CN113271965B - Cd37抗体和cd37-car-t细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及单克隆抗人CD37抗体或单链可变片段(scFv)，其包括具有SEQ ID NO:3的氨基酸的VH和具有SEQ ID NO:7的氨基酸的VL。本发明还涉及嵌合抗原受体融合蛋白，其从N末端到C末端包括：(i)本发明的单链可变片段(scFv)、(ii)跨膜结构域、(iii)至少一个共刺激结构域和(iv)激活结构域。

Description

CD37抗体和CD37-CAR-T细胞
序列表、表格或计算机程序的引用
序列表以ASCII格式的文本文件通过EFS-Web与说明书同时提交，文件名为Sequence Listing.txt，创建日期为2019年12月19日，并且大小为8千字节。通过EFS-Web提交的序列表是说明书的一部分，并在此通过引用全文并入本文。
技术领域
本发明涉及CD37特异性抗体和CD37-CAR-T细胞，其可用于肿瘤的过继性免疫基因治疗领域中。
背景技术
免疫疗法正在成为一种非常有前途的癌症治疗方法。T细胞或T淋巴细胞是我们免疫***的武装力量，不断寻找外来抗原并将异常细胞(癌症或经感染细胞)和正常细胞区分开来。利用CAR(嵌合抗原受体)构建体对T细胞进行基因修饰是设计肿瘤特异性T细胞最常见的方法。可以将靶向肿瘤相关抗原(TAA)的CAR-T细胞输注到患者体内(称为过继性细胞转移或ACT)，其代表一种有效的免疫治疗方法[1，2]。与化学疗法或抗体相比，CAR-T技术的优点在于，重编程的改造的T细胞可以在患者体内增殖并持续存在(“一种活的药物”)[1，3]。
CAR通常由以下组成：在N末端部分的单克隆抗体衍生的单链可变片段(scFv)、铰链、跨膜结构域、以及与激活CD3-ζ结构域串联的若干个胞内共刺激结构域：(i)CD28，(ii)CD137(4-1BB)、CD27或其它共刺激结构域。(图1)[1，2]。CAR的演变从第一代(没有共刺激结构域)到第二代(具有一个共刺激结构域)再到第三代CAR(具有若干个共刺激结构域)。生成具有两个共刺激结构域的CAR(所谓的第三代CAR)使得CAR-T细胞杀伤活性增加，并改善了CAR-T细胞持久性，从而增强了其抗肿瘤活性。
图1显示了CAR的结构。左图显示了第一代CAR(无共刺激结构域)的结构。中图显示了第二代CAR(一个共刺激结构域CD28或4-BB)的结构。右图显示了第三代CAR(两个或若干个共刺激结构域)[6]。
自然杀伤细胞或NK细胞是对先天性免疫***至关重要的一类细胞毒性淋巴细胞。NK细胞发挥的作用类似于脊椎动物适应性免疫应答中的细胞毒性T细胞的作用。NK细胞提供针对受病毒感染的细胞的快速应答，在感染后约3天起作用，并且对肿瘤形成作出反应。
CD37抗原(或四跨膜蛋白-26(Tetraspanin-26)、Tspan-26)是由CD37基因编码的细胞表面糖蛋白。四跨膜蛋白因四个跨膜区和两个细胞外环而出名。CD37蛋白是包含281氨基酸的蛋白质，其中39-59位氨基酸和112-241位氨基酸代表蛋白质的胞外结构域。
CD37表达仅限于淋巴组织，特别是成熟B细胞，在浆细胞和树突状细胞上的表达水平低。CD37在成熟B细胞肿瘤中表达，所述成熟B细胞肿瘤包括套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病，但在急性成淋巴细胞性白血病和多发性骨髓瘤中表达很低或不存在。[7]
附图说明
图1显示了CAR的结构。
图2显示了CD 37蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。两个胞外结构域加下划线且粗体显示。
图3显示了CD37 CAR构建体的结构。第二代CAR用CD28或41BB作为共刺激结构域。
图4A表示CD37抗体(上图)用HEK293-CD37而不是用HEK293、HEK293-CD18进行的特异性免疫荧光染色。下图显示了核DNA的DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)蓝色荧光染色，其证实了细胞的存在。图4B显示了CD37抗体在CHO-CD37细胞(右图)中检测到CD37抗原，而在CHO细胞(左图)中未检测到。中图使用同种型抗体作为对照。图4C显示了CD37抗体在体腔淋巴瘤(BCBL-1)细胞系(左图)和小鼠淋巴细胞性白血病细胞系L1210细胞系(右图)中检测到CD37抗原。
图5显示了在CD37阳性Raji淋巴瘤细胞上的FACS染色，但在CD37阴性细胞(诸如Lovo结肠癌细胞、MCF-7、MDA-231乳腺癌细胞、K562慢性粒细胞性白血病细胞和RPMI8226多发性骨髓瘤细胞)中无染色或染色极弱。
图6显示了经CD37-28-CD3 CAR病毒转导后，用小鼠FAB抗体的FACS检测到CD37+CAR+阳性细胞。左图：对照T细胞。右图：CD37-CAR阳性细胞。
图7A-7C是实时RTCA测定结果，显示了CD37-CAR-T细胞针对CHO-CD37靶细胞(而不是CHO细胞)的特异性杀伤活性。
图8显示了CD37-CAR-T细胞靶向CHO-CD37细胞的高IFN-γ分泌，而CD37-CAR-T细胞针对CHO细胞没有。相对于模拟CAR-T细胞，*CD37-CD28-CAR-T、**CD37-41BB-CAR-T细胞两者均为p<0.05，学生t检验(Student’s t-test.)。
图9显示了由CD37-CD28-CAR-T细胞针对Raji靶细胞的IFN-γ分泌，显著高于由CD37-CD28-CAR-T细胞针对K562细胞的IFN-γ分泌。通过学生t检验，相对于T细胞或K562细胞，CD37-28-CD3在Raji细胞中，*p<0.05。
图10显示了在经CD37-CAR-T细胞、PBS和T细胞处理后，NSG小鼠中的Raji异种移植瘤的图像。左图显示了经CD37-28-CD3 CAR-T细胞处理后，小鼠体内信号降低。右图示出了总通量(Y轴：光子/秒；X轴：Raji细胞注射到NSG小鼠内之后的天数)。在第14天，CD37-CD28-CD3细胞相对于T细胞，*p<0.05。
图11是卡普兰-迈耶曲线(Kaplan-Meier curve)，其显示了在Raji异种移植瘤的活体模型中CD37-CAR-T细胞处理的小鼠的存活期增加。CD37-CAR-T细胞相对于PBS对照，*p<0.05，学生t检验。
具体实施方式
定义
如本文使用的，“嵌合抗原受体(CAR)”是一种经过工程改造的受体蛋白，赋予T细胞靶向特定蛋白的新能力。该受体是嵌合的，因为它们将抗原结合和T细胞激活功能组合到单个受体内。CAR是一种融合蛋白，其包括能够与抗原结合的胞外结构域、跨膜结构域，和至少一个胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”有时被称为“嵌合受体”、“T小体(T-body)”或“嵌合免疫受体(CIR)”。“能够与抗原结合的胞外结构域”意指可以与某种抗原结合的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”意指已知作为结构域起作用的任何寡肽或多肽，其通过传递信号以激活或抑制细胞中的生物过程。如本文使用的，“结构域”意指多肽中的一个区域，其独立于其它区域而折叠成特定结构。
如本文所用，“单链可变片段(scFv)”意指衍生自抗体的单链多肽，仍保留与抗原结合的能力。scFv的实例包括如下所述的抗体多肽，其通过重组DNA技术形成，并且其中免疫球蛋白重链(H链)和轻链(L链)片段的Fv区经由间隔序列相连接。用于改造scFv的各种方法是本领域技术人员已知的。
如本文所用，“肿瘤抗原”意指具有抗原性的生物分子，其表达导致癌症。
本发明人已制备出了特异性靶向人CD37的小鼠单克隆抗体。本发明涉及单克隆抗人CD37抗体，其包括具有SEQ ID NO:3的氨基酸的VH和具有SEQ ID NO:7的氨基酸的VL。单克隆抗人CD37抗体是针对人CD37(110-241个氨基酸)的纯化重组片段的胞外域而生成的。在一个实施方案中，单克隆抗人CD37抗体是单链可变片段(scFv)。ScFv可以是VH-接头-VL或VL-接头-VH。
本发明还涉及嵌合抗原受体融合蛋白，其从N末端到C末端包括：(i)靶向CD37的单链可变片段(scFv)，其中VH具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，并且VL具有SEQ ID NO:7的氨基酸，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个共刺激结构域，和(iv)激活结构域。本发明的CD37-CAR-T细胞针对若干种癌细胞系具有高细胞毒性活性。本发明人已制出了CD37-CAR-T细胞，以靶向过表达CD37肿瘤抗原的癌细胞。
在一个实施方案中，CAR结构如图2所示。
在一个实施方案中，共刺激结构域选自由CD28、4-1BB、GITR、ICOS-1、CD27、OX-40和DAP10组成的组。优选的共刺激结构域是CD28或4-1BB。
优选的激活结构域是CD3ζ(CD3 Z或者CD zeta)。
跨膜结构域可以衍生自天然多肽，或者可以是人工设计的。衍生自天然多肽的跨膜结构域可以获自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。例如，可以使用T细胞受体α或β链、CD3ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154或GITR的跨膜结构域。人工设计的跨膜结构域是主要包括诸如亮氨酸和缬氨酸疏水性残基的多肽。优选在合成的跨膜结构域的每一端处发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。可选地，短的寡肽接头或多肽接头(例如长度为2-10个氨基酸的接头)可以布置在跨膜结构域和胞内结构域之间。在一个实施方案中，可以使用具有甘氨酸-丝氨酸连续序列的接头序列。
本发明提供了编码CD37-CAR的核酸。编码CAR的核酸可以通过常规方法，由指定CAR的氨基酸序列进行制备。编码氨基酸序列的碱基序列可以获自关于每个结构域的氨基酸序列的上述NCBI RefSeq ID或GenBank登录号，并且本发明的核酸可以使用标准分子生物学和/或化学程序进行制备。例如，可以基于碱基序列，合成核酸，并且通过使用聚合酶链反应(PCR)，将得自cDNA文库的DNA片段结合，可以制备本发明的核酸。
可以将编码本发明的CAR的核酸***到载体内，并且可以将载体导入细胞内。例如，可以使用病毒载体，诸如逆转录病毒载体(包括肿瘤逆转录病毒载体、慢病毒载体和假型载体)、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、猿猴病毒载体、痘苗病毒载体或仙台病毒载体、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)载体和HSV载体。优选使用缺乏复制能力从而不能在受感染细胞中自我复制的病毒载体。
例如，当使用逆转录病毒载体时，可以基于载体所具有的LTR序列和包装信号序列来选择合适的包装细胞，用于使用该包装细胞制备逆转录病毒颗粒。包装细胞的实例包括PG13(ATCC CRL-10686)、PA317(ATCC CRL-9078)、GP+E-86和GP+envAm-12，和Psi-Crip。还可以使用具有高转染效率的293细胞或293T细胞来制备逆转录病毒颗粒。基于逆转录病毒和可以用于包装逆转录病毒载体的包装细胞生产的多种逆转录病毒载体，可以从许多公司广泛商购得到。
CAR-T细胞经由CAR与特定抗原结合，从而将信号传递到细胞内，由此激活细胞。表达CAR的细胞的激活根据宿主细胞的种类和CAR的胞内结构域而变化，并且可以基于例如细胞因子的释放、细胞增殖率的改善、细胞表面分子中的变化等等作为指标进行确认。例如，从激活细胞中释放细胞毒性细胞因子(IFN-γ、肿瘤坏死因子、淋巴毒素等)会破坏表达抗原的靶细胞。另外，细胞因子的释放或细胞表面分子中的变化刺激其它免疫细胞，例如B细胞、树突状细胞、NK细胞和巨噬细胞。
表达CAR的细胞可以用作疾病的治疗剂。治疗剂包括作为活性成分表达CAR的细胞，并且它可以进一步包括合适的赋形剂。
本发明人已制备了针对过表达CD37的血液癌细胞的CD37-CAR-T细胞。本发明人已提供数据证明了CD37在诸如淋巴瘤和某些白血病的血液癌症中的有效表达。CD37-CAR-T细胞针对CD37阳性癌细胞表现出比针对非转导的T细胞和模拟CAR-T细胞更高的细胞毒性活性。
本发明的CD37单克隆抗体或CD37-ScFv超过其它已知CD37抗体的优点在于，本文的抗体对淋巴瘤抗原具有高结合活性，并且它针对淋巴瘤中CD37阳性癌细胞是高度特异性的。这提供了用于靶向血液癌症的更广泛范围的抗体应用。CD37抗体在许多临床应用中作为治疗剂是高度有效的。
本文的单克隆小鼠抗人CD37抗体检测到CD37阳性癌细胞中的CD37。
本文的CD37抗体可以用于免疫治疗应用：毒素/药物偶联Ab、单克隆治疗性抗体、CD37抗体的人源化和CAR-T细胞免疫疗法。
使用本文CD37抗体的CD37-CAR-T细胞可以靶向诸如淋巴瘤和某些白血病中的CD37阳性细胞系中的CD37抗原。
CD37-CAR-T可以与不同疗法联合使用：检查点抑制剂；靶向治疗、小分子抑制剂和抗体。
CD37抗体可以用定点突变进行修饰用于亲和力调整；它可以进行人源化，并且可以用于完整的人抗体制备。
CD37-CAR-T细胞可以在临床上用于CD37阳性细胞。
CD28或4-1BB的共刺激结构域的修饰可能增加CAR的功效。标签偶联的CD37 scFv可以用于CAR生成。
第三代CAR-T或其它共激活信号传导结构域可以与本文的CD37-scFv一起使用，以制备CD37-CAR。
本文的小鼠CD37抗体可以进行人源化，用于生成CD37-CAR。
CD37-CAR与靶向其它肿瘤抗原或肿瘤微环境的其它CAR(VEGFR-1-3)、PDL-1、CD80或双scFv-CAR的组合，可以用于增强单一疗法CD37-CAR的活性。可以生成CD37和CD3或其它抗原的双特异性抗体用于治疗。
本文的CD37-CAR可以用于生成其它类型的细胞，诸如CAR-自然杀伤(NK)细胞、CD37-CAR-巨噬细胞和其它CD37-CAR造血细胞，这些细胞可以靶向CD37阳性癌症。本发明提供了被修饰为表达CD37-CAR的T细胞、或NK细胞、或巨噬细胞、或造血细胞。
下述实施例进一步说明了本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不应被解释为限制性的。
实施例
实施例1.抗CD37抗体：VH、VL以及scFv序列
我们使用Boeye[4]所述的标准杂交瘤技术制备了小鼠单克隆抗人CD37抗体。通过对于CD37呈阳性的杂交瘤克隆之一(2B8D12)测序而获得CD37scFv。CD37 scFv的结构是：VH-接头-VL。
小鼠CD37 VH的核苷酸序列和氨基酸序列如下所示。
接头的核苷酸序列和氨基酸序列如下所示。
小鼠CD37 VL的核苷酸序列和氨基酸序列如下所示。
CD37 scFv(VH-接头-VL)的氨基酸序列如下所示。粗体突出显示了VH的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)；下划线突出显示了VL的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)；两者之间的(斜体的)是3×G4S接头序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。
实施例2.CD37抗体通过免疫染色检测到CD37阳性细胞中的CD37蛋白
抗体CD37，克隆2B8D12，通过ELISA检测到细胞外CD37蛋白(CD37蛋白的OD405读数为1.53，而阴性无关对照蛋白的OD405读数为0.098)。抗体是IgG1型。
图4A表示用含CD37质粒转化的HEK 293细胞系(HEK293-CD37)、而不是用未转染的HEK293(HEK293)或阴性对照蛋白CD18转化的HEK 293细胞系(HEK293-CD18)的、CD37抗体的特异性免疫荧光染色(上行附图)。下行附图显示了核DNA的DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)蓝色荧光染色，以示出细胞的存在。
图4B显示了CD37抗体在具有CD37稳定表达的CHO-CD37细胞(右图)中检测到CD37抗原，而在CHO细胞(左图)中却没有。中图使用同种型抗体作为对照。
图4C显示了CD37抗体在体腔淋巴瘤(BCBL-1)细胞系(左图)和小鼠淋巴细胞性白血病细胞系L1210细胞系(右图)中检测到CD37抗原。两种细胞系中的免疫染色均显示了膜染色。
实施例3.通过IHC染色CD37在大多数正常组织中的低表达
使用免疫组织化学染色的CD37抗体显示大多数正常组织中显示阴性染色，但在其中存在血液细胞的扁桃体中呈现出非常高的表达。CD37抗体(2B8D12)的稀释度为1:700。在肝癌、胃癌、十二指肠癌和乳腺癌中存在一些阳性染色。大多数组织呈阴性：食道、食道癌、甲状腺、结肠癌、直肠、睾丸和其它组织。
实施例4.CD37抗体在CD37阳性淋巴瘤细胞中检测到CD37
我们用CD37抗体染色不同的细胞系。图5显示了在CD37阳性Raji淋巴瘤细胞上的FACS染色，但在CD37阴性细胞(诸如Lovo结肠癌细胞、MCF-7、MDA-231乳腺癌细胞、K562慢性粒细胞性白血病细胞)中呈阴性，并且在CD37阴性RPMI8226多发性骨髓瘤细胞中非常弱的染色。K562慢性粒细胞性白血病细胞并不表达CD37。
实施例5.CD37-CAR序列
CD37-CAR构建体的图解如图3所示。具有EF1启动子的慢病毒载体用于克隆scFvCAR序列。我们还使用MNDU-3启动子慢病毒载体来增加CAR阳性细胞的百分比。
下述核苷酸序列显示了本发明的CD37 ScFv-CD8铰链-TM28-CD28-CD3ζ。该结构包括人CD8信号传导肽、小鼠CD37 scFv(VH-接头3×(G4S)-VL)、人CD8铰链、人CD28跨膜、共刺激结构域人CD28、激活结构域人CD3ζ(图3)。
CD8前导区-CD37 scFv(VH-接头-VL)-CD8铰链-CD28 TM-CD28-CD3-ζ(CD37-CD28CAR)的每个区段的核酸序列和氨基酸序列如下所示。
<CD8前导区>
<Nhe I位点>
<CD37 ScFv>VH-接头-VL
关于核酸序列和氨基酸序列，参见实施例1。
<XhoI限制性酶切位点>
<CD8铰链>
<CD8 TM>
<CD28/共刺激结构域>
<CD3ζ>
<EcoRI限制性酶切位点>
CD37-CAR蛋白的氨基酸序列如下所示。
分别用CD8跨膜结构域和4-1BB共刺激结构域代替CD28TM和CD28共刺激结构域，制备了类似的CD37-CAR构建体。
CD8前导区-CD37 scFv(VH-接头-VL )-CD8铰链-CD8 TM-4-1BB-CD3ζ(CD37-4-1BBCAR)：
核苷酸序列(SEQ ID NO:20)
氨基酸序列(SEQ ID NO:21)
实施例6.CAR慢病毒的制备
如[5]中所述，使用293T细胞通过标准程序制备慢病毒。本发明人制备了克隆到慢病毒载体的Xba I和EcoR I位点内的、在慢病毒载体内部的CD37CAR构建体。pCD510-CD37-CD28(或4-1BB)-CD3ζ慢病毒CAR构建体在Xba I和Eco RI克隆位点之间包含CD37 ScFv-CD28(或4-1BB)-CD3ζ。
在293T细胞中生成慢病毒，并且通过RT-PCR确定滴度。等剂量的慢病毒用于T细胞的转导。
实施例7.从全血中分离外周血单核细胞(PBMC)
全血(Stanford Hospital Blood Center，Stanford，CA)从个体或混合供体(取决于所需的血液量)中收集到10mL肝素真空采血管(Becton Dickinson)中。将大约10ml的抗凝血全血与无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液在50ml锥形离心管(PBS，pH 7.4，不含Ca2+和Mg2+)中混合，总体积共20ml。取出在稀释的血浆/Ficoll界面处的含有外周血单核细胞(PBMC)的细胞层，用PBS洗涤两次，并且在室温下以200xg离心10分钟。用血细胞计数器来计数细胞。PBMC用CAR-T培养基(ATM V-AlbuMAX(BSA)(LifeTechnologies)，和含有5％AB血清和1.25μg/mL两性霉素B(Gemini Bioproducts，Woodland，CA)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)洗涤一次后，用于实验或在-80℃下冷冻。
实施例8.来自PBMC的T细胞激活
在不存在人白细胞介素2(huIL-2)(Invitrogen)的情况下，以5×105个细胞/mL的浓度，将新鲜分离的PBMC用1×PBS(pH7.4，无Ca2+/Mg2+)洗涤，并且在CAR-T培养基(AIM V-AlbuMAX(BSA)(Life Technologies)，和含有5％AB血清和1.25μg/mL两性霉素B(GeminiBioproducts，Woodland，CA)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)中洗涤一次，然后在不含huIL-2的CAR-T培养基中洗涤一次，之后将它们最终在含有300U/mL huIL2(来自1000x原液；Invitrogen)的CAR-T培养基中重悬浮至最终浓度为5×105个细胞/mL。然后通过将25μL磁珠转移到1mL PBMC中，以1:1的磁珠/细胞比将PBMC和磁珠混合。将所需数目的等分试样分配到培养板的单个孔中，然后在病毒转导之前，在37℃和CO2的存在下孵育24小时。
实施例9.T细胞转导和扩增
在PBMC激活之后，将细胞在37℃、5％CO2下孵育24小时。向1×106个细胞的每个孔中，加入5×106个慢病毒和2μL/mL Transplus培养基(Alstem，Richmond，CA)(最终稀释度为1:500)。在重复加入病毒之前，使细胞再孵育24小时。然后使细胞在具有300U/ML IL-2新鲜培养基的持续存在下生长12-14天(总孵育时间取决于所需的CAR-T细胞的最终数目)。每2-3天分析细胞浓度，此时加入培养基以将细胞悬浮液稀释至1×106个细胞/mL。
实施例10.通过FACS验证转导
将细胞洗涤并且悬浮于FACS缓冲液(磷酸盐缓冲盐水PBS)加上0.1％叠氮化钠和0.4％BSA)中。然后将细胞分成1×106等分试样。
Fc受体用正常山羊IgG(Life Technologies)进行封闭。将100μl 1:1000稀释的正常山羊IgG加入每个管中，并且在冰上孵育10分钟。
将1.0ml FACS缓冲液加入每个管中，充分混合并且以300g离心5分钟。添加生物素标记的多克隆山羊抗小鼠F(ab)2抗体(Life Technologies)以检测CD37 ScFv；添加生物素标记的正常多克隆山羊IgG抗体(Life Technologies)作为同种型对照。(1:200稀释度，100μL的反应体积)。细胞在4℃下孵育25分钟，用FACS缓冲液洗涤一次。将细胞悬浮于FACS缓冲液中，通过向每个管中加入100μl 1:1000稀释的正常小鼠IgG(Invitrogen)进行封闭，并在冰上孵育10分钟。细胞用FACS缓冲液洗涤，并且重悬浮于100ml FACs缓冲液中。
然后用藻红蛋白(PE)标记的链霉抗生物素蛋白(BD Pharmingen，San Diego，CA)和别藻蓝蛋白(APC)标记的CD3抗体(eBiocience，San Diego，CA)来染色细胞。
实施例11.实时细胞毒性测定
如[5]所述，根据制造商的方案，使用ACEA机器检测细胞毒性。用XCELLigence***进行实时细胞毒性测定(RTCA)。
实施例12.CD37-CAR-T细胞表达CD37 scFv
将CD37 scFv序列(实施例1)与共刺激结构域CD28或41BB和激活结构域CD3ζ一起***CAR内部，并且将慢病毒CAR转导到T细胞内。CD37-CAR细胞在体外有效扩增(未示出)。模拟对照的scFv来自胞内蛋白质，并且用作细胞毒性和细胞因子测定中的阴性对照。通过FACS用小鼠抗FAB抗体检测CD37-CAR阳性细胞(图6，右图)，所述小鼠抗FAB抗体与胞外scFvCAR结构域结合。通过小鼠抗FAB抗体未检测到对照未转导的T细胞(图6，左图)。
实施例13.与模拟CAR-T细胞和未转导的T细胞相比，CD37-CAR-T细胞对CD37阳性细胞表现出高细胞毒性活性，并高于CD37阴性细胞
在图7A-7B中，CD37-CAR使用EF-1-慢病毒载体制备。在图7C中，CD37-CAR使用MNDU3启动子-慢病毒载体制备。
RTCA细胞毒性测定如下执行：利用靶CHO-CD37细胞(图7A)和对照CHO细胞(图7B)，与T细胞、模拟CAR-T细胞、用EF-1启动子慢病毒生成的CD37-CD28-CD3ζ-CAR-T细胞和CD37-41BB-CD3ζ-CAR-T细胞分别共培养。CD37-CAR-T细胞特异性地杀伤CHO-CD37细胞(图7A)，而不是CHO细胞(图7B)。
使用MNDU3启动子慢病毒制备的CD37-CD28-CD3ζ-CAR T细胞，观察到类似的RTCA活性(图7C)
实施例14.CD37-CAR-T细胞针对CD37阳性癌细胞分泌高水平的IFN-γ。
我们收集了CHO-CD37癌细胞与CD37-CAR-T细胞共孵育后的清液，并根据制造商的方案，用来自Fisher的试剂盒进行了ELISA。CD37-CAR-T细胞针对CD37阳性细胞分泌的IFN-γ水平显著高于CD37阴性细胞，且高于对照T细胞和模拟CAR-T细胞(图8)。图8显示了通过CD37-CAR-T细胞针对CHO-CD37细胞、而不针对CHO细胞的高IFN-γ分泌。
我们还使CD37-CD28-CAR-T细胞与CD37阳性Raji细胞和CD37阴性K562细胞一起孵育，并且用上清液进行了ELISA测定，以检测CAR-T细胞的IFN-γ分泌。观察到CD37-CD28-CAR-T细胞针对Raji靶细胞的IFN-γ分泌显著高于CD37-CD28-CAR-T细胞对K562细胞的IFN-γ分泌(图9)。用CD37-41BB-CAR-T细胞观察到类似的结果(数据未显示)。
实施例15.CD37-CAR-T细胞在体内显著降低Raji异种移植瘤生长
我们使用NSG小鼠，将Raji-萤光素酶阳性细胞静脉内注射到NSG小鼠内，然后在第1天在NSG小鼠中通过i.v方式实施CD37-CD28-CAR-T细胞(实施例5)的一次注射。与用PBS和T细胞处理的小鼠相比，用CD37-CD28-CAR-T细胞处理的小鼠生物发光信号显著降低(图10)，其证实了CD37-CAR-T细胞显著降低Raji异种移植瘤生长。CD37-CD28-CAR-T细胞并未降低小鼠体重，表明不存在CAR-T细胞毒性(数据未示出)。在小鼠血液中检测到CAR-T细胞，表明CAR-T细胞在体内具有持久性。
图11显示了在Raji异种移植瘤的体内模型中，与用PBS处理的小鼠相比，用CD37-CD28-CAR-T细胞处理的小鼠延长了小鼠的存活。因此，CD37-CAR-T细胞在体内抑制了肿瘤生长，并且延长了小鼠存活期。
参考文献
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湖南远泰生物技术有限公司
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<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 281
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Ser Ala Gln Glu Ser Cys Leu Ser Leu Ile Lys Tyr Phe Leu Phe
1 5 10 15
Val Phe Asn Leu Phe Phe Phe Val Leu Gly Ser Leu Ile Phe Cys Phe
20 25 30
Gly Ile Trp Ile Leu Ile Asp Lys Thr Ser Phe Val Ser Phe Val Gly
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Leu Ala Phe Val Pro Leu Gln Ile Trp Ser Lys Val Leu Ala Ile Ser
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Gly Ile Phe Thr Met Gly Ile Ala Leu Leu Gly Cys Val Gly Ala Leu
65 70 75 80
Lys Glu Leu Arg Cys Leu Leu Gly Leu Tyr Phe Gly Met Leu Leu Leu
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Trp Phe Gln Val Leu Ile Leu Arg Gly Asn Gly Ser Glu Ala His Arg
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Val Pro Cys Ser Cys Tyr Asn Leu Ser Ala Thr Asn Asp Ser Thr Ile
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Leu Asp Lys Val Ile Leu Pro Gln Leu Ser Arg Leu Gly His Leu Ala
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Arg Ser Arg His Ser Ala Asp Ile Cys Ala Val Pro Ala Glu Ser His
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<212> DNA
<213> 小家鼠（Mus musculus）
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<212> PRT
<213> 小家鼠
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
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<213> 小家鼠
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Leu Glu Ile Lys Arg Leu Glu Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
260 265 270
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
275 280 285
Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
290 295 300
Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
305 310 315 320
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
325 330 335
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
340 345 350
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
355 360 365
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe
370 375 380
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
385 390 395 400
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
405 410 415
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg
420 425 430
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
435 440 445
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
450 455 460
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
465 470 475 480
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 20
<211> 1449
<212> DNA
<213> 智人
<400> 20
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgcaggtga agctggatga gactggagga ggcttggtgc aacctgggag gcccatgaaa 120
ctctcctgtg ttgcctctgg attcactttt agtgactact ggatgaactg ggtccgccag 180
tctccagaga aaggactgga gtgggtagca caaattagag acaaacctta taattatgaa 240
acattttatt cagattctgt gaaaggcaga ttcaccatat caagagatga ttccaaaagt 300
agtgtctacc tgcaaatgaa caacttagga gctgaagaca tgggtatcta ttactgtaca 360
gggtcgtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgcagg tggcggtggt 420
tctggtggcg gtggttctgg tggcggtggt tctgacatcc agatgactca gtctccagcc 480
tccctatctg catctgaggg agaaactgtc accatcacat gtcgagcaag tgggaatatt 540
cacaattatt tagcatggta tcagcagaaa cagggaaaat ctcctcagct cctggtctat 600
aatgcaaaaa ccttaccaga tggtgtgcca tcaagggtca gtggcagtgg atcaggaaca 660
cagtattctc tcaagatcaa caacctgcag cctgaagatt ttgggaatta ttactgccaa 720
cagtattgga gtactccgta cacgttcgga ggggggtcca ggctggaaat aaaacggacc 780
acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc 840
ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac 900
ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc ctggccggga cttgtggggt ccttctcctg 960
tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa 1020
caaccattta tgagaccagt acaaactact caagaggaag atggctgtag ctgccgattt 1080
ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc 1140
cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag 1200
gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga 1260
aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 1320
tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 1380
cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 1440
cctcgctaa 1449
<210> 21
<211> 482
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Arg Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Thr Phe Ser Asp Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Val Ala Gln Ile Arg Asp Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu
65 70 75 80
Thr Phe Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
85 90 95
Asp Ser Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Gly Ala Glu
100 105 110
Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Gly Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala
145 150 155 160
Ser Leu Ser Ala Ser Glu Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
165 170 175
Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly
180 185 190
Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Pro Asp Gly
195 200 205
Val Pro Ser Arg Val Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu
210 215 220
Lys Ile Asn Asn Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln
225 230 235 240
Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Ser Arg Leu Glu
245 250 255
Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
260 265 270
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
275 280 285
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
290 295 300
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
305 310 315 320
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
325 330 335
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
340 345 350
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
355 360 365
Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys
370 375 380
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
385 390 395 400
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
405 410 415
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
420 425 430
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
435 440 445
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
450 455 460
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
465 470 475 480
Pro Arg

Claims (13)

1.一种单克隆抗人CD37抗体，包括具有SEQ ID NO:3的氨基酸的VH和具有SEQ ID NO:7的氨基酸的VL。
2.一种单链可变片段(scFv)，包括具有SEQ ID NO:3的氨基酸的VH和具有SEQ ID NO:7的氨基酸的VL。
3.根据权利要求2所述的scFv，其进一步包括位于VH和VL之间的接头。
4.根据权利要求3所述的scFv，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
5.一种嵌合抗原受体(CAR)，其从N末端到C末端包括：
(i)权利要求2所述的scFv，
(ii)跨膜结构域，
(iii)至少一个共刺激结构域，和
(iv)激活结构域。
6.根据权利要求5所述的CAR，其中，所述scFv具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
7.根据权利要求5所述的CAR，其中，所述共刺激结构域是CD28或4-1BB。
8.根据权利要求5所述的CAR，其中，所述激活结构域是CD3ζ。
9.根据权利要求5所述的CAR，其具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
10.根据权利要求5所述的CAR，其具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
11.一种编码权利要求5所述的CAR的核酸。
12.一种经修饰以表达权利要求5所述的CAR的T细胞。
13.一种经修饰以表达权利要求5所述的CAR的自然杀伤细胞。
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