CN112724253B

CN112724253B - 抗人穹窿体蛋白的抗体及其应用

Info

Publication number: CN112724253B
Application number: CN202110257408.7A
Authority: CN
Inventors: 付康; 赵逸堃; 李胡丹
Original assignee: SANGON BIOTECH (SHANGHAI) CO Ltd
Current assignee: SANGON BIOTECH (SHANGHAI) CO Ltd
Priority date: 2021-03-09
Filing date: 2021-03-09
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2041-03-09
Also published as: CN112724253A

Abstract

本发明公开了一种抗人穹窿体蛋白的抗体及其应用，涉及生物医药技术领域。本发明公开的抗体包括SEQ ID NO.1所示的重链可变区和SEQ IDNO.2所示的轻链可变区。该抗体能够特异性结合人穹窿体蛋白，具有良好的特异性和较高的亲和力，可以用于诊断以穹窿体蛋白为标志物的相关疾病以及用于检测人穹窿体蛋白。

Description

抗人穹窿体蛋白的抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及抗人穹窿体蛋白的抗体及其应用。

背景技术

肿瘤多药耐药(MDR)是近年来肿瘤治疗研究的困扰之一，其产生机制非常错综复杂。随着对非P-糖蛋白介导MDR机制研究的不断深入，肺耐药相关蛋白(lung resistance-related protein,LRP)被证实在DMR中发挥着重要作用，有望成为一种新的治疗靶点。LRP基因已由Scheper等克隆成功，其基因与褐鼠MVP氨基酸87％的序列相同，由此推断LRP为人的穹窿体蛋白。穹窿体蛋白，又称MVP。经研究在一种人非小细胞肺癌的细胞株中筛选出耐药细胞株，其氨基酸系列有87.7％与穹窿体蛋白(major vaμlt protein，MVP)具有同源，所以MVP又称为肺耐药相关蛋白。

穹窿是一种重要的细胞器，广泛分布于多物种，在真核生物中高度保守，大多位于胞质，5％位于核孔附近与核膜相连。通过聚焦显微镜观察到不同细胞类型中LRP独特的定位于胞浆内，呈粗糙颗粒状或囊泡状，核膜孔复合体内并未见。

肿瘤的多药耐药(Mμlti-drug resistance，MDR)现象是困扰临床治疗的一大难题，在肺耐药蛋白被证实为MVP后，穹窿体与MDR的关系被广泛研究。很多研究证明，MDR细胞中MVP的表达强度与耐药程度呈正相关，MVP的蛋白水平有不同程度的上调。同时通过对86例急性淋巴细胞白血病的统计，MVP在复发者中高表达，阳性率为85.7％。

因为LRP与肿瘤细胞多药耐药的相关性，国内外研究均报道了通过分析MVP的表达与肿瘤患者的生物学行为和预后指标的关系，将MVP作为治疗和预后评判指标。肺耐药相关蛋白主要通过阻止药物进入胞核或使入胞质的药物进入运输囊泡，以胞吐方式排出到胞外以降低细胞内药物浓度而产生耐药。MVP若高表达则提示预后不良。抗MVP单克隆抗体将有利于癌症治疗和预后的诊断并使癌症的诊断独立于病因学之外，因此更加简便。但目前，缺乏针对MVP的单克隆抗体。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗人穹窿体蛋白的抗体及其应用，本发明提供的抗人穹窿体蛋白的抗体能够特异性结合人穹窿体蛋白，具有良好的特异性和较高的亲和力，可以用于诊断以穹窿体蛋白为标志物的相关疾病以及用于检测人穹窿体蛋白。

本发明是这样实现的：

一方面，本发明提供一种抗人穹窿体蛋白的抗体或其抗原结合片段，该抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供的抗人穹窿体蛋白的抗体具有如上所述氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区，该抗人穹窿体蛋白的抗体可特异性识别人穹窿体蛋白，不仅可用于检测人穹窿体蛋白，还作为诊断试剂，用于诊断以穹窿体蛋白为标志物的相关疾病例如肿瘤等，该抗体对人穹窿体蛋白具有较高的特异性和亲和力。

如本发明所用术语“抗体”，是指能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点特异性结合到标靶的免疫球蛋白分子。本发明所使用的“抗体”不仅包括完整的(即全长的)抗体，而且还包括其抗原结合片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、其变异体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及任何其他包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的修改配置，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体及共价修饰的抗体等。

通常，完整或全长的抗体包含两个重链和两个轻链。每个重链含有重链可变区(VH)和第一、第二及第三恒定区(CH1、CH2及CH3)。每个轻链含有轻链可变区(VL)和恒定区(CL)。全长的抗体可以是任何种类的抗体，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或上述的子类)，但抗体不需要属于任何特定的类别。根据重链的恒定区的抗体氨基酸序列，可以将抗体分为不同的类别。通常，抗体有五种主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，而且这些类别中有几个可以再被进一步区分成子类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同抗体类别的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、以及μ。不同类别的抗体的子单元结构和三维结构是公知的。

可选的，在本发明的一些实施方案中，所述抗原结合片段选自所述抗体的Fab’、Fab、F(ab’)2、scFv和Fv中的任意一种。

如本发明所用术语“抗原结合片段”，是指负责结合抗原(如人穹窿体蛋白或含有人穹窿体蛋白的复合物)的完整抗体分子的一部分或区域。其可以包含重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)或上述两者，通常为Fab’、Fab、F(ab’)2、scFv和Fv等结构形式，这些结构对本领域技术人员来说是公知的。

可选的，在本发明的一些实施方案中，所述抗体的恒定区选自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区。

可选的，在本发明的一些实施方案中，所述抗体的恒定区的种属来源为小鼠、大鼠、牛、马、羊、兔或狗。

可选的，在本发明的一些实施方案中，所述抗体的恒定区的种属来源为小鼠。

需要说明的是，本领域技术人员可以根据需要对本发明提供的抗体进行各种改造例如人源化改造，亲和力改造等，无论何种形式的改造，只要一本发明提供的抗体为基础进行改造得到的抗体只要具有本发明前述的可变区序列或其中的互补决定区即属于本发明的保护范围。

另一方面，本发明还提供如上所述的抗体或其抗原结合片段在制备肿瘤诊断试剂或试剂盒中的应用，所述肿瘤的诊断标志物为人穹窿体蛋白。

以人穹窿体蛋白为标志物的肿瘤包括：肺腺癌、乳腺癌等。

另一方面，本发明还提供含有如上所述的抗体或其抗原结合片段的免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体或药物组合物。

另一方面，本发明还提供一种检测试剂盒，所述试剂盒含有如上所述的抗体或其抗原结合片段。

可选的，本发明的一些实施方案中，当本发明提供的抗体或其抗原结合片段作为检测试剂检测人穹窿体蛋白时，该抗体或其抗原结合片段具有可被检测的检测标记。

检测标记可选自酶、荧光材料、配体、发光材料、微粒、氧化还原分子和放射性同位素，但不限于此。当酶用作检测标记时，该酶包括但不限于β-葡萄糖醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶、鸟苷二磷酸酶(GDPase)、核糖核酸酶、葡萄糖氧化酶、荧光素酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶、磷酸烯醇丙酮酸脱羧酶和β-内酰胺酶等。当荧光材料用作检测标记时，该荧光材料包括但不限于荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺等。当配体用作检测标记时，该配体包括但不限于生物素衍生物等。当发光材料用作检测标记时，该发光材料包括但不限于吖啶酯、萤光素和萤光素酶等。当微粒用作检测标记时，该微粒包括但不限于胶体金、有色乳胶等。当氧化还原分子用作检测标记时，该氧化还原分子包括但不限于二茂铁、钌络合物、紫罗碱、醌、Ti离子、Cs离子、二酰亚胺、1,4-苯醌、对苯二酚、K₄W(CN)₈、[Os(bpy)₃]²⁺、[RU(bpy)₃]²⁺、[MO(CN)₈]^4-等。当放射性同位素用作检测标记时，该放射性同位素包括但不限于³H、¹⁴C、³²P、³⁵S、³⁶Cl、⁵¹Cr、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I和¹⁸⁶Re等。

另一方面，本发明还提供一种分离的核酸分子，其编码如上所述的抗体或其抗原结合片段。

可选地，在本发明的一些实施方案中，编码上述重链可变区的核酸分子的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。

可选地，在本发明的一些实施方案中，编码上述轻链可变区的核酸分子的核酸序列如SEQ ID NO.4所示。

基于本领域的公知常识，例如根据如下表所示的氨基酸对应的密码子关系，本领域技术人员容易根据本发明提供的氨基酸序列获得编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子。

另一方面，本发明还提供一种重组载体，其含有如上述的核酸分子。

另一方面，本发明还提供一种重组细胞，其含如上所述的重组载体。

另一方面，本发明还提供一种制备如上所述的抗体或其抗原结合片段的方法，培养上述的重组细胞，从培养产物中分离纯化得到所述抗体或其抗原结合片段。

基于本发明提供的上述的抗体序列，本领域技术人员可以通过本领域常规的技术例如基因工程技术等得到本发明前述的抗体或抗原结合片段，无论以何种方法制造本发明前述的抗体，其均属于本发明的保护范围。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1中免疫细胞化学(ICC)筛选时阳性细胞的图片。

图2为实施例2中单克隆细胞株2D6-1的重链和轻链经过pcr扩增后在琼脂糖凝胶电泳上的目的条带。

图3为实施例3中采用MVP单克隆细胞株(2D6-1)的细胞上清作为一抗后进行免疫组化的染色结果。

图4为实施例3中采用MVP单克隆细胞株(2D6-1)的细胞上清与抗原中和反应后再作为一抗进行免疫组化的染色结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

特异性抗MVP的小鼠单克隆抗体的获得

1动物(小鼠)免疫

根据文献中(E Harlow,D.Lane,Antibody:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)通用的方法，用免疫原免疫小鼠。免疫原为带His标签的重组人MVP蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)，同时作为检测抗原，对血清效价和杂交瘤进行测定和筛选，高纯度的抗原能使得到所需单抗的机会增加，同时减轻筛选量。免疫5只小鼠，每只小鼠免疫50μg MVP抗原。用PBS配置抗原蛋白溶液。将适量的抗原蛋白、PBS、福氏佐剂放入注射器中，注射器出水口用塞子塞住，放在乳化仪上搅拌充分乳化，使抗原佐剂形成稳定油包水的溶液。在初免和二免后的7-10天进行第一次尾血血清效价检测，经过2到4次的加强免疫得到良好的效价。选择血清效价高的免疫小鼠腹腔终免后进行细胞融合。

重组人MVP蛋白的氨基酸序列如下：

MATEEFIIRIPPYHYIHVLDQNSNVSRVEVGPKTYIRQDNERVLFAPMRMVTVPPRHYCTVANPVSRDAQGLVLFDVTGQVRLRHADLEIRLAQDPFPLYPGEVLEKDITPLQVVLPNTALHLKALLDFEDKDGDKVVAGDEWLFEGPGTYIPRKEVEVVEIIQATIIRQNQALRLRARKECWDRDGKERVTGEEWLVTTVGAYLPAVFEEVLDLVDAVILTEKTALHLRARRNFRDFRGVSRRTGEEWLVTVQDTEAHVPDVHEEVLGVVPITTLGPHNYCVILDPVGPDGKNQLGQKRVVKGEKSFFLQPGEQLEQGIQDVYVLSEQQGLLLRALQPLEEGEDEEKVSHQAGDHWLIRGPLEYVPSAKVEVVEERQAIPLDENEGIYVQDVKTGKVRA。

2杂交瘤细胞融合与筛选

在细胞融合前需要做好准备工作：(1)培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0至对数生长期；(2)在融合前一天处死一只阴性鼠，在无菌环境中用HAT培养基注入小鼠腹腔取小鼠腹腔滋养层细胞并铺板在96孔板，每孔100μl，这些细胞对杂交瘤细胞生长有促进作用；(3)处死免疫小鼠，在无菌环境下取脾脏，根据上述文献中的方法使用PEG化学融合脾B细胞和SP2/0骨髓瘤细胞，根据要铺板的个数，加入合适的HAT培养基；(4)最后将融合细胞铺在滋养层细胞培养板上，每孔100μl。

7-10天后可在显微镜下观察存活的杂交瘤细胞生长情况，在铺板两周后，收集各孔上清，用ELISA方法用人MVP-his蛋白抗原进行杂交瘤细胞筛选。方法如下：用100μl 2μg/ml人MVP-his蛋白抗原的PBS溶液包被酶标板37℃两小时。PBST洗板3次后，加入150μl/孔的3％脱脂奶粉的PBS溶液至于4℃封闭过夜。再洗板三次，加入80μl/孔的杂交瘤上清，37℃孵育1小时，而后洗板三次。以100μl/孔加入1：7000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗，37℃孵育45分钟，洗板3次，拍干。添加100μl/孔的TMB显色液，室温显色5-10分钟，用2M硫酸溶液终止，测定450纳米处各孔的吸光值。挑选出阳性的杂交瘤细胞。

将ELISA阳性的融合孔，挑选出来接着做免疫细胞化学染色(ICC)，挑选出阳性孔做后续实验。实验步骤如下：(1)实验前几天将贴壁细胞人非小细胞肺癌细胞(A549)用胰酶消化液消化好后铺在96孔板里，贴壁生长铺满孔板；(2)取出96孔板，倒掉培养基，PBS清洗3次；(3)加入4％多聚甲醛室温固定15-30分钟，PBS洗板三次；(4)0.2％triton×-100室温10-15min，PBS漂洗三次；(5)3％双氧水处理15min，PBS漂洗3次；6.3％山羊血清37℃封闭1小时；(6)将融合孔ELISA阳性的细胞上清去80μl加入到icc检测板上4℃过夜；(7)PBST漂洗后，加入二抗室温反应40min；(8)DAB显色；(9)苏木素染色；(10)PBST反蓝观察，见图1。

通过ELISA和ICC实验挑出结合为阳性的融合细胞，通过有限稀释法克隆，每孔阳性株铺48/96孔板，继续培养。并通过ELISA方法进行第二轮复筛，筛选出特异性识别MVP且能阻断MVP结合的杂交瘤，通过有限稀释法亚克隆，获得单克隆细胞株(2D6-1)。将单克隆细胞株进行扩培，将收集到的约1×10⁶个细胞注射进挑选好的老鼠(老鼠需提前一周在腹腔注射石蜡油)，再经过7-10天的等待，小鼠产生腹水，收集腹水进行抗体纯化。提纯后，获得特异性抗人MVP的小鼠单克隆抗体。

实施例2

DNA克隆和测序，抗人MVP单克隆抗体的可变区基因测序。

使用Trizol试剂提取小鼠单克隆细胞株中的总RNA。收集在9cm皿中培养的细胞到1.5ml离心管中，将上清吸干。加入1ml的Trizol试剂并将细胞吹打均匀使细胞裂解，将裂解后样品或匀浆液室温放置5-10min，使得核蛋白与核酸完全分离。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15sec，室温放置3min。12000rpm4℃离心10min。吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20min。12000rpm 4℃离心10min，弃上清。加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀。12000rpm 4℃离心3min，弃上清。室温干燥5-10min。加入30-50μl RNase-freeddH₂O。将所得到的RNA溶液置于-70℃保存或用于后续实验。

选用AMV第一链cDNA合成试剂盒把总RNA逆转录为cDNA。实验体系配置如下，6μl的总RNA+1μl Oligo dT+4μl RNase-free水(共11μl)。轻轻混匀后离心3-5s，反应混合物在65℃温浴5mi预变性后，冰浴30s，然后离心3-5s，接着冰浴2min。在冰浴状态下加入4μl的5×缓冲液+1μl的dNTP混合物+1μl的RNase抑制剂+1μl逆转录酶(总共20μl体系)，轻轻混匀后离心3-5s，在PCR仪上42℃50分钟，85℃5min，完成cDNA合成。随机引物适合于500bp以下的短链cDNA的合成，所转录的RNA模板无需poly(A)尾，可转录5`端区域。

轻链与重链的PCR扩增。对于扩增抗体轻链可变区序列，配置PCR反应体系：2×Taq酶缓冲液25μl+FP-VL 1μl+RP-VL 1μl+cDNA 2μl+ddH₂O 21μl。对于扩增抗体重链可变区序列，配置PCR反应体系：2×Taq酶缓冲液25μl+FP-VH 1μl+RP-VH 1μl+cDNA 2μl+ddH₂O 21μl。重链和轻链可变区PCR扩增的温度循环如下(其中步骤2到4，重复35个循环)：

步骤1-预变性94℃，4min；

步骤2-变性94℃，30sec；

步骤3-退火55℃，45sec；

步骤4-延伸72℃，60sec；

步骤5-72℃，10min；

步骤6-保存4℃。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析(见图2)，切出对应大小的DNA区段条带(VH的约为375bp，VL的约为325bp)，用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行DNA提取。简述如下：从琼脂糖凝胶中割下含目标片段的胶块，称重；加入胶块重量3-6倍的buffer B2，50℃水浴5-10分钟溶胶；将溶胶液移入吸附柱中，8000g离心30秒；倒掉收集管中的液体；柱中加入500μl wash Solution，9000g离心30秒，倒掉收集管中液体；再重复加wash solution一次，倒掉液体；孔吸附柱于9000g离心1分钟；将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入15-40μl Elution Buffer，室温静置1分钟后，离心1分钟。获得制备的DNA溶液，纯化PCR产物经过测序获得抗体的可变区序列。测序结果见下表1。

表1单克隆细胞株2D6-1分泌的鼠抗人MVP单克隆抗体的VH和VL的氨基酸序列

实施例3

基于免疫组化(IHC)测定抗体与肺耐药相关蛋白的结合能力

将乳腺癌组织切片置于60℃恒温箱中烘烤60分钟，将切片用二甲苯Ⅰ浸泡15分钟，更换二甲苯Ⅱ后浸泡15分钟，分别在无水乙醇浸泡5分钟、无水乙醇中浸泡5分钟、95％乙醇5分钟、85％乙醇5分钟、75％乙醇5分钟，ddH₂O浸泡5分钟，清洗3次；利用高压锅进行抗原修复(煮沸法)压力锅中加入足以淹没切片的10mmol/L枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)，加热至沸腾，切片置耐热料切片架上，放入锅中，盖好锅盖，扣上压力阀，继续加热，设置保压4分钟，时间到后打开放气阀放气，压力归零后开锅盖将内锅取出放置室温冷却。待溶液冷却至室温后取出切片(约40min)；ddH₂O浸泡5分钟，清洗2次，PBST浸泡5分钟，清洗2次；将切片放置在20ml3％H₂O₂-甲醇溶液中，避光，室温处理10分钟；PBST浸泡5分钟，清洗3次；每个组织群加入山羊血清封闭液一滴约25μl，湿盒中室温孵育45分钟；PBST浸泡5分钟，清洗3次。每个组织中加入实施例1的MVP单克隆细胞株(2D6-1)的细胞上清，4℃湿盒中孵育过夜；从4℃冰箱取出，室温孵育60分钟；PBST轻柔冲洗后浸泡5分钟，清洗3次；每个组织群加入HRP标记的长岛公司二抗(CAT#:)25μl，室温，孵育45分钟；洗涤；配制好DAB显色液，避光反应10-15分钟后滴加到切片上，显色1-5分钟；用蒸馏水终止显色反应；每个组织群滴加苏木素染液50μl复，染色5-10分钟，用蒸馏水冲洗干净；将切片放入1％盐酸-乙醇中脱色2-3秒后迅速取出放入蒸馏水中终止，再放入PBST(pH8.0)中反蓝5-10分钟；分别在75％乙醇中浸泡5分钟：85％乙醇中浸泡5分钟；95％乙醇中浸泡5分钟：无水乙醇中浸泡5分钟。用二甲苯浸泡10分钟，换二甲苯后再浸泡10分钟；滴加中性树胶封片，加盖玻片封片；显微镜拍片，如图3所示。

免疫组化中和实验：取一定量的抗原蛋白与MVP单克隆细胞株(2D6-1)的细胞上清混合，37℃中和反应1小时。按免疫组化实验步骤，作为一抗滴加到乳腺癌组织切片，4℃过夜，之后按同样的步骤免疫组化染色，拍片，如图4所示。

由图4可以看出，在免疫组化的中和反应中，MVP抗原蛋白反应结合了细胞上清中的抗体，使得细胞上清中的抗体无法与癌组织中的抗原结合。而从图3中，可以看出本发明实施例提供的抗人MVP单克隆抗体2D6-1可以识别人癌细胞中的MVP蛋白并结合，使得乳腺癌组织中癌细胞胞质呈棕色。说明实施例1提供的抗人MVP单克隆抗体可特异性结合MVP。

实施例4

抗体的亲和力和灵敏度检测

(1)将抗原按照3mg/L、1.5mg/L、0.75mg/L、0.375mg/L包板。

(2)调整实施例1的抗体浓度至10-7mol/L水平(1×10-7至5×10-7mol/L均可)。

(3)然后倍比稀释1:2-1:256，加至不同抗原包被量的孔中。加入二抗，TMB显色，测450nm吸光值。结果见表2。

表2

从表2中可以看出，实施例1的抗人MVP单克隆抗体能够将低至0.375mg/L抗原检测出，说明其具有较高的灵敏度。

(4)根据抗原抗体结合S曲线，求出不同抗原浓度下，半数吸光值的抗体浓度，获得四个抗体浓度(mol/L)：3.2576×10^-8mol/L、3.2292×10^-8mol/L、2.0052×10^-8mol/L、2.4484×10^-8mol/L。代入公式K＝(N-1)/(N×AB’-AB)计算亲和常数。AB'、AB为对应抗原浓度AG下(3mg/L、1.5ml/L、0.75mg/L、0.375mg/L)产生半数吸光值的抗体浓度，N＝AG/AG’(AG>AG’)。当N＝2时，可以得到三个K值3.125、12.8、3.45。当N＝4时，可以得到两个K值7.25、4.57。当N＝8时可以得到一个K值4.287。求出6个K值的平均值(见表3)，为5.9137×10⁹，说明实施例1提供的抗人MVP单克隆抗体对MVP抗原具有较好的亲和力。

表3

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种kyi更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 生工生物工程（上海）股份有限公司

<120> 抗人穹窿体蛋白的抗体及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser

1 5 10 15

Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr Trp

20 25 30

Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Ala

35 40 45

Arg Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

50 55 60

Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met

65 70 75 80

Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Ser Tyr Asp Tyr Asp Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 3

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtcaaactgc agcagtcagg agctgagctg gtgaggcctg gggcttcagt gaagctgtcc 60

tgcaagactt ctggatacat cttcaccagc tactggattc actgggtaaa acagaggtct 120

ggacagggcc ttgagtggat tgcaaggatt tatcctggaa ctggtagtac ttactacaat 180

gagaagttca agggcaaggc cacactgact gcagacaaat cctccagcac tgcctacatg 240

cagctcagca gcctgaaatc tgaggactct gctgtctatt tctgtgcaag atcttatgat 300

tacgacaggg ggtttgctta ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctca 354

<210> 4

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gacattgagc tcacccagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 60

atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag 120

ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 240

gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagg tggaaattaa acgg 324

<210> 5

<211> 400

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Ala Thr Glu Glu Phe Ile Ile Arg Ile Pro Pro Tyr His Tyr Ile

1 5 10 15

His Val Leu Asp Gln Asn Ser Asn Val Ser Arg Val Glu Val Gly Pro

20 25 30

Lys Thr Tyr Ile Arg Gln Asp Asn Glu Arg Val Leu Phe Ala Pro Met

35 40 45

Arg Met Val Thr Val Pro Pro Arg His Tyr Cys Thr Val Ala Asn Pro

50 55 60

Val Ser Arg Asp Ala Gln Gly Leu Val Leu Phe Asp Val Thr Gly Gln

65 70 75 80

Val Arg Leu Arg His Ala Asp Leu Glu Ile Arg Leu Ala Gln Asp Pro

85 90 95

Phe Pro Leu Tyr Pro Gly Glu Val Leu Glu Lys Asp Ile Thr Pro Leu

100 105 110

Gln Val Val Leu Pro Asn Thr Ala Leu His Leu Lys Ala Leu Leu Asp

115 120 125

Phe Glu Asp Lys Asp Gly Asp Lys Val Val Ala Gly Asp Glu Trp Leu

130 135 140

Phe Glu Gly Pro Gly Thr Tyr Ile Pro Arg Lys Glu Val Glu Val Val

145 150 155 160

Glu Ile Ile Gln Ala Thr Ile Ile Arg Gln Asn Gln Ala Leu Arg Leu

165 170 175

Arg Ala Arg Lys Glu Cys Trp Asp Arg Asp Gly Lys Glu Arg Val Thr

180 185 190

Gly Glu Glu Trp Leu Val Thr Thr Val Gly Ala Tyr Leu Pro Ala Val

195 200 205

Phe Glu Glu Val Leu Asp Leu Val Asp Ala Val Ile Leu Thr Glu Lys

210 215 220

Thr Ala Leu His Leu Arg Ala Arg Arg Asn Phe Arg Asp Phe Arg Gly

225 230 235 240

Val Ser Arg Arg Thr Gly Glu Glu Trp Leu Val Thr Val Gln Asp Thr

245 250 255

Glu Ala His Val Pro Asp Val His Glu Glu Val Leu Gly Val Val Pro

260 265 270

Ile Thr Thr Leu Gly Pro His Asn Tyr Cys Val Ile Leu Asp Pro Val

275 280 285

Gly Pro Asp Gly Lys Asn Gln Leu Gly Gln Lys Arg Val Val Lys Gly

290 295 300

Glu Lys Ser Phe Phe Leu Gln Pro Gly Glu Gln Leu Glu Gln Gly Ile

305 310 315 320

Gln Asp Val Tyr Val Leu Ser Glu Gln Gln Gly Leu Leu Leu Arg Ala

325 330 335

Leu Gln Pro Leu Glu Glu Gly Glu Asp Glu Glu Lys Val Ser His Gln

340 345 350

Ala Gly Asp His Trp Leu Ile Arg Gly Pro Leu Glu Tyr Val Pro Ser

355 360 365

Ala Lys Val Glu Val Val Glu Glu Arg Gln Ala Ile Pro Leu Asp Glu

370 375 380

Asn Glu Gly Ile Tyr Val Gln Asp Val Lys Thr Gly Lys Val Arg Ala

385 390 395 400

Claims

1.一种抗人穹窿体蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段选自所述抗体的Fab’、Fab、F(ab’)2、scFv和Fv中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区。

4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的恒定区的种属来源为小鼠、大鼠、牛、马、羊、兔或狗。

5.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的恒定区的种属来源为小鼠。

6.权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备肿瘤诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述肿瘤的诊断标志物为人穹窿体蛋白。

7.含有权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段的免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体或药物组合物。

8.一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

9.一种分离的核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

10.一种重组细胞，其特征在于，其含有重组载体，所述重组载体含有权利要求9所述的核酸分子。

11.一种制备如权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求10所述的重组细胞，从培养产物中分离纯化得到所述抗体或其抗原结合片段。