KR20230142738A - 항-oxMIF 방사성면역접합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암을 치료, 예방 및 진단하는 데 효과적인 방법 및 도구의 개발에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인에서 선택된 아미노산 치환으로 인해 감소된 응집 가능성 및 감소된 소수성과 같은 개선된 특성을 갖는 항-oxMIF 항체(항-oxMIF 방사성면역접합체)에 접합된 방사성 동위원소 및 항-oxMIF 방사성면역접합체를 사용하는 단계를 포함하는, 암의 치료, 예방 및 진단 방법에 관한 것이다.

Description

항-oxMIF 방사성면역접합체
본 발명은 암(cancer)을 치료, 예방 및 진단하는 데 효과적인 방법 및 도구의 개발에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 경쇄(light chain) 및 중쇄 가변 도메인(heavy chain variable domain)에서 선택된 아미노산 치환으로 인해 감소된 응집 가능성(aggregation potential) 및 감소된 소수성(hydrophobicity)과 같은 개선된 특성을 갖는 항-oxMIF 항체(항-oxMIF 방사성면역접합체(radioimmunoconjugate))에 접합된 방사성 동위원소(radioisotope) 및 항-oxMIF 방사성면역접합체를 사용하는 단계를 포함하는, 암의 치료, 예방 및 진단 방법에 관한 것이다.
방사선 면역요법(radio-immunotherapy; RIT)에 의한 암의 치료는 표적 종양 세포를 선택적으로 파괴할 목적으로 모노클로날 항체와 같은 특정 암 세포 벡터(vector)에 연결된 방사성 동위원소 '불릿(bullet)'을 환자에게 주사하는 것을 포함한다. 방사성 붕괴 동안, 광자, 전자 또는 더 무거운 입자가 방출되고 그들의 궤적(trajectory)을 따라 세포를 손상시키거나 사멸시킨다. 방사선 면역요법(RIT)은 베타 방출 방사성 핵종(beta-emitting radionuclide)을 사용하기 시작한 암 요법을 위한 비교적 새로운 양식이다. 지난 10년 동안, 조직 내 0.7mm 범위와 6.7일의 긴 물리적 반감기(physical half-life)를 갖는 중간 에너지 베타 방출기(베타 최대 0.13 MeV)인 상업적으로 이용 가능한 루테튬-177(177Lu)의 첨가로 방사성 동위원소의 RIT 의료품(armamentarium)이 더욱 풍부해졌다. 177Lu는 특히 소마토스타틴 수용체 결합 방사성 표지 펩티드의 치료 임상 시험에서 고무적인 결과를 입증했다. 방사성 란탄족 화학으로 인해, 177Lu는 주로 간 담도 경로를 통해 배설되는 잔류성 방사성 동위원소이다(Phaeton R. et al., 2016). 최근 실험은 또한 알파 방출기가 종양 세포를 파괴하는 데 효과적이라는 것을 입증하였다. 그들은 특히 혈액 매개 암 및 미세 전이성 종양(암 세포가 전형적으로 몸 전체에 존재하는 경우)의 치료에 매력적인 것으로 간주된다. 알파-면역 요법의 또 다른 사용 가능 분야는 고용량 화학 요법 또는 수술 후 잔류할 수 있는 소수의 암 세포를 치료하는 것이다. 그러나, 방사선 면역요법 적용은 주로 혈액 악성 종양과 관련이 있다. 불충분한 종양 침투가 RIT의 효능을 제한하는 주요 요인이기 때문에, 고형 종양 RIT의 치료 효능은 종종 방사성면역접합체(RIC)의 부적합한 침투에 의해 제한된다(Huang C-Y, et al., 2012).
항체는 선택된 종양의 방사선 이미징을 위한 암 벡터(cancer vector)로서 사용된다. 이는 종양에 특이적인 항체에 연결된 '진단 프로브(diagnostic probe)'로서 방사성 동위원소를 환자에게 주사하는 것을 포함한다. 주사 후, 환자는 종양의 국소화 및 질환 진행의 모니터링을 허용하는 SPECT 또는 PET와 같은 비침습적 신경영상 기술(non-invasive neuroimaging technique)을 겪는다. 89Zr은 반감기, 단백질 접합에 대한 물리화학적 특성 및 이용 가능성으로 인해 PET에 대한 최적의 핵종으로 간주된다(Warram J.M. et al., 2014; Carter L.M. et al., 2018).
RIT 또는 방사선 이미징은 암 환자에게 항체에 연결된 바람직한 특성을 갖는 방사성 핵종을 포함하는 작제물(construct)인 소위 방사성면역접합체를 투여하여 수행된다. 일반적으로, 방사성 핵종과 항체의 연결은 킬레이트제에 의해 수행된다. 체내에서, 항체는 방사성 핵종을 상응하는 항원을 발현하는 병든 조직으로 운반할 것이다. RIT 및 방사선 이미징은 종양 조직에서는 특이적 발현을 갖지만 정상 조직에서는 발현되지 않거나 최소한의 발현을 갖는 종양 특이적 표적을 필요로 한다.
사이토카인 대식세포 이동 억제 인자(cytokine Macrophage Migration Inhibitory Factor; MIF)는 일찍이 1966년에 기재되었다(David, J.R., 1966; Bloom B.R. and Bennet, B., 1966). 그러나, MIF는 구성적으로 발현되고 세포질에 저장되며 건강한 대상체(subject)의 순환계에 존재하기 때문에 다른 사이토카인 및 케모카인과는 현저하게 상이하다. 이 단백질의 유비쿼터스 특성으로 인해, MIF는 치료적 개입에 부적절한 표적으로 간주될 수 있다. 그러나, MIF는 환원된 MIF(redMIF)와 산화된 MIF(oxMIF)라고 지칭되는 두 개의 면역학적으로 뚜렷한 구조적 이소형(isoform)에서 발생한다(Thiele M. et al., 2015). RedMIF는 건강한 대상체와 질병에 걸린 대상체에서 풍부하게 발현되고 MIF의 잠복성 효소원 형태를 반영할 수 있는 MIF의 풍부하게 발현된 이소형인 것으로 밝혀졌다(Schinagl. A. et al., 2018). 대조적으로, oxMIF는 종양 조직, 특히 결장직장암(colorectal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 난소암(ovarian cancer) 및 폐암(lung cancer) 환자의 종양 조직에서 검출되어 oxMIF의 높은 종양 특이성을 나타낼 수 있는 질환 관련 이소형인 것으로 보인다(Schinagl. A. et al., 2016). oxMIF가 종양 특이적 표적으로서의 요건을 충족하는 것처럼 보이지만, 몇 가지 사실로 인해 oxMIF가 명백한 표적이 되지는 않는다. OxMIF는 정확하게 특성화되지 않았고, oxMIF의 질환 관련 생성의 분자 메커니즘은 여전히 불분명하며, oxMIF는 세포 표면 수용체로 간주되지 않는다.
oxMIF를 표적으로 하는 항체는 암의 시험관내 및 생체내 모델에서 효능을 나타냈다(Hussain F. et al., 2013; Schinagl. A. et al., 2016). oxMIF 특이적 항체(이말루맙)는 1상 임상 시험에서 허용되는 안전성 프로파일, 만족스러운 조직 침투 및 항종양 활성에 대한 적응증을 입증했다. 그러나, mCRC 환자에서 이말루맙과 5-플루오로우라실/류코보린 또는 파니투무맙 대 표준 치료를 조사하는 IIa상 병용 연구는 데이터 안전성 모니터링 위원회의 전반적인 이익-위험 평가에 기초하여 조기에 종료되었다(Mahalingam D. et al., 2015; Mahalingam D. et al., 2020).
문헌[Thiele M. et al., (2015)]은 뮤린(murine) 췌장 종양 모델에서 방사성 표지된 항-oxMIF 항체의 축적을 보고한다.
WO2019/234241A1은 방사성 동위원소로 표지될 수 있는 항-oxMIF/항-CD3 이중특이적 항체를 개시한다.
WO2009/086920A1은 항-oxMIF 항체 Bax69(이말루맙)를 기재한다.
단백질 응집, 특히 항체 응집은 단백질 발현, 정제 및 저장을 포함한 바이오 프로세싱(bioprocessing)의 여러 단계에서 자주 관찰된다. 항체 응집은 치료 단백질 제조 공정의 전반적인 수율에 영향을 미칠 수 있으며, 치료 항체의 안정성 및 면역원성에 기여할 수 있다. 따라서, 항체의 단백질 응집은 개발 가능성(developability)에서 계속 중요한 문제가 되고 있으며 항체 생산에서 주요 초점 영역으로 남아 있다. 항체 응집은 소수성 패치 및 이의 도메인의 부분적 전개에 의해 유발될 수 있으며, 단량체-단량체 결합에 이어 핵 형성 및 응집체 성장으로 이어질 수 있다. 항체 및 항체 기반 단백질의 응집 성향은 외부 실험 조건에 의해 영향을 받을 수 있지만, 그들은 서열과 구조에 의해 결정되는 고유 항체 특성에 크게 의존한다.
항원 결합 도메인을 포함하는 항체 및 단백질의 응집 내성 또는 응집 성향은 일반적으로 그 안에 함유된 가장 응집하기 쉬운 도메인(들)과 주변 도메인(존재하는 경우)과의 상호작용의 강도에 의해 제한된다. 항체의 불변 도메인(constant domain)은 일반적으로 응집하지 않으며 크게 변하지 않는다. 따라서, 응집 가능성 및 안정성과 관련하여 항체의 가장 약한 도메인은 일반적으로 가변 도메인으로 간주된다(예: 중쇄 가변 도메인(VH) 및/또는 경쇄 가변 도메인(VL), Ewert S. et al., 2003). 이와 관련하여, 응집하기 쉬운 VH 또는 VL 도메인의 그렇지 않으면 안정한 재조합 항체 생성물로의 혼입은 종종 이러한 일반적으로 바람직하지 않은 특성을 새로운 재조합 설계에 부여한다. 따라서, 가변 도메인을 응집 내성이도록 조작하는 것은 그 가변 도메인을 포함하는 전체 단백질이 응집 내성이도록 할 가능성이 높다. 가변 도메인의 응집을 감소시키기 위한 다양한 전략, 예를 들어, 응집 내성 단백질의 합리적 설계, 상보성 결정 영역(CDR) 그래프팅, 가변 도메인에 이황화 결합의 도입 또는 표면 노출된 소수성 패치의 제거가 제안되어 왔다. 그러나, 이들 방법은 종종 친화성(affinity) 또는 특이성(specificity)과 같은 결합 특성을 변경하고, 전문 지식을 필요로 하기 때문에 일반적으로 적용할 수 없고, 종종 힘들고, 면역원성 에피토프를 도입할 수 있기 때문에 단점을 나타낸다.
소수성과 같은 단백질의 추가의 고유 특성도 항체 용해도에 중요한 역할을 한다. 표면 소수성으로 인해 이러한 치료 단백질의 낮은 용해도는 제형 개발을 더 어렵게 할 수 있고, 생체내에서 불량한 생체 분포(bio-distribution), 바람직하지 않은 약동학 거동(pharmacokinetics behavior) 및 면역원성(immunogenicity)을 초래할 수 있다. 따라서, 후보 모노클로날 항체의 전반적인 표면 소수성을 감소시키면 정제 및 투약 섭생과 관련된 이점과 비용 절감을 제공할 수 있다.
RIT 및 방사선 이미징에 대한 노력이 증가하고 임상 시험에 사용되는 모노클로날 항체의 수가 증가하고 있지만, 암 치료 및 진단에서 효율적인 치료 효과를 제공하는, 특히 종양 관련 항원에 대한 매우 선택적인 결합을 갖는 항체를 포함하는 향상된 방사선 면역요법 및 이미징에 대한 지속적인 요구가 있다.
본 발명의 목적은 매우 선택적인 종양 결합 특성을 갖는 방사성면역접합체를 제공하는 것이다.
상기 목적은 본 발명의 주제에 의해 해결된다. oxMIF는 종양 특이적 표적으로서의 요건을 충족하는 것으로 보이지만, 몇 가지 사실로 인해 oxMIF가 방사선 면역요법의 명백한 표적이 되지 않는다. OxMIF는 정확하게 특성화되지 않았고, oxMIF의 질환 관련 생성의 분자 메커니즘은 여전히 불분명하며, oxMIF는 세포 표면 수용체로 간주되지 않는다.
그럼에도 불구하고, 놀랍게도 방사성 표지된 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편(항-oxMIF 방사성면역접합체)은 oxMIF 특이성으로 인해 매우 선택적이고 방사선 면역요법에 사용될 때 방사성 동위원소의 존재로 인해 매우 세포 독성이다는 것이 나타났다.
방사성면역접합체는 또한 방사선 이미징에 사용될 때 oxMIF 특이성과 적절한 방사성 핵종으로 인해 종양 조직에서 쉽게 검출될 수 있다.
방사성면역접합체는 또한 oxMIF 특이성으로 인해 매우 선택적이며, 치료적 접근법에 사용될 때 방사성 핵종으로 인한 진단 및 요법을 가능하게 한다. 방사성 핵종 및 항-oxMIF 항체의 조합은 놀랍게도 방사성 표지된 항-oxMIF 항체가 이미 마우스 모델에서 입증된 관련 생체 분포, 종양 흡수 및 효능을 갖는다는 것을 보여주었다. 따라서, 본 발명의 방사성면역접합체는 암 요법에 매우 효율적이며 종양 검출 및 진단에도 매우 유용하다.
본 발명은 재조합 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 방사성면역접합체(RIC)를 개시한다.
본 발명은 구체적으로 재조합 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 방사성면역접합체(RIC)로서,
(a1) 아미노산 치환 M30L, F49Y, A51G, P80S, W93F 중 적어도 하나를 갖는 서열번호 32를 포함하는 경쇄 가변 도메인, 또는
(a2) - 위치 36에 보존된 티로신, 및
- 아미노산 치환 M30L, F49Y, A51G, P80S, W93F 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 32를 포함하는 경쇄 가변 도메인; 및
(b1) 서열번호 29를 포함하는 중쇄 가변 도메인; 또는
(b2) 서열번호 29 및 아미노산 치환 L5Q 및/또는 W97Y를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 또는
(b3) 아미노산 치환 L5Q 또는 W97Y 중 적어도 하나, 및 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가 아미노산 치환을 갖는 서열번호 29를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고,
아미노산 위치가 카바트(Kabat)에 따라 넘버링(numbering)되고,
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이, 아미노산 치환이 결여된 서열번호 32 및 서열번호 29를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 비교하여 감소된 응집 가능성 및 감소된 소수성을 갖는, 방사성면역접합체를 제공한다.
항-oxMIF 항체의 관련 생식세포 VL 서열은 프레임워크 1의 위치 D1, M4, S10 및 L11에서 높은 변동성(variability)을 가질 수 있다.
따라서, 특정 구현예에 따르면, 항-oxMIF 항체는 위치 D1, M4, S10 및 L11에서의 추가 치환 이외에 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 32를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
관련 생식세포 VH 서열은 다음 위치에서 높은 변동성을 가질 수 있다: E1, S74 및 T77.
따라서, 추가의 특정 구현예에 따르면, 항-oxMIF 항체는 위치 E1, S74 및 T77에서의 추가 치환 이외에 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 29를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 대안적인 구현예에서,
(a) 서열번호 32와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 위치 36에 티로신을 포함하며, 아미노산 치환 M30L, F49Y, A51G, P80S, W93F 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 항-oxMIF 항체 경쇄 가변 도메인, 및
(b) 서열번호 29 및 아미노산 치환 W97Y를 포함하는 중쇄 가변 도메인 또는 서열번호 29와 적어도 95% 서열 동일성을 포함하며 아미노산 치환 W97Y를 추가로 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 재조합 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 방사성면역접합체(RIC)가 본원에 제공된다.
또 다른 추가 구현예에 따르면, 방사성면역접합체는 아미노산 치환 W93F를 갖는 경쇄 가변 도메인 및 아미노산 치환 W97Y를 포함하는 중쇄 가변 영역을 함유한다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 직접 표지되거나 비환식, 모노사이클릭, 매크로사이클릭 이작용성 킬레이트제, 특히 킬레이팅 그룹(chelating group) 및 작용성/반응성 링커를 포함하는 p-SCN-bn-DOTA, p-NH2-Bn-DOTA, DOTA-NHS 및 p-SCN-Bn-데페록사민으로부터 선택된 킬레이트제를 사용하여 표지된다.
특정 구현예에 따르면, 방사성면역접합체는 킬레이팅 그룹, 구체적으로 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 킬레이트제에 결합시킴으로써 생성되는 킬레이팅 그룹, 특히 DOTA, 헥사덴테이트 킬레이터, 예를 들어, 데페록사민 B(CAS 번호 70-51-9), 및 옥타덴테이트 킬레이터, 예를 들어, DFO 유도체 DFO* 또는 이들의 산소 함유 유사체, 예를 들어, oxoDFO*로부터 선택된 킬레이팅 그룹을 포함한다.
구체적으로, DFO는 다음과 같은 구조일 수 있다:
구체적으로, DFO*는 다음과 같은 구조일 수 있다:
본 발명에 따르면, 치료적 적용에 유용한 임의의 알파- 또는 베타 방출 방사성 동위원소는 항-oxMIF 항체에 연결될 수 있으며, 구체적으로 그것은 11C, 13N, 15O, 18F, 32P, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 89Zr, 90Y, 99mTc, 103Pd, 105Rh, 109Pd, 111Ag, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 140La, 149Tb, 149Pm, 153Sm, 159Gd, 165Dy, 166Dy, 166Ho, 169Yb, 175Yb, 177Lu, 227Th, 186Re, 188Re, 192Ir, 193mPt, 195mPt, 198Au, 199Au, 211At, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 225Ac, 223Ra, 227Th일 수 있고, 구체적으로 방사성 동위원소는 67Ga, 89Zr, 111In, 124I, 131I, 177Lu, 225Ac이다.
특정 구현예에서, 위치 L234, L235, G236, G237, N297, L328 또는 P329 중 어느 하나에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 서열번호 37을 갖는 야생형 인간 IgG1 불변 도메인의 Fc 변이체 도메인을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 방사성면역접합체가 제공되며, 상기 방사성면역접합체는 야생형 IgG1 Fc 영역을 포함하는 방사성면역접합체와 비교하여 Fcγ-수용체에 대한 감소된 결합을 나타낸다.
추가의 특정 구현예에서, 방사성면역접합체는 위치 I253, H310, H435 중 어느 하나에 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하는, 서열번호 37의 야생형 인간 IgG1 불변 도메인의 Fc 변형 도메인을 포함하며, 상기 방사성면역접합체는 야생형 IgG1 Fc 영역을 포함하는 방사성면역접합체와 비교하여 인간 FcRn에 대해 감소된 친화성을 나타낸다.
구체적으로, 방사성면역접합체는 서열번호 38를 포함하고, 야생형 IgG1 Fc 영역을 포함하는 방사성면역접합체와 비교하여 인간 FcRn에 대해 감소된 친화성을 나타낸다.
특정 구현예에서, 방사성면역접합체는 서열번호 31, 33, 34, 35 및 36으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 특정 구현예에서, 방사성면역접합체는 서열번호 37, 38, 39 및 40 중 어느 하나와 함께 서열번호 29 및 34, 서열번호 30 및 33, 서열번호 30 및 34, 서열번호 31 및 34, 서열번호 31 및 36, 또는 서열번호 31 및 33을 포함한다.
보다 구체적으로, 본원에 기재된 방사성면역접합체는 IgG, IgG 융합 단백질, Fv, scFv, scFv 융합 단백질, 디아바디(diabody), 디아바디 융합 단백질, Fab, Fab 융합 단백질, scFab, scFab 융합 단백질, Fab' 및 F(ab')2, Fab'-SH, Fcab, Fcab 융합 단백질, 2개 이상의 단일 쇄 항체의 융합 단백질, 미니바디(minibody) 및 소형 면역 단백질(small immune protein; SIP) 포맷일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
구현예에 따르면, 본원에 기재된 방사성면역접합체는 의약(medicament)의 제조에 사용하기 위한 것이다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 방사성면역접합체를, 임의로 약제학적 담체 (carrier)또는 보조제(adjuvant)와 함께, 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다.
구체적으로, 약제학적 조성물은 정맥내 투여용으로 제형화된다.
추가의 구현예에 따르면, 약제학적 조성물은 암을 앓고 있는 대상체의 치료, 구체적으로 종양(tumor), 구체적으로 혈액학적 또는 고형 종양(solid tumor)의 치료, 보다 구체적으로 결장직장암, 난소암, 유방암(breast cancer), 뇌 종양(brain tumors), 전립선암(prostate cancer), 췌장암 및 폐암의 치료에 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 한 양태는 본원에 나열된 질환 또는 증상 중 어느 하나의 치료 방법에서 본 발명의 약제학적 조성물의 유효량의 사용에 관한 것이다.
본 발명의 한 구현예는 다른 요법과 함께 또는 이에 추가적으로 본 발명의 방사성면역접합체의 사용에 관한 것이다.
본 발명의 한 구현예에서, 다른 요법은 화학 요법, 모노클로날 항체 요법, 수술, 방사선 요법 및/또는 광역학적 요법으로부터 선택된다.
한 구현예에 따르면, 본원에 기재된 방사성면역접합체는 대상체의 암 세포에서 oxMIF 수준의 검출 또는 결정을 위한 것이며, 구체적으로 검출은 대상체의 샘플에서 생체외로 수행된다. 그런 다음, 잠재적 환자 그룹은 oxMIF 수준에 따라 계층화(stratification)에 의해 하위 그룹(계층(strata), 블록)으로 나뉠 수 있으며, 여기서 각 계층은 환자 집단의 특정 섹션을 나타낸다.
구체적으로, 방사성면역접합체는 대상체에서 암 진단용으로 사용된다.
하나의 구현예에서, 암을 시험관내에서 진단하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 여기서 방사성면역접합체는 대상체의 샘플에서 종양 세포를 시험관내 검출하거나 대상체의 종양 세포 또는 종양을 생체내 검출하기 위해 사용된다. 상기 샘플은, 예를 들어, 혈액 샘플, 조직 샘플, 예를 들어, 생검으로부터 유래될 수 있다.
암을 진단하기 위한 방법이 추가로 본원에 제공되며, 여기서 방사성면역접합체는 대상체에서 또는 시험관내에서, 대상체의 샘플에서 종양 세포를 검출하기 위해 사용된다.
추가의 구현예는 본원에 기재된 방사성면역접합체를 포함하는 진단 키트(diagnostic kit)에 관한 것이다.
대안적인 구현예에서, 2개 이상의 바이알(vial)을 포함하는, 방사성면역접합체 생산용 키트가 제공되며, 여기서 하나의 바이알은 항-ox-MIF 항체에 연결된 킬레이터를 포함하는 접합체를 함유하고, 두 번째 바이알은 구체적으로 67Ga, 89Zr, 111In, 124I, 131I, 177Lu, 225Ac로부터 선택된 방사성 동위원소를 함유한다. 구체적으로, 하나 또는 여러 바이알의 내용물은 동결 건조되거나 용액 상태이다. 보다 구체적으로, 키트는 본원에 기재된 방사성면역접합체를 생산하기 위한 지침을 함유하는 매뉴얼을 추가로 포함한다.
본원에 기재된 방사성면역접합체 또는 상기 방사성면역접합체를 포함하는 약제학적 조성물을 사용하여 암을 치료하기 위한 방법이 추가로 본원에 제공된다.
본원에 기재된 방사성면역접합체의 재조합 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩(encoding)하는 단리된 핵산(isolated nucleic acid)이 추가로 제공된다.
추가의 구현예에서, 방사성면역접합체의 재조합 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자(들)를 포함하는 발현 벡터(expression vector).
추가의 구현예에서, 본원에 기재된 oxMIF 항체의 핵산 또는 본원에 기재된 핵산 분자(들)를 포함하는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포가 제공된다.
또 다른 추가의 구현예에서, 숙주 세포에서 oxMIF 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산을 발현시키는 단계 및 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 방사성 동위원소로 추가로 표지화하는 단계를 포함하는, 방사성면역접합체를 생산하기 위한 방법이 제공된다.
도 1: DOTA-C0008의 순도 및 완전성 분석; A: DOTA-C0008 SE-HPLC 프로파일 (λ=280nm). B: 쿠마시(Coomassie) 염색된 SDS PAGE: 1: 분자량 표준; 2: 환원되지 않은 C0008; 3: 환원된 C0008; 4: 환원되지 않은 농축 C0008(표지화 배치); 5: 환원된 농축 C0008(표지화 배치); 6: 환원되지 않은 DOTA-C0008; 7: 환원된 DOTA-C0008.
도 2: ITLC로 결정된 C0008에 그래프팅된 DOTA 분자 수의 결정: DOTA 접합 항체에 대한 2(레인 6), 4(레인 7), 6(레인 8) 또는 8(레인 9)배 과량의 111/ 115In에서 추적량의 방사성 인듐(111In)과 안정한 인듐(115In)의 혼합물과 함께 배양된 DOTA-C0008의 ITLC 분리.
도 3: ITLC 및 자가 방사선 촬영(autoradiography)에 의한 방사성 표지된 C0008의 분석: A: 방사성 표지된 C0008의 ITLC(레인 3: DOTA-C0008을 사용한 177Lu 표지화 반응; 레인 4: C0008을 사용한 177Lu 표지화 반응); B: ITLC 필름 레인 3의 자가 방사선 사진(autoradiogram)(DTPA 첨가 후 77Lu-DOTA-C0008; 피크 1은 유리 177Lu-DTPA를 반영하고, 피크 2는 177Lu-DOTA-C0008을 반영한다).
도 4: 177Lu-DOTA-C0008의 혈장 안정성(자가 방사선 촬영): 마우스 혈장에서 7일 동안 배양된 177Lu-DOTA-C0008의 자가 방사선 사진; 1: 177Lu-DOTA-C0008 유도체 및 유리 177Lu; 2: 177Lu-C0008.
도 5: 177Lu-DOTA-C0008의 혈장 안정성(SDS-PAGE): 마우스 혈장에서 177Lu-DOTA-C0008을 사용한 감소된 SDS PAGE(왼쪽: 쿠마시 염색, 오른쪽: 자가 방사선 촬영). 레인 1 및 레인 10: 분자량 표준; 레인 2: DOTA-C0008; 레인 3: 완충액(T0) 중 177Lu-DOTA-C0008; 레인 5: 177Lu-DOTA-C0008(혈장 내 T0 시간); 레인 6: 177Lu-DOTA-C0008(혈장 내 1일); 레인 7: 177Lu-DOTA-C0008(혈장 내 2일); 레인 8: 177Lu-DOTA-C0008(혈장 내 3일); 레인 9: 177Lu-DOTA-C0008(혈장 내 7일).
도 6: 피하 CT26 종양을 보유한 암컷 Balb/c에서 IRDye 800CW 표지된 C0008의 생체 분포: 피하 CT26 종양을 보유한 마우스의 적외선 생체내 이미징. 마우스의 적외선 이미지는 A: IRDye 800CW 표지된 C0008(5mg/kg)의 주사 후 1시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 168시간에 또는 B: 치료 없이 촬영되었고(눈금 막대는 A 및 B에 적용됨); C: 디지털 이미지 분석(digital image analysis)에 의해 정량화된 IRDye 800CW 표지된 C0008의 종양 침투 및 유지.
도 7: 새로 설계된 항-oxMIF 항체의 감소된 응집 및 소수성을 입증하는 크로마토그래피 프로파일. (A) 5xPBST를 이동상으로 사용하는 슈퍼덱스(Superdex) 200 증가 10/300 GL 겔 여과 컬럼에서 C0008(대조군 항체, 회색 영역)과 새로 설계된 항체의 용출 프로파일의 비교. (B) 1xPBS를 이동상으로 사용하는 엔리치(Enrich) 650 겔 여과 컬럼에서 C0008(대조군 항체, 회색 영역)과 새로 설계된 항체의 용출 프로파일의 비교. (C) HiTrap 부틸 HP HIC 컬럼에서 C0008(대조군 항체, 회색 영역)과 새로 설계된 항체의 용출 프로파일의 비교.
도 8: 새로 설계된 항-oxMIF 항체의 고정된 MIF에 대한 결합 곡선(KD 결정). C0008이 참조 항체로서 사용되었다.
도 9: 새로 설계된 항체의 oxMIF 대 redMIF에 대한 차등 결합. C0008은 참조 항체로서 사용되었다.
도 10: 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0083 대 대조군 항체 C0008의 개선된 생산.
도 11: 피하 CT26 종양을 보유한 마우스의 적외선 생체내 이미징에 의한 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0083 대 C0008의 종양 침투. A: 마우스의 적외선 이미지는 5mg/kg으로 투여된 IRDye 800CW 표지 C0083의 주사 후 1시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 168시간에 촬영되었고; B: 디지털 이미지 분석으로 정량화된 IRDye 800CW 표지 C0083의 종양 침투 및 유지. C: 디지털 이미지 분석으로 정량화된 IRDye 800CW 표지 C0083 대 C0008의 종양 침투 및 유지의 비교.
도 12: DOTA-C0083의 순도 및 완전성 분석; A: DOTA-C0083 SE-HPLC 프로파일 (λ=280nm). B: 쿠마시 염색된 SDS PAGE: 1: 분자량 표준; 2: 환원되지 않은 C0083; 3: 환원된 C0083; 5: 환원되지 않은 DOTA-C0083; 6: 환원된 DOTA-C0083.
도 13: ITLC에 의해 결정된 C0083에 그래프팅된 DOTA 분자 수의 결정: DOTA 접합 항체의 양에 비례하여 2(레인 1), 4(레인 2), 6(레인 3) 또는 8(레인 4)배 과량의 177/ 175Lu에서 0.04N HCl 중 추적량의 방사성 177Lu와 안정한 루테튬(175Lu)의 혼합물과 함께 배양된 DOTA-C0083의 ITLC 분리.
도 14: ITLC 및 자가 방사선 촬영에 의한 방사성 표지된 177Lu-DOTA-C0083의 분석: ITLC 필름의 자가 방사선 사진(DTPA 첨가 후 177Lu-DOTA-C0083; 피크 1/2는 유리 177Lu-DTPA 및 177Lu-DOTA-C0083 유도체를 반영하고, 피크 3은 177Lu-DOTA-C0083을 반영한다).
도 15: 177Lu-DOTA-C0083의 혈장 안정성(자가 방사선 촬영): 마우스 혈장에서 7일 동안 배양된 177Lu-DOTA-C0083의 자가 방사선 사진; 1: 177Lu-DOTA-C0083 유도체 및 유리 177Lu; 2: 177Lu-DOTA-C0083.
도 16: 177Lu-DOTA-C0083의 혈장 안정성(SDS-PAGE): 마우스 혈장에서 177Lu-DOTA-C0083을 사용한 감소된 SDS PAGE(왼쪽: 쿠마시 염색, 오른쪽: 자가 방사선 촬영). 레인 1: 분자량 표준; 레인 2: 완충액(T0) 중 177Lu-DOTA-C0083; 레인 3: 177Lu-DOTA-C0083(혈장 내 T0 시간); 레인 4: 177Lu-DOTA-C0083(혈장 내 1일), 레인 5: 177Lu-DOTA-C0083(혈장 내 3일), 레인 6: 177Lu-DOTA-C0083(혈장 내 7일).
도 17: 아미노산 서열
도 18: 새로 설계된 Fc 침묵 항-oxMIF 항체의 감소된 응집 및 소수성을 입증하는 크로마토그래피 프로파일. (A) 1xPBS를 이동상으로 사용하는 Enrich 650 겔 여과 컬럼에서 C0008(대조군 항체, 회색 영역)과 새로 설계된 Fc 침묵 항체 C0115 및 C0118의 용출 프로파일의 비교 (B) HiTrap 부틸 HP HIC 컬럼에서 C0008(대조군 항체, 회색 영역)과 새로 설계된 항체 Fc 침묵 C0115 및 C0118 및 그들의 모 항체 C0083 및 C0090(Fc 침묵 없음)의 용출 프로파일의 비교.
도 19: 고정된 oxMIF에 대한 새로 설계된 Fc 침묵 항-oxMIF 항체의 결합 곡선(KD 결정). 항-oxMIF 항체는 항-인간-IgG (Fc)-HRP 접합체에 의해 검출되었고, C0008이 참조 항체로서 사용되었다.
도 20: 새로 설계된 Fc 침묵 항체의 oxMIF 대 redMIF에 대한 차등 결합. C0008은 참조 항체로서, 동형(Isotype) IgG는 음성 대조군으로 사용되었다.
도 21: FACS에 의해 결정된 A2780 MIF-/- 세포에 대한 새로 설계된 Fc 침묵 항-oxMIF 항체의 감소된 비특이적 결합. 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0118과 이의 모 항체 C0090(A) 및 C0115 및 이의 모 항체 C0083(B) 및 대조군 항체 C0008뿐만 아니라 음성 대조군으로서 동형 IgG를 사용한 A2780 MIF-/- 세포의 염색; 생존 세포의 GeoMean(AF488의 평균 형광 강도)은 항체 농도에 대해 플롯팅된다.
도 22: 리포터 검정에 의해 결정된 새로 설계된 Fc 침묵 항체 C0115 및 C0118의 강력하게 감소된 ADCC 이펙터 기능(effector function). wt Fc를 갖는 그들의 모 항체 C0083 및 C0090과 비교하여 FcyRIIIA 및 HCT116-pMIF 표적 세포를 안정적으로 발현하는 조작된 주르캇 이펙터 세포(Jurkat effector cell)를 사용하여 새로 설계된 Fc 침묵 항체 C0115 및/또는 C0118을 사용한 ADCC 리포터 생물검정. 평균 및 SEM이 제시된다(n=2).
도 23: 피하 HCT116 종양을 보유한 마우스의 적외선 생체내 이미징에 의한 새로 설계된 Fc 침묵 항-oxMIF 항체 C0115 및 참조 항체 C0008의 종양 침투 및 유지. (A) 마우스의 적외선 이미지는 5mg/kg으로 투여된 IRDye 800CW 표지 항체 C0115(상단 패널) 및 C0008(하단 패널)의 주사 후 1시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 168시간에 촬영되었고; (B) 디지털 이미지 분석에 의해 정량화된 C0115 및 C0008의 종양 침투 및 유지.
도 24: 피하 CT26 또는 HCT116 종양을 보유한 마우스의 생체내 PET/CT 이미징에 의한 DFO*에 접합되고 89Zr로 방사성 표지된 새로 설계된 Fc 침묵 항-oxMIF 항체 C0115 및 C0118의 종양 침투 및 유지. 마우스의 PET 및 CT 이미지는 마우스당 약 10MBq로 투여된 89Zr-DFO* 표지 항체의 주사 후 4일, 7일 및 10일에 촬영되었고; 마우스의 대표적인 디지털 수직 단면이 제시되며, 백색 화살표는 종양을 표시한다.
달리 명시되거나 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 용어는 당업계에서의 통상적인 의미를 갖고, 이는 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 표준 핸드북, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (4th Ed.), Vols. 1 -3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012); Krebs et al., "Lewin´s Genes XI", Jones & Bartlett Learning, (2017), and Murphy & Weaver, "Janeway´s Immunobiology" (9th Ed., or more recent editions), Taylor & Francis Inc, 2017]을 참조한다.
청구범위의 주제는 구체적으로 인공 제품 또는 이러한 인공 제품을 사용하거나 생산하는 방법을 지칭하며, 이는 네이티브(야생형) 제품의 변이체일 수 있다. 네이티브 구조와 특정 정도의 서열 동일성이 있을 수 있지만, 예를 들어, 단리된 핵산 서열, 아미노산 서열, 융합 작제물, 발현 작제물, 형질전환된 숙주 세포 및 변형된 단백질을 참조하여 본 발명의 재료, 방법 및 용도는 "인공(man-made)" 또는 합성이며, 따라서 "자연의 법칙(laws of nature)"의 결과로서 간주되지 않는다는 것이 잘 이해될 것이다.
본원에서 사용된 용어 "포함하다(comprise)", "함유하다(contain)", "가지다(have)" 및 "포함하다(include)"는 동의어로 사용될 수 있으며, 추가 구성원 또는 부분 또는 요소를 허용하는 개방형 정의로 이해되어야 한다. "구성하는(consisting)"은 구성하는 정의 특성의 추가 요소가 없는 가장 가까운 정의로 간주된다. 따라서, "포함하는(comprising)"은 더 광범위하며, "구성하는" 정의를 함유한다.
본원에서 사용된 용어 "약"은 동일한 값 또는 제주어진 값의 +/-5%만큼 상이한 값을 지칭한다.
본원 및 청구범위에 사용된 단수 형태, 예를 들어, "a", "an" 및 "the"는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 아미노산은 61개의 삼중 코돈에 의해 인코딩된 20개의 천연 아미노산을 지칭한다. 이러한 20개의 아미노산은 중성 전하, 양전하, 음전하를 갖는 것들로 나눌 수 있다:
"중성(neutral)" 아미노산은 각각의 세 문자 및 한 문자 코드와 극성과 함께 아래에 제시되어 있다: 알라닌(Ala, A; 비극성, 중성), 아스파라긴(Asn, N; 극성, 중성), 시스테인(Cys, C; 비극성, 중성), 글루타민(Gln, Q; 극성, 중성), 글리신(Gly, G; 비극성, 중성), 이소류신(Ile, I; 비극성, 중성), 류신(Leu, L; 비극성, 중성), 메티오닌(Met, M; 비극성, 중성), 페닐알라닌(Phe, F; 비극성, 중성), 프롤린(Pro, P; 비극성, 중성), 세린(Ser, S; 극성, 중성), 트레오닌(Thr, T; 극성, 중성), 트립토판(Trp, W; 비극성, 중성), 티로신(Tyr, Y; 극성, 중성), 발린(Val, V; 비극성, 중성), 및 히스티딘(His, H; 극성, 양성(10%), 중성(90%)).
"양성으로(positively)" 하전된 아미노산은 다음과 같다: 아르기닌(Arg, R; 극성, 양성) 및 리신(Lys, K; 극성, 양성).
"음성으로(negatively)" 하전된 아미노산은 다음과 같다: 아스파르트산(Asp, D; 극성, 음극) 및 글루탐산(Glu, E; 극성, 음성).
용어 "면역접합체"는 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 제2 모이어티(moiety)의 접합체를 지칭하며, 용어 "방사성면역접합체 "는 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 방사성 동위원소(방사성 핵종)의 접합체를 지칭한다.
방사성 동위원소는 11C, 13N, 15O, 18F, 32P, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 89Zr, 90Y, 99mTc, 103Pd, 105Rh, 109Pd, 111Ag, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 140La, 149Tb, 149Pm, 153Sm, 159Gd, 165Dy, 166Dy, 166Ho, 169Yb, 175Yb, 177Lu, 227Th, 186Re, 188Re, 192Ir, 193mPt, 195mPt, 198Au, 199Au, 211At, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 225Ac, 223Ra, 227Th를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 베타, 알파 또는 양전자 방출 방사성 핵종일 수 있으며, 구체적으로 방사성 동위원소는 67Ga, 89Zr, 111In, 124I, 131I, 177Lu, 225Ac이다.
유용한 알파 방출 방사성 핵종은 149Tb, 211At, 212Bi, 213Bi 및 225Ac일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로 유용한 베타 전달 물질은 177Lu이다.
양전자 방출 또는 베타 플러스 붕괴(β+ 붕괴)는 베타 붕괴라고 하는 방사성 붕괴의 하위 유형이며, 여기서 방사성 핵종 핵 내부의 양성자는 중성자로 변환되는 반면, 양전자 및 전자 중성미자(electron neutrino)(ve)를 방출한다. 양전자 방출 방사성 핵종은 양전자 방출 단층 촬영(positron emission tomography; PET)에 사용된다.
구체적으로 유용한 양전자 방출기는 11C, 13N, 15O, 18F, 또는 89Zr이며, 구체적으로는 89Zr이다.
충분한 복합체화 능력과 단백질 또는 펩티드에 대한 직접적 또는 간접적 접합을 가능하게 하는 작용성 그룹을 갖는 임의 유형의 링커가 사용될 수 있다. 방사성 동위원소를 항체에 부착하기 위한 이러한 링커의 예는 문헌(예: Brechbiel M.W., 2008; Liu S., 2008, Zeglis & Lewis 2011)에 기재되어 있다. 본 발명의 방사성 핵종은 바람직하게는 직접 또는 이작용성 킬레이트제를 사용하여 항-oxMIF 항체에 접합된다. 이들은 사이클릭, 선형 또는 분지형 킬레이트제일 수 있다. 특히, 백본 질소에 산성(예: 카르복시알킬) 그룹이 부착된 선형, 사이클릭 또는 분지형 폴리아자알칸 백본을 포함하는 폴리아미노폴리산 킬레이터가 참조될 수 있다.
일부 유용한 비제한적 예는 사이클릭 킬레이터 또는 이의 이작용성 킬레이트제, 예를 들어, 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA) 및 1,4,7,10-테트라-아자사이클로도데칸-N,N',N",N"-테트라 아세트산, ca-DTPA, ibca-DTPA, 1B4M-DTPA, lys-DTPA, 비닐 DTPA, glu-DTPA, p-SCN-bn-DOTA, DOTA-NHS-에스테르, 데페록사민 B 또는 이들의 유도체; 또는 선형 킬레이터 또는 이의 이작용성 킬레이트제, 예를 들어, p-SCN-Bn-DTPA, HOPO 및 CHX-A"-DTPA, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), DTPA, EDTMP, NOTA, TETA, DOTMP, N2S2, N3S, HEDP이다. 추가의 적합한 킬레이트제의 예는 DOTA 유도체, 예를 들어, p-이소티오시아네이토벤질-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(p-SCN-Bz-DOTA) 및 DTPA 유도체, 예를 들어, p-이소티오시아네이토벤질-디에틸렌트리아민펜타아세트산(p-SCN-Bz-DTPA)을 포함하고, 첫 번째는 사이클릭 킬레이터이고, 후자는 선형 킬레이터이다.
데페록사민(데스페리옥사민, DFO) 및 이의 유도체의 추가 예는 p-NCS-Bz-DFO, DFOSq, DFO*, oxoDFO*, DFO*Sq, DFO*-NCS, DFO*pPhe-NCS를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
미접합 킬레이터를 제거하기 위해 정제가 이어질 수 있으며, 킬레이터 항체 접합체와 방사성 핵종의 반응 후, 정제를 수행하여 임의의 미접합 방사성 핵종을 제거할 수 있다. 대안적으로, 킬레이터와 방사성 핵종이 먼저 결합된 후 항체에 접합될 수 있다.
방사성 표지화 절차는 방사성 표지화가 일어나기 전에 킬레이터가 항체에 접합되는 경우 더 편리할 수 있다. 항체에 부착된 킬레이터를 사용하여 방사성 표지된 접합체를 제조하는 원리는, 예를 들어, 문헌(Liu S., 2008)에 보다 광범위하게 기재되어 있다.
방사성면역접합체의 항체 또는 항원 결합 단편은 oxMIF를 특이적으로 인식하는 적어도 하나의 결합 부위를 포함한다. 이러한 항체는 문헌(Kerschbaumer R. et al., 2012)에 의해 기재되었다. 항-oxMIF 항체는 MIF의 생물학적 기능과 연결된 티올 단백질 산화환원효소의 고도로 보존된 촉매 모티프(motif)(57Cys-Ala-Leu-Cys60, 서열번호 44)를 포함하여 MIF 내의 β-시트 구조에 특이적이다(Kerschbaumer R. et al., 2012). oxMIF에 특이적인 CDR은 본원에 기재되어 있다.
이말루맙(C0008) CDR은 서열번호 7 내지 12를 포함한다.
대안적으로, oxMIF를 특이적으로 인식하는 추가 항체의 CDR은 구체적으로 서열번호 1 내지 6(Bax8), 또는 서열번호 13 내지 18(Bax74), 또는 서열번호 19 내지 24(Bax94), 또는 서열번호 22, 23, 24, 26, 27 및 21(BaxA10), 또는 서열번호 7 내지 12, 서열번호 1 내지 6, 서열번호 13 내지 18, 또는 서열번호 19 내지 24 또는 서열번호 22, 23, 24, 26, 27 및 21과 적어도 80%, 90%, 95% 서열 동일성을 갖는 임의의 서열을 포함한다.
감소된 응집 성향 및/또는 소수성은 방사성면역접합체의 경우 특히 중요한데, 이는 임의의 응집체 및/또는 매우 소수성 계면이 방사성면역접합체 및 이에 따른 방사성 핵종의 비종양 조직에 대한 비특이적 부착을 유도할 수 있기 때문이다.
특정 구현예에서, 방사성면역접합체의 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 아미노산 치환이 결여된 변형되지 않은 항체와 비교하여 가변 중쇄 및 경쇄 도메인에서 표적 아미노산 치환으로 인해 감소된 응집 성향 및 감소된 소수성을 나타낸다.
응집 가능성의 감소 및 감소된 소수성은 본원에 기재된 항체의 가변 도메인 내의 선택된 위치에서 아미노산 치환에 기인한다.
항체 응집 수준은 질량 분석법, 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 동적 광 산란(DLS), 빛 가림(LO), 동적 이미징 입자 분석(DIP A) 기술, 예를 들어, 미세 유동 이미징(MFI), 및 쿨터 카운터(CC), 시차 주사 형광 측정(DSF)을 포함하는 다양한 공지된 기술을 사용하여 측정될 수 있다.
본원에서 사용된 감소된 소수성 및 감소된 응집 가능성은 서열번호 29(VH), 및 서열번호 32(VL) 및 서열번호 37(CH1-CH3), 서열번호 41(CL)을 포함하는 이말루맙의 표면 소수성 및 응집 가능성과 비교하여 방사성면역접합체의 본 발명 항체의 표면 소수성의 감소 및 감소된 응집 가능성을 지칭한다. C0008의 서열은 제안된 INN 목록 111(WHO Drug Information, Vol. 28, No. 2, 2014)에 공개된 이말루맙의 서열을 함유하지만, C-말단 리신이 결여되어 있다. 측정은 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 또는 친화성 포획 자기 상호작용 나노입자 분광법(AC-SINS, Estep P. et al., 2015)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 공지된 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
구현예에서, 감소된 응집 가능성 및 감소된 소수성을 갖는 방사성면역접합체의 oxMIF 항체는 구체적으로 다음을 포함한다:
- 서열번호 32를 참조하고 카바트 넘버링에 따라 아미노산 치환 M30L, F49Y, A51G, P80S, W93F 중 1, 2, 3, 4, 또는 5개를 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
- 위치 36에 천연 티로신을 포함하고, 더욱이 아미노산 치환 M30L, F49Y, A51G, P80S 및/또는 W93F 중 1, 2, 3, 4 또는 5개를 포함하는 서열번호 32와 적어도 95%, 구체적으로 적어도 96, 97, 98 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는
- 서열번호 29를 포함하는 중쇄 가변 도메인과 조합하여, 또는
- 서열번호 29를 참조하고 카바트의 넘버링에 따라, 아미노산 치환 L5Q 및/또는 W97Y를 포함하는 중쇄 가변 도메인과 조합하여, 또는
- 적어도 95, 구체적으로 적어도 96, 97, 98 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열번호 29를 포함하고, 아미노산 치환 L5Q 또는 W97Y 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 중쇄 가변 도메인.
대안적인 구현예에서, 서열번호 32를 포함하는 경쇄 가변 도메인은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환을 갖고, 단 위치 36의 천연 티로신은 보존되고, 또한 아미노산 중 1, 2, 3, 4 또는 5개가 위치 M30, F49, A51, P80, W93에서 치환된다.
추가의 구현예에서, 방사성면역접합체의 항-oxMIF 항체는 감소된 응집 가능성 및 감소된 소수성을 갖고, 구체적으로 다음을 포함한다:
- 서열번호 29 및 아미노산 치환 W97Y 또는 아미노산 치환 L5Q 및 W97Y를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 또는
- 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 29를 포함하고, 임의로 L5Q와 조합하여 아미노산 치환 W97Y를 추가로 포함하는 중쇄 가변 도메인.
경쇄의 36번 위치에서 천연 티로신은 항-oxMIF 항체의 결합 특성을 보존하기 위해 변형되지 않은 상태로 유지된다. 상기 아미노산 위치에서 임의의 변형은 원치 않는 손상된 결합 특성을 초래할 수 있다.
본원에 기재된 방사성면역접합체는 구체적으로 서열번호 32의 아미노산 넘버링을 참조하여 다음 아미노산 치환 조합 중 하나를 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함한다: M30L, F49Y, A51G, P80S, 및 W93F; F49Y, A51G, 및 W93F; F49Y 및 A51G.
본 발명의 방사성면역접합체는 다음의 가변 경쇄 및 중쇄 도메인 조합 중 임의의 것을 포함할 수 있다:
서열번호 33 및 서열번호 30
서열번호 34 및 서열번호 29
서열번호 34 및 서열번호 30
서열번호 34 및 서열번호 31
서열번호 35 및 서열번호 29
서열번호 35 및 서열번호 30, 31
서열번호 36 및 서열번호 29
서열번호 36 및 서열번호 30, 31.
추가의 구현예에서, 항-oxMIF 항체는 다음 서열 조합 중 어느 하나를 포함한다:
서열번호 37, 30, 33, 및 41,
서열번호 37, 31, 33, 및 41,
서열번호 37, 29, 34, 및 41,
서열번호 37, 30, 34, 및 41,
서열번호 37, 31, 34, 및 41,
서열번호 37, 29, 35, 및 41,
서열번호 37, 30, 35, 및 41,
서열번호 37, 31, 35, 및 41,
서열번호 37, 29, 36, 및 41,
서열번호 37, 30, 36, 및 41, 또는
서열번호 37, 31, 36, 및 41.
특정 구현예에서, 본 방사성면역접합체의 항-oxMIF 항체는 중쇄 불변 영역, 구체적으로 CH2 영역에서 선택된 위치에서 아미노산 치환으로 인해 Fcγ 수용체 보유 세포에 대한 감소된 결합(FcγRI, FcγRII, FcγRIII에 대한 감소된 결합)을 나타낸다.
본원에 사용된 "이펙터 기능"은 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드의 상호 작용으로 인해 발생하는 생화학적 사건을 의미한다. 이펙터 기능은 ADCC, ADCP 및 CDC를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "이펙터 세포"는 하나 이상의 Fc 수용체를 발현하고 하나 이상의 이펙터 기능을 매개하는 면역계 세포를 의미한다. 이펙터 세포는 단핵구, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 호산구, 비만 세포, 혈소판, B 세포, 큰 과립 림프구, 랑게르한스 세포(Langerhans' cell), 자연 살해(NK) 세포 및 T 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 원숭이를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 본 발명에 따르면, 본원에 기재된 항-oxMIF 항체는 중쇄 불변 영역, 구체적으로 Fc 영역 중 선택된 위치에서 아미노산 치환으로 인해 이펙터 기능이 침묵된다. 감소된 보체- 및 FcgR 매개 활성으로 인해 이들 항체의 감소되거나 침묵된 이펙터 기능은 감소되거나 페지된 보체 의존성 세포 독성(complement dependent cytotoxicity; CDC), 항체 의존성 세포 매개 세포 독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity; ADCC) 및/또는 항체 의존성 세포 포식작용(antibody dependent cellular phagocytosis; ADCP)을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "Fc" 또는 "Fc 영역"(또는 단편 결정화 가능 영역)은 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인(CH1 도메인)을 제외한 항체의 불변 영역 및 일부 경우에, 힌지의 일부를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. Fc 영역은 항체의 C-말단 영역을 지칭한다. Fc 영역은 항체의 두 개의 중쇄: 쇄 A 및 쇄 B의 두 번째 및 세 번째 불변 도메인으로부터 유래된 두 개의 동일한 단백질 단편으로 구성된다. 두 번째 및 세 번째 불변 도메인은 각각 CH2 도메인 및 CH3 도메인으로 공지된다. CH2 도메인은 쇄 A의 CH2 도메인 서열과 쇄 B의 CH2 도메인 서열을 포함한다. CH3 도메인은 쇄 A의 CH3 도메인 서열과 쇄 B의 CH3 도메인 서열을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, Fc 영역은 힌지 영역 또는 이의 일부를 포함한다.
인간 IgG Fc 영역 서열의 "CH2 도메인"은 일반적으로 EU 넘버링에 따라 약 아미노산 231에서 약 아미노산 340까지 확장된다. CH2 도메인 서열은 다른 도메인 서열과 밀접하게 쌍을 이루지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 두 개의 N-연결된 분지형 탄수화물 쇄가 온전한 네이티브 IgG 분자의 두 개의 CH2 도메인 서열 사이에 삽입된다.
"CH3 도메인"은 Fc 영역 서열의 CH2 도메인 서열에 대한 잔기 C-말단의 스트레치(즉, EU 넘버링에 따라 IgG의 약 아미노산 잔기 341에서 약 아미노산 잔기 447까지)를 포함한다.
"기능적 Fc 영역"은 네이티브(native) Fc 영역의 "이펙터 기능"을 보유한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1 q 결합; 보체 의존성 세포 독성; Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개 세포 독성(ADCC) 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인(예: 항체 가변 도메인)과 결합될 것을 요구하며, 당업계에 공지된 다양한 검정을 사용하여 본원에 개시된 바와 같이 평가될 수 있다.
"네이티브 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 네이티브 서열 인간 Fc 영역은 네이티브 서열 인간 IgG1 Fc 영역(비-A 및 A 알로형(allotype)); 네이티브 서열 인간 IgG2 Fc 영역 및 네이티브 서열 인간 IgG3 Fc 영역뿐만 아니라 이의 천연 변이체를 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 "하나 이상의 아미노산 치환"에 의해 네이티브 Fc 영역 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 변이체 Fc 영역 서열은 네이티브 Fc 영역 서열 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어, 약 1개 내지 약 20개의 아미노산 치환을 가지며, 바람직하게는 네이티브 Fc 영역 서열 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역 서열에서 약 1개 내지 약 17개의 아미노산 치환을 갖는다. 특정 구현예에서, 본원의 변이체 Fc 영역 서열은 네이티브 Fc 영역 서열 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역 서열과 적어도 약 80% 동일성, 가장 바람직하게는 그들과 적어도 약 90% 동일성, 더욱 바람직하게는 그들과 적어도 약 95% 동일성을 보유한다.
특정 구현예에서, 아미노산 치환은 EU 번호에 따른 IgG1을 참조하여 위치 E233, L234, L235, G236, G237, P238, D265, S267, H268, N297, S298, T299, E318, L328, P329, A330, P331 중 어느 하나에 있다. 그러나, 이러한 침묵 돌연변이는 EU 넘버링에 따라 상응하는 위치에서 야생형 IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc에 도입될 수 있다.
감소되거나 침묵된 Fc를 초래하는 Fc 영역의 변형은 당업계에 공지되어 있으며, 문헌(Saunders K., 2019 및 Liu R. et al., 2020)에 기재되어 있다.
대안적인 구현예에서, 아미노산 치환은 CH2 도메인에서 위치 L234 F, H268Q, K274Q, Y296F, A327G, A330S, P331S 및 CH3 도메인에서 R355Q, K409R, Q419E, P445L 중 어느 하나 또는 전부에 있다.
구체적으로, 본원에 기재된 Fc 침묵 항-oxMIF 항체는 아미노산 치환 또는 결실의 다음 조합 중 하나 이상을 포함한다:
i) L235, G237 및 E318, 구체적으로 L235A, G237A 및 E318A;
ii) L234, L235, 구체적으로 L234A, L235A;
iii) S228, L235, 구체적으로 S228P, L235E;
iv) G236, L328, 구체적으로 G236R, L328R;
v) S298, T299, 구체적으로 S298G, T299A;
vi) L234, L235, P331, 구체적으로 L234F, L235E, P331S;
vii) H268, V309, A330, P331, 구체적으로 H268Q, V309L, A330S, P331S;
viii) E233, L234, L235, G236, S267, 구체적으로 E233P, L234V, L235A, G236del, S267K;
ix) L234, L235, P329, 구체적으로 L234A, L235A, P329G;
x) V234, G237, P238, H268, A330, P331, 구체적으로 V234A, G237A, P238S, H268A, A330S, P331S;
xi) L234, L235, D265, 구체적으로 L234F, L235E, D265A;
xii) D265, 구체적으로 D265A;
xiii) G237, 구체적으로 G237A;
xiv) E318, 구체적으로 E318A;
xv) E233, 구체적으로 E233P,
xvi) G236, L328, 구체적으로 G236R, L328R;
xvii) L235, 구체적으로 L235E;
xviii) L234, L235, P331, 구체적으로 L234Q, L235F, P331S;
xix) L234, L235, G237, P238, H268, A330, P331, 구체적으로 L234A, L235A, G237A, P238S, H268A, A330S, P331S.
xx) N297, 구체적으로 비글리코실화(aglycosylated) 항체를 유도하는 N297A, N297Q 또는 N297G.
글리코실화, O- 및 N-글리코실화는 환경적 요인, 예를 들어, 스트레스 또는 질환, 사이토카인 활성, 및 선천적 면역 신호전달 수용체, 예를 들어, 톨 유사 수용체를 포함한 다양한 B 세포 자극에 의해 조절될 수 있는 Ab의 번역 후 변형이다. 모 항체의 글리코실화 패턴은 당업계에 익히 공지된 방법에 의해 변형될 수 있다. 구체적으로, O-연결된 글리코실화 부위는 CH2 및 힌지 영역에 위치한다.
용어 "비글리코실화된"은 Fc 영역이 글리코실화되지 않음을 나타낸다. IgG 동형의 모든 인간 불변 영역은 위치 297의 아스파라긴 잔기에서 글리코실화되는 것으로 공지되고, 이는 N-글리코실화 모티프 아스파라긴 297-X 298-세린 299 또는 트레오닌 299의 일부를 구성하고, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산의 잔기이다. 글리칸은 헵타사카라이드 코어 및 가변 연장, 예를 들어, 푸코스, 갈락토스 및/또는 시알산을 갖는다. 따라서, 본 발명의 항체는 이러한 불변 영역에서 아스파라긴 297을 효소적 수단에 의해 글리코실화 또는 탈글리코실화될 수 없는 다른 아미노산으로 대체함으로써 비글리코실화될 수 있다. 임의의 다른 아미노산 잔기가 잠재적으로 사용될 수 있지만, 알라닌이 가장 바람직하다. 대안적으로, 아스파라긴 297에서의 글리코실화는 모티프의 다른 잔기 중 하나를 변경함으로써, 예를 들어, 잔기 298을 프롤린으로 대체하거나 잔기 299를 세린 또는 트레오닌 이외의 임의의 아미노산으로 대체함으로써 방지할 수 있다. 이러한 부위 지시된 돌연변이유발을 수행하는 기술은 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 예를 들어, 상업적으로 이용 가능한 부위 지시된 돌연변이유발 키트를 사용하여 수행될 수 있다.
용어 "침묵 Fc "는 항체의 임의의 FcγR, 예를 들어, FcγRIIaH, FcγRIIaR, FcyRIIb FcyRIIIaF, FcyRIIIaV 및 FcyRIa 수용체 및 보체 인자 C1 q 단백질에 대한 결합을 감소시키거니 제거하는 변형된 글리칸을 초래하는 아미노산 치환 또는 글리코실화 패턴의 변형으로 인해 이펙터 기능이 감소되거나 제거된 항체의 Fc 영역을 지칭한다. 이 결합의 이러한 감소 또는 제거는 전형적으로 야생형 IgG Fc 영역에 의해 매개되는 이펙터 기능의 감소 또는 제거를 초래한다.
예를 들어, 임의의 FcγRIIaH, FcγRIIaR, FcyRIIb FcyRIIIaF, FcyRIIIaV 및 FcyRIa 수용체 중 하나 및 보체 인자 C1 q 단백질에 대한 FcγR 결합이 완전히 폐지된 경우, 용어 "Fc 제로(null)"가 본원에서 사용될 수 있다.
상당한 정도의 Fc 침묵은 돌연변이를 결합함으로써 달성될 수 있다. L234 및 L235, 이들 잔기는 힌지 영역에 가깝게 위치하고, 알라닌으로 치환될 때 FcyR 결합을 감소시킨다. 예로서, L234A 및 L235A와 P329G의 조합은 모든 이소형에 대한 FcyR 상호 작용을 거의 완전한 억제를 유도할 수 있다.
크게 감소, 침묵, 무시 가능하거나 절제된 FcyR 결합 친화성 및 C1 q 결합 친화성을 갖는 Fc 침묵 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 모 폴리펩티드 또는 네이티브 Fc 영역 서열을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 감소된 FcyR 결합 활성 및 C1 q 결합 활성을 갖는 것이다. 일부 구현예에서, 크게 감소, 침묵, 무시가능하거나 절제된 FcyR 결합 친화성 및 C1 q 결합 친화성을 갖는 Fc 침묵 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 모 폴리펩티드 또는 네이티브 Fc 영역 서열을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 크게 감소, 침묵, 무시할 수 있거나 절제된 ADCC, ADCP 및 CDC 활성을 또한 갖는다. FcyR에 대한 감소되거나 검출되지 않는 결합을 나타내는 Fc 침묵 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 모 폴리펩티드보다 낮은 친화성으로 모든 FcyR에 결합할 수 있다. FcyR에 대한 감소된 결합을 나타내는 이러한 변이체는 FcyR에 대한 현저한 결합을 거의 또는 전혀 갖지 않을 수 있다. 하나의 특정 구현예에서, 변이체는, 예를 들어, 평형 상수의 변화에 의해 측정된 바와 같이, 네이티브 IgG Fc 영역과 비교하여 FcyR에 대한 0 내지 20%의 결합을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 변이체는 네이티브 IgG Fc 영역과 비교하여 FcyR에 대한 0 내지 10%의 결합을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 변이체는 네이티브 IgG Fc 영역과 비교하여 FcyR에 대한 0 내지 5%의 결합을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 변이체는 네이티브 IgG Fc 영역과 비교하여 FcyR에 대한 0 내지 1%의 결합을 나타낸다.
침묵 보체 활성을 갖는 본원에 기재된 항체는 세포 기반 CDC 검정에 의해 결정될 수 있으며, 즉 SPR 또는 ELISA에 의해 결정된 C1q에 대한 결합을 감소시키거나 없앨 수 있다.
감소되거나 침묵된 CDC 활성은 참조, 즉 변형되지 않은 야생형 항체, 예를 들어, C0008과 비교하여 적어도 1.5배, 구체적으로 적어도 2배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 더욱 구체적으로 적어도 10배 하향 조절된 것으로 결정된다.
감소된 ADCC 또는 ADCP 활성은 참조 항체, 즉 변형되지 않은 야생형 항체, 예를 들어, C0008과 비교하여 적어도 2배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 보다 구체적으로 적어도 10배 감소된 효능을 갖는 것으로 결정된다.
야생형 IgG1 Fc 영역을 포함하는 방사성면역접합체와 비교하여 감소된 FcγR 결합을 나타내는 방사성면역접합체 항체 부분의 Fc 도메인은 구체적으로 위치 L234, L235, G236, G237, N297, L328 또는 P329 중 어느 하나에 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 이상의 아미노산 치환, 보다 구체적으로 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하는, 보다 구체적으로 위치 L234 및 L235에 치환을 포함하는, 야생형 인간 IgG1 불변 도메인(서열번호 37)의 Fc 변이체 도메인을 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 항-oxMIF 항체 부분은 위치 L234 및 L235, 구체적으로 L234A 및 L235A에 아미노산 치환을 포함하는, 야생형 인간 IgG1 불변 도메인(서열번호 37)의 Fc 변이체 도메인을 포함한다.
추가의 양태에서, Fc 변이체를 포함하는 방사성면역접합체의 항-oxMIF 항체에 의한 FcγR 결합의 감소 또는 하향 조절은 야생형 Fc 영역을 포함하는 항-oxMIF 항체에 대해 관찰된 값의 0, 2.5, 5, 10, 20, 50 또는 75%로의 감소이다.
시험관내 검정은 FcγR 결합의 감소/고갈을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체(FcR) 결합 검정은 항체가 FcγR 결합이 결여되어 있음을 보장하기 위해 수행될 수 있다. 이러한 검정은 FcγR을 특이적으로 발현하는 세포에 대한 SPR 결합 연구 또는 FACS를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
추가의 구현예에서, 항-oxMIF 항체는 다음 서열 조합 중 어느 하나를 포함한다:
서열번호 38, 30, 33, 및 41,
서열번호 38, 31, 33, 및 41,
서열번호 38, 29, 34, 및 41,
서열번호 38, 30, 34, 및 41,
서열번호 38, 31, 34, 및 41,
서열번호 38, 29, 35, 및 41,
서열번호 38, 30, 35, 및 41,
서열번호 38, 31, 35, 및 41,
서열번호 38, 29, 36, 및 41,
서열번호 38, 30, 36, 및 41, 또는
서열번호 38, 31, 36, 및 41.
특정 구현예에서, 본 방사성면역접합체의 항-oxMIF 항체는 중쇄 불변 영역의 선택된 위치에서 아미노산 치환으로 인해 신생아 수용체(Neonatal Receptor)(FcRn)에 대한 감소된 결합을 나타낸다.
FcRn은 내피 세포에 의해 발현되며, 이는 세포흡수작용에 의해 혈류로부터 가용성 IgG를 포함한 혈청 성분을 내재화한다. FcRn에 대한 IgG 결합은 pH 의존적이며; 엔도솜 구획 내부의 산성 pH(pH 6.0)는 IgG가 FcRn에 결합할 수 있도록 한다. 세포 표면으로 다시 재활용한 후, IgG는 생리적 pH(약 pH 7.2)에서 FcRn으로부터 해리되고, 혈액 순환으로 다시 방출되어 리소좀 분해로부터 보호되어 IgG의 연장된 반감기를 초래한다. FcRn에 대한 방사성면역접합체의 감소된 결합은 순환계의 감소된 반감기 및 더 빠른 생체내 클리어런스를 초래한다.
FcRn 결합 및 생체내 클리어런스/반감기 결정은 또한 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다(참조: 예를 들어, Petkova, S.B., et al., 2006).
야생형 IgG1 Fc 영역을 포함하는 방사성면역접합체와 비교하여 감소된 FcRn 결합을 나타내는 방사성면역접합체 항체 부분의 Fc 도메인은 바람직하게는 감소된 FcγR 결합을 나타내는 Fc 변이체 도메인(서열번호 38)을 포함할 수 있고, 방사성면역접합체의 Fc 부분은 위치 I253, H310 및 H435 중 어느 하나에 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다.
추가의 구현예에서, 항-oxMIF 항체는 다음 서열 조합 중 어느 하나를 포함한다:
서열번호 39, 30, 33, 및 41,
서열번호 39, 31, 33, 및 41,
서열번호 39, 29, 34, 및 41,
서열번호 39, 30, 34, 및 41,
서열번호 39, 31, 34, 및 41,
서열번호 39, 29, 35, 및 41,
서열번호 39, 30, 35, 및 41,
서열번호 39, 31, 35, 및 41,
서열번호 39, 29, 36, 및 41,
서열번호 39, 30, 36, 및 41,
서열번호 39, 31, 36, 및 41.
추가의 구현예에서, 항-oxMIF 항체는 다음 서열 조합 중 어느 하나를 포함한다:
서열번호 40, 30, 33, 및 41,
서열번호 40, 31, 33, 및 41,
서열번호 40, 29, 34, 및 41,
서열번호 40, 30, 34, 및 41,
서열번호 40, 31, 34, 및 41,
서열번호 40, 29, 35, 및 41,
서열번호 40, 30, 35, 및 41,
서열번호 40, 31, 35, 및 41,
서열번호 40, 29, 36, 및 41,
서열번호 40, 30, 36, 및 41, 또는
서열번호 40, 31, 36, 및 41.
본원에 기재된 항체의 oxMIF 결합 부위는 MIF의 산화 형태, 즉 동물, 구체적으로 마우스, 래트, 원숭이 및 인간을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유류 oxMIF, 구체적으로 인간 oxMIF에 특이적이지만 감소된 MIF에 대한 실질적인 교차 반응성을 나타내지 않는다. oxMIF는 암 환자의 종양 조직에서 특이적이고 우세하게 검출될 수 있는 MIF의 질환 관련 구조적 이소형이다. 하나의 구현예에서, 인간화 또는 인간 항-oxMIF 결합 부위는 본원에 기재된 인간화 또는 인간 항-oxMIF 결합 도메인의 하나 이상(예: 모두 3개)의 경쇄 상보성 결정 영역, 예를 들어, 서열번호 32, 33, 34, 35 또는 36에 포함된 CDR 및 본원에 기재된 인간화 또는 인간 항-oxMIF 결합 도메인의 하나 이상(예: 모두 3개)의 중쇄 상보성 결정 영역, 예를 들어, 서열번호 29, 30 또는 31을 포함한다.
방사성면역접합체의 oxMIF 결합 특이성은 oxMIF에 대한 선택적 결합을 결정하는데 적합한 임의의 검정, 예를 들어, oxMIF에 대한 결합과 관련하여 표지되지 않고 비특이적 대조군 항체, 예를 들어, 표지되지 않은 이말루맙에 대한 임의의 경쟁 검정에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 링커 서열을 포함하거나 포함하지 않고 면역글로불린의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 및/또는 가변 도메인으로 이해되는 항체 도메인으로 구성되거나 이를 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 상기 용어는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체, 예를 들어, 이중특이적 항체, 삼중특이적 항체, 및 목적하는 항원 결합 활성, 즉 oxMIF에 대한 결합을 나타내는 한 항체 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 포함한다. 상기 용어는 또한 융합 단백질, 예를 들어, 면역 독소와의 융합체 또는 항체 접합체, 예를 들어, oxMIF에 결합하는 항체 약물 접합체를 포함한다. 항체는 또한 Fc 영역이 두 번째 별개의 항원 결합 부위를 함유하는 FcabTM으로 대체된 IgG 구조를 갖는 전장 항체 포맷을 포함한다.
항체 도메인은 네이티브 구조일 수 있거나, 예를 들어, 항원 결합 특성 또는 임의의 다른 특성, 예를 들어, 안정성 또는 기능적 특성, 예를 들어, FcRn 및/또는 Fc-감마 수용체와 같은 Fc 수용체에 대한 결합을 변형시키기 위해 돌연변이유발 또는 유도체화, 바람직하게는 Fc-감마 수용체 및/또는 FcRn에 대한 결합을 감소시키는 변형에 의해 변형될 수 있다. 폴리펩티드 서열은 루프 서열(loop sequence)에 의해 연결된 항체 도메인 구조의 적어도 두 개의 베타 가닥(beta-strand)으로 이루어진 베타-배럴 구조(beta-barrel structure)를 포함하는 경우, 항체 도메인으로 간주된다.
용어 "항체"는 항원 결합 유도체 및 이의 단편을 포함하는 것으로 이해된다. 유도체는 본 발명의 하나 이상의 항체 도메인 또는 항체 및/또는 본 발명의 항체의 임의의 도메인이 하나 이상의 다른 단백질의 임의의 위치에서 융합될 수 있는 융합 단백질, 예를 들어, 다른 항체 또는 항체 포맷, 예를 들어, CDR 루프를 포함하는 결합 구조, 수용체 폴리펩티드뿐만 아니라 리간드, 스캐폴드 단백질, 효소, 표지, 독소 등의 임의의 조합이다.
용어 "항체"는 특히 표적 항원 oxMIF에 대한 결합 특성을 나타내는 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다.
"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, 단일 쇄 항체 분자(예: scFv), Fab-scFv 융합, Fab-(scFv)2, (scFv)2, F(ab')2, 디아바디, 교차-Fab 단편; 선형 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 방사성면역접합체의 항체 단편은 힌지 영역에 의해 침묵된 Fc-부분 또는 침묵된 Fc-도메인에 융합된다.
또한, 항체 단편은 VH 도메인의 특성, 즉 VL 도메인과 함께 조립합 수 있는 특성 또는 VL 도메인의 특성, 즉 VH 도메인과 함께 기능적 항원 결합 부위에 조립할 수 있는 특성을 갖는 단일 쇄 폴리펩티드를 포함하여 전장 항체의 항원 결합 특성을 제공한다.
본원에서 언급된 항체 단편은 또한 항원 결합 영역을 함유하는 하나 이상의 구조적 루프 영역, 예를 들어, FcabTM을 포함하는 침묵 Fc 도메인 또는 침묵 Fc 영역이 두 번째 별개의 항원 결합 부위를 함유하는 FcabTM으로 대체된 IgG 구조를 갖는 전장 항체 포맷을 포함할 수 있다.
용어 "기능적 변이체" 또는 "기능적 활성 변이체"는 또한 천연 대립 유전자 변이체뿐만 아니라 돌연변이체 또는 임의의 다른 비천연 변이체를 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 대립 유전자 변이체 또는 상동체로서 지칭되기도 하는 것은 핵산 또는 폴리펩티드의 생물학적 기능을 본질적으로 변경하지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가를 갖는 것을 특징으로 하는 핵산 또는 펩티드의 대안적인 형태이다. 구체적으로, 기능적 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 잔기 또는 이들의 조합의 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함할 수 있으며, 이 치환, 결실 및/또는 첨가는 보존적 변형이며 항원 결합 특성을 변경하지 않는다. 구체적으로, 본원에 기재된 기능적 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 이하의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함하며, 이는 보수적 변형이고 항체의 기능을 변경하지 않는다. 구체적으로, 본원에 기재된 바와 같은 기능적 활성 변이체는 최대 15개, 바람직하게는 최대 10개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함하며, 이는 보존적 변형이고 항체의 기능을 변경하지 않는다.
기능적 변이체는 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열의 서열 변경, 예를 들어, 하나 이상의 점 돌연변이(point mutation)에 의해 수득될 수 있으며, 여기서 서열 변경은 본 발명의 조합으로 사용될 때 변경되지 않은 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열의 기능을 유지하거나 개선한다. 이러한 서열 변경은 (보존적) 치환, 첨가, 결실, 돌연변이 및 삽입을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
보존적 치환은 그들의 측쇄 및 화학적 특성과 관련된 아미노산 계열 내에서 일어나는 치환이다. 이러한 계열의 예는 염기성 측쇄, 산성 측쇄, 비극성 지방족 측쇄, 비극성 방향족 측쇄, 하전되지 않은 극성 측쇄, 작은 측쇄, 큰 측쇄 등을 갖는 아미노산이다. 이러한 보존적 치환은, 예를 들어, 류신에 대한 이소류신, 글루타메이트에 대한 아스파르테이트, 세린에 대한 시스테인 등일 수 있다.
비보존적 치환은, 예를 들어, 프롤린 또는 발린에 대한 알라닌, 또는 페닐알라닌에 대한 시스테인, 세린 또는 발린에 대한 페닐알라닌 등과 같지만, 이에 제한되지 않는, 그들의 측쇄 및 화학적 특성과 관련되지 않는 아미노산 내에서 일어나는 치환이다.
점 돌연변이는 특히 상이한 아미노산에 대해 아미노산의 하나 이상의 단일(비연속적) 또는 이중선의 치환 또는 교환, 결실 또는 삽입에서 비조작된 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열의 발현을 초래하는 폴리뉴클레오티드의 조작으로 이해된다. 바람직한 점 돌연변이는 동일한 극성 및/또는 전하의 아미노산의 교환을 지칭한다. 이와 관련하여, 아미노산은 61개의 삼중선 코돈으로 인코딩된 20개의 천연 아미노산을 지칭한다. 이러한 20개의 아미노산은 중성 전하, 양전하 및 음전하를 갖는 것들로 나눌 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "Fab 단편 또는 Fab"은 경쇄의 VL 도메인 및 불변 도메인(CL)을 포함하는 경쇄 단편 및 중쇄의 VH 도메인 및 제1 불변 도메인(CH1)을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. 본 발명의 항체는 적어도 하나의 Fab 단편을 포함할 수 있고, 여기서 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역 중 어느 하나는 교환된다. 가변 영역 또는 불변 영역 중 어느 하나의 교환으로 인해, 상기 Fab 단편은 또한 "교차(cross)-Fab 단편" 또는 "크로스오버(crossover) Fab 단편"으로 지칭되기도 한다. 크로스오버 Fab 분자의 두 개의 상이한 쇄 조성물이 가능하며, 본 발명의 항체에 포함된다: Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 교환될 수 있으며, 즉 크로스오버 Fab 분자는 경쇄 가변 영역(VL)과 중쇄 불변 영역(CH1)으로 구성된 펩티드 쇄 및 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된 펩티드 쇄를 포함한다. 이 크로스오버 Fab 분자는 또한 CrossFab(VLVH)으로 지칭된다.
"단일 쇄 Fab 단편" 또는 "scFab"는 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 불변 도메인 1(CH1), 항체 경쇄 가변 도메인(VL), 항체 경쇄 불변 도메인(CL) 및 링커로 이루어진 폴리펩티드이며, 여기서 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음의 순서를 가질 수 있고: VH-CH1-링커-VL-CL, VL-CL-링커-VH-CH1, VH-CL-링커-VL-CH1 또는 VL-CH1-링커-VH-CL; 상기 링커는 적어도 20개 아미노산, 적어도 30개 아미노산, 특히 32개 내지 50개 아미노산의 폴리펩티드이다. 상기 단일 쇄 Fab 단편 VH-CH1-링커-VL-CL, VL-CL-링커-VH-CH1, VH-CL-링커-VL-CH1 및 VL-CH1-링커-VH-CL은 CL 도메인과 CH1 도메인 사이의 천연 이황화 결합을 통해 안정화될 수 있다. 또한, 이러한 단일 쇄 Fab 분자는 시스테인 잔기의 삽입을 통해 쇄간 이황화 결합의 생성으로 추가로 안정화될 수 있다.
Fv 단편은 항원 결합 활성에서 기능을 갖는 면역글로불린 분자의 가장 작은 단위이다. "단일 쇄 가변 단편" 또는 "scFv"는 짧은 링커 펩티드 또는 이황화 결합으로 연결된 면역글로불린의 중쇄(VH)와 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. 링커는 일반적으로 가요성(flexibility)을 위한 글리신과 용해도를 위한 세린 또는 트레오닌이 풍부하며, VH의 N-말단을 VL의 C-말단과 연결할 수 있거나 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 단일 쇄 가변 단편은 불변 Fc 영역이 결여된다. ScFv는 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고 원래 면역글로불린의 특이성을 유지한다.
용어 "N-말단"은 N-말단의 마지막 아미노산을 나타낸다.
용어 "C-말단"은 C-말단의 마지막 아미노산을 나타낸다.
용어 "미니바디"는 CH3 도메인을 통해 연결된 한 쌍의 단일 쇄 Fv 단편(단일 쇄 Fv-CH3)으로 구성된 항체를 지칭하며, 구체적으로 미니바디는 약 75kDa이다.
용어 "디아바디"는 작은 펩티드 링커로 연결된 중쇄 가변(VH) 영역과 경쇄 가변(VL) 영역으로 구성된 단일 쇄 Fv(scFv) 단편의 비공유 이량체를 지칭한다. 또 다른 형태의 디아바디는 두 개의 scFv 단편이 서로 공유 결합되어 있는 단일 쇄 (Fv)2이다. 또한, 각 쇄 중의 유전자를 내부 링커와 탠덤 연결함으로써 4개의 VH 및 VL 도메인은 탠덤으로 발현되고 단일 쇄 디아바디(scDb)로 중첩될 수 있으며, 이는 또한 이중특이적 항체 생산에 효과적인 전략이다. 또한, 재조합 가변 도메인을 Fc 영역 또는 CH3 도메인(scDb-Fc 및 scDb-CH3, 디아바디-CH3)에 융합하면 최종 생성물의 원자가를 두 배로 늘릴 수 있다. 증가된 크기는 또한 혈청 내 디아바디의 반감기를 연장할 수 있다. 구체적으로, 디아바디-CH3은 약 125kDa이다.
특정 구현예에 따르면, 본원에 기재된 항체는 친화성 태그, 용해도 향상 태그 및 모니터링 태그와 같지만 이에 제한되지 않는, 정제 및/또는 검출을 위한 하나 이상의 태그를 포함할 수 있다.
구체적으로, 친화성 태그는 폴리-히스티딘 태그, 폴리-아르기닌 태그, 항체용 펩티드 기질, 키틴 결합 도메인, RNAse S 펩티드, 단백질 A, ß-갈락토시다제, FLAG 태그, Strep II 태그, 스트렙타비딘 결합 펩티드(SBP) 태그, 칼모둘린 결합 펩티드(CBP), 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 결합 단백질(MBP), S-태그, HA 태그 및 c-Myc 태그로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 구체적으로 태그는 4개 이상의 H를 포함하는 His 태그, 예를 들어, 헥사히스티딘 태그이다.
"융합된" 또는 "연결된"은 구성 요소(예: Fab 분자와 Fc 도메인 서브유닛)가 직접 또는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 펩티드 결합에 의해 연결된다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "링커"는 펩티드 링커를 지칭하며, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상의 아미노산의 길이, 바람직하게는 2 내지 10개, 더욱 바람직하게는 3 내지 5개 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다.
용어 "면역글로불린"은 천연 항체의 구조를 갖는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, IgG 부류의 면역글로불린은 이황화 결합된 두 개의 경쇄와 두 개의 중쇄로 구성된 약 150,000달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단에서 C-말단까지, 각 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라고도 하는 가변 영역(VH)에 이어, 중쇄 불변 영역이라고도 하는 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단에서 C-말단까지, 각 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라고도 하는 가변 영역(VL)에 이어, 경쇄 불변 영역이라고도 하는 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. IgG 부류의 면역글로불린은 본질적으로 면역글로불린 힌지 영역을 통해 연결된 두 개의 Fab 분자와 하나의 Fc 도메인으로 구성된다. 면역글로불린의 중쇄는 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG) 또는 μ(IgM)라고 하는 다섯 가지 유형 중 하나에 배정될 수 있으며, 이 중 일부는 하위 유형, 예를 들어, γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) 및 α2(IgA2)로 추가로 세분화될 수 있다. 면역글로불린의 경쇄는 카파(κ) 및 람다(λ)라고 하는 두 가지 유형 중 하나에 배정될 수 있다.
용어 "키메라 항체(chimeric antibody)"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종에서 유래되는 반면, 나머지 중쇄 및/또는 경쇄가 상이한 공급원 또는 종에서 유래되고, 일반적으로 재조합 DNA 기술로 제조되는 항체를 지칭한다. 키메라 항체는 토끼 또는 뮤린 가변 영역과 인간 불변 영역을 포함할 수 있다. 키메라 항체는 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 DNA 세그먼트와 면역글로불린 불변 영역을 인코딩하는 DNA 세그먼트를 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 생성물이다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있는 종래의 재조합 DNA 및 유전자 형질감염 기술을 포함한다(Morrison, S.L., et al., 1984).
"인간 항체(human antibody)"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 기타 인간 항체 인코딩 서열을 활용하는 비인간 공급원에서 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유한다. 이 인간 항체의 정의는 구체적으로 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 배제한다. 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 또한 불변 영역에서, 예를 들어, "부류 전환", 즉 Fc 부분의 변경 또는 돌연변이(예: IgG1에서 IgG4로 및/또는 IgG1/IgG4 돌연변이)에 의해 변형되는 이러한 항체를 포함한다. 본 발명에 포함되는 다른 형태의 인간화 항체는, 예를 들어, C1q 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합과 관련하여 새로운 특성을 생성하기 위해 불변 영역이 원래 항체의 불변 영역으로부터 추가로 변형되거나 변경된 것들이다.
본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예를 들어, 숙주 세포, 예를 들어, HEK 세포, NS0 또는 CHO 세포로부터 단리된 항체 또는 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자 도입된 동물(예: 마우스)로부터 단리된 항체 또는 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현되는 항체를 포함하도록 의도된다. 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식선 서열로부터 유래되고 이와 관련되지만, 생체내 인간 항체 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
"인간 컨센서스 프레임워크 (human consensus framework)"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 일반적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위 그룹으로부터 이루어진다. 일반적으로, 서열의 하위 그룹은 문헌(Kabat et al., 1991)에 기재된 바와 같은 하위 그룹이다.
용어 "표적" 또는 "표적 항원"과 상호교환적으로 본원에 사용된 용어 "항원"은 항체 결합 부위에 의해 인식되는 전체 표적 분자 또는 이러한 분자의 단편을 지칭한다. 구체적으로, 항원의 하위 구조, 예를 들어, 일반적으로 "에피토프(epitope)", 예를 들어, 면역학적으로 관련되는 B-세포 에피토프 또는 T-세포 에피토프로 지칭되는 폴리펩티드 또는 탄수화물 구조는 이러한 결합 부위에 의해 인식될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "에피토프"는 특히 특이적 결합 파트너를 완전히 구성하거나 본 발명의 항체 포맷의 결합 부위에 대한 특이적 결합 파트너의 일부일 수 있는 분자 구조를 지칭한다. 에피토프는 탄수화물, 펩티드 구조, 지방산, 유기, 생화학적 또는 무기 물질 또는 이들의 유도체 및 이들의 임의의 조합으로 구성될 수 있다. 에피토프가 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질과 같은 펩티드 구조로 포함되는 경우, 일반적으로 적어도 3개의 아미노산, 구체적으로 5 내지 40개의 아미노산, 구체적으로 10개 미만의 아미노산, 구체적으로 4 내지 10개의 아미노산을 포함할 것이다. 에피토프는 선형 또는 구조적 에피토프일 수 있다. 선형 에피토프는 폴리펩티드 또는 탄수화물 쇄의 1차 서열의 단일 세그먼트로 구성된다. 선형 에피토프는 인접하거나 중첩될 수 있다. 구조적 에피토프는 폴리펩티드를 중첩시켜 3차 구조를 형성함으로써 함께 모인 아미노산 또는 탄수화물로 구성되며, 아미노산은 선형 서열에서 반드시 서로 인접할 필요는 없다. 이러한 oxMIF 에피토프는 서열 EPCALCS(oxMIF의 중심 영역 내에 위치된 서열번호 45)일 수 있다.
용어 "항원 결합 도메인" 또는 "결합 도메인" 또는 "결합 부위"는 항원의 일부 또는 전체에 특이적으로 결합하고 이에 상보적인 영역을 포함하는 항원 결합 모이어티의 일부를 지칭한다. 항원이 큰 경우, 항원 결합 분자는 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있으며, 이 부분은 에피토프로 지칭된다. 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 하나 이상의 항체 가변 도메인(항체 가변 영역이라고도 함)에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
본 발명의 항체와 관련하여 본원에 사용된 용어 "결합 부위"는 항원과의 상호 작용을 결합할 수 있는 분자 구조를 지칭한다. 전형적으로, 결합 부위는 본원에서 다양한 항원에 결합 기능을 부여하는 다양한 구조를 갖는 특정 영역인, "CDR 결합 부위"라고도 하는 항체의 상보성 결정 영역(CDR) 내에 위치된다. 다양한 구조는 항체의 천연 레퍼토리, 예를 들어, 뮤린 또는 인간 레퍼토리로부터 유래될 수 있거나, 돌연변이유발 및 구체적으로 무작위화 기술에 의해 재조합적으로 또는 합성적으로 생성될 수 있다. 이들은 돌연변이화된 CDR 영역, 가변 항체 도메인의 루프 영역, 특히 항체의 CDR 루프, 예를 들어, 임의의 VL 및/또는 VH 항체 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 루프를 포함한다. 본 발명에 따라 사용되는 항체 포맷은 전형적으로 각각 항원에 특이적인 하나 이상의 CDR 결합 부위를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "특이적"은 이질적인 분자 집단에서 관심 있는 동족 리간드를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 본원에서, 결합 반응은 적어도 oxMIF 항원에 의한 것이다. 따라서, 지정된 조건, 예를 들어, 면역검정 조건하에서, 이의 특정 표적에 특이적으로 결합하는 항체는 샘플에 존재하는 다른 분자에 유의한 양으로 결합하지 않으며, 구체적으로 그것은 감소된 MIF에 대한 상당한 교차 반응성을 나타내지 않는다.
특정 결합 부위는 전형적으로 다른 표적과 교차 반응하지 않는다. 여전히, 특정 결합 부위는 표적의 하나 이상의 에피토프, 이소형 또는 변이체에 특이적으로 결합할 수 있거나 다른 관련 표적 항원, 예를 들어, 상동체 또는 유사체에 교차 반응성일 수 있다.
특이적 결합은, 결합이 선택된 바와 같이, 표적 동일성, 높은, 중간 또는 낮은 결합 친화성 또는 결합력 측면에서 선택적이라는 것을 의미한다. 선택적 결합은 일반적으로 oxMIF와 같은 표적 항원에 대한 결합 상수 또는 결합 동역학이 표적 항원이 아닌 항원에 대한 결합 상수 또는 결합 동역학과 비교하여 적어도 10배 상이하고, 바람직하게는 차이가 적어도 100배, 더욱 바람직하게는 적어도 1000배인 경우에 달성된다.
현재 출원 내에 사용된 용어 "원자가( valent )"는 항체 분자 내에 특정된 수의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 항체의 원자가는 개별 항체 분자가 결합할 수 있는 항원성 결정인자의 수를 지칭한다. 이와 같이, 용어 "2가", "4가" 및 "6가"는 항체 분자 내에 각각 2개의 결합 부위, 4개의 결합 부위 및 6개의 결합 부위의 존재를 나타낸다.
항체의 원자가(항원 결합 부위 수)가 클수록 결합할 수 있는 항원의 양이 많아진다.
항체의 결합 부위와 관련하여 본원에 사용된 용어 "1가"는 표적 항원에 대해 지시된 하나의 결합 부위만을 포함하는 분자를 지칭한다.
본 발명의 항체는 oxMIF에 특이적으로 결합하는 1가, 2가, 4가 또는 다가 결합 부위를 포함하는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역( hypervariable region)" 또는 "HVR"은 서열 중 초가변적이고/이거나 구조적으로 정의된 루프("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 각 영역을 지칭한다. 일반적으로, 네이티브 4-쇄 항체는 6개의 HVR: VH 중 3개(H1, H2, H3) 및 VL 중 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프 및/또는 "상보성 결정 영역"(CDR)의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 최고 서열 가변성이거나 항원 인식에 관여한다(Kabat et al., 1991). 초가변 영역(HVR)은 또한 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되기도 하며, 이러한 용어는 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역의 일부와 관련하여 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 수는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당업자는 어느 잔기가 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 감안하여 특정 CDR을 포함하는지를 일상적으로 결정할 수 있다.
카바트는 임의의 항체에 적용할 수 있는 가변 영역 서열에 대한 넘버링 시스템을 정의했다. 당업자는 서열 자체 이외의 임의의 실험 데이터에 의존하지 않고 이 "카바트 넘버링(Kabat numbering)" 시스템을 임의의 가변 영역 서열에 명확하게 배정할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 항체의 서열과 "표준" 카바트 넘버링된 서열의 상동성 영역에 정렬시킴으로써 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "카바트 넘버링"은 문헌(Kabat et al., 1983, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest")에 제시된 넘버링 시스템을 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 항체 가변 영역에서 특정 아미노산 잔기 위치의 넘버링에 대한 참조는 카바트 넘버링 시스템에 따른다. 불변 영역의 번호는 EU 넘버링 지수에 따른다.
CDR은 또한 항원과 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 약어-CDR 또는 a-CDR이라고 하는 CDR 영역 내에 함유되어 있다. 달리 지시되지 않는 한, 가변 영역의 HVR 잔기 및 기타 잔기(예: FR 잔기)는 문헌(Kabat et al., 상기)에 따라 본원에서 넘버링된다.
본원에서 식별된 폴리펩티드 서열에 대한 "퍼센트( % ) 서열 동일성"은 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입한 후, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고 특정 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 당업자는 비교될 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
본 발명에 따르면, 가변 또는 불변 영역 서열의 서열 동일성은 본원에 기재된 각 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%이다. %의 사양으로 인해, 순전히 산술적으로 아미노산 또는 핵산은 더 이상 정수(whole number)로 지정될 수 없을 수 있다. 예로서, 동일성의 계산은 동일하거나 동일하지 않은 1.5개의 아미노산을 초래한다. 이 경우에, 값은 핵산과 아미노산이 항상 정수로 주어지도록 반올림된다.
본원에 사용된 용어 "대상체 " 또는 "환자" 또는 "개체"는 포유동물을 지칭한다. 포유동물은 가축(예: 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예: 인간 및 비인간 영장류, 예를 들어, 원숭이), 토끼 및 설치류(예: 마우스 및 래트)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 개체 또는 대상체는 인간, 가장 바람직하게는 종양 내 악성 세포를 포함하여 비정상 세포를 갖는 것으로 의심되는 인간이다.
"단리된 " 핵산"은 자연 환경의 구성 요소로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 통상적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체외로 존재하거나 이의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항- oxMIF를 인코딩하는 단리된 핵산"은 단일 벡터 또는 별개의 벡터 중 이러한 핵산 분자(들), 및 숙주 세포 중 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들)를 포함하여 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 이의 단편)를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 지칭한다.
"상당한 교차 반응성 없음"은 분자(예: 항체)는, 특히 그 표적 항원과 비교될 때 분자의 실제 표적 항원과 상이한 항원(예: 표적 항원과 밀접하게 관련된 항원), 구체적으로 감소된 MIF를 인식하지 않거나 이에 특이적으로 결합하지 않는다는 것을 의미한다. 예를 들어, 항체는 실제 표적 항원과 상이한 항원에 약 10% 미만 내지 약 5% 미만으로 결합할 수 있거나, 실제 표적 항원과 상이한 항원에 약 10%, 9%, 8% 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2% 또는 0.1% 미만, 바람직하게는 약 2%, 1% 또는 0.5% 미만, 가장 바람직하게는 약 0.2% 또는 0.1% 미만으로 구성되는 양으로 실제 표적 항원과 상이한 상기 항원을 결합할 수 있다. 결합은 ELISA 또는 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)과 같지만, 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 항체의 재조합 생산은 바람직하게는, 예를 들어, 항체 포맷을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 작제물 또는 벡터를 포함하는 발현 시스템을 사용한다.
용어 "발현 시스템"은 작동 가능한 결합으로 목적하는 코딩 서열과 제어 서열을 함유하여 이러한 서열로 형질전환되거나 형질감염된 숙주가 인코딩된 단백질을 생산할 수 있도록 하는 핵산 분자를 지칭한다. 형질전환에 영향을 미치기 위해, 발현 시스템이 벡터에 포함될 수 있지만, 관련 DNA는 또한 숙주 염색체에 통합될 수 있다. 대안적으로, 발현 시스템은 시험관내 전사/번역에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "발현 벡터"는 클로닝된 재조합 뉴클레오티드 서열, 즉 재조합 유전자의 전사 및 적절한 숙주 유기체에서 그들의 mRNA의 번역에 필요한 DNA 서열로서 정의된다. 발현 벡터는 발현 카세트를 포함하며, 추가로 일반적으로 숙주 세포에서 자율 복제를 위한 기원 또는 게놈 통합 부위, 하나 이상의 선택 가능한 마커(예: 아미노산 합성 유전자 또는 제오신, 카나마이신, G418 또는 하이그로마이신과 같은 항생제에 대한 내성을 부여하는 유전자), 다수의 제한 효소 절단 부위, 적합한 프로모터 서열 및 전사 종결 인자를 포함하며, 이 구성 요소는 함께 작동 가능하게 연결된다. 본원에 사용된 용어 "플라스미드" 및 "벡터"는 자율적으로 복제하는 뉴클레오티드 서열 및 게놈 통합 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
구체적으로, 상기 용어는 DNA 또는 RNA 서열(예: 외래 유전자), 예를 들어, 본 발명의 항체 포맷을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 숙주를 형질전환시키고 도입된 서열의 발현(예: 전사 및 번역)을 촉진하기 위해 숙주 세포 내로 도입될 수 있는 비히클을 지칭한다. 플라스미드는 본 발명의 바람직한 벡터이다.
벡터는 전형적으로 외래 DNA가 삽입되는 전달 가능한 제제(agent)의 DNA를 포함한다. DNA의 한 세그먼트를 DNA의 다른 세그먼트에 삽입하는 일반적인 방법은 제한 부위라고 하는 특정 부위(특정 뉴클레오티드 그룹)에서 DNA를 절단하는 제한 효소라고 하는 효소의 사용을 포함한다.
"카세트(cassette)"는 정의된 제한 부위에서 벡터에 삽입될 수 있는 발현 생성물을 코딩하는 DNA 코딩 서열 또는 DNA 세그먼트를 지칭한다. 카세트 제한 부위는 적절한 판독 프레임에 카세트의 삽입을 보장하도록 설계된다. 일반적으로, 외래 DNA는 벡터 DNA의 하나 이상의 제한 부위에 삽입된 다음 벡터에 의해 전달 가능한 벡터 DNA와 함께 숙주 세포로 운반된다. 발현 벡터와 같은 삽입되거나 첨가된 DNA를 갖는 DNA의 세그먼트 또는 서열은 또한 "DNA 작제물"이라고 지칭될 수도 있다. 일반적인 유형의 벡터는 "플라스미드"이며, 이는 일반적으로 추가의 (외래) DNA를 쉽게 수용할 수 있고 적절한 숙주 세포에 쉽게 도입될 수 있는 이중 가닥 DNA의 자체 함유된 분자이다. 본 발명의 벡터는 종종 코딩 DNA 및 발현 제어 서열, 예를 들어, 프로모터 DNA를 함유하며, 외래 DNA를 삽입하기에 적합한 하나 이상의 제한 부위를 갖는다. 코딩 DNA는 본 발명의 항체 포맷과 같은 특정 폴리펩티드 또는 단백질에 대한 특정 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 서열이다. 프로모터 DNA는 코딩 DNA의 발현을 개시, 조절 또는 달리 매개 또는 제어하는 DNA 서열이다. 프로모터 DNA와 코딩 DNA는 동일한 유전자로부터 또는 상이한 유전자로부터 유래될 수 있으며, 동일하거나 상이한 유기체로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 재조합 클로닝 벡터는 종종 클로닝 또는 발현을 위한 하나 이상의 복제 시스템, 숙주에서의 선택을 위한 하나 이상의 마커, 예를 들어, 항생제 내성, 및 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 것이다.
예를 들어, 본 발명의 인자 및/또는 관심 단백질, 프로모터, 종결 인자 및 추가 서열을 각각 제공하거나 코딩하는 DNA 서열을 결찰시키고, 통합 또는 숙주 복제에 필요한 정보를 함유하는 적절한 벡터에 그들을 삽입하는 데 사용된 절차는 당업자에게 익히 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌(Sambrook et al, 2012)에 기재되어 있다.
숙주 세포는 구체적으로 본 발명에 따른 벡터와 같은 발현 작제물로 형질감염된 세포, 재조합 세포 또는 세포주로서 이해된다.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포주"는 장기간에 걸쳐 증식하는 능력을 획득한 특정 세포 유형의 확립된 클론을 지칭한다. 용어 숙주 세포주는 본 발명의 재조합 항체 포맷과 같은 폴리펩티드를 생산하기 위해 내인성 또는 재조합 유전자를 발현하는 데 사용되는 세포주를 지칭한다.
"생산 숙주 세포" 또는 "생산 세포"는 일반적으로 본 발명의 재조합 항체 포맷인 생산 공정의 생성물을 수득하기 위해 생물 반응기(bioreactor)에서 배양할 준비가 된 세포주 또는 세포 배양물인 것으로 이해된다. 본 발명에 따른 숙주 세포 유형은 임의의 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "재조합"은, 예를 들어, 구체적으로 재조합 벡터 또는 재조합 숙주 세포에 혼입된 이종 서열을 사용하는, "유전자 공학에 의해 제조되는" 또는 "유전자 공학의 결과"를 의미한다.
항체는 임의의 공지되고 잘 확립된 발현 시스템 및 재조합 세포 배양 기술을 사용하여, 예를 들어, 박테리아 숙주(원핵 시스템) 또는 진핵 시스템, 예를 들어, 효모, 진균, 곤충 세포 또는 포유류 세포에서의 발현에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 항체 분자는 유전자도입 유기체, 예를 들어, 염소, 식물 또는 유전자 도입 마우스, 인간 면역글로불린 유전자좌의 큰 단편을 갖고 마우스 항체 생산에서 결핍된 조작된 마우스 균주에서 생산될 수 있다. 항체는 또한 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 숙주 세포는 CHO, PerC6, CAP, HEK, HeLa, NS0, SP2/0, 하이브리도마 및 주르캇으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포의 생산 세포주이다. 보다 구체적으로, 숙주 세포는 CHO 세포로부터 수득된다.
본 발명의 숙주 세포는 구체적으로 혈청에 대한 대안으로서 다른 성분, 예를 들어, 혈장 단백질, 호르몬 및 성장 인자를 포함하는 무혈청 배양물에서 배양되거나 유지된다.
숙주 세포는 혈청 부재 조건하에서, 그리고 임의로 동물 기원의 임의의 단백질/펩티드를 함유하는 않는 배지에서 확립, 적응 및 완전히 배양될 때, 가장 바람직하다.
본원에 기재된 바와 같이 방사성면역접합체의 항-oxMIF 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
용어 "약제학적 제형"은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 이러한 형태로 존재하며, 제형이 투여되는 대상체에게 허용할 수 없을 정도로 독성이 있는 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약제학적으로 허용되는 담체 "는 대상체에게 무독성인, 활성 성분 이외의 약제학적 제형 중의 성분을 지칭한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 일부 예는 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 아미노산, 예를 들어, 글리신 또는 히스티딘, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 뿐만 아니라 이들의 조합이다. 많은 경우에, 등장성 제제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 약제학적으로 허용되는 물질의 추가 예는 습윤제 또는 소량의 보조 물질, 예를 들어, 습윤제 또는 유화제, 방부제 또는 완충제이며, 이는 항체의 저장 수명 또는 유효성을 향상시킨다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료", "치료하다" 또는 "치료하는" 또는 "요법"은 치료될 개체의 자연적인 경과를 변경하기 위한 시도에서 임상적 개입을 지칭하며, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행률의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 예후 개선을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 질환의 발병을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
본 발명의 방사성면역접합체의 항-oxMIF 항체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물은 하나 이상의 다른 치료제, 진단제 또는 예방제와 함께 투여될 수 있다. 추가의 치료제는 치료될 질환에 따라 다른 항신생물, 항종양제, 항혈관형성제, 화학요법제, 스테로이드 또는 체크포인트 억제제를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 형태, 예를 들어, 액체 용액(예: 주사용 및 주입용 용액), 분산액 또는 현탁액 및 리포솜일 수 있다. 다양한 다른 전달 시스템도 공지되어 있으며, 본원에 기술된 방사성면역접합체를 투여하는 데, 예를 들어, 리포좀, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 수용체-매개 세포내이입(endocytosis)에서의 캡슐화에 사용될 수 있다(참조: 예를 들어, Wu and Wu, 1987).
암의 치료, 예방 또는 관리 또는 암의 진단에 효과적일 본 발명의 방사성면역접합체 조성물의 양은 표준 연구 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 암의 치료, 예방 또는 관리 또는 암의 진단에 효과적일 조성물의 용량은 동물 모델, 예를 들어, 본원에 개시되거나 당업자에게 공지된 동물 모델에게 조성물을 투여함으로써 결정될 수 있다. 또한, 시험관내 검정이 최적의 용량 범위를 식별하는 데 도움이 되도록 임의로 사용될 수 있다. 바람직한 유효량의 선택은 당업자에게 공지될 여러 요인을 고려하여 당업자에 의해 결정될 수 있다(예를 들어, 임상 시험을 통해). 이러한 요인은 치료 또는 예방될 질환, 관련 증상, 환자의 체질량, 환자의 면역 상태 및 투여된 약제학적 조성물의 정확성을 반영하는 당업자에게 공지된 기타 요인을 포함한다. 제형에 사용되는 정확한 투여량은 또한 투여 경로 및 암의 중증도에 따라 달라질 것이며, 의사의 판단과 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 투여량-반응 곡선(dose-response curve)으로부터 외삽될 수 있다.
특정 구현예에서, 방사성면역접합체의 치료적 유효량은 약 25mCi 내지 250mCi, 50mCi 내지 200mCi, 75mCi 내지 175mCi, 또는 100mCi 내지 150mCi의 범위 내이다.
방사성면역접합체는 공지된 화학 요법제와 함께 투여될 수 있다. 화학요법제의 예는 BCNU, 시스플라틴, 젬시타빈, 하이드록시우레아, 파클리탁셀, 테모조마이드, 토포테칸, 플루오로우라실, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 프로카바진, 다카바진, 알트레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 머캅토푸린, 티오구아닌, 플루다라빈 포스페이트, 클라드리빈, 펜토스타틴, 플루오로우라실, 시타라빈, 아자시티딘, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 에토포사이드, 테니포사이드, 이리노테칸, 도세탁셀, 독소루비신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 이다루비신, 플리카마이신, 아드리아마이신, 미토마이신, 블레오마이신, 타목시펜, 플루타마이드, 류프롤리드, 고세렐린, 아미노글루테티미드, 아나스트로졸, 암사크린, 아스파라기나제, 미톡산트론, 미토탄 및 아미포스틴을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
바람직한 제형은 의도된 투여 방식 및 치료적 적용에 따라 달라진다. 전형적인 바람직한 조성물은 주사 가능한 또는 주입 가능한 용액 형태, 예를 들어, 인간의 수동 면역화에 사용되는 것들과 유사한 조성물이다. 바람직한 투여 방식은 비경구(예: 피내, 정맥내, 피하, 경막외, 복강내, 근육내)이다. 바람직한 구현예에서, 방사성면역접합체는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다.
특정 구현예에서, 방사성면역접합체를 치료가 필요한 영역에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있고; 이는, 예를 들어, 그리고 제한 없이, 수술 중 국소 주입에 의해, 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌약에 의해 또는 임플란트에 의해 달성될 수 있으며, 상기 임플란트는 실라스틱 막(silastic membrane)과 같은 막 또는 섬유를 포함하는 다공성, 비다공성 또는 젤라틴성 물질이다.
또 다른 구현예에서, 방사성면역접합체 또는 방사성면역접합체를 포함하는 임의의 조성물은 제어 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 하나의 구현예에서, 펌프가 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제어 방출 시스템은 치료 표적, 예를 들어, 뇌에 근접하여 배치될 수 있고, 따라서 전신 투여량의 분획만을 필요로 한다.
방사성면역접합체는 한 번 투여할 수도 있지만, 더 바람직하게는 여러 번 투여된다.
본 발명은 또한 MIF 관련 상태, 구체적으로 (과)증식성 장애((hyper)proliferative disorder)에 대한 치료가 필요한 대상체의 치료 및 진단을 위한, 방사성면역접합체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 치료가 필요한 대상체는 인간이다.
본원에 사용된 용어 "암"은 증식성 질환, 구체적으로 비고형암 및 고형암을 지칭한다. 암의 예는 암종(carcinoma), 림프종(lymphoma), 모세포종(blastoma), 육종(sarcoma) 및 백혈병(leukemia)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 보다 특히, 이러한 암의 예는 편평 세포암(squamous cell cancer), 소세포 폐암(small-cell lung cancer), 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 폐 선암(adenocarcinoma of the lung), 폐 편평 상피암(squamous carcinoma of the lung), 복막암(cancer of the peritoneum), 골수종(myeloma)(예: 다발성 골수종(multiple myeloma)), 간세포암(hepatocellular cancer), 위장암(gastrointestinal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 교모세포종(glioblastoma)/신경교종(glioma)(예: 역형성 성상세포종(anaplastic astrocytoma), 다형성 교모세포종(glioblastoma multiforme), 역형성 희소돌기아교종(anaplastic oligodendroglioma), 역형성 희소돌기아교성상세포종(anaplastic oligodendroastrocytoma)), 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 간종양(hepatoma), 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 자궁내막 또는 자궁 암종(endometrial or uterine carcinoma), 침샘 암종(salivary gland carcinoma), 신장암(kidney cancer), 간암(liver cancer), 전립선암(prostate cancer), 외음부암(vulval cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 흑색종(melanoma), 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma; SCC)(예: 두경부(head and neck), 식도(esophageal) 및 구강(oral cavity)), 결장직장 선암종(colorectal adenocarcinoma), 갑상선 수질암(medullary thyroid cancer), 갑상선 유두암(papillary thyroid cancer), 성상세포 종양(astrocytic tumor), 신경모세포종(neuroblastoma), 자궁경부암(cervical cancer), 자궁내막 암종(endometrial carcinoma), 및 임의의 상기 암의 불응성 버전을 포함하는 악성 정상피종(malignant seminoma) 또는 상기 암 중 하나 이상의 조합을 포함한다.
본 발명의 방사성면역접합체에 의해 치료 및/또는 진단될 수 있는 암성 질환 또는 암과 같은 과증식성 장애는 임의의 조직 또는 기관을 포함할 수 있으며, 뇌, 폐, 편평 세포, 방광, 위, 췌장, 유방, 두부, 경부, 간, 신장, 난소, 전립선, 결장직장, 식도, 부인과, 비인두 또는 갑상선암, 흑색종, 림프종, 백혈병 또는 다발성 골수종을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특히, 본 발명의 방사성면역접합체는 난소, 췌장, 결장 및 폐의 암종 및 혈액학적 악성 종양을 치료 및/또는 진단하는 데 유용하다.
특정 구현예에서, 방사성면역접합체의 항체는 암성 질환의 치료 및/또는 진단, 구체적으로 고형 종양의 치료에 매우 적합하며, 감소된 응집 가능성 및 감소된 소수성을 갖고,
i) 다음 가변 도메인:
(a) 서열번호 32 및 아미노산 치환 M30L, F49Y, A51G, P80S, W93F 중 적어도 하나를 포함하는 경쇄 가변 도메인, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환을 갖고, 위치 36에 보존된 티로신을 추가로 포함하고 아미노산 치환 M30L, F49Y, A51G, P80S, W93F 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 서열번호 32의 기능적 변이체; 및
(b) 서열번호 29를 포함하는 중쇄 가변 도메인; 또는
(c) 서열번호 29 및 아미노산 치환 L5Q 또는 W97Y 중 적어도 하나를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 29를 포함하고 아미노산 치환 L5Q 또는 W97Y 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 서열번호 29의 기능적 변이체 중 하나를 포함하는 재조합 항-oxMIF 항체 또는 이들의 항원 결합 단편이다.
또한, 또 다른 바람직한 양태에서, 방사성면역접합체의 항-oxMIF 항체는, 예를 들어, Fc의 알라닌 스캔에 의해 식별될 수 있는 FcγR 결합을 감소시키는 변형을 포함한다. 구체적으로는, 그것은 위치 L234, L235, G236, G237, N297, L328 또는 P329 중 어느 하나에 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하는, 서열번호 37을 갖는 야생형 인간 IgG1 불변 도메인의 Fc 변이체 도메인을 포함하며, 여기서 상기 방사성면역접합체는 야생형 IgG1 Fc 영역을 포함하는 방사성면역접합체와 비교하여 감소된 FcγR 결합을 나타낸다. 추가의 구현예에서, 방사성면역접합체는 위치 I253, H310, H435 중 어느 하나에 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하는, 감소된 FcγR 결합을 갖는 Fc 변이체 도메인(서열번호 38)을 포함하며, 여기서 상기 방사성면역접합체는 야생형 IgG1 Fc 영역을 포함하는 방사성면역접합체와 비교하여 인간 FcRn에 대해 감소된 친화성을 나타낸다.
본 발명의 방사성면역접합체는 진단제 또는 검출 가능한 제제로서 사용될 수 있다. 본 발명의 방사성면역접합체는 특정 요법의 효능을 결정하는 것과 같은 임상 시험 절차의 일부로서 암의 발병 또는 진행을 모니터링하거나 예후를 예측하는 데 유용할 수 있다. 추가로, 이러한 방사성면역접합체는 암성 상태의 발병 또는 진행을 모니터링하거나 예후를 예측하는 데 유용할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방사성면역접합체의 최초 투여 후, 암 세포가 이미징될 수 있고, 암 세포의 상대적인 양 또는 수가 임의의 이용 가능한 수단에 의해 결정될 수 있다. 본 발명은 암을 검출하고/하거나 환자의 장기 또는 신체 영역에서 암 세포에 대한 치료제의 효과를 평가하기 위한 진단 방법을 포함한다.
본 방법은 방사성 동위원소에 접합된 항-oxMIF 항체의 검출 가능한 양을 포함하는 조성물을 요법 전후에 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 치료제의 투여에 이어, 치료 후 남아있는 암 세포의 상대적인 양을 결정하기 위해 검출 가능한 항-oxMIF 항체의 추가량이 투여될 수 있다. 치료 전후 이미지의 비교는 치료 효능을 평가하는 수단으로 사용될 수 있으며, 여기서 치료 후 이미징된 암 세포의 수의 감소는 효과적인 치료 섭생을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "검출 가능한 양"은 종양 내 하나 이상의 악성 암 세포에 대한 표지 항체의 결합의 검출을 가능하게 하기에 충분한, 환자에게 투여된, oxMIF에 결합하는 방사성면역접합체의 양을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "이미징 유효량"은 종양 내 하나 이상의 악성 암 세포에 대한 항-oxMIF 항체의 결합의 이미징을 가능하게 하기에 충분한, 환자에게 투여되는 방사성면역접합체의 양을 지칭한다.
본 발명의 방법은 양전자 방출 단층 촬영(positron emission tomography; PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영(single-photon emission computed tomography; SPECT)과 같은 감마 이미징(gamma imaging)과 같은 비침습적 이미징 기술(non-invasive imaging technique)과 함께 종양 내 악성 세포를 포함한 생체내 비정상 세포를 식별하고 정량화하는 데 사용되는 본 발명의 방사성면역접합체를 포함한다. 용어 "생체내 이미징(in vivo imaging)"은 상기 기재된 바와 같은 방사성면역접합의 검출을 허용하는 임의의 방법을 지칭한다. 감마 이미징의 경우, 검사되는 종양 또는 영역으로부터 방출된 방사선이 측정되고, 총 결합으로서 또는 한 조직의 총 결합이 동일한 생체내 이미징 절차 중에 동일한 대상체의 다른 조직 또는 전신에서의 총 결합으로 정규화되는(예를 들어, 이에 의해 나누어진) 비율로서 표현된다. 생체내 총 결합은 많은 초과량의 표지되지 않았지만 화학적으로 동일한 화합물과 함께 동일한 양의 표지된 화합물의 두 번째 주사로 보정할 필요 없이 생체내 이미징 기술에 의해 종양 또는 조직에서 검출된 전체 신호로 정의된다.
생체내 이미징의 목적을 위해, 이용 가능한 검출 기기의 유형은 주어진 표지를 선택하는 데 있어 주요 요소이다. 예를 들어, 방사성 동위원소는 본원에 기재된 방법에서 생체내 이미징에 특히 적합하다. 사용되는 기기의 유형은 방사성 동위원소의 선택을 가이드할 것이다. 예를 들어, 선택된 방사성 동위원소는 주어진 유형의 기기로 검출 가능한 붕괴의 유형을 가져야 한다. 또 다른 고려 사항은 방사성 동위원소의 반감기에 관한 것이다. 반감기는 표적에 의한 최대 흡수 시점에 여전히 검출 가능하도록 충분히 길어야 하지만, 숙주가 해로운 방사선을 견디지 않도록 충분히 짧아야 한다. 동위원소 표지된 방사성면역접합체는 적절한 파장의 방출된 감마 조사가 검출되는 감마 이미징을 사용하여 검출될 수 있다. 감마 이미징 방법은 양전자 방출 단층 촬영(PET) 이미징 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영(SPECT)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, SPECT 검출의 경우, 선택된 방사성 표지는 미립자 방출이 결여되지만 많은 수의 광자를 생성할 것이다. PET 검출의 경우, 방사성 표지는 PET 카메라에 의해 검출될 양전자 방출 방사성 동위원소일 것이다.
본 발명에서, 방사성면역접합체는 종양의 생체내 검출 및 이미징에 유용하다. 이러한 화합물은 비침습적 이미징 기술, 예를 들어, 양전자 방출 단층 촬영(PET), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영(SPECT) 또는 세렌코프 발광 이미징(Cerenkov luminescence imaging; CLI)과 함께 사용되어야 한다. 본 발명에 따라, 면역접합체는 임의의 허용 가능한 방사성 동위원소로 표지(복합체화)될 수 있다.
추가의 구현예에 따르면, 방사성면역접합체는 상기 대상체에게 방사성면역접합체를 투여하고 생체내 SPECT 및 PET 이미징에 의해 방사성면역접합체를 검출하는 단계를 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 암 세포, 종양 미세 환경의 세포 또는 종양의 국소화를 결정하기 위해 사용된다.
추가의 구현예에 따르면, 방사성면역접합체는 상기 대상체에게 방사성면역접합체를 투여하고 생체내 PET 및 SPECT 이미징에 의해 방사성면역접합체를 검출하는 단계를 포함하여, 대상체에서 하나 이상의 암 세포, 종양 미세 환경의 세포, 장기 또는 조직을 이미징하는 데 사용된다.
추가의 구현예에 따르면, 방사성면역접합체는 상기 대상체에게 방사성면역접합체를 투여하고 생체내 PET 및 SPECT 이미징에 의해 방사성면역접합체를 검출하는 단계를 포함하여, 대상체에서 암 세포, 종양 미세 환경의 세포, 장기 또는 조직에 서 oxMIF의 결정 및 (상대적) 정량화에 사용된다.
일반적으로, 방사성면역접합체의 용량은 환자의 연령, 상태, 성별, 및 질환의 정도, 금기 사항, 존재하는 경우, 당업자에 의해 조정될 병용 요법 및 기타 변수와 같은 고려 사항에 따라 달라질 것이다. 용량은 치료적 투여의 경우 약 25mCi 내지 250mCi의 범위에서 가변적일 수 있고, 방사선 선량은 진단 목적의 경우, 0.5 내지 10mCi의 범위 내, 예를 들어, 약 1 내지 5mCi일 수 있다. 개별 용량은 당업자에 의해 결정될 수 있다.
환자에의 투여는 국소 또는 전신 투여일 수 있으며, 정맥내, 동맥내, 척수강내(척수액을 통해), 두개강내 등으로 달성될 수 있다. 투여는 또한 검사 중인 신체 부위에 따라 피내 또는 공동내 투여일 수 있다.
방사성면역접합체가 비정상 세포와 결합할 수 있는 충분한 시간, 예를 들어, 약 30분 내지 48시간 또는 72시간 또는 그 이상이 경과된 후, 조사 중인 대상체의 영역은 또한 통상적인 이미징 기술, 예를 들어, SPECT, 평면 섬광 이미징(planar scintillation imaging), PET 및 최신 이미징 기술에 의해 검사된다. 정확한 프로토콜은 반드시 상기 언급된 바와 같이 환자에 특이적인 요인, 및 조사 중인 신체 부위, 투여 방법 및 사용된 표지의 유형에 따라 달라질 것이며; 특정 절차의 결정은 당업자에게 일상적일 것이다. 종양 이미징의 경우, 바람직하게는 결합된 방사성면역접합체의 양(총 또는 특정 결합)이 측정되고, 화학요법 치료 후 종양에 결합된 방사성면역접합체의 양과 (비율로서) 비교된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방사성면역접합체는 원발성 종양 부위의 원위부에 있는 조직 및 유체(뿐만 아니라 원발성 종양의 조직 및 유체 및/또는 종양을 둘러싸는 조직 및 유체를 사용하는 방법)를 사용함으로써 진단 및 예후에 사용될 수 있다. 본 발명의 방사면역접합체는 당업자에게 공지된 고전적인 면역조직학적 방법을 사용하여 생물학적 샘플에서 oxMIF 수준을 검정하는 데 사용될 수 있다(참조: 예를 들어, Jalkanen et al. (1985) J. Cell. 101, 976-985; 및 Jalkanen et al. (1987) J. Cell. Biol. 105, 3087-3096).
또 다른 추가 구현예에서, 본 발명은 상기 기재된 면역검출 및 이미징 방법과 함께 사용하기 위한 면역검출 및 이미징 키트를 모두 포함하는 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 다음 항목을 포함한다:
1. 재조합 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 방사성면역접합체로서,
(a1) 아미노산 치환 M30L, F49Y, A51G, P80S, W93F 중 적어도 하나를 갖는 서열번호 32를 포함하는 경쇄 가변 도메인, 또는
(a2) - 36번 위치에 보존된 티로신, 및
- 아미노산 치환 M30L, F49Y, A51G, P80S, W93F 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 32를 포함하는 경쇄 가변 도메인; 및
(b1) 서열번호 29를 포함하는 중쇄 가변 도메인; 또는
(b2) 서열번호 29 및 아미노산 치환 L5Q 및/또는 W97Y를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 또는
(b3) 아미노산 치환 L5Q 또는 W97Y 중 적어도 하나, 및 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가 아미노산 치환을 갖는 서열번호 29를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고;
아미노산 위치가 카바트에 따라 넘버링되고,
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이, 아미노산 치환이 결여된 서열번호 32 및 서열번호 29를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 비교하여 감소된 응집 가능성 및 감소된 소수성을 갖는, 방사성면역접합체.
2. 항목 1에 있어서, 상기 경쇄 가변 도메인이 아미노산 치환 W93F를 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역이 아미노산 치환 W97Y를 포함하는, 방사성면역접합체.
3. 항목 1 또는 2에 있어서, 상기 방사성 동위원소가 11C, 13N, 15O, 18F, 32P, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 89Zr, 90Y, 99mTc, 103Pd, 105Rh, 109Pd, 111Ag, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 140La, 149Tb, 149Pm, 153Sm, 159Gd, 165Dy, 166Dy, 166Ho, 169Yb, 175Yb, 177Lu, 227Th, 186Re, 188Re, 192Ir, 193mPt, 195mPt, 198Au, 199Au, 211At, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 225Ac, 223Ra, 및 227Th로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 구체적으로 상기 방사성 동위원소가 67Ga, 89Zr, 111In, 124I, 131I, 177Lu, 및 225Ac로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방사성면역접합체.
4. 항목 1 또는 2에 있어서, 위치 L234, L235, G236, G237, N297, L328 또는 P329 중 어느 하나에 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함하는, 서열번호 37을 갖는 야생형 인간 IgG1 불변 도메인의 Fc 변이체 도메인을 포함하고, 상기 방사성면역접합체가 야생형 IgG1 Fc 영역을 포함하는 방사성면역접합체와 비교하여 Fcγ-수용체, 구체적으로 FcγRI, FcγRII, FcγRIII에 대한 감소된 결합을 나타내는, 방사성면역접합체.
5. 항목 1 내지 4 중 어느 한 항목에 있어서, 위치 I253, H310, H435 중 어느 하나에 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하는, 인간 IgG1 불변 도메인의 Fc 변이체 도메인을 포함하고, 상기 방사성면역접합체가 야생형 IgG1 Fc 영역을 포함하는 방사성면역접합체와 비교하여 인간 FcRn에 대한 감소된 친화성을 나타내는, 방사성면역접합체.
6. 항목 1 내지 5 중 어느 한 항목에 있어서, 서열번호 31, 33, 34, 35 및 36으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 방사성면역접합체.
7. 항목 1 내지 5 중 어느 한 항목에 있어서, 서열번호 37, 38, 39 및 40 중 어느 하나와 함께 서열번호 29 및 34, 서열번호 30 및 33, 서열번호 30 및 34, 서열번호 31 및 34, 서열번호 31 및 36 또는 서열번호 31 및 33을 포함하는, 방사성면역접합체.
8. 항목 1 내지 7 중 어느 한 항목에 있어서, IgG, IgG-융합 단백질, Fv, scFv, scFv 융합 단백질, 디아바디, 디아바디 융합 단백질, Fab, Fab-융합 단백질, scFab, scFab-융합 단백질, Fab' 및 F(ab')2, Fab'-SH, Fcab, Fcab 융합 단백질, 2개 이상의 단일 쇄 항체의 융합 단백질, 미니바디, 소형 면역 단백질(SIP) 포맷, 및 나노바디 및 나노바디 융합 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방사성면역접합체.
9. 항목 1 내지 8 중 어느 한 항목에 있어서, DOTA 및 데페록사민 B(DFO) 및 DFO*의 그룹으로부터 선택된, 킬레이팅 그룹을 추가로 포함하는, 방사성면역접합체.
10. 항목 1 내지 9 중 어느 한 항목에 있어서, 의약의 제조에 사용하기 위한, 방사성면역접합체.
11. 항목 1 내지 9 중 어느 한 항목의 방사성면역접합체를, 임의로 약제학적 담체 또는 보조제와 함께, 포함하는 약제학적 조성물.
12. 항목 11에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 정맥내 투여용으로 제형화되는, 약제학적 조성물.
13. 항목 11 또는 12에 있어서, 암으로 고통받는 환자의 치료, 구체적으로 종양, 구체적으로 혈액학적 또는 고형 종양의 치료, 보다 구체적으로 결장직장암, 난소암, 유방암, 전립선암, 췌장암 및 폐암의 치료에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
14. 항목 1 내지 8 중 어느 한 항목의 방사성면역접합체의 재조합 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산.
15. 항목 14의 핵산 분자(들)를 포함하는 발현 벡터.
16. 항목 12 또는 13의 핵산 또는 항목 13의 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포.
17. 항목 1 내지 9 중 어느 한 항목의 방사성면역접합체를 생산하기 위한 방법으로서, 숙주 세포에서 항-oxMIF 항체를 인코딩하는 핵산을 발현시키는 단계 및 상기 항체를 방사성 동위원소로 추가로 표지화하는 단계를 포함하는, 방법.
18. 대상체의 암에서 oxMIF 수준을 검출하기 위한, 항목 1 내지 9 중 어느 한 항목의 방사성면역접합체의 용도.
19. 대상체에서 암의 진단을 위한, 항목 1 내지 9 중 어느 한 항목의 방사성면역접합체의 용도.
20. 암을 시험관내 진단하기 위한 방법으로서, 항목 1 내지 9 중 어느 한 항목의 방사성면역접합체가 샘플에서 종양 세포를 검출하기 위해 사용되는, 방법.
21. 암을 생체내 진단(in vivo diagnosing)하기 위한 방법으로서, 항목 1 내지 9 중 어느 한 항목의 방사성면역접합체가 대상체에서 종양 세포를 검출하기 위해 사용되는, 방법.
22. 항목 1 내지 9 중 어느 한 항목의 방사성면역접합체의 생산을 위한 키트로서, 2개 이상의 바이알을 포함하고, 여기서 하나의 바이알이 항-oxMIF 항체에 연결된 킬레이터를 포함하는 접합체를 함유하고, 제2 바이알이, 구체적으로 177Lu 및 89Zr로부터 선택된, 방사성 동위원소를 함유하는, 키트.
23. 항목 21에 있어서, 상기 하나 또는 여러 바이알의 내용물이 동결건조되거나 용액 상태인, 키트.
24. 항목 1 내지 9 중 어느 한 항목의 방사성면역접합체, 또는 항목 11 또는 12의 약제학적 조성물을 사용하여 암을 치료하기 위한 방법.
실시예
본원에 기재된 실시예는 본 발명을 예시하는 것이며, 이에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 많은 변형 및 변경이 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 본원에 기재되고 예시된 기술에 이루어질 수 있다. 따라서, 실시예는 단지 예시적인 것이며 본 발명의 범위를 제한하지 않는다는 것을 이해해야 한다.
실시예 1
177 Lu -C0008 - 방사성면역접합체의 생성
재료 및 방법:
C0008은 HEPES 0.3M pH 9에서 1:20의 몰 비로 SCN-Bn-DOTA와 함께 배양하였다. 표지화 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 반응 후, 과량의 SCN-Bn-DOTA는 30kDa MWCO 아미콘 초원심분리 필터(Amicon Ultra centrifugal filter)(재생 셀룰로스, Millipore)를 사용하여 3000g으로 0.9% NaCl에서 다중 원심분리로 제거하였다. 접합체는 정제 종료시 화학적 순도를 평가하기 위해 SE-HPLC로 검사했다. SE-HPLC는 0.6mL/분의 유속으로 아르기닌을 함유하는 인산염 완충액으로 용출된 슈퍼덱스 200 10/300 GL 컬럼에서 수행되었다. 또한, DOTA-C0008의 순도 및 완전성은 환원 및 비환원 조건하(4-15% 선형 구배 폴리아크릴아미드 겔; Bio-Rad Laboratories)에 SDS-PAGE에 의해 평가하였다.
항체당 부착된 DOTA 분자의 수는 문헌(Meares et al., 1984)의 방법 및 순간 박층 크로마토그래피(Instant Thin-Layer Chromatography; ITLC)를 사용하여 결정하였다. 작은 분취량의 DOTA 접합 항체는 DOTA 접합 항체의 양과 비교하여 2배, 4배, 6배 및 8배 과량의 111/ 115In에서 추적량의 방사성 111In 및 안정한 인듐(115In)의 혼합물과 함께 배양했다(표지화 조건은 표 1에 제시되어 있다). 그런 다음, 불용성 수산화인듐의 형성과 항체에 대한 인듐의 비특이적 부착을 방지하기 위해 소비되지 않은 인듐을 과량의 EDTA로 복합체화하였다. 분석을 위해, 1μL의 방사성 용액을 ITLC 스트립에 놓고 pH 5에서 0.1M 시트레이트 완충액으로 용출시켰다. TLC 플레이트의 자가 방사선 촬영은 용적 적분에 따라 ImageQuant TL을 사용하여 인 스크린(Typhoon IP, Amersham)에 노출 후에 수득되었다. DOTA-C0008당 부착된 DOTA 분자의 수는 표지화 효율과 용액에 첨가된111 / 115In 이온에 대한 단백질의 몰 비로부터 추정되었다.
[표 1]
15mCi/mg(555MBq/mg)의 비활성(specific activity)에서 177Lu로 DOTA-C0008을 방사성 표지하기 위해, 0.04N HCl(ITG Germany) 중의 4500μCi(166.5MBq)의 177Lu 클로라이드 및 12μL의 암모늄 아세테이트 0.25M, pH 5.4를 300μg의 DOTA-C0008에 첨가했다. 반응 혼합물을 37℃에서 10분 동안 배양한 후 방사성 표지된 접합체를 1mM DTPA(최종 농도)와 함께 추가 5분 동안 배양하여 과량의 177Lu를 복합체화했다. 킬레이트화 효율은 DTPA 첨가 후 시트레이트 완충액 0.1M pH 5에서 ITLC 용출 및 용적 적분에 따라 ImageQuant TL을 사용하는 TLC 플레이트(Typhoon IP, Amersham)의 자가 방사선 촬영에 의해 평가했다.
결과: 항체 C0008을 SCN-Bn-DOTA와 함께 배양한 후 정제하면 SE-HPLC(도 1A) 및 SDS PAGE(도 1B)로 제시된 바와 같이, 높은 화학적 순도의 DOTA-C0008 접합체가 생성되었다. 생성되는 DOTA-C0008 접합체는 항체당 부착된 DOTA 분자의 수를 분석했으며, ITLC의 결과는 도 2에 제시된다. 항체당 평균 약 5.8개의 DOTA 분자가 선택된 조건하에 수득되었다. 그런 다음, DOTA-C0008 접합체는 루테튬-177로 성공적으로 표지되었고, 생성되는 방사성면역접합체는 ITLC(도 3A) 및 자가 방사선 촬영(도 3B)으로 결정된 바와 같이, 97.5%의 전체 방사화학적 순도와 함께 16mCi/mg(592MBq/mg)의 비활성을 나타냈다.
결론: 177Lu로 항-oxMIF 항체 C0008을 방사성 표지하기 위한 효율적인 방법이 정교화되었다. 생성되는 방사성면역접합체는 충분한 순도와 비활성을 나타냈다.
도 1은 DOTA-C0008의 순도 및 완전성 분석을 보여준다; A: DOTA-C0008 SE-HPLC 프로파일 (λ=280nm). B: 쿠마시 염색된 SDS PAGE: 1: 분자량 표준; 2: 환원되지 않은 C0008; 3: 환원된 C0008; 4: 환원되지 않은 농축 C0008(표지화 배치); 5: 환원된 농축 C0008(표지화 배치); 6: 환원되지 않은 DOTA-C0008; 7: 환원된 DOTA-C0008.
도 2는 ITLC로 결정된 -C0008에 그래프팅된 DOTA 분자 수의 결정을 보여준다: DOTA 접합 항체의 양에 비례하여 2(레인 6), 4(레인 7), 6(레인 8) 또는 8(레인 9)배 과량의 111/ 115In에서 추적량의 방사성 인듐(111In) 및 안정한 인듐(115In)의 혼합물과 함께 배양된 DOTA-C0008의 ITLC 분리.
도 3은 ITLC 및 자가 방사성 촬영에 의한 방사성 표지된 C0008의 분석을 보여준다: A: 방사성 표지된 C0008의 ITLC(레인 3: DOTA-C0008을 사용한 177Lu 표지화 반응; 레인 4: C0008을 사용한 177Lu 표지화 반응); B: ITLC 필름 레인 3의 자가 방사선 사진(DTPA 첨가 후 177Lu-DOTA-C0008; 피크 1은 유리 177Lu-DTPA를 반영하고, 피크 2는 177Lu-DOTA-C0008을 반영한다).
실시예 2
제형 완충액 중 177 Lu - DOTA -C0008의 안정성
재료 및 방법:
177Lu-DOTA-C0008 용액은 안정성 연구에 적합한 700μg/mL의 최종 농도를 달성하기 위해 제조하였다. 177Lu-DOTA-C0008 용액의 특성은 표 2에 제시되어 있다.
[표 2]
4℃에서 저장된 제형 완충액 중 177Lu-DOTA-C0008을 상이한 시점에 ITLC 및 SE-HPLC로 분석했다. 방사화학적 순도는 경시적으로 방사성면역접합체로부터 방사성 방출 백분율을 정량화하기 위해 시트레이트 0.1M pH 5를 갖는 ITLC 용출액으로 결정하였다. SE-HPLC는 응집 및 오염 물질(예: 177Lu-DTPA 또는 177Lu-DOTA)을 결정하기 위해 0.6mL/분의 유속으로 아르기닌을 함유하는 인산염 완충액으로 용출된 슈퍼덱스 200, 10/300 GL 컬럼 상에서 수행되었다. 크로마토그래피 프로파일은 Radiomatic 150TR 유동 섬광 분석기(flow scintillation analyser)를 사용하여 획득했다.
또한, 방사성면역접합체의 방사성은 감마 계수로 측정하여 제형 완충액에서177Lu-DOTA-C0008의 용해도에 대한 정보를 제공했다. 이 목적을 위해, 5μL를 제형 완충액에서 1/20 희석으로부터 직접 계수했다.
결과: 177Lu-DOTA-C0008 용액의 ITLC 분석은 경시적으로 방사성면역접합체로부터 방사성이 거의 방출되지 않는 것으로 나타났다. 7일 후, 방사성 표지된 항체의 용액은 최대 96.25%의 방사성 순도를 나타냈다. 방사성 표지된 항체는 제형 완충액에서 4℃로 유지했을 때 초기 결합 방사성의 약 1.2%(표 2)를 방출했다(표 3). 177Lu-DOTA-C0008은 21.6분에 용출되었고, 이의 오염 물질(177Lu-DTPA 및 177Lu-DOTA 유도체)은 32.8분에 용출되었다. 0일째부터 3일째까지 HMW 응집체가 약간 증가했지만 3일째 이후에는 추가의 응집체는 검출되지 않았다(표 5). 7일 후, 투여 용액은 SE-HPLC에 의해 93% 온전한 항체를 제시했다. SE-HPLC 결과는 ITLC 결과에 따랐다. 경시적으로 모니터링된 방사성은 루테튬-177의 이론적 방사성 붕괴(표 4의 괄호 안의 값)와 잘 일치했다.
결론: 177Lu-DOTA-C0008은 ITLC 및 SE-HPLC로 시험될 때 최대 7일까지 제형 완충액에서 안정적이었다.
[표 3]
[표 4]
[표 5]
실시예 3
마우스 혈장 내 177 Lu - DOTA -C0008의 안정성
재료 및 방법: 177Lu-DOTA-C0008의 혈장 안정성은 37℃에서 신선한 마우스 혈장(헤파린 리튬 튜브로 제조됨)을 사용하여 평가하였다. 혈장 내 177Lu-DOTA-C0008의 농도는 70μg/mL였다. 혈장 내 안정성은 0일, 1일, 2일, 3일 및 7일째에 ITLC(시트레이트 0.1M pH 5로 용출), 자가 방사선 촬영 및 SDS-PAGE에 의해 평가되었다.
결과: 37℃에서 마우스 혈장에서 7일 배양 후, 방사성 표지된 항체의 용액은 초기 결합 방사성의 약 20%의 상응하는 방출과 함께 약 80%의 방사성 순도를 나타냈다(표 6). 방출된 방사성은 ITLC 결과에 의해 입증된 바와 같이 177Lu-DOTA-C0008 유도체 및 유리 177Lu에 상응했다(도 4). SDS-PAGE 분석(도 5)은 혈장에서 배양될 때 방사성 표지된 항체의 유의한 분해를 나타내지 않았다. 또한, 다른 혈장 단백질에 대한 177Lu의 트랜스-킬레이트화는 관찰되지 않았다(도 5).
결론: 혈장 내 안정성 결과는 37℃에서 7일 후 방출된 약 20% 177Lu 활성으로 허용 가능했다. 안정성 연구 중에 관찰된 작은 소형 방사성 생성물은 177Lu-DOTA-C0008 유도체 및 유리 177Lu에 상응할 가능성이 높다. 이하 제시된 바와 같이, 새로 설계된 분자 C0083의 소수성의 감소는 177Lu-DOTA-C0008과 비교하여 생성되는 177Lu-DOTA-C0083 방사성면역접합체의 크게 향상된 혈장 안정성을 초래했다.
[표 6]
도 4는 177Lu-DOTA-C0008의 혈장 안정성을 보여준다(자가 방사선 촬영): 마우스 혈장에서 7일 동안 배양된 177Lu-DOTA-C0008의 자가 방사선 사진; 1: 177Lu-DOTA-C0008 유도체 및 유리 177Lu; 2: 177Lu-DOTA-C0008.
도 5는 177Lu-DOTA-C0008의 혈장 안정성을 보여준다(SDS-PAGE): 마우스 혈장에서 177Lu-DOTA-C0008을 사용한 감소된 SDS PAGE(왼쪽: 쿠마시 염색, 오른쪽: 자가 방사선 촬영). 레인 1 및 레인 10: 분자량 표준; 레인 2: DOTA-C0008; 레인 3: 완충액(T0) 중의 177Lu-DOTA-C0008; 레인 5: 177Lu-DOTA-C0008(혈장 내 T0 시간); 레인 6: 177Lu-DOTA-C0008(혈장 내 1일), 레인 7: 177Lu-DOTA-C0008(혈장 내 2일); 레인 8: 177Lu-DOTA-C0008(혈장 내 3일); 레인 9: 177Lu-DOTA-C0008(혈장 내 7일).
실시예 4
CT26 종양 보유 Balb /c 마우스에서 C0008의 생체 분포
재료 및 방법: C0008의 생체 분포는 동계 결장암 세포주 CT26의 피하 종양을 보유하는 암컷 Balb/c 마우스에서 조사하였다. 10마리의 암컷 Balb/c 마우스는 PBS(100μl/동물) 중 3x105 CT26 세포의 편측 피하 주사를 투여받았다. 개별 종양 용적 150 내지 300mm3에 도달시, 마우스는 5mg/kg의 IRDye 800CW 표지 C0008의 단일 정맥내 투여량을 투여받았다. 두 마리의 마우스는 처리되지 않은 '신호 없음(no signal)' 대조군으로 사용되었다.
C0008은 제조업자의 지침에 따라 LI-COR 바이오사이언시즈(Biosciences)의 IRDye 800CW 단백질 표지화 키트 - 높은 MW를 사용하여 IRDye 800CW로 표지화하였다. 표지화 공정 후 및 표지된 C0008의 마우스에의 주사 전에, IRDye 800CW 표지된 항체의 단백질 농도 및 표지화 효율은 나노드롭 기술(Nanodrop technology)을 사용하여 결정하고, 마우스는 표지화 후 단백질 농도에 기초하여 투여되었다. 생체내 이미징은 다음 시점에 표지된 C0008의 투여시 LI-COR Pearl® Trilogy 이미징 장치에서 수행되었다: 투여 후 1시간, 6 내지 8시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 168시간. 종양 내 항체의 상대적 형광 강도(RFU)를 정량화하기 위해 이미지 분석을 수행했다(RFU= RFU 종양 면적 - RFU 배경/mm2 * 종양 면적).
결과: 도 6A는 24시간에서 피크와 최대 7일까지 종양 유지를 갖는 정맥내 투여된 IRDye 800CW 표지 C0008의 유의한 종양 내 분포를 보여준다. 미처리된 대조군 마우스에서는 신호가 검출되지 않았다(도 6B).
결론: 생체 분포 연구는 방사성 의약품(radiopharmaceuticals)으로서 oxMIF 항체의 적합성(suitability)을 시사한다.
도 6은 피하 CT26 종양을 보유하는 암컷 Balb/c에서 IRDye 800CW 표지 C0008의 생체 분포를 보여준다: 피하 CT26 종양을 보유하는 마우스의 적외선 생체내 이미징. 마우스의 적외선 이미지는 A: IRDye 800CW 표지 C0008(5mg/kg)의 주사 후 1시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 168시간에 또는 B: 치료 없이 촬영되었고(눈금 막대는 A와 B에 적용됨); C: 디지털 이미지 분석으로 정량화된 C0008의 종양 침투 및 유지.
실시예 5:
[표 7]
새로 설계된 항- oxMIF 항체의 감소된 응집 성향 및 감소된 소수성.
재료 및 방법: 소수성 및 응집을 평가하기 위해, 새로 설계된 항체를 두 개의 상이한 SEC 컬럼 및 실행 완충액 조건을 사용하는 겔 여과(SEC) 및 소수성 상호 작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography; HIC)로 분석하고 항-oxMIF 항체 C0008과 비교했다.
SEC의 경우, 샘플을 0.02% Tween(5xPBST)을 포함한 5x 인산염 완충 식염수에서 0.1mg/ml로 희석하고, 50μl의 샘플을 0.75ml/분의 유속으로 슈퍼덱스 200 증가 10/300 GL(GE Healthcare) 겔 여과 컬럼에 적용했다. 분리 및 평형은 22℃에서 5xPBST로 수행되었다. 단백질 피크는 214nm에서 흡광도를 사용하여 모니터링하고, 스펙트럼은 유니콘 에뮬레이션 소프트웨어 패키지(Unicorn emulation software package)(GE Healthcare)를 사용하여 분석했다. 추가로, 샘플을 1x 인산염 완충 식염수(1xPBS)에서 0.2mg/ml로 희석하고, 100μl 샘플을 1ml/분의 유속으로 엔리치(Enrich) 650(Bio-Rad) 겔 여과 컬럼에 적용했다. 분리 및 평형은 22℃에서 1xPBS로 수행했다. 단백질 피크는 280nm에서 흡광도를 사용하여 모니터링하고, 스펙트럼은 크롬랩(ChromLab) 소프트웨어 패키지(Bio-Rad)를 사용하여 분석했다. 결과는 주요 피크에 대한 체류 용적(Vr, ml)으로 보고되며, 응집체의 존재 여부는 수동으로 순위가 매겨졌다.
HIC 분석의 경우, 모든 샘플은 50mM 인산염과 0.75M 황산암모늄, pH 6.9를 사용하여 최종 농도 0.2mg/ml로 희석했다. 고도로 정제된 항체 샘플을 1ml HiTrap 부틸 HP 컬럼에 독립적으로 로딩했다. 50μl의 샘플을 주입하고 컬럼 유속을 22℃에서 1ml/분으로 유지시켰다. 피크의 분리는 0-100%B(완충액 B: 50mM 인산염, 20% 이소프로판올; pH7.0)의 20-컬럼 용적(CV) 구배에서 수행되었다. 단백질 피크는 280nm에서 흡광도를 사용하여 모니터링하고, 스펙트럼은 유니콘 에뮬레이션 소프트웨어 패키지(GE healthcare)를 사용하여 분석했다. 결과는 각 피크에 대해 피크 최대값에서 Vr(ml)로 보고된다.
결과: 대조군 항체 C0008은 크기 배제 컬럼의 상 용적(약 24ml 수퍼덱스 200, 약 18ml 엔리치 650)에 가까운 체류 용적을 입증했으며, 이는 인간 IgG에 대해 예상된 것보다 훨씬 작은 분자량에 상응한다(도 7A 및 B). 비정상적으로 긴 체류 기간은 주로 고정상 표면과의 소수성 상호 작용에 기인하였다. 높은 체류 용적 이외에, 유의한 양의 IgG 이량체 및 응집체가 C0008에 대해 존재했다. 새로 설계된 모든 항체는 감소된 체류 용적(Vr)을 나타내어 컬럼과의 감소된 상호 작용 및 따라서 분자의 감소된 소수성을 입증하였다(표 8, 도 7A 및 B). C0083 및 C0090은 최저 체류 용적(표 8, 도 7B)을 나타냈고, Vr은 분자량 표준과 비교했을 때 단량체 인간 IgG의 분자량에 상응했다. 추가로, 항체 이량체 및 응집은 새로 설계된 항체 C0073, C0078, C0083 및 C0090의 샘플에서 현저히 감소되었다(도 7A 및 B). 특히, C0083과 C0090은 단일 단량체 피크만을 나타냈다.
HIC 컬럼 체류 용적을 사용하여, 항체는 최소에서 최대(최저 내지 최고 체류 용적) 소수성 IgG로 순위가 매겨졌고(도 7C, 표 9), 결과는 SEC 분석으로부터의 데이터를 확인하였다. 새로 설계된 항체 C0083(체류 용적 12.37)이 최소 소수성인 반면, 대조군 항체 C0008(체류 용적 14.92ml)은 최고 소수성을 나타냈다.
결론: SEC 및 HIC 분석으로부터, 최적화가 감소된 소수성 및 응집 성향을 갖는 개선된 항-oxMIF 항체를 초래하였음이 분명하다.
[표 8]
[표 9]
도 7은 새로 설계된 항-oxMIF 항체의 감소된 응집 및 소수성을 입증하는 크로마토그래피 프로파일을 보여준다. (A) 5xPBST를 이동상으로 사용하는 슈퍼덱스 200 증가 10/300 GL 겔 여과 컬럼에서 C0008(대조군 항체, 회색 영역)과 새로 설계된 항체의 용출 프로파일의 비교. (B) 1xPBS를 이동상으로 사용하는 엔리치 650 겔 여과 컬럼에서 C0008(대조군 항체, 회색 영역)과 새로 설계된 항체의 용출 프로파일의 비교. (C) HiTrap 부틸 HP HIC 컬럼에서 C0008(대조군 항체, 회색 영역)과 새로 설계된 항체의 용출 프로파일의 비교.
실시예 6:
고정된 MIF에 대한 새로 설계된 항- oxMIF 항체의 결합(K D 결정)
재료 및 방법: 1μg/ml로 PBS로 희석된 재조합 인간 MIF를 4℃에서 밤새 ELISA 플레이트에 고정시켰다(문헌(Thiele et al., 2015)에 따라 MIF를 oxMIF로 형질전환시킴). 차단 후, 항-oxMIF 항체의 연속 희석액을 플레이트에 첨가했다. 마지막으로, 결합된 항체는 단백질 L-HRP 접합체와 테트라메틸벤지딘(TMB)을 기질로서 사용하여 검출시켰다. 발색 반응은 3M H2SO4로 정지시키고, OD는 450nm에서 측정하였다. 상이한 실험의 데이터는 각 실험의 항-oxMIF 항체 C0008의 최대 OD(=100%)로 정규화하였고, EC50 값은 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)을 사용하는 4-파라미터 적합도에 의해 결정하였다(그리고 두 실험의 평균이 제시된다).
결과 및 결론: 고정된 MIF(oxMIF)에 대한 새로 설계된 항체의 결합은 광범위한 농도에 걸쳐 측정되었으며, 생성되는 결합 곡선은 도 8에 도시된다. 항-oxMIF 항체 C0008은 oxMIF 결합에 대한 참조로 사용되었다. 결합 곡선과 KD를 나타내는 계산된 EC50 값은 새로 설계된 항체 C0073, C0076, C0078, C0083 및 C0090이 C0008(EC50 0.7nM)과 비교하여 oxMIF에 대한 친화성(EC50 범위 0.5-1.6nM, 이는 검정변동성 이내임)를 유지했음을 명백하게 보여주었다(도 3A). C0077의 소수성은 현저하게 감소되었지만(도 7A), C0077은 C0076과 비교하여 VL의 점 돌연변이(Y36F)로 인해 oxMIF에 대한 친화성의 5배 감소를 나타냈다(도 8).
도 8은 고정된 MIF에 대한 새로 설계된 항-oxMIF 항체의 결합 곡선을 보여준다(KD 결정). C0008이 참조 항체로서 사용되었다.
[표 10]
실시예 7: 새로 설계된 항- oxMIF 항체의 oxMIF 대 redMIF에 대한 차등 결합.
재료 및 방법: 항-oxMIF 항체를 4℃에서 밤새 15nM의 농도로 마이크로플레이트에 고정시켰다. 차단 후, 웰을 50ng/ml의 redMIF 또는 oxMIF 대용물 NTB-MIF와 함께 배양했다(Schinagl et al., 2018). 포획된 oxMIF는 비오티닐화 폴리클로날 토끼 항-MIF 항체와 스트렙타비딘-HRP 접합체로 검출시켰다. 플레이트를 테트라메틸벤지딘(TMB)으로 염색하고, 발색 반응은 30% H2SO4를 첨가하여 정지시켰다. OD는 450nm에서 측정했다. 상이한 실험의 데이터는 각 실험의 항-oxMIF 항체 C0008의 최대 OD(=100%)로 정규화했으며, 2 내지 3개 실험의 평균이 제시된다.
결과 및 결론: 가용성 oxMIF 및 redMIF에 대한 새로 설계된 항체의 결합은 도 9에 도시된다. 결과는 새로 설계된 항체 C0073, C0076, C0078, C0083 및 C0090이 oxMIF에 대한 강한 결합을 입증하였지만 redMIF에는 결합하지 않았으며, 따라서 감소된 소수성 및 응집을 갖는 항체는 oxMIF와 redMIF를 구별하는 능력을 유지하였음을 명백하게 보여주었다. 새로 설계된 항체는 oxMIF와 redMIF를 구별하는 것으로 기재된 항체 C0008과 비교하여 유사한 OD를 나타냈다(Thiele et al., 2015)(도 9). C0077은 C0076와 비교하여 VL의 점 돌연변이(Y36F)로 인해 oxMIF에 대한 결합이 현저히 감소되었음을 보여주었다(도 9). C0077은 현저하게 감소된 소수성을 나타내지만(도 7A), 결합 특성을 유지하지 못했다.
도 9는 새로 설계된 항체의 oxMIF 대 redMIF에 대한 차등 결합을 보여준다. C0008이 참조 항체로서 사용되었다.
실시예 8:
새로 설계된 항체 C0083의 개선된 생산.
발현 수율을 비교하기 위해, 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0083 및 C0008을 ExpiCHO 세포(Thermo Fisher)에서 일시적인 발현에 의해 생성되었다. 간단히 말해, 50 내지 200ml의 기하급수적으로 성장하는 ExpiCHO 세포를 ExpiFectamine CHO 키트(Thermo Scientific)를 사용하여 일시적으로 형질감염시키고, 37℃에서 가습 배양기에서 제조업체의 지침 "표준 프로토콜"(Thermo Scientific)에 따라 8일 동안 간 배양했다. 세포를 원심분리로 제거하고, 상청액을 40mM 인산나트륨, 300mM 염화나트륨, pH 7.2를 사용하여 1:1로 희석했다. 희석된 상청액을 0.2μm 여과시키고, 실온에서 NGC QUEST 10 크로마토그래피 시스템(Bio-Rad)을 사용하여 Mab Select 프리즘 A 컬럼(Cytiva)에 적용했다. 컬럼을 20mM 인산나트륨, 150mM 염화나트륨, pH 7.2의 10개 컬럼 용적으로 세척하고, 항체를 100mM 글리신, pH 3.5의 10개 컬럼 용적으로 용출시켰다. 항체를 즉시 pH 5로 중화시키고, Bio-Scale P-6 탈염 카트리지에 의해 1xPBS pH 7.2로 제형화하고, 아미콘 울트라(Amicon Ultra)-15 원심분리 장치(Merck Millipore)를 사용하여 약 1mg/ml로 농축시켰다. 단백질 농도는 나노드롭 기술과 그들 각각의 소멸 계수(extinction coefficient)를 사용하여 결정하였다. Mab Select 프리즘 A 및 중화 후 정제된 항체의 양(각 항체의 최종 수율)은 세포 배양 용적으로 나누고, 생성되는 값은 본원에서 항체 역가(antibody titer)(mg/L)로서 지칭된다.
결과: C0008과 비교하여 C0083의 3개의 개별 생산은 새로 설계된 항체 C0083이 더 높은 수준에서 유의하게 생산되었음(비쌍화 t-테스트, p=0.03)을 명백하게 보여주었다(도 10).
결론: 유의하게 높은 항체 역가는 C0008와 비교하여 감소된 소수성 및 응집 성향과 관련하여 항체를 최적화한 후 수득되었다(117mg/L C0083 대 93mg/mL C0008).
도 10은 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0083 대 대조군 항체 C0008의 개선된 생산을 보여준다.
실시예 9:
CT26 종양 보유 Balb /c 마우스에서 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0083의 생체 분포
재료 및 방법: 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0083의 생체 분포는 동계 결장암 모델 CT26의 피하 종양을 보유하는 암컷 Balb/c 마우스에서 조사되었다. 암컷 Balb/c 마우스는 PBS(100μl/동물) 중의 3x105 CT26 세포의 편측 피하 주사를 투여받았다. 개별 종양 용적 150-300mm3에 도달시, 마우스를 치료 그룹에 배정하고 5mg/kg의 IRDye 800CW 표지 C0083의 단일 정맥내 투여량을 투여받았다.
C0083은 제조업체의 지침에 따라 LI-COR 바이오사이언스의 IRDye 800CW 단백질 표지화 키트 - 높은 MW를 사용하여 IRDye 800CW로 표지하였다. 표지화 공정 후 및 표지된 항체의 마우스로의 주사 전에, IRDye 800CW 표지된 항체의 단백질 농도와 표지화 효율은 나노드롭 기술을 사용하여 결정하였고, 마우스는 표지화 후 단백질 농도에 기초하여 투여되었다. 생체내 이미징은 다음 시점에 표지된 항체의 투여시 LI-COR Pearl® Trilogy 이미징 장치에서 수행되었다: 투여 후 1시간, 6 내지 8시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 168시간. 이미지 분석은 종양 내 항체의 상대적 형광 강도(RFU)를 정량화하기 위해 수행되었다(RFU= RFU 종양 면적 - RFU 배경/mm2 *종양 면적).
결과: 24시간에서 피크 및 7일 이상의 종양 유지를 갖는 정맥내 투여된 IRDye 800CW 표지 C0083(도 11A-B)의 유의한 종양 내 분포가 결정되었다.
결론: 결과는 C0083이 C0008과 비교하여 개선된 종양 침투 및 유지 특성을 갖는다는 것을 명백하게 입증한다(도 6A/도 11C). 추가로, 생체 분포 연구는 방사성면역접합체로서 적용하기 위한 C0083의 적합성을 시사한다.
도 11은 피하 CT26 종양을 보유한 마우스의 적외선 생체내 이미징에 의해 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0083 대 C0008의 종양 침투를 보여준다. A: 마우스의 적외선 이미지는 5mg/kg으로 투여된 IRDye 800CW 표지 C0083을 주사한 후 1시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 168시간에 촬영되었고; B: 디지털 이미지 분석에 의해 정량화된 C0083의 종양 침투 및 유지. C: 디지털 이미지 분석에 의해 정량화된 IRDye 800CW 표지된 C0083 대 C0008의 종양 침투 및 유지의 비교
실시예 10
새로 설계된 C0083의 177 Lu - 방사성면역접합체의 생성
재료 및 방법:
C0083은 HEPES 0.06M pH 9에서 1:10의 몰 비로 SCN-Bn-DOTA와 함께 배양하였다. 표지화 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 반응 후, 과량의 SCN-Bn-DOTA는 30kDa MWCO 아미콘 초원심분리 필터(재생 셀룰로스, Millipore)를 사용하여 3000g으로 0.9% NaCl에서 여러 번 원심분리로 제거했다. 정제 종료시 화학적 순도를 평가하기 위해 접합체를 SE-HPLC로 검사했다. SE-HPLC는 아르기닌을 함유하는 인산염 완충액으로 용출된 슈퍼덱스 200 10/300 GL 컬럼에서 0.6mL/분의 유속으로 수행되었다. 또한, DOTA-C0083의 순도 및 완전성은 환원 및 비환원 조건하(4-15% 선형 구배 폴리아크릴아미드 겔; Bio-Rad Laboratories)에 SDS-PAGE에 의해 평가하였다.
항체당 부착된 DOTA 분자의 수는 문헌(Meares et al. (1984))의 방법 및 순간 박층 크로마토그래피(ITLC)를 사용하여 결정하였다. 작은 분취량의 DOTA 접합 항체를 DOTA 항체의 양과 비교하여 2, 4, 6 및 8배 과량의 175/ 177Lu에서 추적량의 방사성 177Lu와 안정한 루테튬(175Lu)의 혼합물과 함께 배양했다(표 11). 그런 다음, 불용성 수산화루테튬의 형성과 항체에 대한 루테튬의 비특이적 부착을 방지하기 위해 미소비된 루테튬을 과량의 EDTA로 복합체화했다. 분석을 위해, 1μL의 방사성 용액을 ITLC 스트립에 놓고, pH 5에서 0.1M 시트레이트 완충액으로 용출시켰다. TLC 플레이트의 자가 방사선 촬영은 용적 적분에 따라 ImageQuant TL을 사용하여 인 스크린(Typhoon IP, Amersham)에 노출 후 수득되었다. DOTA-C0083당 부착된 DOTA 분자의 수는 표지화 효율과 용액에 첨가된 단백질 대 175/ 177Lu 이온의 몰 비로부터 추정되었다.
[표 11]
275MBq/mg의 비활성에서 177Lu로 DOTA-C0083을 방사성 표지하기 위해, 0.04N HCl(ITG Germany) 중의 81.4MBq의 177Lu 클로라이드 및 20μL의 암모늄 아세테이트 0.25M, pH 5.4를 300μg의 DOTA-C0083에 첨가했다. 반응 혼합물을 37℃에서 10분 동안 배양한 후 방사성 표지된 접합체를 1mM DTPA(최종 농도)와 함께 추가 5분 동안 배양하여 과량의 177Lu를 복합체화했다. 킬레이트화 효율은 DTPA 첨가 후 시트레이트 완충액 0.1M pH 5에서 ITLC 용출 및 용적 적분에 따라 ImageQuant TL을 사용하는 TLC 플레이트(Typhoon IP, Amersham)의 자가 방사선 촬영에 의해 평가했다.
결과: C0083과 SCN-Bn-DOTA의 배양 및 후속적 정제는 SE-HPLC(도 12A) 및 SDS PAGE(도 12B)로 제시된 바와 같이, 약 97%의 높은 화학적 순도의 DOTA-C0083 접합체를 산출하였다. 생성되는 DOTA-C0083 접합체는 항체당 부착된 DOTA 분자의 수를 분석했으며, ITLC의 결과는 도 13에 제시된다. 항체당 평균 약 1개의 DOTA 분자가 선택된 조건하에 수득되었다. 그런 다음, DOTA-C0083 접합체는 루테튬-177로 성공적으로 표지되었고, 생성되는 방사성면역접합체는 ITLC 자가 방사성 촬영(도 14)으로 결정된 바와 같이, 97.8%의 전체 방사화학적 순도와 함께 7.5mCi/mg(277MBq/mg)의 비활성을 나타냈다.
결론: 177Lu로 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0083을 방사성 표지하기 위한 효율적인 방법이 확립되었다. 생성되는 방사성면역접합체는 C0008에 필적하는 우수한 순도와 비활성을 나타냈다. 추가로, 네이키드(naked) 항체(C0083)와 마찬가지로 DOTA-C0083 접합체는 SEC 분석에 의해 결정된 C0008와 비교하여 감소된 소수성을 나타냈다(도 12A, 체류 시간 19.1분 대 도 1A 체류 시간 20.8분).
도 12는 DOTA-C0083의 순도 및 완전성 분석을 보여준다; A: DOTA-C0083 SE-HPLC 프로파일(λ=280nm). B: 쿠마시 염색된 SDS PAGE: 1: 분자량 표준; 2: 환원되지 않은 C0083; 3: 환원된 C0083; 5: 환원되지 않은 DOTA-C0083; 6: 환원된 DOTA-C0083.
도 13은 ITLC로 결정된 C0083에 그래프팅된 DOTA 분자 수의 결정을 보여준다: DOTA-항체의 양에 비례하여 2(레인 1), 4(레인 2), 6(레인 3) 또는 8(레인 4)배 과량의 177/ 175Lu에서 추적량의 방사성 177Lu 및 안정한 루테튬(175Lu)의 혼합물과 함께 배양된 C0083-DOTA의 ITLC 분리.
도 14는 ITLC 및 자가 방사성 촬영에 의한 방사성 표지된 177Lu-DOTA-C0083의 분석을 보여준다: A: ITLC 필름의 자가 방사선 사진(DTPA 첨가 후 177Lu-DOTA-C0083; 피크 1/2는 유리 177Lu-DTPA 및 177Lu-DOTA-C0083을 반영하고, 피크 3은 177Lu-DOTA-C0083을 반영한다).
실시예 11
제형 완충액 중 177 Lu - DOTA -C0083의 안정성
재료 및 방법:
177Lu-DOTA-C0083 용액은 안정성 연구에 적합한 200μg/mL의 최종 농도를 달성하기 위해 제조하였다. 177Lu-DOTA-C0083 용액의 특성은 표 12에 제시되어 있다.
[표 12]
4℃에서 저장된 제형 완충액 중 177Lu-DOTA-C0083을 상이한 시점에 ITLC 및 SE-HPLC로 분석했다. 방사화학적 순도는 경시적으로 방사성면역접합체로부터 방사성 방출 백분율을 정량화하기 위해 시트레이트 0.1M pH 5를 갖는 ITLC 용출액으로 결정하였다. SE-HPLC는 응집 및 오염 물질(예: 177Lu-DTPA 또는 177Lu-DOTA)을 결정하기 위해 0.6mL/분의 유속으로 아르기닌을 함유하는 인산염 완충액으로 용출된 슈퍼덱스 200, 10/300 GL 컬럼 상에서 수행되었다. 크로마토그래피 프로파일은 Radiomatic 150TR 유동 섬광 분석기를 사용하여 획득했다.
또한, 방사성면역접합체의 방사성은 감마 계수로 측정하여 제형 완충액에서177Lu-DOTA-C0083의 용해도에 대한 정보를 제공했다. 이 목적을 위해, 5μL를 제형 완충액에서 1/20 희석으로부터 직접 계수했다.
결과: 177Lu-DOTA-C0083의 ITLC 분석은 경시적으로 방사성면역접합체로부터 방사성이 거의 방출되지 않는 것으로 나타났다. 7일 후, 방사성 표지된 항체의 용액은 94%의 방사성 순도를 나타냈다. 방사성 표지된 항체는 제형 완충액에서 4℃로 유지했을 때 초기 결합 방사성의 약 4%(표 13)를 방출했다(표 13). 177Lu-DOTA-C0083은 19.1분에 용출되었고, 이의 오염 물질(177Lu-DTPA 및 177Lu-DOTA 유도체)은 28.6분에 용출되었다. 0일째부터 7일째까지 LMW 종이 약간 증가했지만 응집체의 증가는 검출되지 않았다(표 15). 7일 후, 투여 용액은 SE-HPLC에 의해 93% 온전한 항체를 제시했다. 따라서, SE-HPLC 결과는 ITLC 결과에 따랐다. 경시적으로 모니터링된 방사성은 루테튬-177의 이론적 방사성 붕괴(표 14의 괄호 안의 값)와 잘 일치했다.
결론: 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0083의 177Lu-DOTA-접합체는 ITLC 및 SE-HPLC로 시험될 때 최대 7일까지 제형 완충액에서 안정적이었다.
[표 13]
[표 14]
[표 15]
실시예 12
마우스 혈장 내 177 Lu -C0083의 안정성
재료 및 방법: 177Lu-DOTA-C0083의 혈장 안정성은 37℃에서 신선한 마우스 혈장(헤파린 리튬 튜브로 제조됨)을 사용하여 평가되었다. 혈장 내 177Lu-DOTA-C0083의 농도는 20μg/mL였다. 혈장 내 안정성은 0일, 1일, 3일 및 7일째에 ITLC(시트레이트 0.1M pH 5로 용출), 자가 방사선 촬영 및 SDS-PAGE에 의해 평가되었다.
결과: 37℃에서 마우스 혈장에서 7일 배양 후, 방사성 표지된 항체의 용액은 초기 결합 방사성의 단지 1%의 상응하는 방출과 함께 약 96%의 방사성 순도를 나타냈다(표 16). 방출된 방사성은 ITLC 결과에 의해 입증된 바와 같이 177Lu-DOTA-C0083 유도체 및 유리 177Lu에 상응했다(도 15). SDS-PAGE 분석은 혈장에서 배양될 때 방사성 표지된 항체의 유의한 분해를 나타내지 않았다(도 16). 또한, 다른 혈장 단백질에 대한 177Lu의 트랜스-킬레이트화는 관찰되지 않았다(도 16).
결론: 혈장 내 177Lu-DOTA-C0083의 안정성은 단지 1% 177Lu 활성이 방출되고 37℃에서 7일 후 분해 생성물이 존재하지 않아 우수했다. 새로 설계된 분자 C0083의 소수성의 감소는 또한 177Lu-DOTA-C0008과 비교하여 생성되는 177Lu-DOTA-C0083 방사성면역접합체의 크기 향상된 혈장 안정성을 초래했다(각각 177Lu-DOTA-C0083 및 177Lu-DOTA-C0008(실시예 3)에 대해 7일 후 초기 결합 방사성의 1% 대 20% 방출).
[표 16]
도 15는 177Lu-DOTA-C0083의 혈장 안정성을 보여준다(자가 방사선 촬영): 마우스 혈장에서 7일 동안 배양된 177Lu-DOTA-C0083의 자가 방사선 사진; 1: 177Lu-DOTA-C0083 유도체 및 유리 177Lu; 2: 177Lu-DOTA-C0083.
도 16은 177Lu-DOTA-C0083의 혈장 안정성을 보여준다(SDS-PAGE): 마우스 혈장에서 177Lu-DOTA-C0083을 사용한 감소된 SDS PAGE(왼쪽: 쿠마시 염색, 오른쪽: 자가 방사선 촬영). 레인 1: 분자량 표준; 레인 2: 완충액(T0) 중 177Lu-DOTA-C0083; 레인 3: 177Lu-DOTA-C0083(혈장 내 T0 시간); 레인 4: 177Lu-DOTA-C0083(혈장 내 1일), 레인 5: 177Lu-DOTA-C0083(혈장 내 3일); 레인 6: 177Lu-DOTA-C0083(혈장 내 7일).
실시예 13: Fc 침묵을 갖는는 새로 설계된 항- oxMIF 항체의 감소된 응집 성향 및 감소된 소수성.
소수성 및 응집을 평가하기 위해, 새로 설계된 Fc 침묵 항체 C0115 및 C0118을 SEC 컬럼을 사용한 겔 여과(SEC) 및 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 대조군 항-oxMIF 항체 C0008 및 Fc 침묵이 없는 그들 모 항체 C0083 및 C0090과 비교하여 분석했다.
SEC의 경우, 샘플을 1x 인산염 완충 식염수(1xPBS)에서 1mg/ml로 희석하고, 100μl 샘플을 1.25ml/분의 유속으로 엔리치 650(Bio-Rad) 겔-여과 컬럼에 적용했다. 분리 및 평형은 실온에서 1x PBS로 수행했다. 단백질 피크는 280nm에서 흡광도를 사용하여 모니터링하였고, 스펙트럼은 크롬랩 소프트웨어 패키지(Bio-Rad)를 사용하여 분석하였다. 결과는 주 피크에 대한 체류 용적(Vr, ml)으로 보고되었고, 응집체의 존재는 수동으로 순위가 매겨졌다.
소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC) 분석의 경우, 모든 샘플을 50mM 인산염과 0.75M 황산암모늄, pH 6.9를 사용하여 최종 농도 1mg/ml로 희석시켰다. 고도로 정제된 항체 샘플(약 100μg)을 1ml HiTrap 부틸 HP 컬럼에 독립적으로 로딩했다. 100μl 샘플을 주입하고 컬럼 유속을 22℃에서 1ml/분으로 유지시켰다. 피크의 분리는 0-100%B(완충액 B: 50mM 인산염, 20% 이소프로판올; pH 7.0)의 20-컬럼 용적(CV) 구배에 걸쳐 수행하였다. 단백질 피크는 280nm에서 흡광도를 사용하여 모니터링하였고, 스펙트럼은 크롬랩 소프트웨어 패키지(Bio-Rad)를 사용하여 분석했다.
결과: 대조군 항체 C0008은 크기 배제 컬럼의 공극 용적(약 15ml 엔리치 650)에 가까운 체류 용적을 입증하였고, 이는 인간 IgG에 대해 예상되는 것보다 훨씬 더 작은 분자량에 상응한다(도 18A). 비정상적으로 긴 체류 기간은 주로 고정상 표면과의 소수성 상호 작용에 기인하였다. 또한, 높은 체류 용적에 대해, 상당량의 IgG 이량체 및 응집체가 C0008에 대해 존재했다. 새로 설계된 항체 C0115 및 C0118은 분자량 표준과 비교했을 때 단량체 인간 IgG의 분자량에 상응하는 체류 용적을 나타냈다(표 17, 도 18A). 추가로, 항체 이량체 및 응집은 새로 설계된 항체 C0115 및 C0118의 샘플에서 현저히 감소되었다(도 18A). 새로 설계된 신규 항체 C0115 및 C0118의 Fc 침묵 돌연변이는 각각 wt Fc를 갖는 그들의 모 항체 C0083 및 C0090과 비교하여 그들의 SEC 프로파일을 변경하지 않았다(도 18A, 및 실시예 6의 도 7B).
HIC 컬럼 체류 용적은 소수성의 척도이며, 여기서 낮은 체류 용적을 갖는 항체가 높은 체류 용적을 갖는 항체보다 덜 소수성이다(도 18B). 새로 설계된 Fc 침묵 항체 C0115 및 C0118은 매우 높은 소수성을 나타내는 대조군 항체 C0008(체류 용적 약 21ml)과 비교하여 덜 소수성인 것으로 입증되었다(체류 용적 15 내지 16ml). 새로 설계된 신규 항체 C0115 및 C0118의 Fc 침묵 돌연변이는 각각 wt Fc를 갖는 그들의 모 항체 C0083 및 C0090과 비교하여 그들의 HIC 프로파일을 변경하지 않았다.
결론: SEC 및 HIC 분석으로부터, 새로 설계된 Fc-침묵 항체가 대조군 항-oxMIF 항체 C0008과 비교하여 개선된 생화학적 특성, 특히 감소된 소수성 및 응집 성향을 갖는다는 것이 분명하다.
[표 17]
도 18은 새로 설계된 Fc 침묵 항-oxMIF 항체의 감소된 응집 및 소수성을 입증하는 크로마토그래피 프로파일을 보여준다. (A) 1xPBS를 이동상으로 사용하는 엔리치 650 겔 여과 컬럼에서 C0008(대조군 항체, 회색 영역)과 새로 설계된 Fc 침묵 항체 C0115 및 C0118의 용출 프로파일의 비교 (B) HiTrap 부틸 HP HIC 컬럼에서 C0008(대조군 항체, 회색 영역)과 새로 설계된 Fc 침묵 항체 C0115 및 C0118 및 그들의 모 항체 C0083 및 C0090(Fc 침묵 없음)의 용출 프로파일의 비교.
실시예 14: DFO * 에 대한 접합이 있거나 없는 새로 설계된 Fc 침묵 항- oxMIF 항체 C0115 및 C0118의 고정된 MIF에의 결합(K D 결정)
1μg/ml로 PBS에서 희석된 재조합 인간 MIF를 4℃에서 밤새 ELISA 플레이트에 고정시켰다(문헌(Thiele et al., 2015)에 따라 MIF를 oxMIF로 형질전환시킴). 차단 후, DFO* 접합(DFO* 접합은 실시예 19에 기재되어 있다)이 있거나 없는 항-oxMIF 항체의 연속 희석액을 플레이트에 첨가했다. 마지막으로, 결합된 항체는 염소 항-인간 IgG (Fc)-HRP 접합체와 테트라메틸벤지딘(TMB)을 기질로서 사용하여 검출시켰다. 발색 반응은 3M H2SO4로 정지시키고, OD는 450nm에서 측정했다. 상이한 실험의 데이터가 결합된 경우, 데이터는 각 실험의 항-oxMIF 항체 C0008의 최대 OD(=100%)로 정규화하였고, EC50 값은 그래프패드 프리즘을 사용하여 4-파라미터 적합도에 의해 결정하였다(그리고 두 실험의 평균 +/- SEM이 제시된다).
결과 및 결론: 고정된 MIF(oxMIF)에 대한 새로 설계된 항체의 결합은 광범위한 농도에 걸쳐 측정되었으며, 생성되는 결합 곡선은 도 19에 도시되어 있다. 항-oxMIF 항체 C0008은 oxMIF 결합에 대한 참조로서 사용되었다. 겉보기 KD를 나타내는 결합 곡선과 계산된 EC50 값은 새로 설계된 Fc 침묵 항체 C0115 및 C0118이 C0008과 비교하여 oxMIF에 대한 그들의 낮은 나노몰 친화성을 유지하였음을 명백하게 보여주었다(도 19A, 표 18). 추가로, 새로 설계된 Fc-침묵 항체 C0115 및 C0118의 DFO* 접합은 그들의 친화성을 변경하지 않았다(도 19B). 이는 비접합 항체뿐만 아니라, 즉 IRDye 800CW 표지 항체로 수득된 데이터가 DFO*-Zr89 표지 항체와 같은 방사성면역접합체로 직접 번역될 수 있음을 시사한다.
도 19는 고정된 oxMIF에 대한 새로 설계된 Fc 침묵 항-oxMIF 항체의 결합 곡선(KD 결정)을 보여준다. 항-oxMIF 항체는 항-인간-IgG (Fc)-HRP 접합체에 의해 검출되었으며, C0008이 참조 항체로서 사용되었다.
[표 18]
실시예 15: 새로 설계된 Fc 침묵 항- oxMIF 항체 C0115 및 C0118의 oxMIF 대 redMIF에 대한 차등 결합.
재료 및 방법: oxMIF 대 redMIF에 대한 C0115 및 C0118의 결합은 실시예 8에 기재된 바와 같이 분석했다.
결과 및 결론: 가용성 oxMIF 및 redMIF에 대한 새로 설계된 Fc 침묵 항체 C0115 및 C0118의 결합은 도 20에 도시되어 있다. 결과는 새로 설계된 Fc 침묵 항체 C0115와 C0118이 oxMIF에 대한 강한 결합을 입증하였지만 redMIF에는 결합하지 않음을 명백하게 보여주었다. C0115 및 C0118은 참조 항체 C0008에 매우 필적하는 OD를 나타냈으며, 이는 oxMIF와 redMIF를 구별하는 것으로 기재되었다(Thiele et al., 2015). 동형 IgG에 대한 결합은 관찰되지 않았다. 따라서, 감소된 소수성 및 응집과 Fc 침묵을 갖는 새로 설계된 항체는 oxMIF와 redMIF를 구별하는 능력을 유지하였다.
도 20은 oxMIF 대 redMIF에 대한 새로 설계된 Fc 침묵 항체의 차등 결합을 보여준다. C0008이 참조 항체로서 사용되고, 동형 IgG가 음성 대조군으로 사용되었다.
실시예 16: 새로 설계된 Fc 침묵 항- oxMIF 항체 C0115 및 C0118의 A2780 MIF -/- 세포에 대한 감소된 비특이적 결합.
A2780 MIF-/- 세포주는 A2780 난소 암종 세포주에서 인간 MIF 유전자의 CRISPR/Cas9 유전자 편집에 의해 생성되었다. 간단히 말해서, GenCRISPRTM 시스템을 위한 표적 가이드 RNA(gRNA) 설계의 일반적인 규칙에 따라 표적 유전자 서열을 분석하고 표적 부위를 위치시켰다. 가이드 RNA(gRNA)는 MIF 유전자의 5' 영역(TTGGTGTTTACGATGAACATCGG, 서열번호 48)을 특이적으로 인식하도록 설계되었고, gRNA 서열은 에스. 피요게네스(S. pyogenes) Cas9(SpCas9) 뉴클레아제를 함유하는 PX459(addgene) 벡터로 클로닝되었다. A2780 세포는 전기천공에 의해 일시적으로 형질감염시키고, 제한 희석에 의해 96웰 플레이트에 플레이팅하여 동종 단일 클론을 생성하였다. 내인성 MIF 유전자가 효율적으로 돌연변이되어 MIF 단백질 발현의 결과적 감소(또는 제거)를 초래하는 동종 단일 클론이 생거 서열분석 스크리닝(Sanger sequencing screening)에 의해 식별되었다. 최종 클론은 인간 MIF 유전자의 시작 코돈 뒤 +2 위치에서 10bp의 결실을 나타냈다. A2780 MIF-/- 세포주에서 내인성 인간 MIF 단백질의 부재는 폴리클로날 항-인간 MIF 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅(Western blotting)을 통해 확인되었다.
A2780 MIF-/- 세포를 셀 스트리퍼(Cell Stripper)(Corning, Cat# 25-056-Cl)로 분리하고, 염색 완충액(PBS +5% BSA)으로 세척한 후 웰당 2x105 세포로 96웰 U-바닥 플레이트에 플레이팅했다. 세포를 4℃에서 20분 동안 고정 가능한 생존력 염료 eFluor780(Invitrogen, PBS에서 1:2000으로 희석됨)으로 염색하고 염색 완충액으로 세척했다. 세포를 50μl의 염색 완충액에 재현탁시키고, 새로 설계된 항-oxMIF Fc 침묵 항체 C0115 및 C0118 또는 각각 그들의 모 항체 C0083 및 C0090 또는 대조군 항-oxMIF 항체 C0008 또는 동형 IgG(최종 농도 37nM 내지 9.4nM)의 50μl의 연속 희석액을 첨가했다. 4℃에서 40분 동안 배양한 후, 세포를 염색 완충액으로 세척하고, 100μl의 2차 항체(염소 항-인간 IgG (H+L)-AlexaFluor 488, 1:100으로 희석됨)에 재현탁시켰다. 4℃에서 30분 동안 배양한 후, 세포를 염색 완충액으로 세척하고 PBS+2% BSA에 재현탁시키고, Cytoflex-S 유세포 분석기(Beckman Coulter)에서 획득하였다.
데이터는 FlowJo로 분석하고, 생존 세포의 GeoMean(AF488에 대한 평균 형광 강도)은 그래프패드 프리즘으로 항체 농도에 대해 플롯팅하였다.
결과 및 결론: 도 21A 및 B로부터, 새로 설계된 Fc 침묵 항-oxMIF 항체 C0118과 이의 모 항체 C0090(A)뿐만 아니라 C0118과 이의 모 항체 C0083(B)은 Geo 평균이 동형 IgG 음성 대조군의 것과 매우 가깝기 때문에 A2780 MIF-/- 세포에 결합하지 않는 것이 명백하다. 대조적으로, 항-oxMIF 항체 C0008은 MIF를 발현하지 않는 것으로 입증되었지만, A2780 MIF-/- 세포에 대한 유의한 결합을 나타냈다. 따라서, 소수성의 감소는 A2780 MIF-/-에 대한 새로 설계된 항-oxMIF 항체의 비특이적 결합의 강력한 감소 또는 제거를 초래한 반면, 항-oxMIF 대조군 항체 C0008은 이의 소수성 특성으로 인해 세포 표면에 비특이적으로 결합한다.
도 21은 FACS로 결정된 A2780 MIF-/- 세포에 대한 새로 설계된 항-oxMIF 항체의 감소된 비특이적 결합을 보여준다. 새로 설계된 Fc 침묵 항-oxMIF 항체 C0118과 이의 모 항체 C0090(A) 및 C0115 및 이의 모 항체 C0083(B) 및 대조군 항체 C0008뿐만 아니라 음성 대조군으로서의 동형 IgG를 사용한 A2780 MIF-/- 세포의 염색; 생존 세포의 GeoMean(AF488에 대한 평균 형광 강도)을 항체 농도에 대해 플롯팅한다.
실시예 17: 리포터 검정에 의해 결정된 새로 설계된 Fc 침묵 항- oxMIF 항체 C0115 및 C0118의 강력하게 감소된 ADCC 이펙터 기능.
상기 기재된 바와 같이, Fc 부분, 즉 L234A/L235A의 점 돌연변이에 의해 항체의 ADCC 가능성을 감소시키려는 노력이 이루어질 수 있다. 표적 결합 항체의 Fc 부분이 이펙터 세포의 세포 표면 상의 Fc 수용체에 결합할 때, 두 세포 유형의 다중 가교결합이 발생하여 ADCC의 경로 활성화를 유도하고, 이는 기능적 Fc 관련 부작용을 방지하기 위한 표적 중화 항체에 바람직하지 않다.
인간 FcγRIIIA 수용체, V158(고친화성 알로형(allotype)) 및 반딧불이 루시퍼라제(firefly luciferase)의 발현을 구동하는 NFAT 반응 요소를 안정적으로 발현하는 조작된 주르캇 세포를 이펙터 세포로서 사용하여, 항체 생물학적 ADCC 활성은 NFAT 경로 활성화의 결과로 생성된 루시퍼라제를 통해 정량화된다.
ADCC 리포터 검정은 본질적으로 제조업체(Promega #G7010)에 의해 권장된 바와 같이 수행하였다.
고반응성 표적 세포를 생성하기 위해, HCT116 세포를 huMIF-pDisplay 플라스미드(Invitrogen)로 형질감염시키고, 제네티신으로 선택하고, FACS로 분류하여 막 고정 단량체 인간 MIF(HCT116-pMIF)를 안정적으로 발현하는 세포주를 생성하고, 즉 MIF는 oxMIF 에피토프가 항-oxMIF 항체에 접근할 수 있는 단량체 단백질로서 표시된다(Schinagl et al., 2018). 이 세포주는 세포 표면에서 oxMIF의 증가된 제시를 나타내고, 따라서 시험관내 분석을 위한 더 민감한 도구이다.
간단히 말해서, 100μl 검정 배지(Pen/Strept/L-글루타민 및 4% 저 IgG FBS가 보충된 RPMI 1640 배지) 중 1x104 세포/웰의 HCT116-pMIF 표적 세포를 96웰 평저 백색 플레이트에 시딩하고 가습 인큐베이터에서 37℃/5% CO2에서 밤새 부착되도록 정치시켰다. 다음 날, 배지를 25μl의 신선한 검정 배지로 교체했다. 침묵 Fc를 갖는 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0115 및 C0118 또는 그들의 모 항체 C0083, C0090(최종 농도 0.01-100nM)의 연속 희석액 25μl와 이펙터 대 표적 세포 비율 약 6:1의 새로 해동된 이펙터 세포(고반응자 유전자형 V158의 FcγRIIIA 수용체 이펙터 세포) 25μl를 플레이트에 첨가했다. 가습 인큐베이터에서 37℃/5% CO2에서 6시간 동안 배양 후, 검정 플레이트를 실온으로 평형화하고 Bio-Glo 루시퍼라제 시약을 첨가했다. 발광(RLU)은 테칸 멀티플레이트 판독기(Tecan multiplate reader)(0.5초 통합 시간)를 사용하여 10 내지 20분 배양 후 측정하였다.
결과: 도 22로부터, Fc 침묵 돌연변이를 보유한 새로 설계된 항체 C0115 및 C0118은 ADCC 리포터 검정에서 이펙터 세포의 임의의 활성화를 나타내지 않은 반면, wt Fc를 갖는 그들의 모 항체, C0083 및 C0090은 이펙터 세포의 강력한 FcyRIIIA 매개 활성화를 유도하였음이 명백하다.
결론: Fc 침묵 돌연변이(L234A/L235A)를 보유하는 새로 설계된 변이체 C0115 및 C0118은 리포터 생물학적 검정에서 ADCC의 임의의 개시를 나타내지 않았다. 따라서, 그들은 강력하게 감소된 ADCC 이펙터 기능을 나타낸다.
도 22는 리포터 검정에 의해 결정된 새로 설계된 Fc 침묵 항체 C0115 및 C0118의 강력하게 감소된 ADCC 이펙터 기능을 보여준다. wt Fc를 갖는 그들의 모 항체 C0083 및 C0090과 비교하여 FcyRIIIA 및 HCT116-pMIF 표적 세포를 안정적으로 발현하는 조작된 주르캇 이펙터 세포를 사용하여 새로 설계된 Fc 침묵 항체 C0115 및/또는 C0118을 사용한 ADCC 리포터 생물학적 검정. 평균 및 SEM이 제시된다(n=2).
실시예 18: HCT116 종양 보유 Balb /c 마우스 누드 마우스에서 새로 설계된 Fc-침묵 항- oxMIF 항체 C0115와 대조군 항체 C0008의 생체 분포.
재료 및 방법: 인간 결장 선암 세포주 HCT116 이종이식 마우스 모델에서 새로 설계된 Fc-침묵 항-oxMIF 항체 C0115의 생체 분포가 참조 항-oxMIF 항체 C0008과의 일대일 비교로 조사되었다. 암컷 Balb/c 누드 마우스는 총 주사 용적 100μl로 50% PBS 및 50% 마트리겔 중 5x106 HCT116 세포의 편측 피하 주사를 투여받았다. 개별 종양 용적이 150 내지 300mm3에 도달시, 마우스를 치료 그룹에 배정하고 5mg/kg의 IRDye 800CW 표지 C0115 또는 C0008을 단일 정맥내 투여량을 투여받았다.
C0115 및 C0008은 제조업체의 지침에 따라 LI-COR 바이오사이언시즈의 IRDye 800CW 단백질 표지화 키트-높은 MW를 사용하여 IRDye 800CW로 표지했다. 표지화 공정 후 및 표지된 항체의 마우스에의 주사 전에, IRDye 800CW 표지 항체의 단백질 농도와 표지화 효율을 나노드롭 기술을 사용하여 결정하였고, 마우스는 표지화 후 단백질 농도에 기초하여 투여되었다. 생체내 이미징은 다음 시점에 표지된 항체의 투여시 LI-COR Pearl® Trilogy 이미징 장치에서 수행되었다: 투여 후 1시간, 6 내지 8시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 168시간. 이미지 분석은 종양 내 항체의 상대적 형광 강도(RFU)를 정량화하기 위해 수행하였다(RFU/면적= RFU 종양 면적/mm2 종양 면적 - RFU 배경/mm2 배경 면적).
결과 및 결론: 도 23은 최대 7일 종양 보유로, 각각 정맥내 투여된 IRDye 800CW 표지 C0115 및 C0008의 유의한 종양내 분포를 나타낸다. 도 23A 및 정량적 이미지 분석(도 23B)으로부터, 새로 설계된 Fc 침묵 항-oxMIF 항체 C0115의 종양 흡수가 약 24시간에 피크를 나타낸 참조 항-oxMIF 항체 C0008과 비교하여 7일에 걸쳐 강력하게 향상되고 증가하였음이 명백하다. 따라서, 생체 분포 연구는 방사성면역접합체로서의 적용에 대해 C0008과 비교하여 C0115의 우월성을 시사한다.
도 23은 피하 HCT116 종양을 보유한 마우스의 적외선 생체내 이미징에 의해 새로 설계된 항-oxMIF Fc 침묵 항체 C0115 및 참조 항체 C0008의 종양 침투 및 유지를 보여준다. (A) 마우스의 적외선 이미지는 5mg/kg으로 투여된 IRDye 800CW 표지 항체 C0115(상단 패널) 및 C0008(하단 패널)의 주사 후 1시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 168시간에 촬영되었고; (B) 디지털 이미지 분석에 의해 정량화된 C0115 및 C0008의 종양 침투 및 유지.
실시예 19: CT26 또는 HCT116 종양 보유 Balb /c 또는 Balb /c 누드 마우스에서 DFO * 에 접합되고 89 Zr로 방사성 표지된 새로 설계된 Fc -침묵 항- oxMIF 항체 C0115 및 C0118의 생체 분포
재료 및 방법: 새로 설계된 Fc-침묵 항-oxMIF 항체 89Zr-DFO*-C0115 및 89Zr-DFO*-C0118의 생체 분포는 인간 결장 선암 세포주 HCT116 이종 이식 및 마우스 결장 선암 세포주 CT26 동종 이식 마우스 모델을 사용하여 조사되었다.
항체 C0115 및 C0118은 이작용성 킬레이터 DFO*-NCS(ABX advanced biochemical compounds GmbH)와 접합시켰다. 항체의 완충액은 0.9% NaCl, 50mM NaHCO3, pH 9(5.0mg/mL)로 교환했다. 그 후, 항체를 37℃에서 45분 동안 DMSO(1mg/ml) 중 3몰 당량(과량)의 DFO*-NCS와 반응시켰다. 반응 후, 항체를 HiTrap 컬럼(탈염 컬럼, GE 17-1408-01, 5ml)으로 정제했다. 정제 동안, 완충액를 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 DPBS로 교환했다.
DFO*-Abs의 방사성 표지화는 89Zr(Perkin Elmer)로 수행했다. 먼저, 약 100MBq 89Zr(1M 옥살산 중)을 180μl의 2M Na2CO3 용액과 혼합하고, 실온(RT)에서 3분 동안 반응하도록 정치시켰다. 89Zr 용액을 1ml HEPES(pH 7)를 사용하여 pH 7로 중화시키고, 2mg의 DFO*-항체를 혼합물에 첨가하고 RT에서 60분 동안 반응하도록 정치시켰다. 방사성 표지 항체를 원심분리 필터로 정제하고, 완충액을 50mM 아르기닌을 갖는 0.01M PBS pH 6.5로 교환했다. 방사화학적 순도(RCP)는 용출액으로서 0.05M DTPA 및 UV 검출기(280nm), 포시람 방사성 검출기(Posiram radiodetector)(Lablogic), 크기 배제 컬럼 SEC-2000(Phenomenex, 30℃로 설정)이 장착된 radio-HPLC(Agilent Infinity II, 1260) 및 이동상으로서 0.1M 인산나트륨 pH 6.8을 사용하여 iTLC로 방사성 표지화 직후에 분석하였다.
암컷 Balb/c 누드 마우스는 총 주사 용적 100μl로 50% PBS 및 50% 마트리겔 중 5x106 HCT116 세포의 편측 피하 주사를 투여받았다. 암컷 Balb/c 마우스는 100 μl의 PBS 중 3x105 CT26 세포의 편측 피하 주사를 투여받았다. 개별 종양 용적이 150 내지 250mm3에 도달시, 마우스를 치료 그룹에 배정하고 10 내지 11MBq 89Zr-DFO*-C0115 및 89Zr-DFO*-C0118 항체의 단일 정맥내 투여량을 투여받았다. 방사성 선량은 교차 보정된 선량 교정기(VDC-405, Veenstra 기기)로 주사기 투여 전후를 측정하여 결정되었다.
동물은 이소플루란으로 마취하고, 전신 PET 스캔(60분)은 주사 후 4일, 7일 또는 10일에 BioPET 소형 동물 PET/CT(Sedecal, Madrid Spain)에 이어, 해부학적 참조를 위해 CT 이미지로 수행하였다. 이미지는 CT 기반 감쇠 보정과 함께 2DOSEM 알고리즘으로 재구성되었다. 이미지 분석은 PMOD 소프트웨어(v 3.7, PMOD Technologies LLC, Zurich, Switzerland)를 사용하여 수행하였다.
결과 및 결론: 두 항체 모두 성공적으로 DFO* 변형되었고, oxMIF에 대한 친화성을 유지했다(도 19B). 89Zr-DFO*-C0115는 약 80%의 방사화학적 수율로 합성되었으며, 계산된 비활성은 19.7MBq/mg이었다. 주입된 방사성은 11.0 ± 0.5 MBq(평균 ± SD, n=6)였고, 주입된 질량은 0.56 ± 0.03mg(평균 ± SD, n=6)이었다. 89Zr-DFO*-C0118은 약 72%의 방사화학적 수율로 합성되었으며, 계산된 비활성은 54.0MBq/mg이었다. 주입된 방사성은 11.0 ± 0.2 MBq(평균 ± SD, n=6)였고, 주입된 질량은 0.20 ± 0.01mg(평균 ± SD, n=6)이었다. 도 24로부터, 새로 설계된 Fc 침묵 항-oxMIF 항체가 모두 두 동물 모델의 종양에 축적되었고, 적어도 10일 동안 종양에 유지되었다는 것이 명백하다. 따라서, 생체 분포 연구는 진단용 방사성면역접합체로서 적용하기 위한 새로 설계된 Fc 침묵 항체 C0115 및 C0118의 적합성을 시사한다.
도 24는 피하 CT26 또는 HCT116 종양을 보유하는 마우스의 생체내 PET/CT 이미징에 의해 DFO*에 접합되고 89Zr로 방사성 표지된 새로 설계된 항-oxMIF 항체 C0115 및 C0118의 종양 침투 및 유지를 보여준다. 마우스의 PET 및 CT 이미지는 마우스당 약 10MBq로 투여된 89Zr-DFO* 표지 항체를 주사한 후 4일, 7일, 10일째 에 촬영하였고; 마우스의 대표적인 디지털 수직 단면이 제시되어 있으며, 백색 화살표는 종양을 표시한다.
참고 문헌
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10 <210> 29 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences VH (wt) <400> 29 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Ser Gln Trp Leu Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 30 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH L5Q <400> 30 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Ser Gln Trp Leu Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 31 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH L5Q W97Y <400> 31 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Ser Gln Tyr Leu Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences VL (wt) <400> 32 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Arg Ile Met Thr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Val Ala Ser His Ser Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Trp Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 33 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL F49Q A51G <400> 33 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Arg Ile Met Thr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Val Gly Ser His Ser Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Trp Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 34 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL F49Y/A51G/W93F <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Arg Ile Met Thr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Val Gly Ser His Ser Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Phe Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 35 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL M30L/F49Y/A51G/W93F <400> 35 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Arg Ile Leu Thr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Val Gly Ser His Ser Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Phe Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 36 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL M30L/F49Y/A51G/P80S/W93F <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Arg Ile Leu Thr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Val Gly Ser His Ser Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Phe Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 37 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1-CH3 wt <400> 37 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 325 <210> 38 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1-CH3, L234A/L235A <400> 38 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 325 <210> 39 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1-CH3, L234A/L235A/I253A <400> 39 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 325 <210> 40 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1-CH3, L234A/L235A/H310A/H435Q <400> 40 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Gln Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 325 <210> 41 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CL wt <400> 41 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 42 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C0090 LC <400> 42 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Arg Ile Leu Thr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Val Gly Ser His Ser Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Phe Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 43 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C0090 HC <400> 43 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Ser Gln Tyr Leu Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 44 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MIF catalytic motif <400> 44 Cys Ala Leu Cys 1 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxMIF epitope <400> 45 Glu Pro Cys Ala Leu Cys Ser 1 5 <210> 46 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C0083/C0115 LC <400> 46 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Arg Ile Met Thr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Val Gly Ser His Ser Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Phe Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 47 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C0115/C0118 HC <400> 47 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Ser Gln Tyr Leu Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MIF gene <400> 48 ttggtgttta cgatgaacat cgg 23

Claims (23)

  1. 재조합 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 방사성면역접합체(radioimmunoconjugate)로서,
    (a1) 아미노산 치환 M30L, F49Y, A51G, P80S, W93F 중 적어도 하나를 갖는 서열번호 32를 포함하는 경쇄 가변 도메인(light chain variable domain), 또는
    (a2) - 36번 위치에 보존된 티로신, 및
    - 아미노산 치환체 M30L, F49Y, A51G, P80S, W93F 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 32를 포함하는 경쇄 가변 도메인; 및
    (b1) 서열번호 29를 포함하는 중쇄 가변 도메인(heavy chain variable domain); 또는
    (b2) 서열번호 29 및 아미노산 치환 L5Q 및/또는 W97Y를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 또는
    (b3) 아미노산 치환 L5Q 또는 W97Y 중 적어도 하나, 및 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가 아미노산 치환을 갖는 서열번호 29를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고;
    아미노산 위치가 카바트(Kabat)에 따라 넘버링(numbering)되고,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이, 아미노산 치환이 결여된 서열번호 32 및 서열번호 29를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 비교하여 감소된 응집 가능성(aggregation potential) 및 감소된 소수성(hydrophobicity)을 갖는, 방사성면역접합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 경쇄 가변 도메인이 아미노산 치환 W93F를 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역이 아미노산 치환 W97Y를 포함하는, 방사성면역접합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방사성 동위원소(radioisotope)가 11C, 13N, 15O, 18F, 32P, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 89Zr, 90Y, 99mTc, 103Pd, 105Rh, 109Pd, 111Ag, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 140La, 149Tb, 149Pm, 153Sm, 159Gd, 165Dy, 166Dy, 166Ho, 169Yb, 175Yb, 177Lu, 227Th, 186Re, 188Re, 192Ir, 193mPt, 195mPt, 198Au, 199Au, 211At, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 225Ac, 223Ra, 및 227Th로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 구체적으로 상기 방사성 동위원소가 67Ga, 89Zr, 111In, 124I, 131I, 177Lu, 및 225Ac로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방사성면역접합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 L234, L235, G236, G237, N297, L328 또는 P329 중 어느 하나에 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함하는, 서열번호 37을 갖는 야생형 인간 IgG1 불변 도메인(constant domain)의 Fc 변이체 도메인을 포함하고, 상기 방사성면역접합체가 야생형 IgG1 Fc 영역을 포함하는 방사성면역접합체와 비교하여 Fcγ-수용체에 대한 감소된 결합을 나타내는, 방사성면역접합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 I253, H310, H435 중 어느 하나에 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하는, 인간 IgG1 불변 도메인의 Fc 변이체 도메인을 포함하고, 상기 방사성면역접합체가 야생형 IgG1 Fc 영역을 포함하는 방사성면역접합체와 비교하여 인간 FcRn에 대한 감소된 친화성(affinity)를 나타내는, 방사성면역접합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 31, 33, 34, 35 및 36으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 방사성면역접합체.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 37, 38, 39 및 40 중 어느 하나와 함께, 서열번호 29 및 34, 서열번호 30 및 33, 서열번호 30 및 34, 서열번호 31 및 34, 서열번호 31 및 36 또는 서열번호 31 및 33을 포함하는, 방사성면역접합체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, IgG, IgG-융합 단백질, Fv, scFv, scFv 융합 단백질, 디아바디(diabody), 디아바디 융합 단백질, Fab, Fab-융합 단백질, scFab, scFab-융합 단백질, Fab' 및 F(ab')2, Fab'-SH, Fcab, Fcab 융합 단백질, 2개 이상의 단일 쇄 항체의 융합 단백질, 미니바디(minibody), 및 소형 면역 단백질(small immune protein; SIP) 포맷으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방사성면역접합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 구체적으로 DOTA, 데페록사민 B(DFO) 및 DFO*의 그룹으로부터 선택된, 킬레이팅 그룹(chelating group)을 추가로 포함하는, 방사성면역접합체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 의약(medicament)의 제조에 사용하기 위한, 방사성면역접합체.
  11. 구체적으로 정맥내 투여용으로 제형화된, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방사성면역접합체를, 임의로 약제학적 담체(carrier) 또는 보조제(adjuvant)와 함께, 포함하는 약제학적 조성물.
  12. 제10항 또는 제11항, 또는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 암(cancer)으로 고통받는 환자의 치료, 구체적으로 종양(tumor), 구체적으로 혈액학적 또는 고형 종양(solid tumor)의 치료, 보다 구체적으로 결장직장암(colorectal cancer), 난소암(ovarian cancer), 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 췌장암(pancreas cancer) 및 폐암(lung cancer)의 치료에 사용하기 위한, 약제학적 조성물, 또는 방사성면역접합체.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방사성면역접합체의 재조합 항-oxMIF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩(encoding)하는 단리된 핵산(isolated nucleic acid).
  14. 제13항의 핵산을 포함하는 발현 벡터(expression vector).
  15. 제13항의 핵산 또는 제14항의 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포(host cell).
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방사성면역접합체를 생산하기 위한 방법으로서, 숙주 세포에서 항-oxMIF 항체를 인코딩하는 핵산을 발현시키는 단계 및 상기 항체를 방사성 동위원소로 추가로 표지화하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 대상체(subject)의 암에서 oxMIF 수준을 검출하기 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방사성면역접합체의 용도.
  18. 대상체의 암을 진단하기 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방사성면역접합체의 용도.
  19. 대상체에서 암을 생체내 진단(in vivo diagnosing)하기 위한 방법으로서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방사성면역접합체가 종양 세포를 검출하기 위해 사용되는, 방법.
  20. 암을 시험관내 진단하기 위한 방법으로서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방사성면역접합체가 샘플에서 종양 세포를 검출하기 위해 사용되는, 방법.
  21. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방사성면역접합체를 생산하기 위한 키트(kit)로서, 2개 이상의 바이알(vial)을 포함하고, 하나의 바이알이, 항-oxMIF 항체에 연결된 킬레이터(chelator)를 포함하는 접합체를 함유하고, 제2 바이알이, 구체적으로 177Lu 및 89Zr로부터 선택된, 방사성 동위원소를 함유하며, 상기 하나 또는 여러 바이알의 내용물이 임의로 동결건조되거나 용액 상태인, 키트.
  22. 제21항에 있어서, 상기 하나 또는 여러 바이알의 내용물이 동결건조되거나 용액 상태인, 키트.
  23. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방사성면역접합체, 또는 제11항의 약제학적 조성물을 사용하여 암을 치료하기 위한 방법.
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