FI111194B - Kaksikohtainen immuunitesti vasta-aineelle käyttäen kemiluminisoivaa leimaa ja biotiiniin sidottua ligandia - Google Patents

Description

111194

Kaksikohtainen immuunitesti vasta-aineelle käyttäen kemi-luminisoivaa leimaa ja biotiiniin sidottua ligandia

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää, jolla tun-5 nistetaan vasta-aine näytteessä käyttäen kerniluminisoivaa leimausyhdistettä.

Erikoisemmin keksintö koskee avidiiniin tai strept-avidiiniin kiinnitetyn kerniluminisoivan akridiniumesteri-yhdisteen ja biotiiniin kiinnitetyn ligandin käyttöä kak-10 sikohtaisessa immuuni testissä, jossa affiniteettikompleksi on kiinnitetty paramagneettipartikkeleihin, joka mahdollistaa näytteessä, kuten biologisissa nesteissä ja kudosnäytteissä, maidossa, ruokanäytteissä, juomissa, vedessä tai teollisuuden jätevesissä, olevien immunologisesti ak-15 tiivisten aineiden, kuten vasta-aineiden nopean tunnistuksen ja/tai kvantitoinnin.

Menetelmä immunoglobuliini-E-vasta-aineiden tunnistamiseksi ja kvantitoimiseksi seerumissa on kuvattu esittelylehtisessä "Specific IgE, Magic8 Lite SQ™", jonka ovat 20 julkaisseet Ciba Corning Diagnostics Corp. ja ALK Laboratories syyskuussa 1990. Mainitussa menetelmässä paramagneettipartikkeleihin kovalenttisesti sidottu spesifinen allergeeni reagoi allergeenille spesifisen IgE-vasta-ai-neen, joka on läsnä seerumi- tai plasmanäytteessä, kanssa. 25 Ensimmäisen inkubaation jälkeen, ja kun sitoutumaton epäspesifinen IgE on pesty pois, lisätään IgE-proteiinia vastaan olevaa monoklonaalista vasta-ainetta, joka on leimattu kemiluminisoivalla akridiniumesterillä. Toisen inkubaa- tioajan jälkeen kiinteäfaasiin sitoutunut ja leimattu vas-30 ta-aine mitataan Magic LiteR -analysaattorilla (luettelo-numero 472 733 tai luettelonumero 472 270), joka automaattisesti injektoi reagenssit, jotka aloittavat kemilumini-senssireaktion. Kun käytetään mainittua menetelmää, ainoastaan loppuvaihe, jossa aloitetaan ja mitataan kemilumi-35 nisenssi, voidaan automatisoida. Kemiluminisoiva akridi- 111194 2 niumesterileimausyhdiste on kuvattu US-patentissa nro 4 745 181.

US-patentti nro 4 946 958 kuvaa kemiluminisoivan akridiniumesterin, joka on liitetty N-sukkinimidyyliosaan, 5 joka voidaan edelleen liittää proteiiniin tai polypepti-diin niin, että saadaan aikaan immunologisesti reaktiivinen luminisoiva reagenssi. Mainittua reagenssia voidaan käyttää immuunitestissä, joka voi sisältää samanaikaisen kiinteäfaasin vasta-aineen, antigeenimolekyylin ja leima-10 tun vasta-aineen sitomisen, kiinteäfaasin erotuksen ja pesun ja kiinteäfaasin luminisenssin kvantitoinnin.

Strasburger et ai. kuvaavat julkaisussa Methods in Enzymology, 184 (1990), sivut 481 - 496, kaksikohtaisen kemiluminisenssi-immuunitestin käytön, jossa hGH- ja hCG-15 hormonit napataan mikrotiitterilevyille immobilisoitujen vasta-aineiden toimesta ja leimataan avidiiniin kiinnitetyllä kemiluminisoivalla aineella biotiinilla leimatun toisen vasta-aineen välityksellä. Antigeenisiä analyytte-jä, kuten proteiinihormoneja, voidaan testata suoraan see-20 ruminäytteistä ja verrata standardikäyriin. Immunoglobu- liinien, kuten IgE-proteiinin, konsentraatio on kuitenkin erittäin suuresti potilaasta riippuvainen ja spesifisen IgE-proteiinin testiä täytyy verrata yksittäisen potilaan kokonais-IgE-proteiinin tasoon ja sen vuoksi se vaatii 25 testiä, jolla on suurempi dynaaminen skaala kuin se, joka saadaan testillä, jonka ovat kuvanneet Strasburger et ai.

EP-hakemusjulkaisu 0 425 217 kuvaa hybridisaatio-testin, jossa muodostetaan kemiluminisoiva kompleksi, joka sisältää nukleiinihapon, joka on hybridisoitu ensimmäiseen 30 leimattuun nukleotidikoettimeen, joka on kiinnitetty para-magneettipartikkeleihin, ja toisen nukleotidikoettimen, joka on leimattu biotiinilla ja kiinnitetty avidiini-akri-diniumesteriin. Kuitenkin alan asiantuntija, joka on joutunut vastatusten sen ongelman kanssa, että saataisiin 35 täysin automaattinen menetelmä vasta-aineiden tunnistami- 3 111194 seksi, etsii menetelmää, joka voidaan suorittaa yhdessä reaktioastiassa ja suositeltavasti ympäröivissä reaktio-olosuhteissa. Tässä esitetty testi on pohjimmiltaan erilainen, koska siinä käytetään spesifisten nukleotidisek-5 venssien tunnistusta, jotka eivät ole antigeenejä, joita vastaan voitaisiin muodostaa spesifisiä vasta-aineita.

Yksityiskohtaisemmin mainitussa testissä on tarpeen käyttää kohotettuja lämpötiloja hybridisaatiota varten ja hap-teeni-oligonukleotidikoetinta, joka ei ole tarpeen tai 10 toivottava immuunitesteissä.

Tähän saakka biologisissa nesteissä, kuten seerumissa, olevien immunologisesti aktiivisten molekyylien, kuten immunoglobuliinien (esim. spesifisen immunoglobulii-ni-E-proteiinin) kvantitoimista varten olevat immuunites-15 tit ovat olleet manuaalisia, esim. entsyymivälitteinen immuunitesti (ELISA), tai puoliautomaattisia. Puoliautomaattisen immuunitestin, kuten yllä viitatun spesifisen MagicR Lite SQ™ -IgE-testin, kestoaika on tyypillisesti noin kaksi tuntia.

20 Lisäksi, kaupallisissa spesifisissä IgE-testeissä (CAP, RAST, joita toimittaa Pharmacia, Uppsala) ja spesifisessä Magic* Lite SQ™ -IgE-testissä käytetään totaali-IgE-verrokkitestiä, joka tehdään eri tavalla johtaen epätarkkoihin tuloksiin. Vain testit, joissa käytetään saman-/ 25 laisia nappaus- ja tunnistusmenetelmiä, ovat suoraan ver rannollisia. Esimerkiksi kaikkien spesifisten IgE loppu-vastekäyrien täytyy olla rinnakkaisia totaali-IgE-vaste-käyrien kanssa. Syy on se, että tarvittava dynaaminen skaala spesifiselle (tai kokonais?) IgE-testille on 2 de-30 kadia ja tarvittava dynaaminen skaala kokonais-IgE-testil-le on 2 - 7 dekadia, eivätkä olemassa olevat immuunitestit salli konsentraatiomittauksia koko skaalan yli. Näin ollen tähän saakka on ollut tarpeen käyttää erilaisia menetelmiä spesifisiin ja kokonais-immunoglobuliinitesteihin, joissa 35 on erilaiset reagenssit.

111194 4

Johtuen kohoavasta mielenkiinnosta turvallisia laboratoriomenetelmiä kohtaan on olemassa tarve täysin automatisoiduista menetelmistä aineiden, kuten vasta-aineiden, tunnistamiseksi biologisissa nesteissä, kuten ihmisen see-5 rumissa, plasmassa, veressä, maidossa, virtsassa tai syl-jessä, joiden tulisi sisältää minimaalisen riskin sille, että joudutaan kosketukseen vaarallisten nesteiden kanssa. Myöskin laboratoriotestien kohoava käyttö diagnostiikassa peräänkuuluttaa menetelmiä, jotka ovat nopeita, suositelit) tavasti ainoastaan muutaman minuutin pituisia.

Näin ollen tämän keksinnön aihe on esittää menetelmä, joka on turvallinen, nopea ja täysin automatisoitavissa, näytteessä olevan vasta-aineen tunnistamiseksi.

Tämä aihe saavutetaan yhdellä keksinnön mukaisella 15 menetelmällä, joka sisältää vaiheet, joissa: a) sekoitetaan biotiiniin tai sen toiminnalliseen johdannaiseen sidottu ligandiantigeeni -vasta-aine tai -haptee-ni; paramagneettipartikkeleihin sidottu tunnistettavaa vasta-ainetta vastaan oleva vasta-aine; ja avidiiniin, 20 strepavidiiniin tai sen toiminnalliseen johdannaiseen sidottu kerniluminisoiva akridiniumyhdiste näytteen kanssa niin, että muodostetaan kiinteäfaasiin sitoutunut kompleksi, b) erotetaan magneettisesti kiinteäfaasi nestefaasista, 25 c) aloitetaan kemiluminisenssireaktio ja analysoidaan erotettu kiinteäfaasi kerniluminisoivan kompleksin läsnäolon suhteen, jossa kemiluminisenssin läsnäolo on osoitus mainitun vasta-aineen läsnä olosta mainitussa näytteessä.

Vaikka keksinnön mukainen menetelmä voidaan suorit-30 taa yllä kuvatuilla vaiheilla (a), (b) ja (c), on suositeltavaa lisätä leimausyhdiste erillisessä vaiheessa ja menetelmä suoritetaan suositeltavasti niin, että se sisältää seuraavat vaiheet, joissa: i) sekoitetaan biotiiniin tai sen toiminnalliseen johdan-35 naiseen sidottu ligandiantigeeni, -vasta-aine tai -haptee- 5 111194 ni näytteen ja tunnistettavaa vasta-ainetta vastaan suunnatun vasta-aineen kanssa, joka on sidottu paramagneetti-partikkeleihin niin, että muodostetaan ensimmäinen kiin-teäfaasikompleksi, 5 ii) lisätään avidiiniin, streptavidiiniin tai sen toiminnalliseen johdannaiseen kiinnitetty kerniluminisoiva akri-diniumyhdiste niin, että muodostetaan toinen kiinteäfaasi-kompleksi, iii) erotetaan magneettisesti kiinteäfaasi nestefaasista, 10 iv) aloitetaan kemiluminisoiva reaktio ja analysoidaan erotettu kiinteäfaasi kemiluminisoivan kompleksin läsnäolon suhteen.

Keksinnön erityinen aihe on esittää täysin automatisoitava immuunitesti spesifisten vasta-aineiden, kuten 15 immunoglobuliinien, kvanti toimi seksi, jossa käytetään verrokkina todellista rinnakkaista immuuniverrokkitestiä, joka suoritetaan samanlaisella menetelmällä.

Spesifisten vasta-aineiden kvantitoiminen käyttäen todellista rinnakkaista immuuniverrokkitestiä saadaan ai-20 kaan menetelmällä, jossa mitataan nestenäytteessä olevan spesifisen vasta-aineen konsentraatiota ja/tai suhteellista määrää, jossa erotetun kiinteäfaasin, joka sisältää napatun spesifisen vasta-aineen kiinnittyneenä kemilumini-; soivaan leimaan, mitattua valoemissiota verrataan siihen 25 mitattuun valoemissioon, joka saadaan rinnakkaisesta im-; : : muuniverrokkitestistä, jossa mitataan näytteen sen vasta- aineluokan, johon mainittu spesifinen vasta-aine kuuluu, kokonaismäärää niin, että mainittu menetelmä sisältää vaiheet, joissa: 30 a) sekoitetaan biotiiniin tai sen toiminnalliseen johdannaiseen sidottu ligandiantigeeni tai -hapteeni, jota vastaan mitattava spesifinen vasta-aine on suunnattu; para-magneettipartikkeleihin sidottu vasta-aine, joka on suunnattu mitattavan vasta-aineen vakioaluetta vastaan; ja 35 avidiiniin, streptavidiiniin tai sen toiminnalliseen joh- 111194 6 dannaiseen sidottu kemiluminisoiva akridiniumyhdiste näytteen kanssa niin, että muodostetaan ensimmäinen kiinteä-faasikompleksi; b) erotetaan magneettisesti mainittu ensimmäinen kiinteä- 5 faasi nestefaasista, c) aloitetaan kemiluminisoiva reaktio ja mitataan erotetun ensimmäisen kiinteäfaasin valoemissio, d) sekoitetaan biotiiniin tai sen toiminnalliseen johdannaiseen sidottu ligandivasta-aine, joka on suunnattu mi- 10 tattavan vasta-aineen luokkaa vastaan; paramagneettipar-tikkeleihin sidottu vasta-aine, joka on suunnattu mitattavan vasta-aineluokan vakioaluetta vastaan; ja avidii-niin, streptavidiiniin tai sen toiminnalliseen johdannaiseen sidottu kemiluminisoiva akridiniumyhdiste näytteen 15 kanssa niin, että muodostetaan toinen kiinteäfaasikomplek si, e) erotetaan magneettisesti mainittu toinen kiinteäfaasi nestefaasista, f) aloitetaan kerniluminisenssireaktio ja mitataan erotetun 20 toisen kiinteäfaasin valoemissio, ja g) verrataan erotetun ensimmäisen kiinteäfaasin valoemis-siota erotetun toisen kiinteäfaasin valoemissioon.

Yllä kuvatun menetelmän suositeltavassa suoritustavassa vaihe a) suoritetaan niin, että se sisältää vai-25 heet, joissa; (i) sekoitetaan biotiiniin tai sen toiminnalliseen johdannaiseen sidottu ligandiantigeeni tai -hapteeni näytteen ja paramagneettipartikkeleihin sidotun vasta-aineen kanssa niin, että muodostetaan kiinteäfaasikompleksi, ja 30 (ii) lisätään avidiiniin, streptavidiiniin tai sen toimin nalliseen johdannaiseen sidottu kemiluminisoiva akridiniumyhdiste niin, että muodostetaan mainittu ensimmäinen kiinteäfaasikompleksi, ja vaihe b) suoritetaan niin, että se sisältää vai-35 heet, joissa: 7 111194 (i) sekoitetaan biotiiniin tai sen toiminnalliseen johdannaiseen sidottu ligandivasta-aine näytteen ja paramagneet-tipartikkeleihin sidotun vasta-aineen kanssa niin, että muodostetaan kiinteäfaasikompleksi, ja 5 (ii) lisätään avidiiniin, streptavidiiniin tai sen toiminnalliseen johdannaiseen kovalenttisesti sidottu kemilumi-nisoiva akridiniumyhdiste niin, että muodostetaan mainittu toinen kiinteäfaasikompleksi.

Näytteessä mitattava mainittu spesifinen vasta-aine 10 on suoriteltavasti spesifinen immunoglobuliini, joka valitaan ryhmästä, joka sisältää IgA-, IgD-, IgE-, IgG-, IgM-immunoglobuliinit ja niiden isotyypit, ja mainitun vasta-aineen variaabeliosaa vastaan suunnattu ligandiantigeeni, -vasta-aine tai -hapteeni on allergeeni, ja vasta-aine-15 luokka on suositeltavasti immunoglobuliiniluokka, joka valitaan ryhmästä, joka sisältää kokonais-IgA-, kokonais-IgD-, kokonais-IgE-, kokonais-IgG-, kokonais-IgM-immuno-globuliinit ja niiden isotyypit, ja ligandiantigeeni, -vasta-aine tai -hapteeni on suunnattu mainittua immuno-20 globuliiniluokkaa vastaan.

Suositeltavammin spesifinen immunoglobuliini on spesifinen IgE ja vasta-aineluokka on kokonais-IgE-luokka.

Paramagneettipartikkeleihin sidottu vasta-aine, joka on suunnattu mitattavaa vasta-ainetta vastaan, vali-25 taan suositeltavasti ryhmästä, joka sisältää polyklonaali- set vasta-aineet, monoklonaaliset vasta-aineet sisältäen rekombinanttivasta-aineet, fragmentoidut vasta-aineet, suositeltavasti hiiren monoklonaalinen anti-immunoglobuliini.

30 Keksinnön edut ovat: kaikki reagenssit voidaan sekoittaa samanaikaisesti yhteen reaktioastiaan, joka minimoi kontaminaatioriskin, virheet ja käsittelyvaiheet, alentaa merkittävästi immuunitestin suoritusaikaa ja suuresti helpottaa prosessin automati-35 sointia ja tarkkuus paranee, vertaa esimerkki 6; 111194 8 spesifisten vasta-aineiden, esim. seeruminäytteessä olevien, kvantitointi voidaan suorittaa vertaamalla todelliseen rinnakkaiseen kokonaisvasta-ainetestiin käyttäen identtistä menetelmää, vertaa esimerkki 3; 5 saatu suurempi kapasiteetti ja herkkyys helpottaa sitä, että jopa hyvin alhaiset immunoglobuliinikonsentraa-tiot ja spesifisten immunoglobuliinien alhaiset konsent-raatiot voidaan tunnistaa, vertaa esimerkit 1, 2 ja 7.

Keksinnön suositeltava suoritustapa on immuunitesti 10 näytteessä, kuten seerumissa tai syljessä, olevien vasta-aineiden, kuten spesifisten immunoglobuliinien (IgA, IgE, IgG, IgM ja niiden isotyypit) tunnistamiseksi.

Erikoisesti keksintöä voidaan käyttää testissä, jolla tunnistetaan ja kvantitoidaan näytteessä oleva spe-15 sifinen IgE. Kun näyte on nestemäinen, esim. seerumia tai plasmaa, se voidaan lisätä suoraan reaktioastiaan, joka sisältää vesipohjaisessa alustassa suositeltavasti hiiren monoklonaalista anti-IgE-vasta-ainetta, joka on sidottu suspensoituihin paramagneettipartikkeleihin, ja spesifistä 20 allergeeniä (ligandia), joka on sidottu biotiiniin. Bio-tiini on suositeltavasti biotiiniamidokaproaatti-N-hydrok-sisukkinimidiesteri (Sigma luettelonumero B2643). Kun näyte ei ole nestemäistä, esim. se on kudosnäyte, se suositeltavasti homogenisoidaan ja suspensoidaan vesipohjaiseen 25 alustaan. Näytteessä olevan spesifisen IgE-vasta-aineen, allergeenin ja monoklonaalisen anti-IgE-vasta-aineen samanaikainen reaktio vesipohjaisessa alustassa johtaa kon-jugaatin muodostumiseen. Kemiluminisoiva leimausyhdiste, suositeltavasti akridiniumesteri, joka on sidottu strepta-30 vidiiniin (Sigma luettelonumero S4 762)(avidiini-DMAE) lisätään reaktioastiaan ja tapahtuu sitoutumisreaktio avii-dini-DMAE-yhdisteen ja biotiinin, joka on sitoutunut kon-jugaattiin ja konjugoitumattoman allergeeniin sitoutuneen biotiinin välillä. Konjugaattiin sitoutunut leima erote-35 taan sitoutumattomasta avidiini-DMAE-yhdisteellä leimatus- 9 111194 ta vasta-aineesta erottamalla reaktioseos magneettisesti ja kaatamalla supernatantti pois. Erotetun konjugaatin kemiluminisenssi mitataan, kuten ovat kuvanneet Pazzali, M. et ai. (toim.), Studies and applications in "Biology & 5 Medicine", Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence 4(1), 1 - 646, 1989.

Samanaikaisesti suoritettuna verrokkina käytetään todellista rinnakkaista kokonais-IgE-immuunitestiä, joka eroaa ainoastaan niin, että ligandina suositeltavasti kä-10 ytetään biotiiniin sidottua polyklonaalista anti-IgE-vas-ta-ainetta.

Kuvio 1 on graafinen esitys keksinnön mukaisesta spesifisestä IgE-testistä ja se sisältää rinnakkaisen kokonais- IgE-verrokki testin. Kuviossa (1) edustaa spesifistä 15 tunnistettavaa IgE-vasta-ainetta, (2) on biotiiniin sidottu spesifinen allergeeni, (3) on hiiren monoklonaalinen anti-IgE-vasta-aine, joka on sidottu paramagneettipartik-keleihin, (4) on avidiini-akridiniumesteri ja (5) edustaa leimattua kiinteäfaasikompleksia, joka muodostuu osien 20 (1), (2), (3) ja (4) välille, ja sisältää vaihtoehtoiset inkubaatio-, erotus- ja pesuvaiheet, ja (6) edustaa lopullista vaihetta, jossa aloitetaan kemiluminisenssireaktio ja mitataan valoemissio.

Kokonais-IgE-verrokkitestissä kuviossa 1 (7) edus-25 taa IgE-vasta-ainetta (WHO 75/502 IU/ml), (8) on polyklo-naalinen anti-IgE-vasta-aine, joka on sidottu biotiiniin, (9) on hiiren monoklonaalinen anti-IgE-vasta-aine, joka on sidottu suspensoituihin paramagneettipartikkeleihin, (10) on avidiini-akridiniumesteri ja (11) edustaa leimattua 30 kiinteäfaasikompleksia, joka muodostuu osien (7), (8), (9) ja (10) välille, ja sisältää vaihtoehtoiset inkubaatio-, erotus- ja pesuvaiheet, ja (12) on lopullinen vaihe, jossa aloitetaan kemiluminisenssireaktio ja mitataan valoemissio.

10 111194

Erikoisemmin, keksinnön menetelmää käyttävä immuuni testi voidaan suorittaa täysautomaattisella ACS:180 -analysaattorilla, jota valmistaa Ciba Corning Diagnostics Corp., Medfield, Mass., USA.

5 Eräässä keksinnön suositeltavassa suoritustavassa tunnistettava immunologisesti aktiivinen aine on vasta-aine, esim. penisilliiniä tai sen johdannaisia, kuten bentsyylipenisilliiniä, penisilloyyliä, jne., vastaan oleva ja biotiiniin sidottu ligandi on hapteeni, kuten peni-10 silliini tai sen johdannainen.

Määritelmät

Keksinnön mukaisissa menetelmissä tunnistettava vasta-aine on spesifinen immunoglobuliini, suositeltavasti spesifinen IgA-, igD-, igE-, IgG-, IgM-vasta-aine ja nii-15 den isotyypit, ja suositeltavammin spesifinen IgE-vasta-aine, tai vasta-aineluokka, kuten immunoglobuliinit, joka suositeltavasti valitaan ryhmästä, joka sisältää kokonais-IgA-, kokonais-IgD-, kokonais-IgE-, kokonais-IgG-, kokonais- IgM-luokan ja niiden isotyypit, suositeltavimmin ko-20 konais-IgE-luokka.

Näytteellä tarkoitetaan mitä tahansa nestemäistä tai nesteytettyä näytettä, sisältäen liuokset, emulsiot, dispersiot ja suspensiot.

Biotiiniin sidottu ligandiantigeeni, -vasta-aine 25 tai -hapteeni voi olla mikä tahansa immunologisesti aktiivinen aine, kuten allergeeni, vasta-aineet, kuten polyklo-naaliset vasta-aineet, monoklonaaliset vasta-aineet sisältäen rekombinanttivasta-aineet, tai fragmentoidut vasta-aineet, suositeltavasti allergeeni ja/tai polyklonaalinen 30 anti-immunoglobuliini, kuten vuohen polyklonaalinen anti- ihmis-seerumi, jota valmistaa Ventrez Laboratories, Inc., Portland, Maine, luettelonumero 77 660. Verrokki-immuuni-testissä mainittu vasta-aine on suositeltavasti suunnattu mitattavan vasta-aineluokan vakioaluetta vastaan, se tar- u 111194 koittaa vasta-ainetta, joka on suunnattu igE-vasta-aineita vastaan.

Biologisella nesteellä tarkoitetaan mitä tahansa kliinistä näytettä, kuten verta, plasmaa, seerumia, virt-5 saa tai sylkeä, joka myös sisältää minkä tahansa biologisen nesteen, joka on eritetty, eritetään tai kuljetetaan organismin sisällä.

Paramagneettipartikkeleilla (PMP) tarkoitetaan partikkeleita, jotka voidaan dispersoida tai suspensoida nes-10 temäiseen alustaan. Kaikissa esimerkeissä on käytetty Bio-Mag-partikkeleita (rautaoksidipartikkeleita, jotka on päällystetty amiiniin loppuvilla ryhmillä), joita myy Advanced Magnetics, Inc., Cambridge, Massachusetts. PMP-partikkeleihin kiinnitetyt vasta-aineet on suositeltavasti 15 suunnattu tunnistettavien tai mitattavien vasta-aineiden vakioaluetta vastaan ja ne voivat olla polyklonaalisia tai monoklonaalisia vasta-aineita sisältäen rekombinanttivas-ta-aineet tai fragmentoidut vasta-aineet, suositeltavasti monoklonaalinen vasta-aine MAb A 5697-1A3 (920325), jota 20 valmistaa Biolnvent International AB, Lund, Ruotsi.

Kemiluminisoiva akridiniumyhdiste on suositeltavasti N-hydroksisukkinimididimetyyliakridiniumesteri, joka on kovalenttisesti sidottu avidiiniin tai streptavidiiniin (avidiini-DMAE). Avidiini ja DMAE kiinnitetään niiden me-25 netelmien mukaisesti, jotka ovat kuvanneet Weeks et ai., Clin. Chem. 29/8, 1 474 - 1 479 (1983). Muita luminisoivia > leimausyhdisteitä, joita voidaan sitoa avidiiniin tai streptavidiiniin, voidaan käyttää keksinnön menetelmässä. Esim. luminoli, lusigeniini tai lophiini.

30 Biotinyloitujen vasta-aineiden valmistus

Biotinyloitu anti-IgE ja Phleum pratense -heinä:

Vuohen polyklonaalinen anti-ihmis-seerumi (Ventrex Laboratories, Inc., MA, USA) puhdistetaan affiniteettikro-matografialla CNBr-aktivoidussa Sepharose 4B -matriksissa 35 (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi) käyttäen ligandina myelooma- 12 111194

IgE-proteiinia (OEM-suunnitelma, USA). Anti-IgE-vasta-aine biotinyloidaan niin, että mol biotiinia: mol anti-IgE-vas-ta-ainetta-suhde on 41:1.

Dimetyyliformamidissa (Merck) olevaa biotiinia 5 [biotiiniamidokaproaatti-N-hydroksisukkinimidiesteri(Sig

ma)], jonka konsentraatio on 25 mg/ml, lisätään 9 μΐ 0,4 ml:aan anti-IgE-vasta-ainetta, jonka konsentraatio on 4,5 mg/ml 0,1 M NaHC03:oa (Merck). Reagensseja inkuboidaan "ym-päripyörivässä" pyörittäjässä kaksi tuntia 25 °C:ssa. Li-10 sätään 0,9 ml lysiiniliuosta (Sigma), jonka konsentraatio on 20 mg/ml NaHC03:oa. Liuos suodatetaan ja biotinyloitu vasta-aine puhdistetaan kokoerotukseen perustuvalla kroma-tografialla Superdex 75 Hiload 16/60 -matriksissa (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi). Yhdistetyt fraktiot laimen-15 netaan fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella PBS, pH

7,2, joka sisältää 0,1 % ihmisen seerumialbumiinia (Sigma) 0,1 % NaN3:ssa (Sigma).

Phleum pratense -uute (ALK Laboratories A/S, Hors-holm, Tanska) biotinyloidaan niin, että molaarisuhde on 20 10:1. 0,65 ml biotiinia, jonka konsentraatio on 10 mg/ml, lisätään 0,43 ml:aan Phleum pratense -uutetta, jonka konsentraatio on 10 mg/ml 0,1 M NaHC03:oa. Reagensseja inkuboidaan kaksi tuntia 25 °C:ssa "ympäripyörivässä" pyörittäjässä, inkubaation jälkeen lisätään 40 μΐ lysiiniliuosta 25 (Sigma), jonka konsentraatio on 50 mg/ml. Liuos suodate taan ja biotinyloitu vasta-aine puhdistetaan ylimääräisestä biotiinista kokoerotukseen perustuvalla kromatografiällä Superdex 75 Hiload 16/60 -matriksissa (Pharmacia). Allergeenit sisältävät fraktiot yhdistetään. Biotinyloitu 30 Phleum pratense -uute laimennetaan PBS:llä, pH 7,2, joka sisältää 0,1 % ihmisen seerumialbumiinia (Sigma) ja 0,1 % NaN3:ia (Sigma).

Streptavidiini-akridiniumesterileiman valmistus

Streptavidiini konjugoitiin DMAE-HNS-yhdisteen 35 [2' ,6,-dimetyyli-4'-(N-sukkinimidyylioksikarbonyyli)fenyy- 13 111194 li-10-metyyliakridinium-9-karboksylaattimetosulfaatti] kanssa käyttäen menetelmiä, jotka ovat kuvanneet Weeks et ai., Clin. Chem. 29/8, 1 474 - 1 479 (1983).

Streptavidiini-akridiniumesterileiman valmistus: 5 0,96 mg N-hydroksisukkinimididimetyyliakridiniumes- teriä DMAE (Ciba Corning Diagnostics Corp., Medfield, MA, USA) laimennetaan 1,92 ml:aan dimetyyliformamidia. 250 μΐ tätä liuosta pipetoidaan 2,5 ml:aan streptavidiinia (Sigma), jonka konsentraatio on 1 mg/ml liuoksessa, joka on 10 0,1 M natriumdivetyfosfaatti, 0,15 M NaCl, pH 8,15.

Putkessa liuoksen yllä oleva ilma vaihdetaan typek-si (AGA). Reagensseja inkuboidaan 30 minuuttia 25 °C:ssa sekoittaen, inkubaation jälkeen lisätään 2 250 μΐ lysii-niä, jonka konsentraatio on 10 mg/ml liuoksessa, joka on 15 0,1 M natriumdivetyfosfaatti (Merck), 0,15 M NaCl (Merck), pH 8,15. Sitoutumattoman DMAE-yhdisteen poistamiseksi liuos ladataan PD-10-pylvääseen (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi). Eluaatti kerätään ja puhdistetaan ultrasuodatuksella käyttäen Minitan-S-selluloosasuodatinarkkia 10 000 NMWL (Mil-20 lipore). Suodatus suoritetaan 1,5 1 fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta PBS, pH 7,2. Jäljelle jäänyt osa (reta-naatti) konsentroidaan 25 ml:ksi ja lisätään 25 ml PBS:ää, pH 7,2, joka sisältää 0,5 % HSA:ta (Sigma) ja 0,1 % NaN3:ia (Sigma).

25 Keksintö kuvataan yksityiskohtaisesti seuraavissa esimerkeissä.

Vasta-aineen immobilisaatio paramagneettipartikke- leihin 6,5 g paramagneettipartikkeleita (Ciba Corning Dia-30 gnostics Corp., MA, USA) pestään 650 ml:ssa metanolia (Merck) kolme kertaa käyttäen magneettierotusta. Pesu 650 ml:11a 0,01 M asetaattipuskuria, pH 5,5, suoritetaan kahdesti. Partikkelit aktivoidaan 6,25 % glutaraldehydissä (Merck) 0,01 M asetaattipuskurissa, pH 5,5, kolme tuntia 35 25 °C:ssa. Partikkelit pestään kolme kertaa 650 mlrssa 14 111194 0,01 M asetaattipuskuria, pH 5,5. Partikkelit kiinnitetään 1083 mg:n kanssa monoklonaalista anti-IgE-vasta-ainetta (ALK Laboratories, Horsholm, Tanska), joka on spesifistä IgE-vasta-aineen Fc-domeenille, 24 tunnin ajan 25 °C:ssa.

5 Partikkelit pestään kahdesti 0,01 M asetaattipuskurissa, pH 5,5. Ylimääräisten aktiivisten ryhmien blokeeraus suoritetaan 200 ml:11a 10 % seerumia, josta IgE-vasta-aineet on poistettu (ALK Laboratories, Horsholm, Tanska) 24 tunnin ajan 25 °C:ssa. Partikkelit pestään 650 ml:lla 0,01 M 10 fosfaattipuskuria (Merck), jonka jälkeen tehdään kolme pesua 650 ml:ssa 1 M NaCl:ia (Merck). Partikkelit pestään kolme kertaa 0,01 M fosfaattipuskurissa. Partikkelit sus-pensoidaan uudelleen 650 ml:aan PBS:ää, pH 7,2, jossa on 0,1 % w/v naudan seerumialbumiinia (Sigma) ja 0,001 % nau-15 dan gammaglobuliinia (Sigma), ja sitä lämpökäsitellään 18 tuntia 50 °C:ssa. Partikkelit pestään kolme kertaa 650 ml:ssa PBS:ää, pH 7,2, jossa on 0,1 % w/v naudan seerumi-albumiinia (Sigma) ja 0,001 % naudan gammaglobuliinia (Sigma). Partikkeleita lämpökäsitellään seitsemän vuoro-20 kautta 37 °C:ssa. Partikkelit pestään 0,01 M fosfaattipuskurissa kahdesti. Partikkelit laimennetaan konsentraati-oksi 0,5 g/1 PBS:ää, pH 7,2, jossa on 0,5 % ihmisen seerumialbumiinia (Sigma).

Esimerkki 1 25 Antigeenin (kokonais-IgE) tunnistus ja kvantitointi

Kokonais-IgE-vasta-aineiden määritys keksinnön mukaisesti suoritettiin Ciba Corning ACS:180 Benchtop Immunoassay -analysaattorilla, joka on kuvattu julkaisussa Clinical Chemistry, 36/9, 1 598 - 1 602 (1990), käyttäen 30 seuraavaa menetelmää: 50 μΐ näytettä ja 50 μΐ biotinyloitua anti-IgE-vas-ta-ainetta toimitetaan näyteanturilla kyvettiin. Ryvettiin lisätään ensimmäinen reagenssikoetin Rl, jossa 100 μΐ pa-ramagneettipartikkeleita, joihin on immobilisoitu IgE-vas-35 ta-aineen Fc-osalle spesifistä monoklonaalista anti-IgE- 15 111194 vasta-ainetta (ALK Laboratories A/S, Horsholm, Tanska), toimitetaan yhdessä 200 μ1:η kanssa streptavidiini-akri-diniumesterileimaa (ALK Laboratories A/S, Horsholm, Tanska). Kyvetti liikkuu alas rataa magneeteille ja pesu-5 asemaan. Pesu 750 pl:lla deionisoitua vettä suoritetaan kahdesti. Kun pesusykli on tehty, partikkelit suspensoi-daan uudelleen 300 pl:aan liuosta, jossa on 0,5 g H202:ta/1 0,1 M HN03:oa. Kyvetti saapuu luminometrikammioon ja valo-monistimen edessä lisätään 300 μΐ 25 mM NaOH-liuosta ja 10 valon emittoimat fotonit mitataan ja kvantitoidaan ja ne ilmoitetaan suhteellisina valoyksikköinä (RLU). RLU-määrä on suoraan verrannollinen näytteessä olevan IgE-vasta-ai-neen määrään. Aika näytteen jakamisesta ensimmäiseen tulokseen on 15 minuuttia ja uusi tulos tulee joka 20. se-15 kunti. Tulokset ilmoitettiin arvona RLU-koe/RLU-tausta, jossa RLU-tausta oli se kemiluminisenssireaktio, joka havaittiin kokonais-IgE-vasta-aineen poissaollessa.

Yhdeksän kokonais-IgE-standardia, jotka kalibroitiin Magic Lite Total IgE -käyttöpakkauksella (ALK Labo-20 ratories A/S, Horsholm, Tanska) ihmisen seerumin IgE-vas-ta-aineen WHO 2nd IRP numero 75/502 -standardia vastaan, testattiin käyttäen yllä kuvattua menetelmää ja osoitettiin, että 0,1 IU seerumin kokonais-IgE-vasta-ainetta/ml kyettiin tunnistamaan (määritettynä arvona tausta x 10 25 standardipoikkeama), katso kuvio 2.

Esimerkki 2

Spesifisen vasta-aineen (spesifinen IgE) tunnistus ja kvantitointi

Phleum pratense -spesifisten IgE-vasta-aineiden 30 (keksinnön mukainen timotei-spesifinen IgE) määritys suoritettiin Ciba Corning ACS:180 Benchtop Immunoassay -analysaattorilla, joka on kuvattu julkaisussa Clinical Chemistry, 36/9, 1 598 - 1 602 (1990), käyttäen seuraavaa menetelmää: 16 111194 50 μΐ näytettä ja 50 μΐ biotinyloitua Phleum pra-tense -uutetta toimitetaan näyteanturilla kyvettiin. Ryvettiin lisätään ensimmäinen reagenssikoetin Rl, jossa 100 μΐ paramagneettipartikkeleita, joihin on immobilisoitu 5 IgE-vasta-aineen Fc-osalle spesifistä monoklonaalista an-ti-IgE-vasta-ainetta (ALK Laboratories A/S, Horsholm, Tanska), toimitetaan yhdessä 200 μ1:η kanssa streptavidii-ni-akridiniumesterileimaa (ALK Laboratories A/S, Horsholm, Tanska). Kyvetti liikkuu alas rataa magneeteille ja pesu-10 asemaan. Pesu 750 pl:lla deionisoitua vettä suoritetaan kahdesti. Kun pesusykli on tehty, partikkelit suspensoi-daan uudelleen 300 pl:aan liuosta, jossa on 0,5 g H202:ta/1 0,1 M HN03:oa. Kyvetti saapuu luminometrikammioon ja valo-monistimen edessä lisätään 300 μΐ 25 mM NaOH-liuosta ja 15 valon emittoimat fotonit mitataan ja kvantitoidaan ja ne ilmoitetaan suhteellisina valoyksikköinä (RLU). RLU-määrä on suoraan verrannollinen näytteessä olevan IgE-vasta-ai-neen määrään. Aika näytteen jakamisesta ensimmäiseen tulokseen on 15 minuuttia ja uusi tulos tulee joka 20. se-20 kunti. Tulokset ilmoitettiin arvona RLU-koe/RLU-tausta, jossa RLU-tausta oli se kemiluminisenssireaktio, joka havaittiin kokonais-IgE-vasta-aineen poissaollessa.

Kymmenen Phleum pratense -spesifistä IgE-standar-dia, jotka kalibroitiin Magic Lite SQ Specific IgE -käyt-25 töpakkauksella (ALK Laboratories A/S, Horsholm, Tanska) kliinisesti karakterisoitujen Phleum pratense -allergisten potilaiden näytteitä vastaan ja ilmoitettiin arvona SU/ml (standardisoidut yksiköt), testattiin käyttäen yllä kuvattua menetelmää ja osoitettiin, että 1,43 - 800 SU Phleum 30 pratense -spesifistä IgE-vasta-ainetta/ml kyettiin mittaamaan, kuten Magic Lite SQ Specific IgE -testissä, katso kuvio 3.

I? 111194

Esimerkki 3

Spesifisen IgE-vasta-aineen kvantitointi WHO-koko- nais-IgE-verrokkia vastaan

Seeruminäytteissä olevien spesifisten IgE-vasta-5 aineiden kvantitointi suoritettiin käyttäen verrokkina kokonais-IgE-vasta-ainetta tai spesifistä IgE-vasta-ainet-ta käyttäen samanlaista testimenetelmää kuin on kuvattu esimerkeissä 1 ja 2, vastaavasti.

35 potilasnäytettä testattiin Phleum pratense -spe-10 sifisen IgE-vasta-aineen suhteen yhdessä 10 Phleum pratense -spesifisen IgE-standardin kanssa, jotka kalibroitiin Magic Lite SQ Specific IgE -käyttöpakkauksella (ALK Laboratories A/S, Horsholm, Tanska) kliinisesti karakterisoitujen Phleum pratense -allergisten potilaiden näytteitä 15 vastaan ja ne ilmoitettiin arvona SU/ml (menetelmä kuvattu esimerkissä 2).

Yhdeksän IgE WHO 2nd IRP numero 75/502 -standardia (National Biological Standard Board) testattiin samalla kertaa kokonais-IgE-vasta-ainetta vastaan (menetelmä ku-20 vattu esimerkissä 1).

Kuviossa 4 esitetään kahden annosvastekäyrän vertailu kokonais-IgE-testille ja Phleum pratense -spesifiselle IgE-testille, vastaavasti. Rinnakkaiskäyrätesti ei osoittanut mitään merkittävää eroa kahden annosvastekäyrän 25 kulmakertoimissa, joka osoitti, että potilasnäytteiden spesifinen IgE voidaan kalibroida WHO-kokonais-IgE-stan-dardia vastaan ja ilmoittaa arvona IU/ml.

Kuviossa 5 esitetään 35 potilasnäytteen, jotka on kalibroitu WHO-kokonais-IgE-standardeja (ilmoitettu arvona 30 IU/ml) tai Phleum pratense -spesifisiä IgE-standardeja (ilmoitettu arvona SU/ml) vastaan, tulosten vertailut ja se osoittaa erittäin hyvän korrelaation näiden kahden yksikön välillä.

Tuntemattoman näytteen konsentraatio (annos) las-35 kettiin käyttäen interpolaatiota signaali/tausta-suhteen

J ' I

18 111194 ja konsentraation (annoksen) log-log-muunnoksen jälkeen, vastaavasti.

Lineaarisesta regressiokäyrästä laskettiin, että yksi SU (standardisoitu yksikkö) vastaa 0,14 kansainvälis-5 tä yksikköä (IU).

Yhteenvetona, allergeenispesifistä IgE-vasta-ainet-ta voidaan mitata käyttäen esillä olevan keksinnön suoritustapaa ja kalibroida suoraan WHO-IgE-kalibroidun stan-dardikäyrän kokonais-IgE-testistä.

10 Esimerkki 4

Kokonais-IgE-menetelmän vertailu 33 potilasnäytettä mitattiin seerumin kokonais-IgE-vasta-aineen suhteen Magic Lite Total IgE -käyttöpakkauk-sella (ALK Laboratories A/S, Horsholm, Tanska). Testi suo-15 ritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti, Samat näytteet mitattiin seerumin kokonais-IgE-vasta-aineen suhteen ACS:180-analysaattorilla samalla menetelmällä kuin esimerkissä 1.

Kuviossa 6 esitetään hajontakaavio menetelmän ver-20 taamiseksi seerumin kokonais-IgE-vasta-aineen mittaamises sa. Havaittiin korrelaatio r = 0,90.

Esimerkki 5

Spesifisen IgE-menetelmän vertailu 35 potilasnäytettä mitattiin Phleum pratense -spe-25 sifisen IgE-vasta-aineen suhteen Magic Lite SQ Specific IgE -käyttöpakkauksella (ALK Laboratories A/S, Horsholm, Tanska). Testi suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Samat näytteet mitattiin Phleum pratense -spesifisen IgE-vasta-aineen suhteen ACS:180-analysaattorilla samalla 30 menetelmällä kuin esimerkissä 2.

Kuviossa 7 esitetään hajontakaavio menetelmän vertaamiseksi Phleum pratense -spesifisen IgE-vasta-aineen mittaamisessa. Havaittiin korrelaatio r = 0,80.

19 111194

Esimerkki 6

Testin tarkkuuden vertailu

Testiajon sisäistä epätarkkuutta ACS-kokonais-IgE-vasta-aineelle, käyttäen esimerkin 1 menetelmää, verrat-5 tiin Magic Lite Total IgE -menetelmän vastaavaan. Potilas-näytteet ajettiin kolmena rinnakkaisena testeissä, jotka on kuvattu esimerkissä 4. Yhdistetty ajon sisäinen variaa-tiovakio (CVpwr) laskettiin sen mukaisesti, kuten ovat kuvanneet Krouwer ja Rabinowitz, Clinical Chemistry, 30, 10 290 (1984). Saatiin seuraavat tulokset:

Magic-liite ACS

%-Cpwr 4,69 2,75

Minimi %-CV 0,80 0,70 15 Maksimi %-CV 11,70 8,40

Kuten tuloksista voidaan havaita, käsittelyvaiheiden automatisointi ja minimointi parantaa merkittävästi analyysin tarkkuutta (F-testillä F = 1,71, p = 0,049).

20 Esimerkki 7

Kokonais- ja spesifisen IgE-vasta-aineen vertailu potilasnäytteissä Näytteet, joista mitattiin Phleum pratense -spesi-• finen IgE-vasta-aine ACS:180-analysaattorilla esimerkin 2 25 mukaisella menetelmällä ja jotka oli kalibroitu kokonais-| ; ; IgE-verrokkia (WHO 75/502) vastaan, kuten on kuvattu esi merkissä 3, analysoitiin myös kokonais-IgE-vasta-aineen suhteen, kuten on kuvattu esimerkissä 1. Mitatun spesifisen IgE-vasta-aineen ja kokonais-IgE-vasta-aineen suhde 30 laskettiin kullekin näytteelle ja ilmoitettiin %-suhteena (spes.-IU/kokonais-IU*100).

20 111194

Saatiin seuraavat tulokset:

Spesifinen Kokonais-

nr -W/BU W

5 2 0,000 153,330 0,000 3 0,000 25,119 0,000 4 0,000 43,980 0,000 5 0,082 51,997 0,158 6 0,586 30,807 1,902 10 7 9,130 20,796 43,903 8 2,125 168,771 1,259 9 1,545 321,553 0,480 10 0,000 299,105 0,000 11 1,664 248,660 0,669 15 .12 8,553 46,635 18,340 13 19,427 234,858 8,272 14 0,000 178,304 0,000 15 2,380 428,987 0,555 16 4,342 112,457 3,861 20 17 3,975 173,793 2,287 18 0,220 206,580 0,106 19 0,158 298,630 0,053 20 4,936 17,116 28,839 21 0,376 146,939 0,256 25 22 4,865 23,521 20,684 23 3,115 281,804 1,105 24 0,017 17,937 0,095 25 3,446 160,651 2,145 26 1,485 167,427 0,887 30 27 2,763 124,309 2,223 28 3,705 247,679 1,496 29 1,289 196,314 0,657 30 8,967 416,528 2,153 31 0,355 29,784 1,192 35 32 15,173 290,670 5,220 33 2,141 63,847 3,353 34 3,929 96,951 4,053

35 0,154 > 620 NO

21 111194

Kuten tuloksista voidaan havaita, Phleum pretense -spesifisen IgE-vasta-aineen testi kykeni mittaamaan niinkin matalan määrän kuin 0,05 % Phleum pratense -spesifistä IgE-vasta-ainetta kokonais-IgE-vasta-aineen joukosta. Ma-5 taiat suhteelliset Phleum pratense -spesifisen IgE-vasta-aineen määrät osoittavat, että näytteissä on läsnä muita allergeenispesifisyyksiä. Jopa 44 % kokonais-IgE-vasta-aineesta havaittiin yhdellä potilaalla olevan spesifistä Phleum pratense -heinää vastaan. Mitään korrelaatiota ei 10 havaittu kokonais-IgE-konsentraation ja Phleum pratense -spesifisen IgE-konsentraation välillä, kuten havaitaan kuviossa 8.

Esimerkki 8

Seerumin kokonais-IgÄ-vasta-aineiden määritys käyt-15 täen paramagneettipartikkeleita ja avidiini-akri- diniumesterileimaa

Kokonais-IgA-vasta-aineiden määritys testattiin käyttäen seuraavaa menetelmää.

25 μΐ potilasnäytettä tai kalibraattoria pipetoi-20 tiin 12 x 75 mm:n koeputkeen. Kuhunkin putkeen lisättiin 50 μΐ biotinyloitua polyklonaalista anti-IgA-vasta-ainetta DAKO E484 (toimittaja DAKO, Glostrup, Tanska) 0,05 M fosfaattipuskurissa, pH 7,4, joka sisälsi 0,1 % natriumatsi-. , dia, 0,01 % Tween* 20 -detergenttiä ja 0,1 % ihmisen seeru- ; ; 25 mialbumiinia, ja annettiin reagoida 15 minuuttia ympäris- tölämpötilassa. Kuhunkin putkeen lisättiin 400 μΐ paramag-neettipartikkelien lietettä, joihin oli immobilisoitu polyklonaalista anti-IgA-vasta-ainetta DAKO A 262 (toimittaja DAKO, Glostrup, Tanska), ja inkuboitiin 5 minuuttia. 30 Tämän toisen inkubaation jälkeen kuhunkin putkeen lisättiin 50 μΐ streptavidiini-akridiniumesterileimaa, joka oli laimennettu samaan puskuriin kuin yllä on kuvattu, ja inkuboitiin 5 minuuttia lisää ympäristölämpötilassa. Parama-gneettipartikkelit pestiin kahdesti 0,2 M fosfaattipusku-35 rilla, pH 7,4, joka sisälsi 0,1 % Tween* 20 -detergenttiä 22 111194 sen jälkeen, kun magneettipartikkelit oli erotettu nesteestä magneettiperusteisella erottajalla ja vorteksoitu erotettuja partikkeleita yllä kuvatussa pesupuskurissa. Putkien sisällöt mitattiin lopulta luminometrissä, jossa 5 426 nm:ssa emittoitunut valo kvantitoitiin ja se ilmoitet tiin suhteellisina valoyksiköinä (RLU).

Kokonais-IgA-standardit, jotka kalibroitiin ihmisen seerumin IgA DAKO X908 WHO numero 67/86 -standardia (toimittaja DAKO, Glostrup, Tanska) vastaan, testattiin käyt-10 täen yllä kuvattua menetelmää.

Standardit:

Konsentraatio (pg/ml) RLU:t 0 370 937 15 0,02 417 000 0,23 557 563 2,32 1 252 260 23,2 1 872 357 1

Alan asiantuntijalle tulisi olla ilmeistä, että monia variaatiota voidaan tehdä ilman, että poistutaan keksinnön hengestä ja piiristä.

Claims (14)

111194 23

1. Menetelmä näytteessä olevan vasta-aineen tunnistamiseksi käyttäen kemiluminisoivaa leimausyhdistettä, 5 tunnettu siitä, että se sisältää vaiheet, joissa: a) sekoitetaan biotiiniin tai sen toiminnalliseen johdannaiseen sidottu ligandiantigeeni, -vasta-aine tai -haptee-ni; tunnistettavaa vasta-ainetta vastaan suunnattu paramag-neettipartikkeleihin sidottu vasta-aine; ja avidiiniin, 10 streptavidiiniin tai niiden toiminnalliseen johdannaiseen sidottu kemiluminisoiva akridiniumyhdiste näytteen kanssa niin, että muodostetaan kiinteäfaasiin sidottu kompleksi, b) erotetaan magneettisesti kiinteäfaasi nestefaasista, c) aloitetaan kemiluminisoiva reaktio ja analysoidaan ero-15 tettu kiinteäfaasi kemiluminisoivan kompleksin läsnäolon suhteen, jolloin kemiluminisenssin läsnäolo on osoitus mainitun vasta-aineen läsnäolosta mainitussa näytteessä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se sisältää vaiheet, joissa: 20 i) sekoitetaan biotiiniin tai sen toiminnalliseen johdan-naiseen sidottu ligandiantigeeni, -vasta-aine tai -hapteeni ; näytteen kanssa ja sellaisen paramagneettipartikkeleihin ! i sidotun vasta-aineen kanssa, joka on suunnattu tunnistetta- \ vaa vasta-ainetta vastaan niin, että muodostetaan ensimmäi- 25 nen kiinteäfaasikompleksi, ' ii) lisätään avidiiniin, streptavidiiniin tai niiden toi- : minnalliseen johdannaiseen kovalenttisesti sidottu kemilu minisoiva akridiniumyhdiste niin, että muodostetaan toinen ; kiinteäfaasikompleksi, ; ’ j 30 iii) erotetaan magneettisesti kiinteäfaasi nestefaasista; iv) aloitetaan kemiluminisenssireaktio ja analysoidaan ero-tettu kiinteäfaasi kemiluminisoivan kompleksin läsnäolon suhteen. "v;

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että näytteen vasta-aine on spesifinen immunoglobuliini, joka valitaan ryhmästä, joka sisäl 111194 24 tää spesifisen IgA-, IgD-, IgE-, IgG-, IgM-vasta-aineen ja niiden isotyypit, ja ligandiantigeeni, -vasta-aine tai -hapteeni on spesifinen allergeeni.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että spesifinen immunoglobuliini on spesifinen IgE.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että näytteen vasta-aine on immuno-globuliiniluokka, joka valitaan ryhmästä, joka sisältää ko- 10 konais-IgA-, kokonais-IgD-, kokonais-IgE-, kokonais-IgG-, kokonais-IgM-luokan ja niiden isotyypit, ja ligandiantigeeni, -vasta-aine tai -hapteeni on vasta-aine, joka on suunnattu mainittua immunoglobuliiniluokkaa vastaan.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että mainittu immunoglobuliiniluok- ka on kokonais-IgE-luokka.

7. Minkä tahansa edellä mainitun patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että para-magneettipartikkeleihin sidottu vasta-aine, joka on suun- 20 nattu tunnistettavaa vasta-ainetta vastaan, valitaan ryhmästä, joka sisältää polyklonaaliset vasta-aineet, monoklonaaliset vasta-aineet sisältäen rekombinantti-vasta-aineet, fragmentoidut vasta-aineet; suositeltavasti hiiren monoklo-naalinen anti-immunoglobuliini.

8. Minkä tahansa edellä mainitun patenttivaatimuk sen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kemi-luminisoiva akridiniumyhdiste on avidiiniin, streptavidii-niin tai niiden toiminnalliseen johdannaiseen kovalentti-sesti sidottu N-hydroksisukkinimididimetyyliakridiniumes-30 teri.

9. Menetelmä näytteessä olevan spesifisen vasta-aineen konsentraation ja/tai suhteellisen määrän mittaamiseksi, jossa erotetun kiinteäfaasin, joka sisältää napatun spesifisen vasta-aineen kiinnitettynä kemiluminisoivaan 35 leimaan, mitattua valoemissiota verrataan siihen mitattuun valoemissioon, joka saadaan rinnakkain tehdystä verrokki- 111194 25 immuunitestistä, jossa mitataan sen vasta-aineluokan, johon mainittu spesifinen vasta-aine kuuluu, kokonaismäärät näytteessä, tunnettu siitä, että se sisältää vaiheet, joissa: 5 a) sekoitetaan biotiiniin tai sen toiminnalliseen johdannaiseen sidottu ligandiantigeeni tai -hapteeni, jota vastaan mitattava spesifinen vasta-aine on suunnattu; mitattavan vasta-aineen vakioaluetta vastaan suunnattu paramag-neettipartikkeleihin sidottu vasta-aine; ja avidiiniin, 10 streptavidiiniin tai niiden toiminnalliseen johdannaiseen sidottu kemiluminisoiva akridiniumyhdiste näytteen kanssa niin, että muodostetaan ensimmäinen kiinteäfaasikompleksi, b) erotetaan magneettisesti mainittu ensimmäinen kiin-teäfaasi nestefaasista, 15 c) aloitetaan kemiluminisoiva reaktio ja mitataan valoemis-sio erotetusta ensimmäisestä kiinteäfaasista, d) sekoitetaan biotiiniin tai sen toiminnalliseen johdannaiseen sidottu ligandivasta-aine, joka on suunnattu mitattavaa vasta-aineluokkaa vastaan; mitattavan vasta-20 aineluokan vakioaluetta vastaan suunnattu paramagneettipar-;tikkeleihin sidottu vasta-aine; ja avidiiniin, streptavi-·."! diiniin tai niiden toiminnalliseen johdannaiseen sidottu kemiluminisoiva akridiniumyhdiste näytteen kanssa niin, että muodostetaan toinen kiinteäfaasikompleksi, " 25 e) erotetaan magneettisesti mainittu toinen kiinteäfaasi -f.; : nestefaasista, ' f) aloitetaan kemiluminisoiva reaktio ja mitataan valoemis- sio erotetusta toisesta kiinteäfaasista, ja g) verrataan ensimmäisen erotetun kiinteäfaasin ja erotetun /''·, 30 toisen kiinteäfaasin valoemissiota.

' ( 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaihe a) suoritetaan niin, et-tä se sisältää vaiheet, joissa: : (i) sekoitetaan biotiiniin tai sen toiminnalliseen johdan- .... 35 naiseen sidottu ligandiantigeeni tai -hapteeni näytteen 26 111194 kanssa ja paramagneettipartikkeleihin sidotun vasta-aineen kanssa niin, että muodostetaan kiinteäfaasikompleksi, ja (ii) lisätään avidiiniin, streptavidiiniin tai niiden toiminnalliseen johdannaiseen sidottu kerniluminisoiva akri-5 diniumyhdiste niin, että muodostetaan mainittu ensimmäinen kiinteäfaasikompleksi, ja jossa vaihe d) suoritetaan niin, että se sisältää vaiheet, joissa: (i) sekoitetaan biotiiniin tai sen toiminnalliseen johdan-10 naiseen sidottu ligandivasta-aine näytteen kanssa ja paramagneettipartikkeleihin sidotun vasta-aineen kanssa niin, että muodostetaan kiinteäfaasikompleksi, ja (ii) lisätään avidiiniin, streptavidiiniin tai niiden toiminnalliseen johdannaiseen kovalenttisesti sidottu kemilu- 15 minisoiva akridiniumyhdiste niin, että muodostetaan mainittu toinen kiinteäfaasikompleksi.

11. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että näytteen mitattava spesifinen vasta-aine on spesifinen immunoglobuliini, joka vali-20 taan ryhmästä, joka sisältää IgA-, IgD-, IgE-, IgG-, IgM-vasta-aineen ja niiden isotyypit, ja ligandiantigeeni, -vasta-aine tai -hapteeni, joka on suunnattu mainitun vasta-aineen variaabelialuetta vastaan, on allergeeni, ja vasta-aineluokka on immunoglobuliiniluokka, joka valitaan ryhmäs-25 tä, joka sisältää kokonais-IgA-, kokonais-IgD-, kokonais-IgE-, kokonais-IgG-, kokonais-IgM-luokan ja niiden isotyypit, ja ligandiantigeeni, -vasta-aine tai -hapteeni on vasta-aine, joka on suunnattu mainittua immunoglobuliiniluokkaa vastaan.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että spesifinen immunoglobuliini on spesifinen IgE ja vasta-aineluokka on kokonais-IgE-luokka.

13. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että paramagneettipartikkelei-35 hin sidottu vasta-aine, joka on suunnattu mitattavaa vasta-ainetta vastaan, valitaan ryhmästä, joka sisältää polyklo- 111194 27 naaliset vasta-aineet, monoklonaaliset vasta-aineet sisältäen rekombinantti-vasta-aineet, fragmentoidut vasta-aineet; suositeltavasti hiiren monoklonaalinen anti-immunoglobuliini.

14. Minkä tahansa edellä mainitun patenttivaatimuk sen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kemi-luminisoiva akridiniumyhdiste on N-hydroksisukkinimididi-metyyliakridiniumesteri, joka on kovalenttisesti sidottu avidiiniin, streptavidiiniin tai niiden toiminnalliseen 10 johdannaiseen. j 111194 28