发展，减少或结束与该病症相关联的症状，使该病症完全或部分消退，或其一些组合。治疗还可以指对病症的预防性(prophylactic)或预防性(preventative)治疗。
可以施用本文公开的该融合蛋白，缀合物，和药物组合物用于治疗性或预防性治疗。在治疗性应用中，将组合物以“治疗有效剂量”施用于患有疾病(例如，癌症)的患者。有效量的这种使用将取决于疾病的严重程度和患者的一般健康状况。根据患者需要和耐受的剂量和频率，可以单次或多次施用。出于本发明的目的，“患者”或“受试者”包括人和其他动物，特别是哺乳动物。因此，该方法适用于人治疗和兽医应用。其他已知的癌症疗法可以与本发明的方法联合使用。例如，根据本公开使用的该融合蛋白，该缀合物，或该药物组合物也可用于靶向细胞或使细胞对其他癌症治疗剂敏感，如5FU，长春花碱，放线菌素D，顺铂，甲氨蝶呤等。
在其他实施例中，该方法可与其他癌症疗法(例如，根治性***切除术)，放射疗法(外射束或近距放射治疗)，激素疗法(例如，睾丸切除术，抑制睾酮产生的LHRH-类似疗法，抗雄激素疗法)，或化疗一起实施。根治性***切除术包括切除整个***和一些周围组织。当认为癌症尚未扩散到组织之外时，通常使用这种治疗方法。放射疗法通常用于治疗仍局限于***或已扩散至附近组织的***癌。如果疾病更严重，可使用放疗来减小肿瘤大小。激素疗法通常用于***癌已经扩散到***以外或已经复发的患者。激素疗法的目的是降低雄性激素，雄激素的水平，从而使***癌缩小或生长更慢。促黄体激素释放激素(LHRH)激动剂减少睾酮的产生。这些药剂可以每月或更长时间注射一次。两个这样的类似物是亮丙瑞林和戈舍瑞林。也可以使用抗雄激素药物(例如，氟他胺，比卡鲁胺，和尼鲁他胺)。完全雄激素阻断是指将抗雄激素药物与睾丸切除术或LHRH类似物联合使用。化疗是***癌已扩散到***外且激素治疗失败的患者的一种选择。并不预计能破坏所有癌细胞，但它可能会减缓肿瘤生长并减轻疼痛。一些化疗药物用于治疗在用激素疗法治疗后复发或继续生长和扩散的***癌，包括多柔比星(阿霉素)，雌莫司汀，依托泊苷，米托蒽醌，长春花碱，和紫杉醇。通常将两种或多种药物一起给药以降低癌细胞对化疗产生抗性的可能性。小细胞癌是一种罕见的***癌，与激素疗法相比，它更可能对化疗产生反应。
联合施用考虑共同施用，使用不同的制剂或单一药物制剂，并以任一顺序连续施用，其中优选有一段时间，两种(或所有)活性剂同时发挥它们的生物活性。
治疗通常包括经由可接受的施用途径如静脉内注射(IN)以有效剂量重复施用该融合蛋白或该药物组合物。剂量将取决于本领域技术人员通常理解的多种因素，包括但不限于癌症的类型和癌症的严重程度，级别，或阶段，所使用融合蛋白的结合亲和力和半衰期，想要的稳态浓度水平，治疗频率，和与本发明的治疗方法联合使用的化疗剂或其他治疗剂的影响。典型的剂量可在约0.1至100mg/kg的范围内。每周范围为10-500mg的融合蛋白剂量可能是有效且耐受性良好的，尽管更高的每周剂量可能是合适的和/或耐受性良好的。在某些实施例中，施用方案是每周一次或每2-4周一次。确定合适剂量的主要决定因素是在特定情况下治疗有效所需的特定药剂的量。可能需要重复施用以实现肿瘤抑制或消退。初始负荷剂量可能更高。初始负荷剂量可以作为输注施用。如果该初始剂量耐受性良好，可以类似地施用定期维持剂量。
在癌症治疗的治疗用途中，该融合蛋白或该缀合物的剂量可根据患者的需要，所治疗病症的严重程度，和所使用的活性剂而变化。例如，考虑到特定患者诊断出的癌症的类型和阶段，可以凭经验确定剂量。随着时间的推移，施用于患者的剂量应足以对该患者产生有益的治疗反应。为特定情况确定合适的剂量在从业者的技能范围内。通常，治疗以小于化合物的最佳剂量的较小剂量开始。此后，该剂量以小的增量增加直到达到环境下的最佳效果。为方便起见，如果需要，日总剂量可分成几部分并将其在一天中施用。
直接施用该融合蛋白也是可能的，并且在某些情况下可能具有优势。例如，为了治疗膀胱癌，可以将该融合蛋白或该药物组合物直接注射到膀胱中。
可以使用多种已知方法将本文公开的该融合蛋白，缀合物，和药物组合物施用于受试者，例如，以推注或通过一段时间内连续输注进行静脉内施用，通过肌内，腹膜内，脑脊髓内，皮下，关节内，滑膜内，鞘内，口服，外用，或吸入途径。优选静脉内或皮下施用。该施用可以是局部的或全身的。
用于施用的该药物组合物通常包含溶解在药学上可接受的载体，优选含水载体中的如本文所述的融合蛋白或缀合物。可以使用多种含水载体，例如，缓冲盐水等。这些溶液是无菌的并且通常不含不合需要的物质。这些组合物可以通过常规已知的灭菌技术灭菌。该组合物可含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂，毒性调节剂等，例如，乙酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙，乳酸钠等。这些制剂中活性剂的浓度可以广泛变化，并且将根据所选的特定施用方式和患者的需要，主要基于流体体积，粘度，体重等进行选择。
取决于施用方法，该药物组合物可以多种剂型施用。例如，适合口服施用的单位剂型包括但不限于粉剂，片剂，丸剂，胶囊，和锭剂。人们认识到当口服施用时，应保护该药物组合物免于消化。这通常通过将该活性剂与组合物络合以使其对酸性和酶水解具有抗性，或通过将该活性剂包装在适合的抗性载体如脂质体或保护屏障中而实现。保护试剂免于消化的方法为本领域已知。检测癌症和/或肿瘤成像的方法
在另一个方面，本文公开了一种通过施用本文公开的抗PSCA scFv-Fc融合蛋白来体内检测癌症或肿瘤成像的方法。在一个实施例中，本文提供了一种在体内对癌细胞成像的方法，该方法包括向哺乳动物施用标记的抗PSCAscFv-Fc融合蛋白并在体内对该融合蛋白成像。该哺乳动物包括但不限于小鼠，大鼠，仓鼠，兔，猪，人等。
“标记”或“可检测部分”或“可检测标志物”是通过光谱学，光化学，生物化学，免疫化学，化学，或其他物理手段可检测的组合物。例如，有用的标记包括32P，荧光染料，电子致密试剂，酶(例如，常用于ELISA)，生物素，异羟基洋地黄毒甙元，或半抗原和蛋白质，其可被检测，例如，通过将放射性标记掺入肽，或用于检测与肽特异性反应的抗体。
体内成像的方法为本领域已知，包括但不限于磁共振成像(MRI)，核磁共振(NMR)(R.Weissleder，1999，《放射学》212：609-14)，计算机轴向断层(CAT)扫描，冷却电荷耦合器件(CCD)，相机光学成像(Honigman等人，2001《分子治疗》4：239-249)，生物发光光学成像(PR Contag等人，1998《自然·医学》4：245-247)，正电子发射断层扫描(PET)(ME Phelps，1991《神经化学研究》16：929-994；JG Tuvajev等人，1998《癌症研究》58：4333-4341)，单光子发射计算机断层扫描(JG.Tuvajev等人，1996《癌症研究》45：4087-4095)，microPET(综述于McVeigh，2006，《循环研究》98：879-86)等。
以下示例旨在说明本发明的多个实施例。因此，所讨论的具体实施例不应被视为对本发明范围的限制。对本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明范围的情况下可以进行多种等效，改变，和修改，并且应当理解，这些等效实施例将被包括在本文。此外，在本公开中引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文，如同在本文完全阐述。
示例
材料和方法
scFv-Fc片段的设计和克隆：单链可变片段-可结晶片段融合蛋白(scFv-Fc)由scFv与人IgG2的Fc区域融合组成。VH-VL序列中的scFv由15个氨基酸的富含甘氨酸的接头(G4S)2-GGSAQ连接。人γ2 Fc结构域包含截短的铰链，其后是CH2和CH3结构域。所得融合蛋白命名为scFv-Fc2形式。Fc的FcRn结合区中的点突变H310A和H435Q被引入构建体scFv-Fc2DM(双突变体)。野生型和突变的scFv-Fc肽均可形成大约110kDa的二聚体。
使用限制性位点AgeI和ApaI将编码两个A2scFv-Fc构建体的合成的密码子优化的DNA(在质粒pMA-T中，ThermoFisher Scientific的Invitrogen)亚克隆到哺乳动物表达载体pSecTag2A(AgeI)中。使用LipofectamineTM3000(ThermoFisher Scientific)将所得质粒转染到哺乳动物细胞系FS293-F(FreeStyleTM 293-F细胞(Gibco，ThermoFisherScientific)中。通过ZeocinTM选择试剂(ThermoFisher Scientific)选择生成稳定细胞池并通过蛋白质印迹测试蛋白质表达。
蛋白质产生：将Zeocin选择的稳定细胞池扩增到Nunc TripleFlask中，并用无血清培养基(Opti-
Figure BDA0004113634760000182
ThermoFisher Scientific)代替生长培养基进行蛋白质表达。每3-4天收集细胞培养上清液，持续两周。
蛋白质纯化：使用
Figure BDA0004113634760000181
层析***(GE Healthcare)从细胞培养上清液纯化重组抗PSCA scFv-Fc2融合蛋白，其中柱/>
Figure BDA0004113634760000184
rProtein A FF用于A2scDv-Fc2，柱/>
Figure BDA0004113634760000183
Protein L用于A2scFv-FcDM(均为GE Healthcare)。使用5柱体积的结合缓冲液(20mM磷酸钠pH 7.0)平衡柱。在上样之前将上清液浓缩并通过添加1/10体积的1M TrisHCl pH 9.0将其调节至pH 8.0-9.0。通过用结合缓冲液洗涤柱来去除未结合的蛋白质。已结合的蛋白质用100mM柠檬酸pH 3.0洗脱，添加1/10体积的1M TrisHCl pH 9.0中和，含蛋白质的部分用PBS透析。
生化表征：通过SDS-PAGE，蛋白质印记，和尺寸排阻层析(
Figure BDA0004113634760000191
200Increase10/300 GL，ThermoFisher Scientific)分析了纯化的蛋白质的纯度，完整性，和表观分子质量。
蛋白质印迹也用于测试抗原特异性。对重组人PSCA小鼠Fc融合蛋白(UCLA)进行印迹并测试抗PSCA scFv-Fc变体的结合。通过在ELISA中对所固定抗原进行饱和结合从而进一步评估了抗原结合的特异性和亲和力。使用“一个位点特异性结合”方程拟合特异性结合以确定Kd(平衡时结合一半抗原位点的配体浓度)和Bmax(结合位点的最大数量)。
细胞系和小鼠模型：将人***癌细胞系22Rv1，小鼠***癌细胞系RM9(ffluc)，和小鼠胰腺癌细胞系KPC(ffluc)，及其表达人PSCA的衍生物(22Rv1-hPSCA，RM9-hPSCA(ffluc)，和KPC-hPSCA(ffluc))(通过逆转录病毒基因转移，G418选择，和流式细胞术荧光激活细胞分选产生)在RPMI 1640(22Rvl)或含10％FBS的DMEM中培养。RM9和KPC细胞系由德克萨斯大学MD安德森癌症中心和Saul Priceman博士(City of Hope)提供。人胰腺癌细胞系Capan-1(
Figure BDA0004113634760000192
HTB-79TM)在含20％FBS的IMDM中培养。
对于人***癌异种移植模型，雄性无胸腺裸小鼠(J/Nu，Jax 002019，8-12周)在肩区域被皮下植入100μL(1∶1 vol∶vol HBSS∶Matrigel)中的1-2x106个细胞(22Rvl—PSCA或22Rv1)。肿瘤生长10-14天。人PSCA敲入(hPSCA KI)小鼠模型通过标准基因靶向方法在鼠胚胎干细胞中通过同源重组靶向***hPSCA cDNA而生成并回交到C57BL6/J上。通过将100μL(1∶1 HBSS∶Matrigel)中的5x104个细胞(RM9或RM9-hPSCA)皮下植入C57BL/6x hPSCA敲入小鼠(雌性，杂合子)的肩区域中而产生表达人PSCA的同基因鼠***癌模型，肿瘤生长7-10天。一些小鼠分别植入双侧PSCA阳性和阴性肿瘤。
细胞结合和流式细胞术：通过流式细胞术分析了抗PSCA A2scFv-Fc融合蛋白与经转导以表达细胞表面人PSCA或表达内源性hPSCA的细胞系的结合。细胞(0.5x 106)与A2scFvFc2或A2scFvFc2DM(1μM)在0.5mL PBA缓冲液(PBS 1x，2％FBS，0.02％叠氮化钠(NaN3)中于4℃温育2小时。用0.5mL PBA洗涤细胞两次，并使用山羊抗人IgG(H+L)-AlexaFluor 647二抗(1∶1000稀释)于4℃检测结合的scFv-Fc 30分钟。在BD LSRFortessaTM X-20流式细胞仪(BD Biosciences)上分析细胞并使用FlowJo展示。
与双功能螯合剂缀合：将抗PSCA A2scFv-Fc2和A2scFv-Fc2DM与p-SCN-Bn-去铁胺(SCN-DFO，Macrocyclics，B-705)以5倍摩尔过量(ph 9.0，2小时，室温)温育。使用PBS预处理的Micro Bio-Spin色谱柱(BioRad)去除多余的SCN-DFO。通过SDS-PAGE(考马斯亮蓝染色)和SEC(Superdex 200)分析证实了成功的缀合。
放射性标记：[89Zr]Zr-草酸盐(3D成像LLC)被中和(0.45体积2M Na2CO3，2.5体积1M HEPES)并添加至DFO缀合蛋白(0.185-0.278MBq/5-7.5μCi/μg)于室温1小时。使用MicroBio-Spin色谱柱(BioRad)纯化放射性标记的蛋白。使用20mM柠檬酸(pH 5.0)作为溶剂通过ITLC测定标记效率和放射化学纯度。
免疫PET/CT(体内）：小鼠经由尾静脉注射10μg(1.3-2.6MBq/35-70μCi)的89Zr-A2scFvFc2或89Zr-A2scFvFc2DM。用2-3％异氟醚麻醉小鼠，并于注射后(p.i.)的指定时间点在GNEXT PET/CT扫描仪(Sofie Biosciences)上进行10分钟静态PET扫描，然后进行1分钟标准CT扫描。使用3D-OSEM MAP算法重建图像并使用AMIDE软件呈现为全身最大强度投影(MIP)PET/CT叠加。
生物分布(离体）：对感兴趣的组织进行解剖，称重，和γ计数(2480Wizard2γ计数器，PerkinElmer)。每克组织的注射剂量百分比(％ID/g)基于衰减校正注射剂量标准进行计算。
血浆半衰期：在3分钟至96小时之间从尾静脉采集血样(5μL)并进行γ计数。使用两相衰减模型(GraphPad Prism 9)计算终末半衰期(t1/2β)。
示例1：A2scFv-Fc2和A2scFv-Fc2DM的生成
如图1所示，基于抗PSCA抗体片段A2的新型scFv-Fc片段通过将可变结构域的顺序改变为VH-VL而设计，由15个氨基酸的富含甘氨酸的接头((G4S)2-GGSAQ)连接，其后是人免疫球蛋白2(IgG2)截短的铰链和可结晶片段(Fc)。双突变体(DM)衍生物包含两个点突变，分别用丙氨酸或谷氨酰胺替代参与FcRn结合的组氨酸残基(H310A/H435Q)。
将编码scFv-Fc蛋白的密码子优化的基因亚克隆到哺乳动物表达载体(pSECTag2A)中，转染到FreeStyle 293-F细胞中，并选择稳定细胞池。从哺乳动物细胞培养上清液纯化重组scFv-Fc融合蛋白。在非还原条件下对纯化的蛋白质的SDS-Page分析示出了表观分子量大约为110kDa的单条带(A2scFv-Fc2的计算MW为99.65kDa，A2scFv-Fc2DM的计算MW为99.5kDa)，与糖基化(Asn-297，CH2)同源二聚体(图2)一致。在还原条件下，铰链中的二硫键桥断裂，单体蛋白以大约55kDa迁移。
纯化的抗PSCA scFv-Fc的纯度，完整性，和表观分子质量通过尺寸排阻层析测定(图3)。两种抗PSCA scFv-Fc在洗脱体积(分别为12.92和12.88mL)下以单峰洗脱(93-95％AUC)，与计算的分子质量大约110kDa一致。使用凝胶过滤分子质量标志物(Sigma-A1drich，MWGF200)进行分子量测定，结果A2scFv-Fc2为107.2kDa，A2scFv-Fc2DM为108.1kDa。
示例2：抗原特异性
纯化的scFv-Fc2融合部分用于通过免疫印迹检测重组人PSCA-小鼠Fc融合蛋白(hPSCA-mFc)(图4)。A2scFv-Fc2和A2scFv-Fc2DM均与还原和非还原的hPSCA-mFc结合，而二次检测抗体(抗人IgG-AP)与hPSCA-mFc的小鼠Fc没有交叉反应性，证实抗PSCA scFv-Fc构建体的成功重构和保留了抗原特异性。
为了进一步确认特异性抗原结合，使用ELISA检测A2scFv-Fc2和A2scFv-Fc2DM与所固定抗原hPSCA-mFc的结合(图5)。不同浓度的hPSCA-mFc被包被(PBS中1，3，和5μg/mL，100μL/孔)过夜，对照孔用BSA封闭。使用山羊抗小鼠Fc-AP检测所固定抗原的存在。使用山羊抗人IgGFc-AP抗体检测结合的抗PSCA scFv-Fc，并示出了增加的信号。未检测到与BSA包被的孔的非特异性结合。
示例3：抗原结合亲和力
抗PSCA scFv-Fc片段的饱和结合在ELISA中进行了3个重复的独立实验。A2scFv-Fc2和A2scFv-Fc2DM的连续稀释(1μM-0.1pM)与所固定重组hPSCA-mFc(1μg/mL)的结合具有特异性和剂量依赖性(图6)。两个构建体在相似浓度下达到半数最大结合(Kd)(A2scFv-Fc2为0.5±0.1nM，A2scFv-Fc2DM为0.8±0.2nM)。与cys-双抗体片段A2cDb相比，亲和力提高了约4-8倍(所固定hPSCA-mFc上的KD2nM，QCM，表达PSCA的细胞上的KD4nM，流式细胞术)，与A11Mb相比提高了大约20-30倍(所固定hPSCA-mFc上的KD 4nM，QCM，表达PSCA的细胞上的KD14nM，流式细胞术)。
示例4：细胞结合
通过流式细胞术分析了抗PSCA抗体片段与细胞表面上表达的PSCA结合的能力。使用PSCA阳性和阴性细胞系确认抗原特异性。在此试验中，结合仅见于与22Rv1-PSCA细胞，而不见于与22Rv1(图9A)。在保持细胞数恒定的情况下，抗体浓度的滴定示出了两个A2scFv-Fc变体的结合相当，A2scFv-Fc2的表观亲和力为1.2±0.05nM，A2scFv-Fc2DM的表观亲和力为0.65±0.03nM(图9B)。使用A2scFv-Fc2也证实了与经转导以表达人PSCA的鼠细胞系和人胰腺癌细胞系Capan-1的结合(图9C)。
示例5：放射性标记
抗PSCA A2scFv-Fc2/DM抗体片段与双功能螯合剂p-SCN-Bn-去铁胺(DFO)缀合，产生与表面暴露的赖氨酸残基的氨基基团的硫脲连接。SDS-PAGE分析证实了成功的DFO缀合(图10A)。DFO缀合的抗体片段的尺寸排阻层析分析显示了洗脱时间稍早的单峰(与未缀合的片段相比)，对应于大约3kDa的分子质量偏移，这表明螯合剂∶抗体比率为4∶1。DFO缀合的抗体片段通过89Zr螯合进行放射性标记，标记效率的结果相似(约80％)，得到的特异性活性为4.1±2.5μCi/μg，并产生>95％的放射化学纯度(图10C)。放射性标记的抗体片段的SEC示出了放射性和蛋白质的重叠洗脱曲线(图10D)，证实89Zr与抗体片段螯合/结合，纯化后没有游离89Zr残留。
示例6：离体生物分布
雄性裸小鼠分别(经由尾静脉)注射10μg89Zr-A2scFv-Fc2或89Zr-A2scFv-Fc2DM，并在p.i.4，24，或96小时对各组实施安乐死(图11A和11B)。离体生物分布数据证实与89Zr-A2scFv-Fc2相比，89Zr-A2scFv-Fc2DM的血液保留时间显著降低(p.i.4小时低1.3倍，p.i.24小时低3.6倍)，这在之后的时间点变得更加明显(p.i.96小时降低77倍)。这是由影响FcRn循环的突变引起的，89Zr-A2scFv-Fc2DM在对抗体循环贡献最大的组织(如肝脏和脾脏)中活性更高。肾脏中相对较低的摄取值证实了scFvFc抗体片段向肝清除的转移。
与PSCA阴性22Rv1肿瘤相比，22Rv1-PSCA皮下肿瘤的更高摄取证实了PSCA特异性肿瘤摄取。89Zr-A2scFv-Fc2的较长半衰期导致22Rv1-PSCA肿瘤中的蓄积较高(18.4±1.0％ID/g，p.i.96小时)，但肿瘤：血液比率较低(1.9±0.1)。89Zr-A2scFv-Fc2DM导致显著更高的肿瘤：血液比率(32.8±2.2)。较短的半衰期和肝胆清除和***也导致随着时间的推移保留在小鼠体内的注射活性的总体比例更小(与p.i.96小时89Zr-A2scFv-Fc2的全身％ID为49.3±2.2％相比，89Zr-A2scFv-Fc2DM的全身％ID为33.5±0.6％)。
总之，这些结果表明双突变体A2scFv-Fc2DM具有改善RIT治疗指数的潜力，允许在血液学和肾毒性降低的情况下更高活性的施用。
示例7：携带人***癌异种移植物(22Rv1 PSCA)的裸小鼠的免疫PET
将89Zr-A2scFv-Fc2和89Zr-A2scFv-Fc2DM(10μg/35-70μCi)静脉内注射到携带22Rvl-PSCA异种移植物的雄性裸小鼠(右肩)，并在p.i.5，30，和96小时采集静态10分钟PET扫描。代表性图像如图12所示。在表达PSCA的肿瘤中观察到两个抗体片段的抗原特异性摄取。注射89Zr-A2scFv-Fc2DM的小鼠肝脏中活性的蓄积证实了双突变体的快速肝脏清除。注射89Zr-A2scFv-Fc的小鼠心脏中的高保留活性反映了该示踪剂的血液保留时间更长。
示例8：携带同基因***癌异种移植物(RM9-PSCA)的人PSCA敲入小鼠(hPSCAKI)的免疫PET
人PSCA敲入小鼠模型代表了生理学上更相关的疾病模型，因为它能够在免疫活性小鼠和PSCA正常组织表达的背景下评估抗PSCA抗体。hPSCA KI小鼠在正常***，膀胱，和胃中以低水平表达PSCA，再现了在人中观察到的表达模式。在携带双侧RM9和RM9-PSCA肿瘤的hPSCA KI小鼠中进行的免疫PET研究证实了两个抗PSCA scFv-Fc抗体片段的体内特异性，示出了与抗原阴性RM9肿瘤相比，RM9-PSCA肿瘤中摄取更高(图13)。89Zr-A2scFv-Fc2和89Zr-A2scFv-Fc2DM的生物分布和清除未因PSCA正常组织表达而改变，并且在膀胱或胃中未观察到摄取增加。
示例9：89Zr-A2scFv-Fc2和89Zr-A2scFv-Fc2DM在hPSCA KI小鼠的同基因RM9-PSCA中的离体生物分布
在最后一次免疫PET扫描后，对小鼠实施安乐死，收集组织并通过γ计数进行分析(图14A)。与裸小鼠异种移植模型相似，89Zr-A2scFv-Fc2DM从血液中清除的速度显著加快(p.i.24小时为2.9±0.1vs 7.7±0.1％ID/g和p.i.96小时为0.2±0.01vs 5.6±0.9％ID/g)。89Zr-A2scFv-Fc2在PSCA阳性肿瘤中达到更高的摄取，但较长的循环时间导致较低的肿瘤：血液比率(96小时为2.1±0.5)，而89Zr-A2scFv-Fc2DM的肿瘤：血液比率p.i.96小时达到25.8±2.5。PSCA的正常组织表达不会导致更高的背景摄取，并且保留的全身活性与异种移植模型相当，89Zr-A2scFv-Fc2DM的注射剂量保留的比例较低(28.1±0.8％ID)(图14B)。
示例10：血浆半衰期
将89Zr-A2scFv-Fc2和89Zr-A2scFv-Fc2DM单剂量i.v.注射到携带双侧22Rv1(71±33mg)和22Rv1-PSCA(87±52mg)肿瘤的雄性裸小鼠体内后测定其半衰期。通过γ计数测量4天内的抗体浓度，并使用两相衰减非线性拟合进行拟合(图15A)。89Zr-A2scFv-Fc2的终末半衰期(t1/2β)为74.7小时，而双突变体89Zr-A2scFv-Fc2DM从血液中清除更快，导致终末半衰期(t1/2β)为12.2小时(n＝5)。
离体生物分布的血液值(图11)也用于计算终末半衰期并且所得值相当：89Zr-A2scFv-Fc2的t1/2β＝72.77小时，89Zr-A2scFv-Fc2DM的t1/2β＝9.6小时(图15B)。
序列表
<110> 希望之城
加利福尼亚大学董事会
<120> 工程化抗***干细胞抗原融合蛋白及其用途
<130> 054435-8203.CN00
<150> US 63/027,184
<151> 2020-05-19
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 1
Gly Ser Gly Gly Ser Ala Gln
1 5
<210> 2
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv-Fc融合蛋白
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(112)
<223> VH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (113)..(127)
<223> 接头
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (128)..(233)
<223> VL
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (234)..(240)
<223> 铰链
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (241)..(349)
<223> CH2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (350)..(456)
<223> CH3
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Asp Pro Glu Tyr Gly Asp Ser Glu Phe Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Met Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Lys Thr Gly Gly Phe Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Gln Asp
115 120 125
Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
130 135 140
Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Arg Phe Ile His
145 150 155 160
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Asp
165 170 175
Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
180 185 190
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
195 200 205
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Gly Ser Ser Pro Phe Thr Phe
210 215 220
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
225 230 235 240
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Met Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 3
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv-Fc融合蛋白
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(112)
<223> VH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (113)..(127)
<223> 接头
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (128)..(233)
<223> VL
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (234)..(240)
<223> 铰链
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (241)..(349)
<223> CH2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (350)..(456)
<223> CH3
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Asp Pro Glu Tyr Gly Asp Ser Glu Phe Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Met Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Lys Thr Gly Gly Phe Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Gln Asp
115 120 125
Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
130 135 140
Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Arg Phe Ile His
145 150 155 160
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Asp
165 170 175
Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
180 185 190
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
195 200 205
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Gly Ser Ser Pro Phe Thr Phe
210 215 220
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
225 230 235 240
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Met Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val Ala Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Gln Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 4
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(11)
<223> 信号肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (86)..(114)
<223> 前肽
<400> 4
Met Ala Gly Leu Ala Leu Gln Pro Gly Thr Ala Leu Leu Cys Tyr Ser
1 5 10 15
Cys Lys Ala Gln Val Ser Asn Glu Asp Cys Leu Gln Val Glu Asn Cys
20 25 30
Thr Gln Leu Gly Glu Gln Cys Trp Thr Ala Arg Ile Arg Ala Val Gly
35 40 45
Leu Leu Thr Val Ile Ser Lys Gly Cys Ser Leu Asn Cys Val Asp Asp
50 55 60
Ser Gln Asp Tyr Tyr Val Gly Lys Lys Asn Ile Thr Cys Cys Asp Thr
65 70 75 80
Asp Leu Cys Asn Ala Ser Gly Ala His Ala Leu Gln Pro Ala Ala Ala
85 90 95
Ile Leu Ala Leu Leu Pro Ala Leu Gly Leu Leu Leu Trp Gly Pro Gly
100 105 110
Gln Leu
<210> 5
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> 截短的残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> 二硫键桥
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> 二硫键桥
<400> 5
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser
20

Claims (30)

1.一种基因工程化抗***干细胞抗原(PSCA)scFv-Fc融合蛋白，包含形成同源二聚体的两个肽，其中，每个肽包含抗PSCA抗体的可变结构域VH和VL，和截短的铰链和可结晶片段(Fc)区域，并且其中，所述可变结构域以VH-VL的顺序排列。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述可变结构域VH和VL由富含甘氨酸的接头连接。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述接头为约10-25个氨基酸。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的融合蛋白，其中，所述接头具有((G4S)2-GGSAQ)(SEQ ID NO：1)的序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白，其中，所述Fc区域的FcRn结合区域含有两个点突变H310A和H435Q。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白，其中，所述截短的铰链和Fc区域衍生自人IgG2。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白，其中，所述scFv-Fc融合蛋白的每个肽具有与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，或至少99％相同的氨基酸序列。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的融合蛋白，其中，所述scFv-Fc融合蛋白缀合至效应子部分。
9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中，所述效应子部分包括标记部分和/或治疗部分。
10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其中，所述标记部分包含一个或多个放射性标记或荧光标记。
11.根据权利要求9所述的融合蛋白，其中，所述治疗部分包括细胞毒性剂，抗肿瘤药物，毒素，放射性剂，细胞因子，第二蛋白质，抗体，放射性核素，或酶。
12.一种药物组合物，其包含有效量的根据权利要求1-11中任一项所述的一个或多个scFv-Fc融合蛋白，或scFv-Fc融合蛋白和效应子部分缀合物。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，还包含一种或多种药学上可接受的载体，赋形剂，和/或稳定剂。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的药物组合物，还包含一种或多种额外的治疗剂。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中，所述一种或多种额外的治疗剂缀合至所述scFv-Fc融合蛋白。
16.根据权利要求14或权利要求15所述的药物组合物，其中，所述额外的治疗剂包括化疗剂，细胞毒性剂，细胞因子，生长抑制剂，和抗激素剂。
17.根据权利要求12-16中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物配制为适合于静脉内，肌内，腹膜内，脑脊髓内，皮下，关节内，滑膜内，鞘内，口服，外用，或吸入施用。
18.一种治疗或预防表达PSCA的癌症的方法，包括向受试者施用有效量的根据权利要求1-17中任一项所述一个或多个scFv-Fc融合蛋白，scFv-Fc融合蛋白和效应子部分缀合物，或药物组合物。
19.根据权利要求18所述的方法，还包括向所述受试者施用一种或多种额外的治疗剂。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述额外的治疗剂包括化疗剂，放疗，细胞毒性剂，细胞因子，生长抑制剂，和抗激素剂。
21.一种检测在受试者中表达PSCA的癌症的方法，包括：
向受试者施用根据权利要求1-11中任一项所述的一个或多个scFv-Fc融合蛋白；
测量所述受试者中scFv-Fc融合蛋白的水平；和
将所述scFv-Fc融合蛋白的水平与健康受试者的水平或与健康人群的平均水平进行比较，
其中，所述受试者中scFv-Fc融合蛋白水平升高表示癌症的存在。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述scFv-Fc融合蛋白与标记部分缀合。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述标记部分包含一种或多种放射性同位素，如32P，99mTc，111In，18F，64Cu，和89Zr，荧光染料，电子致密试剂，酶，生物素，异羟基洋地黄毒甙元，或可检测的半抗原和蛋白质。
24.一种确定治疗在受试者中表达PSCA的癌症的预后的方法，包括：
向受试者施用根据权利要求1-12中任一项所述的一个或多个scFv-Fc融合蛋白；
测量所述受试者中scFv-Fc融合蛋白的水平；和
比较所述受试者接受癌症治疗前后的scFv-Fc融合蛋白的水平，
其中，接受所述癌症治疗后的所述受试者中scFv-Fc融合蛋白水平降低表示所述癌症治疗有效。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述scFv-Fc融合蛋白与标记部分缀合。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述标记部分包含一种或多种放射性同位素，如32P，99mTc，111In，18F，64Cu，和89Zr，荧光染料，电子致密试剂，酶，生物素，异羟基洋地黄毒甙元，或可检测的半抗原和蛋白质。
27.一种对在受试者中表达PSCA的癌症成像的方法，包括：
向受试者施用根据权利要求1-12中任一项所述的一个或多个scFv-Fc融合蛋白；和
对所述受试者成像以确定肿瘤的位置和大小。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述scFv-Fc融合蛋白与标记部分缀合。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述标记部分包含一种或多种放射性同位素，如32p，99mTc，111In，18F，64Cu，和89Zr，荧光染料，电子致密试剂，酶，生物素，异羟基洋地黄毒甙元，或可检测的半抗原和蛋白质。
30.根据权利要求18-29中任一项所述的方法，其中，所述表达PSCA的癌症包括***癌，胰腺癌，和膀胱癌。
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