CN111925451A

CN111925451A - 一种靶向bcma的嵌合抗原受体(car)及其应用

Info

Publication number: CN111925451A
Application number: CN202011081141.2A
Authority: CN
Inventors: 刘欢; 杨洋
Original assignee: Beijing Guangwei Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Youren cell engineering (Zhejiang) Co.,Ltd.
Priority date: 2020-10-12
Filing date: 2020-10-12
Publication date: 2020-11-13
Anticipated expiration: 2040-10-12
Also published as: CN111925451B

Abstract

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种靶向BCMA的嵌合抗原受体(CAR)及其应用，该嵌合抗原受体以靶向BCMA的单域抗体为抗原结合域，在制备CAR‑T细胞过程中通过调整CD4⁺和CD8⁺T细胞比例进行优化，所获得的新型CAR‑T细胞能够有效杀伤肿瘤细胞，并将IFN‑γ、IL‑10、IL‑6等细胞因子控制在可接受范围内，具有较好的临床应用前景。

Description

一种靶向BCMA的嵌合抗原受体(CAR)及其应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种靶向BCMA的嵌合抗原受体(CAR)及其应用。

背景技术

据统计，每年有数以百万计的患者因恶性肿瘤及其相关疾病离世，恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一，而多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是非霍奇金淋巴瘤之后第二常见的血液恶性肿瘤，它在肿瘤性疾病中占比约1％，在血液***恶性肿瘤中占比约13％，发病率从每10万人中的1人到4人不等，发生率男性较女性更高。多发性骨髓瘤的生存期很短，如果不进行任何治疗，进展期MM患者的中位生存期仅为6 个月，而即使接受化疗等治疗，中位生存期也不会超过3年，只有四分之一的患者可以生存5年以上，因此到目前MM仍被认为是一种不可治愈的疾病。

研究人员针对多发性骨髓瘤开发了多种新型疗法以便能够有效抑制MM的发生和发展，也取得了一定的积极治疗效果，其中嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigenreceptor gene-modified T cell，CAR-T）技术成为了今年来的研究热点之一。该技术是一种始于上世纪90年代的新型细胞免疫疗法，其治疗过程主要为将融合有CAR基因的核酸导入到自体或异体T淋巴细胞基因组中构建成为CAR-T细胞，然后将该细胞回输入患者体内，通过激活免疫应答反应治疗相关疾病，嵌合抗原受体的经典结构中包括抗原结合域、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域，其中抗原结合域用于识别目标肿瘤细胞，其余元件则辅助CAR-T细胞激活并发挥抗肿瘤作用。早期的CAR-T细胞研究集中于靶向BCMA的二代CAR-T细胞，该类CAR-T细胞通常包括靶向BCMA抗原结合域、跨膜区、CD28或4-1BB共刺激因子以及CD3ζ胞内信号域，由于其在白血病、淋巴瘤和骨髓瘤中展现出了令人惊奇的疗效，受到了研究人员和制药企业的高度关注，开发了大量类似的治疗细胞和疗法，其中诺华公司的Kymriah、吉利德公司的Yescarta已经被批准上市，我国的一些科研机构和制药公司也开发了同类产品。

B 细胞成熟抗原（B cell maturationantigen，BCMA）也叫做TNF 配体超家族成员17（TNF receptor superfamily member 17，TNFRSF 17），主要在浆细胞和成熟B淋巴细胞中表达，在其他正常人体组织上基本检测不到。在临床诊断和治疗中，BCMA 是MM 细胞系上最具选择性表达的受体之一，其表达量随着多发性骨髓瘤的疾病进程逐步递增，有研究表明，从正常人体到单克隆免疫球蛋白血症、冒烟型骨髓瘤再到活性MM，BCMA 的表达量随着疾病的进展而增加。因此，业内将BCMA可作为MM患者的重要预后和监测工具，也是理想的抗原靶点，目前已经开发出了多种基于BCMA的免疫疗法，如CN111333732A、CN110945026A、WO2017021450A1、WO2016087531A1等公开了靶向BCMA的抗体，也有研究人员提出了靶向BCMA的嵌合抗原受体，例如CN109153731A公开了一种靶向BCMA的嵌合抗原受体，CN109134665A公开了一种基于单域抗体的BCMA嵌合抗原受体，WO2019195017A1公开了一种靶向BCMA的CAR-T细胞。此外，令人欣喜的是多项靶向BCMA嵌合抗原受体研究已经进入临床试验阶段，如2016年Ali等首次开展了靶向BCMA CAR-T细胞的Ⅰ期临床试验，有12例患者参与了此次临床试验，大部分患者呈现出了不同程度的症状缓解，随后Raje，Berdeja 等开发了靶向BCMA的第二代CAR，并用慢病毒载体转导自体T细胞形成靶向BCMA的CAR-T细胞，在33例患者中，整体应答率可达85%，我国的南京传奇公司、科济生物公司等开发的靶向BCMA的CAR-T细胞也已进入临床试验。但是，上述CAR-T细胞在使用过程中也存在一些问题，包括随着CAR-T细胞剂量的增加，患者细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）症状加重，发热和心动过速、中性粒细胞减少、血小板减少、低血压和急性肾损伤等副作用不同程度的出现，限制了CAR-T细胞的临床应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种新型嵌合抗原受体及其应用，包括信号肽、靶向BCMA的抗原结合域、跨膜区、共刺激因子和CD3ζ胞内信号域，尤其是选用特异性高的靶向BCMA的单域抗原结合域，并对制备过程中CD4+和CD8+T细胞的比例进行了优化，从而能够在激起足够免疫应答的同时，降低免疫因子的释放水平，缓解由于CAR-T细胞治疗而导致的副反应，为开发新型的多发性骨髓瘤疗法提供了新思路。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种靶向BCMA的新型嵌合抗原受体及其应用，以便降低CAR-T细胞治疗过程中的分子生物学操作难度，提高细胞转染效率，改善抗肿瘤效果。

本发明的详细技术方案如下：

提供了一种靶向BCMA的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括信号肽、靶向BCMA的纳米抗体、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域，所述靶向BCMA的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步的，所述跨膜区为CD28跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步的，所述胞内信号域为CD3ζ胞内信号域，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

进一步的，所述共刺激因子选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、B7-H3和/或它们的任何组合。

进一步的，所述共刺激因子选自4-1BB，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

进一步的，所述信号肽氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

进一步的，所述嵌合抗原受体氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

进一步的，所述嵌合抗原受体核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

提供了一种表达载体，所述载体包括编码本申请中所述嵌合抗原受体的氨基酸的核苷酸或其核苷酸。

进一步的，所述表达载体为慢病毒载体。

提供了一种嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞表达本申请中所述的嵌合抗原受体。

进一步的，制备所述嵌合抗原受体T细胞时，选用CD4+和CD8+ T细胞的比例为2:1-3:2。

提供了一种本申请中所述的嵌合抗原受体T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步的，所述的肿瘤为B细胞恶性肿瘤，优选为多发性骨髓瘤。

本发明的有益效果包括：

本发明提供了一种靶向BCMA的新型嵌合抗原受体结构及其应用，该嵌合抗原受体中以靶向BCMA的单域抗体为抗原结合域，不仅具有相对简单的氨基酸序列结构，易于进行基因操作，而且能够与靶抗原进行有效结合， IFN-γ、IL-10、IL-6等表达水平明显降低，说明其能够有效抑制免疫因子风暴等副作用；此外，本发明还优化了CAR-T细胞的制备方法，创造性地提出了在制备过程中选用CD4+和CD8+比例为2:1-3:2的T细胞制备CAR-T，在该比例下制得的CAR-T细胞对于肿瘤细胞更具杀伤效果。

附图说明

图1 嵌合抗原受体核酸片段酶切电泳图；

图2 U266细胞杀伤率图；

图3小鼠体内IFN-γ分泌水平图；

图4小鼠体内IL-6分泌水平图；

图5小鼠体内IL-10分泌水平图；

图6荷瘤小鼠肿瘤体积变化图。

具体实施方式

下面对本发明涉及的部分术语进行解释。

本发明中，“核酸”或“核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或其DNA或RNA的组合及其聚合物，所述的核酸分子是合成的或重组的。

本发明中，“表达载体”是指包括重组核苷酸的载体，所述重组核苷酸包括与待表达的核苷酸序列有效连接的表达控制序列。表达载体包括足以用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达***中提供。表达载体包括本领域已知的所有载体，包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)等等。

本发明中，“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属，慢病毒在逆转录病毒中是独特的，其能够感染非***细胞，可以将大量遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体中最有效的方法之一，如HIV、SIV和FIV等均属于慢病毒。

本发明中，“肿瘤”是指因异常细胞不受控制的生长而造成的疾病，肿瘤细胞可以局部或通过血流和淋巴***传播到身体的其它部位。本文描述了各种肿瘤，包括但不限于乳癌、***癌、卵巢癌、***、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。本发明中“肿瘤”、“癌症”、“癌”可以互换使用，均包括实体肿瘤和液体肿瘤。

本发明中，“嵌合抗原受体”(CAR)是人工改造受体，能够将识别肿瘤细胞表面抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞(如T细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀死肿瘤细胞或病毒感染的细胞。通常来讲，嵌合抗原受体依次包含信号肽、抗原结合域、跨膜区和胞内信号区。可采用本领域已知的用于构建CAR的信号肽、跨膜区和胞内信号区来构建本发明的嵌合抗原受体。结合肿瘤细胞膜抗原的多肽能够以较高或中等亲和力结合肿瘤细胞广泛表达膜抗原，该多肽通常***有抗原表位；信号肽与结合肿瘤细胞膜抗原的多肽之间，抗原结合域内部，以及抗原结合域和铰链区之间；所述抗原结合域为天然多肽或人工合成多肽。

本发明中，“共刺激分子”是指存在于抗原提呈细胞表面，能与Th细胞上的共刺激分子受体结合，产生协同刺激信号的分子。T淋巴细胞的增殖不仅需要抗原的结合，还需要接受共刺激分子信号。共刺激信号传递给T细胞主要是通过表达在抗原呈递细胞表面的共刺激分子CD80、CD86与T细胞表面的CD28分子结合。B细胞接受共刺激信号可以通过一般的病原体成分例如LPS，或者通过补体成分，或者通过激活了的抗原特异性的Th细胞表面的CD40L。可采用本领域已知的用于构建CAR的共刺激因子，包括但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、B7-H3和/或它们的任何组合。

实施例1 靶向BCMA的单域抗体的确定

利用人源BCMA蛋白免疫羊驼，通过噬菌体展示文库，筛选靶向BCMA的单域抗体，具体方法包括：

（一）抗原免疫。选取健康成年单峰驼，将人BCMA蛋白按15μg/Kg与弗氏佐剂按1:1的比例混匀，采用背部皮下多点注射的方式免疫，共免疫6-8次，间隔为2周。第一次免疫使用弗氏完全佐剂，其余各次免疫均采用弗氏不完全佐剂。免疫结束后每周采集单峰驼颈部外周血100mL，使用ELISA检测羊驼血清中BCMA抗体的滴度，当BCMA抗体浓度达到128K以上，符合构建抗体噬菌体展示文库的要求，初步得到BCMA的多克隆抗体。

（二）构建噬菌体展示文库。

采集免疫后的羊驼100mL外周血，使用淋巴细胞分离液分离获得外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC），提取PBMC总RNA，使用RT-PCR试剂盒进行逆转录反应获得cDNA，然后通过两轮巢式得到特异性VHH片段。将获得的VHH片段经酶切纯化后，连接至噬菌体载体上，然后经点击转化构建噬菌体文库。随机挑选50个克隆进行鉴定，经计算***率达98.5%以上。

（三）单域抗体筛选与获得

通过酶联免疫反应方法，以可溶解的人BCMA为抗原，筛选阳性克隆。提取阳性克隆质粒并转化至大肠杆菌感受态细胞，以100mM IPTG诱导纳米抗体蛋白表达，使用树脂分离纯化收集目的蛋白。通过BIACORE3000生物大分子相互作用仪（购自GE公司）测定目的蛋白与人BCMA的亲和力，结果表明所筛选抗体的亲和力在3.52E-07至7.89E-09之间，选择亲和力最高的单域抗体进行后续实验。

（四）单域抗体序列分析

测定上述BCMA单域抗体的氨基酸序列结构，如SEQID NO:1所示，通过IMGT分析该序列结构，获得其CDR1区序列为GGSVRTGE，CDR2区的序列为ARELVGW，CDR3区的序列为TGVYYCTANVEGNRIY。

实施例2嵌合抗原受体基因序列的确定

通过生物信息学方法检索并获得信号肽、CD28跨膜区、4-1BB共刺激因子、CD3ζ胞内信号域、人CD28铰链区的氨基酸和核苷酸序列，其中CD28跨膜区氨基酸序列如SEQID NO:2所示，4-1BB氨基酸序列如SEQID NO:4所示，信号肽氨基酸序列如SEQID NO:5所示，CD3ζ胞内信号域氨基酸序列如SEQID NO:3所示。为了便于分析比对，选取由本实验室保持的具有普通抗体结构的靶向BCMA ssFv片段作为阳性对照进行后续实验，通过基因全合成方式构建嵌合抗原受体基因序列，其中具有单域抗体抗原结合域功能元件的CAR-VHH结构为signalpeptide –antiBCMA VHH -CD28 TM -4-1BB - CD3ζ，具有普通抗体抗原结合域功能元件的CAR-AN结构为signal peptide –antiBCMA ssFC -CD28 TM -4-1BB - CD3ζ，其中CAR-VHH氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

实施例3 携带嵌合抗原受体基因质粒载体的制备

3.1 目标产物的酶切和质粒载体线性化

通过PCR法扩增并获得CAR-VHH、CAR-AN基因序列，并在序列两端添加Xba I和BamH I酶切位点。将目标基因片段与慢病毒载体质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro(购自Addgene公司)进行Xba I和BamH I双酶切反应，酶切反应条件为：37℃，酶切40min。

3.2 酶切产物的回收

将含有CAR-VHH、CAR-AN片段和pCDH-CMV-MCS- EF1-GFP-T2A-Puro DNA片段分别利用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后分别将含有上述核酸片段的琼脂糖凝胶条带切下，放在两个洁净EP管中。采用DNA Extraction kit Ver 4.0（购自Taraka公司）将琼脂糖凝胶中的DNA纯化并浓缩。

3.3 产物连接与转化

将上述DNA片段在T4连接酶的作用下16℃过夜连接，获得的连接产物通过点击法转入DH5α感受态细胞中，将感受态细胞加入至 900μL 未添加抗生素的液体 LB 培养基中，37℃摇床 200 rpm，培养2h，然后4000 rpm离心2 min，弃去上清，使用100μL液体LB培养基重悬沉淀，将菌液涂抹至Amp抗性的固体LB平板上，将平板置于37℃细菌培养箱中，培养过夜，挑取阳性克隆。

3.4 阳性克隆的鉴定

提取阳性克隆中质粒，经Xba I和BamH I双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定目标片段，如图1所示，CAR-VHH目标片段大小约为950bp，CAR-AN目标片段大小约为1600bp，所述质粒经测序鉴定，目标序列正确。

实施例4慢病毒的包装、浓缩和滴度测定

4.1 慢病毒载体的包装

将测序正确的原始菌液接种至50 mL Amp抗性的液体LB培养基，37℃摇床 200 rpm，过夜培养，4000 rpm离心收集菌体，采用Takara MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver4.0（购自Takara公司）质粒提取试剂盒提取质粒。

与六孔板中37℃、5%CO₂条件下培养293T 细胞，待细胞汇合度至80%时更换新鲜培养基。按dR8.9包装质粒：VSVG包膜蛋白质粒为4:3:1的比例混合，后加入Opti-MEM培养基补足体积5mL。逐滴将质粒与转染试剂的混合溶液滴加至293T 细胞培养液中，37℃、5%CO₂条件下培养48h。

4.2慢病毒的浓缩和滴度测定

2500 rpm离心10 min收集上清，使用0.45μm 滤膜和0.22μm 滤膜依次过滤除去细胞碎片和其他杂质，含病毒上清液经过透析浓缩后，采用TCID50法检测上述病毒的滴度，结果显示携带有CAR-VHH、CAR-AN基因的慢病毒滴度均达到10⁷TCID50/mL以上。

实施例5 靶向BCMA CAR-T细胞的制备

招募健康志愿者，采集20mL外周血，通过流式细胞仪法分离并获得外周血中的CD4⁺、CD8⁺T细胞。目前在CAR-T细胞制备过程中，通常选用CD4⁺：CD8⁺比例为1:1的T细胞，然而在初期试验中发明人发现，选用该比例的T细胞难以适用于本发明所述具有单域抗体抗原结合域的嵌合抗原受体结构，其对肿瘤细胞的杀伤效率较低，故在CAR-T细胞制备时调整了CD4⁺：CD8⁺T细胞比例，分别选用1:1、2:1、3:2的比例制备相应细胞。

将获得的T细胞与RPMI1640（含10%FBS）培养基中培养并传代培养2-3代，待细胞处于对数生长期后，收集细胞并分布于6孔板中，每孔1×10⁷个细胞，虽然分别加入携带有CAR-VHH、CAR-AN基因的慢病毒，37℃培养7天，收集细胞并进行保藏。

实施例6靶向BCMA CAR-T细胞体外抗肿瘤效果

为检测本发明所提供的CAR-T细胞的肿瘤杀伤效果，选用可表达BCMA抗原的骨髓瘤细胞系U266细胞作为体外实验对象，验证体外肿瘤杀伤效果。将U266细胞培养于RPMI1640培养基中，5％CO₂、37℃培养箱培养48小时，胰酶消化收集细胞。

将CAR-T VHH、CAR-T AN细胞以及PBS（阴性对照）与U266细胞按照1:1比例进行混合，加入96孔培养板中置于5％CO₂、37℃培养箱培养24小时后每孔加入20μL CCK-8，继续孵育2小时后，酶标仪检测450nm波长，测量OD值，杀伤率＝[1-(实验组OD值-效应细胞对照组OD值)/靶细胞对照组OD值]×100％。如图2所示，上述CAR-T细胞均能够有效杀伤U266细胞，杀伤率均在60%以上。结果还表明，采用单域抗体的抗原结合域似乎比采用普通抗体的抗原结合域具有更强的肿瘤杀伤效果，尤其是在提高CD4⁺：CD8⁺T细胞比例后，这一趋势更加明显。这说明CD4⁺：CD8⁺T细胞比例对于CAR-T细胞的杀伤效果具有重要影响，与目前通用的1:1比例相比，CD4⁺T细胞比重增加似乎更有利于靶向BCMA 的CAR-T细胞发挥抗肿瘤效果，在CAR-T VHH中由比例为3:2的CD4⁺：CD8⁺T细胞制备获得的治疗细胞具有最高的肿瘤细胞杀伤效率，高达约86%，而CAR-T AN中最高的杀伤效率为由比例为2:1的CD4⁺：CD8⁺T细胞制备获得的治疗细胞，约为72%。为了获得具有说服力的实验数据，后续动物体内实验中选用杀伤效率高的CAR-T细胞进行，即比例为2:1的CD4⁺：CD8⁺T细胞制备获得的治疗细胞进行。

实施例7靶向GPC3细胞体内抗肿瘤效果

为了进一步验证上述CAR-T细胞的抗肿瘤效果，本实施例以Balb/c小鼠移植瘤模型（负载肝癌细胞系U266细胞）为生物体材料进行的相关药学实验，具体的实验步骤和结果如下：

7.1 免疫因子分泌情况

取对数生长期的U266细胞，皮下注射BALB/C小鼠，每只1×10⁶个细胞，待7-10天后选取形成明显瘤块的小鼠作为实验对象。选取30只荷瘤小鼠，随机分为3组，分别为CAR-TVHH、CAR-T AN以及生理盐水组，通过尾静脉注射方式分别注射2×10⁶个细胞和同体积生理盐水，每7天注射一次，共注射2次，第二次注射结束3周后尾静脉取血，分离获得血清，采用Elisa试剂盒说明书进行操作测定小鼠血清中IFN-γ、IL-6、IL-10的水平。图3中显示，经过CAR-T治疗后小鼠血浆中的IFN-γ水平显著提高，而CAR-T VHH、CAR-T AN组中水平类似，并无显著性差异；图4中显示，经过CAR-T治疗后小鼠血浆中的IL-6水平显著提高，且CAR-TVHH组具有更低的IL-6表达水平，具有显著性差异；图5中显示，经过CAR-T治疗后小鼠血浆中的IL-10水平显著提高，且CAR-T VHH组具有更低的IL-10表达水平，具有显著性差异，降低幅度较为明显。上述结果说明，在体内实验中，CAR-T VHH、CAR-T AN均能够有效激活体内免疫应答抑制肿瘤的发生和发展过程，虽然在IFN-γ表达水平上未见显著差异，但是CAR-TVHH似乎对白介素具有相对温和的激活效应，IL-6和IL-10的表达水平均低于CAR-T AN组，而白细胞介素属于CAR-T治疗过程中免疫因子风暴中的主要免疫因子，这提示CAR-T VHH在治疗过程中具有较低的毒副作用风险。

7.2 荷瘤小鼠肿瘤体积测定

对上述U266细胞荷瘤小鼠经CAR-T VHH、CAR-T AN以及生理盐水治疗后，每2天测定一次肿瘤体积，共测定20天。肿瘤体积计算公式:体积=(a²xb)/2，a为肿瘤最宽部分长度，b为肿瘤最长部分长度。

如图6所示，在荷瘤小鼠实验中，CAR-T细胞治疗能够有效抑制肿瘤的生长，治疗组的肿瘤体积明显小于生理盐水组，而且CAR-T VHH似乎更能够有效抑制肿瘤的生长过程，治疗两周后，CAR-T VHH组的肿瘤体积明显小于CAR-T AN组，说明以本发明中提供的单域抗体作为抗原结合域构建CAR-T细胞在肿瘤治疗方面更具优势。

序列表

<110> 北京广未生物科技有限公司

<120> 一种靶向BCMA的嵌合抗原受体(CAR)及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

Gly Trp Tyr Arg Gln Val Ser Gly Met Gln His Ser Tyr Val Glu Leu

50 55 60

Glu Val Val Ala Thr Gln Met Asn Ser Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr

65 70 75 80

Ala Asn Val Glu Gly Asn Arg Ile Tyr Ala Leu Pro Ala Pro Gly Ser

85 90 95

Arg Tyr Pro Thr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Gly Thr Pro Asp Asp Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 3

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Val Leu Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Pro Ala Thr Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ala Gly Leu Thr Ala Gly Leu Ala Leu Gly Ala Ala Gly Gly Thr

20 25 30

Ala Val Leu Ala Leu Ala Ala Gly Ala Ala Pro Gly Met Gly Gly Leu

35 40 45

Pro Ala Ala Leu Ala Pro Gly Gly Gly Leu Thr Ala Gly Leu Gly Leu

50 55 60

Ala Leu Met Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ile Gly Met Leu Gly Gly Ala

65 70 75 80

Ala Ala Gly Leu Gly His Ala Gly Leu Thr Gly Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Leu Ala Thr Thr Ala Ala Leu His Met Gly Ala Leu Pro Pro Ala

100 105 110

<210> 4

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 5

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

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20

<210> 6

<211> 315

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Arg Pro Ser Gln Ala Gln Leu Lys Gly Gly Ser Leu Gly Glu

20 25 30

Ser Leu Arg Gly Gly Ser Val Arg Thr Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser

35 40 45

Cys Glu Ala His Trp Phe Ser Gly Asn Ile Tyr Ser Ile Asn Arg Met

50 55 60

Ala Arg Glu Leu Val Gly Trp Tyr Arg Gln Val Ser Gly Met Gln His

65 70 75 80

Ser Tyr Val Glu Leu Glu Val Val Ala Thr Gln Met Asn Ser Thr Gly

85 90 95

Val Tyr Tyr Cys Thr Ala Asn Val Glu Gly Asn Arg Ile Tyr Ala Leu

100 105 110

Pro Ala Pro Gly Ser Arg Tyr Pro Thr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Gly

115 120 125

Thr Pro Asp Asp Val Thr Val Ser Ser Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu

130 135 140

Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr

145 150 155 160

Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

165 170 175

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

180 185 190

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Ala Val Leu Pro Ser

195 200 205

Ala Ser Ala Ala Ala Pro Ala Thr Gly Gly Gly Gly Ala Gly Leu Thr

210 215 220

Ala Gly Leu Ala Leu Gly Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Leu Ala Leu

225 230 235 240

Ala Ala Gly Ala Ala Pro Gly Met Gly Gly Leu Pro Ala Ala Leu Ala

245 250 255

Pro Gly Gly Gly Leu Thr Ala Gly Leu Gly Leu Ala Leu Met Ala Gly

260 265 270

Ala Thr Ser Gly Ile Gly Met Leu Gly Gly Ala Ala Ala Gly Leu Gly

275 280 285

His Ala Gly Leu Thr Gly Gly Leu Ser Thr Ala Thr Leu Ala Thr Thr

290 295 300

Ala Ala Leu His Met Gly Ala Leu Pro Pro Ala

305 310 315

<210> 7

<211> 945

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggcgctgc cggtgaccgc gctgctgctg ccgctggcgc tgctgctgca tgcgcgcccg 60

agccaggcgc agctgaaagg cggcagcctg ggcgaaagcc tgcgcggcgg cagcgtgcgc 120

accggcgaaa gcctgcgcct gagctgcgaa gcgcattggt ttagcggcaa catttatagc 180

attaaccgca tggcgcgcga actggtgggc tggtatcgcc aggtgagcgg catgcagcat 240

agctatgtgg aactggaagt ggtggcgacc cagatgaaca gcaccggcgt gtattattgc 300

accgcgaacg tggaaggcaa ccgcatttat gcgctgccgg cgccgggcag ccgctatccg 360

acctggggcc agggcaccca gggcaccccg gatgatgtga ccgtgagcag catttatatt 420

tgggcgccgc tggcgggcac ctgcggcgtg ctgctgctga gcctggtgat taccctgtat 480

tgcaaacgcg gccgcaaaaa actgctgtat atttttaaac agccgtttat gcgcccggtg 540

cagaccaccc aggaagaaga tggctgcagc tgccgctttc cggaagaaga agaaggcggc 600

tgcgaactgg cggtgctgcc gagcgcgagc gcggcggcgc cggcgaccgg cggcggcggc 660

gcgggcctga ccgcgggcct ggcgctgggc gcggcgggcg gcaccgcggt gctggcgctg 720

gcggcgggcg cggcgccggg catgggcggc ctgccggcgg cgctggcgcc gggcggcggc 780

ctgaccgcgg gcctgggcct ggcgctgatg gcgggcgcga ccagcggcat tggcatgctg 840

ggcggcgcgg cggcgggcct gggccatgcg ggcctgaccg gcggcctgag caccgcgacc 900

ctggcgacca ccgcggcgct gcatatgggc gcgctgccgc cggcg 945

Claims

1.一种靶向BCMA的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括信号肽、靶向BCMA的纳米抗体、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域，所述靶向BCMA的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜区为CD28跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述胞内信号域为CD3ζ胞内信号域，其氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示，所述信号肽氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述共刺激因子为4-1BB，其氨基酸序列如SEQID NO:4所示。

3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO:6所示。

4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO:7所示。

5.一种表达载体，其特征在于，包括权利要求4所述的核苷酸。

6.一种嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体T细胞表达权利要求1-4所述的嵌合抗原受体。

7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，制备所述嵌合抗原受体T细胞时，选用CD4+和CD8+ T细胞的比例为2:1-3:2。

8.权利要求6-7任一项中所述的嵌合抗原受体T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，所述的肿瘤为B细胞恶性肿瘤。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述B细胞恶性肿瘤为多发性骨髓瘤。