CN116375712A - 双吗啉取代的杂环化合物及其医药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物化学领域，具体地涉及一组用做ATR抑制剂的式(I)的双(R)‑3‑甲基吗啉取代的杂环化合物、其制备方法、包含其的药物组合物以及它们用于治疗或预防ATR相关疾病的用途。

Description

双吗啉取代的杂环化合物及其医药用途
技术领域
本发明涉及药物化学领域，具体地涉及一组用做ATR抑制剂的双-烷基取代的吗啉取代的杂环化合物、其制备方法、包含其的药物组合物以及它们用于治疗或预防ATR相关疾病的用途。
背景技术
由于环境因素如紫外线辐射、X射线和内源性因素如活性氧，人体细胞持续暴露于DNA损伤事件。在癌症细胞中，由于受到致癌基因驱动子驱动或受到DNA损伤药物或电离辐射(IR)的外源性诱导，存在较高水平的DNA复制应激(癌症的标志)，持续的复制应激导致DNA断裂，使得肿瘤细胞经历较高的DNA损伤，所述DNA损伤和复制应激构成基因组不稳定性的主要来源。
DNA损伤如果足够高且不被修复，将会对细胞产生高度毒性，导致细胞死亡。为了确保真核细胞基因组的完整性，已经进化形成一组统称为DDR(DNA损伤响应)的生物学通路，用以识别、传递信号并修复DNA损伤。ATR(共济失调毛细血管扩张突变和Rad3相关激酶)、ATM(共济失调毛细血管扩张突变激酶)和DNA-PK(DNA依赖性蛋白激酶)是DDR的关键组分，它们通过响应于不同的DNA损伤而发挥修复DNA损伤的功能，其中ATM和DNA-PK主要响应于DNA双链断裂，ATR主要响应于复制应激。
ATR属于磷脂酰肌醇激酶相关激酶(PIKK)蛋白家族的成员，其主要靶标是CHK1。当ATR被多种DNA损伤、尤其是复制应激激活后，ATR通过CHK1的磷酸化，传递DNA损伤信号，使细胞周期停滞在S期或G2/M中，进行损伤修复，使细胞缓解复制应激压力，从而在去除应激压力后重新开始复制。
相比之于健康的增殖细胞，肿瘤细胞中具有较高的DNA损伤和复制应激，若要复制存活，维持细胞的***，更依赖于ATR进行DNA修复。因此，通过抑制ATR，可以抑制肿瘤细胞的修复功能，导致DNA损伤和复制应激增加且不能被修复，最终导致肿瘤细胞死亡，同时不影响或较少地影响健康的增殖细胞，这构成ATR抑制剂用于癌症治疗的基础，也使得ATR抑制在近年来已经被认为是重要的癌症治疗途径。
标准癌症疗法如放疗或化疗通过诱发DNA损伤来发挥治疗功效，这对增殖性细胞特别具有毒性，而DNA损伤修复机制的存在会限制这些疗法的功效，从而会产生针对化疗或放疗药物的耐药性。通过抑制ATR，增加复制应激、增加DNA损伤，可增强肿瘤细胞对这些DNA损伤诱导性疗法的敏感性，有助于克服放疗或化疗药物因损伤修复导致的耐药性，可以用于治疗基因突变或化疗耐药的肿瘤患者，降低化疗或放疗的剂量，从而降低对血液和胃肠道器官***的毒性。
因此，对于复制应激增加的癌细胞或其他DNA损伤修复通路活性受损或缺陷的癌细胞，可以用ATR抑制剂增加复制应激，诱导肿瘤细胞死亡。的确，研究已揭示，ATR抑制剂对p53突变肿瘤或丧失ATM功能的肿瘤具有合成致死活性，当与多种复制应激/DNA损伤诱导性化疗剂联合使用时具有协同作用，例如铂、电离辐射以及PARP抑制剂。
此外，ATR抑制还可以预防癌症的发生，因为ATR也是DNA损伤检查点的重要成员，ATR抑制会限制癌基因激活导致的原癌细胞的扩增。
近年来，已经开发出一些ATR抑制剂(例如WO2017202748、CN111848605A、WO2020087170、WO2020049017、CN112142744A)。但是，开发新的强效ATR抑制剂仍然是非常具有挑战性的。PIKK激酶家族与相关脂质激酶如磷脂酰肌醇3-激酶(PI3KS)以及mTOR的高度同一性增加了抑制其他激酶的风险，这可能会增加毒性或抵消ATR抑制的治疗效果；此外，一些ATR抑制剂的应用还受限于物理化学性质、药动学性质以及药物相互作用。
因此，本领域仍然需要新的选择性ATR抑制剂，其具有增强的ATR抑制活性，特别是具有改进的物理化学性质和/或药动学性质(口服可利用的)、和/或CYP450抑制最小化的ATR抑制剂。
发明简述
本发明人通过研究已经鉴定，本发明的化合物显示令人满意的ATR抑制活性，而且在药代动力学实验中显示良好的性能，预示着改进的成药性和改进的生物利用度。因此，本发明化合物不仅可实现用于预防或治疗与ATR相关疾病的目的，而且所制备的药物有望具有改善的吸收、在同等剂量下疗效提高、或以更低的剂量提供相同疗效和/或降低可能的副作用。由此，本发明还提供了本发明化合物在制备用于预防或治疗与ATR相关疾病的药物中的用途、包含所述化合物的药物组合物和通过施用所述化合物预防和/或治疗与ATR相关疾病的方法。
因此，在本发明的一方面，提供式(I)化合物、其立体异构体、互变异构体、稳定的同位素变体、药学上可接受的盐或溶剂合物：
Figure BDA0004025733960000021
其中各个基团的定义如发明详述部分所述。
在本发明的另一方面，提供了具有ATR抑制活性、用作药物、尤其是用作ATR抑制剂用于治疗或预防ATR相关疾病的本发明式(I)化合物、其立体异构体、互变异构体、稳定的同位素变体、药学上可接受的盐或溶剂合物。
在本发明的另一方面，提供了包含本发明化合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一个具体的方面，药物组合物可以另外包含适合与本发明化合物组合使用的另外的治疗活性成分。在一个具体的方面，提供了包含本发明化合物和另外的活性剂的药物组合产品，例如试剂盒。
在本发明的另一方面，提供了本发明的化合物或包含其的药物组合物用于在哺乳动物、特别是人中预防或治疗与ATR相关疾病的用途。
在本发明的另一方面，提供了在受试者、例如哺乳动物、特别是人中预防或治疗与ATR相关疾病的方法，该方法包括施用有效量的本文所述的本发明化合物或包含其的药物组合物。
在本发明的另一方面，提供了上述本发明的化合物或包含其的药物组合物在制备用于预防或治疗ATR相关疾病的药物中的用途。
在另外的方面，提供了用于合成本发明化合物的方法，其中代表性的合成方案和途径在下文描述。
通过阅读随后的详细描述，本发明的其它目的和优点对于本领域技术人员将变得显而易见。
发明详述
定义
除非另外指出，说明书和权利要求书中使用的各个术语具有以下所示含义。在特定的术语或短语没有特别定义的情况下，不应该被认为是不确定或不清楚的，而是应该按照本领域的普通含义、并结合本文上下文理解。
本文定义的许多基团都是任选被取代的，该定义部分所给出的取代基列表仅仅是示例性的，而非穷举，也不意欲限制本说明书和权利要求书中其他部分所定义的取代基。
本文所用的术语“治疗”是指给患有所述疾病、或者具有所述疾病的症状的受试者、例如哺乳动物、例如人施用一种或多种本文所述的本发明化合物，用以治愈、缓解、减轻或影响所述疾病或所述疾病的症状。在本发明具体的实施方案中，所述疾病是下文所定义的ATR相关的疾病、尤其是肿瘤或癌症。
本文所用的术语“预防”在本领域中是众所周知的，是给怀疑患上或易感于如本文所定义的ATR相关疾病、尤其是癌症或肿瘤的受试者、例如哺乳动物、例如人施用一种或多种本文所述的本发明化合物，使得罹患所定义疾病的风险降低。术语“预防”包含在诊断或确定任何临床和/或病理症状以前使用本发明的化合物。
本文所用的术语“抑制”和“降低”或这些术语的任何变体，是指生物活性剂的能力，其通过直接或间接与靶点相互作用，降低目标靶点的信号传导活性，且是指目标靶点活性的任何可以测量的减少或完全抑制。例如，与正常情况相比，可以是活性(例如ATR活性)降低量约或至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多、或其中可衍生的任何范围。
本文所用的术语“选择性抑制”是指生物活性剂的能力，其通过直接或间接与靶点相互作用，相比脱靶的信号活性，优先降低目标靶点的信号传导活性。就本发明化合物而言，相对于具有高度同一性的其他激酶如PIKK激酶家族与相关脂质激酶如磷脂酰肌醇3-激酶(PI3KS)以及mTOR，其能够选择性抑制ATR的活性，从而减少同时作用于其他激酶可能导致的毒性或对ATR抑制效果的抵消。例如，与对另一种特定激酶相比，本发明对ATR具有至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多、或其中可衍生的任何范围的更好活性的抑制，或与对另一种特定激酶的活性相比，对ATR具有至少1-、2-、3-、4-、5-、10-、25-、50-、100-、250-或500-倍的更好活性。
本文所用的术语“癌症”或“肿瘤”是指赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，和所有的癌前期细胞和癌细胞和组织。对本发明的化合物、方法、药物组合物、药物组合及用途而言，所述癌症或肿瘤包括但不限于结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、鳞状细胞癌、基底层细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、肺癌、白血病、膀胱癌、胃癌、子***、睾丸癌、皮肤癌、直肠癌、甲状腺癌、肾癌、子宫癌、天疱疮癌、肝癌、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑(脊)膜瘤、成神经细胞瘤、眼癌。
相应地，本文所述的“抗癌作用”或“抗肿瘤作用”包括但不限于对响应速率、疾病进展的时间及存活率的作用。本发明化合物及其医药用途和方法的抗肿瘤作用包括但不限于抑制肿瘤生长、延迟肿瘤生长、消退肿瘤、使肿瘤萎缩、治疗停止后肿瘤再生长时间延长、减缓疾病进展，也包括预防肿瘤发生。
本文所使用的术语“治疗有效量”意指当向个体施用以治疗疾病时足以减轻或完全缓解病症的症状或其它有害作用；逆转、完全停止或减缓病症的进展；或降低病症恶化的风险的量，“有效量”可视化合物、疾病及其严重程度及待治疗的个体的年龄、体重等而变化。
如本文所使用的术语“个体”或“受试者”包括人或非人动物。示例性人个体包括患有疾病(例如本文所述的疾病)的人个体(称为患者)或正常个体。本发明中“非人动物”包括所有脊椎动物，例如非哺乳动物(例如鸟类、两栖动物、爬行动物)和哺乳动物，例如非人灵长类、家畜和/或驯化动物(例如绵羊、犬、猫、奶牛、猪等)。
本文所用的术语“ATR相关疾病”是指ATR活性对所述疾病的发生和发展起到促进作用，或抑制ATR将降低疾病的发生率、减少或消除疾病病状的疾病。对于本发明而言，“ATR相关疾病”优选指的是ATR介导的疾病，更进一步优选癌症或肿瘤。如本文所述，ATR激酶抑制剂对于下列疾病应该具有治疗或预防价值：血液恶性肿瘤，例如白血病(包括慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病和慢性骨髓性白血病)、多发性骨髓瘤、淋巴***恶性肿瘤(例如淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤)、骨髓增生异常综合症，以及实体瘤、例如癌和肉瘤及其转移灶，例如乳腺癌、肺癌(非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌)、中枢神经***肿瘤(例如胶质瘤、胚胎期发育不良性神经上皮肿瘤、多形性成胶质细胞瘤、混合胶质瘤、成髓细胞瘤、成视网膜细胞瘤、成神经细胞瘤、生殖细胞瘤及畸胎瘤)、胃肠道癌(例如胃癌、食管癌、肝癌、胆管癌、结直肠癌、小肠癌、胰腺癌)、皮肤癌、黑色素瘤、甲状腺癌、骨癌、头颈癌、唾液腺癌、***癌、睾丸癌、卵巢癌、子***、子宫癌、子宫内膜癌、外阴癌、膀胱癌、肾癌、鳞状细胞癌、肉瘤(例如骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、软组织肉瘤、尤因式肉瘤、胃肠组织癌、胃肠基质肿瘤、卡波西氏肉瘤)，以及儿科癌症(例如横纹肌肉瘤和成神经细胞瘤)。
本发明的化合物尤其可用于治疗患有肺癌、***癌、黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肾癌、胃癌、肉瘤、头颈癌、中枢神经***肿瘤及其转移灶、以及患有急性髓性白血病的患者。
本文所用的术语“药物组合物”或“药物制剂”是指包含一种或多种本发明式(I)化合物或者其立体异构体、互变异构体、稳定的同位素衍生物、药学上可接受的盐或溶剂合物和在本领域中通常接受的可药用赋形剂或载体的组合物，且可以为固体、半固体、液体或气态形式。
本文所用的术语“药物组合”是指本发明化合物可与其它活性剂组合用于实现本发明的目的。所述其他活性剂可以是一种或多种另外的本发明化合物，或可以是与本发明化合物相容即不会相互不利影响、或具有互补活性的第二种或另外的(例如第三种)化合物。这类活性剂以达到预期目的的有效量适宜地组合存在。所述其他活性剂可以与本发明化合物在单一药物组合物中共同施用，或与本发明化合物处于不同的离散单元中分别施用，例如以试剂盒形式施用，当分别施用时可以同时或相继进行。所述相继施用在时间上可以是接近或隔远的。
本文所用的术语“药学可接受的”意指由各个国家的相应机构批准的或可由其批准，或列于用于动物且更具体地人类的一般公认药典中，或当向动物例如人类适量施用时不会产生不利、过敏或其它不良反应的分子实体和组合物。
本文所用的术语“药学上可接受的赋形剂或载体”是指一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，其药理学上无活性，与组合物中的其它成分相容，并且应是对温血动物如人给药可接受的，用作本发明化合物在施用形式中的载体或介质，其实例包括但不限于纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、醋酸纤维素等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温类)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂等。
本文所用的术语“药学可接受的盐”意指药学上可接受且具有母体化合物所需药理学活性的本发明化合物的盐。具体地，此类盐无毒，可为无机酸加成盐或有机酸加成盐及碱加成盐。具体地，此类盐包括：(1)与无机酸形成的酸加成盐，该无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或与有机酸形成的酸加成盐，该有机酸如乙酸、丙酸、己酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、丁二酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、葡糖庚酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、黏康酸等；或(2)当存在于母体化合物中的酸性质子经金属离子如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子置换时、或与有机碱如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、N-甲基葡糖胺等配位时形成的盐。本领域技术人员将知道制备药用盐的一般原理和技术，例如Berge等，Pharm ScL，66，1-19.(1977)中所述的那些。
本文所用的术语“立体异构体”是指由至少一个不对称中心形成的异构体。在具有一个或多个、例如1、2、3或4个不对称中心的化合物中，可产生外消旋混合物、单一对映异构体、非对映异构体和单独的非对映异构体。特定分子也可以以几何异构体(顺式/反式)存在。本发明化合物还可以以两种或更多种处于快速平衡的结构不同的形式的混合物存在，通常称为互变异构体，代表性实例包括酮-烯醇、苯酚-酮、亚硝基-肟互变异构体等。应当理解，本发明范围涵盖所有这样的异构体以及其任意比例的混合物，例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％。
本文所用的术语“溶剂合物”是指包含化学计量的或非化学计量的溶剂的溶剂加成形式，包括本发明化合物的任何溶剂化形式，包括例如与水的溶剂合物，例如水合物，或与有机溶剂的溶剂合物，例如甲醇、乙醇或乙腈，即分别作为甲醇化物、乙醇化物或乙腈化物；或为任何多晶型物的形式。应当理解的是，本发明化合物的这类溶剂合物还包括本发明化合物的药学上可接受盐的溶剂合物。
本文所用的术语“前药”意指具有可裂解基团且通过溶剂分解或在生理条件下变成在体内具有药学活性的本发明化合物的化合物。前药包括本领域熟知的酸衍生物，如通过母体酸与适合醇反应制备的酯，或通过母体酸化合物与取代或未取代的胺反应制备的酰胺，或酸酐或混合酸酐。衍生自本发明化合物侧接的酸基的简单脂族或芳族酯、酰胺及酸酐为尤其适用的前药。特定的此类前药为本发明化合物的C1-8烷基、C2-8烯基、任选被取代的C6-10芳基及(C6-10芳基)-(C1-4烷基)酯。
本文所用的术语“同位素变体”是指构成该化合物的一或多个原子上含有非天然比例同位素的化合物。本发明的化合物可在构成化合物的一个或多个原子上包含非天然比例的原子同位素，从而形成同位素变化形式，其无论是否具有放射性，都旨在涵盖在本发明的范围内。可以掺入本发明化合物中的同位素及其药学上可接受的盐的实例包括(但不限于)氢的同位素(例如2H、3H)；碳的同位素(例如11C、13C及14C)；氯的同位素(例如36Cl)；氟的同位素(例如18F)；碘的同位素(例如123I及125I)；氮的同位素(例如13N及15N)；氧的同位素(例如15O、17O及18O)；磷的同位素(例如32P)；及硫的同位素(例如35S)。应当理解，本发明化合物的同位素变化形式通常可以通过常规方法、使用适合试剂的适当同位素变化形式来制备。
本文通式(I)化合物结构式中的
Figure BDA0004025733960000071
表示芳族环，即A1至A6的选择使得所形成的环满足芳族环的价键理论，且在化学上可行及稳定。
本文化合物结构式或结构片段中使用的
Figure BDA0004025733960000072
表示存在立体异构体，且表示不对称中心的绝对构型，在本发明所提供的化合物或中间体的命名中通常以R或S表示。当存在于外消旋混合物中时，该实及虚锲形符号定义的是相对立体化学，而非绝对立体化学。
本文所涉及结构片段中使用的
Figure BDA0004025733960000073
指示与其交叉的键是结构片段连接于分子其余部分的键。
本文所用的术语“卤代”或“卤素”意指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)及碘(I)。优选的卤代为氟或氯。
本文定义基团时所用的术语“被卤素取代的”旨在包括单卤代或多卤代基团，其中一个或多个(例如2、3、4、5或6个)相同或不同的卤素取代基团中的一个或多个(例如2、3、4、5或6个)氢。
本文中所使用的术语“羟基”指-OH。
本文中所使用的术语“氧代”指＝O。
本文中所使用的术语“烷基”指由碳原子和氢原子组成的直链或支链的饱和烃基团。具体地，烷基具有1-10个，例如1至6个、1至5个、1至4个、1至3个或1至2个碳原子。例如，如本文中所使用的术语“C1-C6烷基”指具有1至6个碳原子的直链或支链的饱和烃基团，其实例例如甲基、乙基、丙基(包括正丙基和异丙基)、丁基(包括正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基)、戊基(包括正戊基、异戊基、新戊基)、正己基、2-甲基戊基等。特定的烷基具有1至3个碳原子。
本文所用的术语“亚烷基”在单独或与其他基团组合使用式是指饱和的直链或直链二价烃基。例如术语“C1-6亚烷基”是指具有1至6个碳原子的直链或支链亚烷基，优选的“C1-3亚烷基”是指具有1至3个碳原子的支链或支链亚烷基，亚烷基的代表性实例包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、1-甲基亚乙基、2-甲基亚丙基等。
本文所用的术语“环烷基”指具有指定环原子数的单环、稠合多环、桥接多环或螺环非芳族饱和单价烃环结构。环烷基可具有3至12个碳原子(即C3-C12环烷基)，例如C3-10环烷基，C3-8环烷基，C3-6环烷基，C5-6环烷基。适合的环烷基的实例包括但不限于单环结构，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基；或多环(例如双环)结构，包括螺环、稠合或桥连***，如双环[1.1.1]戊基、双环[2.2.1]庚基、螺[3.4]辛烷基、双环[3.1.1]己烷基、双环[3.1.1]庚基或双环[3.2.1]辛基等。
本文所用的术语“取代”或“取代的”是指所指定的原子上的一个或多个(例如1、2、3或4个)氢被所指定的基团代替，条件是未超出所指定原子在当前情况下的正常价键并且形成稳定的化合物，取代基和变量的组合仅当这种组合形成稳定的化合物时才是允许的。
本文所用的术语“任选取代的”，除非另外指出，表示基团可以是未取代的或被一个或多个(例如0、1、2、3、4或5或更多)对该基团所列的取代基取代，其中所述取代基可以相同或不同。
除非另有规定，本发明化合物定义中的Cn-n+m或Cn-Cm包括n至n+m个碳的各种情况，例如C1-6包括C1、C2、C3、C4、C5和C6，也包括n至n+m中的任何一个范围，例如C0-6包括C1、C2、C3、C4、C5、C6、C0-1、C0-2、C0-3、C0-4、C0-5、C1-2、C1-3、C1-4、C2-3等。同理，本发明化合物定义中的n元至n+m元表示环原子数可以为n至n+m之间的任何一个，也包括n至n+m元的任何一个范围。
如在本说明书和随后的权利要求书中所使用的，词语“包含”、“包括”和“含有”意指“包括但不限于”，并且不排除例如其他添加剂、成分、整数或步骤。应理解的是，该术语包括“由所述成分、步骤或条件组成”或“基本上由所述成分、步骤或条件组成”的技术方案。
应理解，当本文描述本发明化合物、包含其的药物组合物、药物组合以及相关的用途和方法时所涉及的剂量，是基于游离形式的重量，而非基于其任何盐、水合物或溶剂化物等，除非说明书中另外定义。
本发明化合物
本申请通篇使用的术语“发明的化合物”和“本发明的化合物”等，除非另外指出，涵盖本文各个实施方案及其具体或优选实施方式中定义的式(I)化合物、它们的立体异构体、互变异构体、稳定的同位素变体、药学上可接受的盐或溶剂合物，以及前药。所述立体异构体、互变异构体、稳定的同位素变体、药学上可接受的盐或溶剂合物以及前药如上文定义部分所描述。优选地，本发明化合物为式(I)化合物的游离形式或其药学上可接受的盐或溶剂合物；最优选为式(I)化合物的游离形式或其药学上可接受的盐。
本发明的某些化合物可以以多晶型或无定形形式存在，它们也落入本发明的范围内。当为固体结晶形式时，式(I)化合物可以是与另一种化学实体的共晶体形式，并且本说明书包括所有这些共晶体。
在存在手性中心时，本发明的化合物可以以单独的对映异构体或对映体混合物形式存在，本领域技术人员能够确定稳定和可行的本发明化合物的异构体形式。根据一个实施方案，提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐，其是对映体过量(％ee)＞95、＞98％或＞99％的单一对映体。优选地，单一对映异构体以＞99％的对映异构体过量(％ee)存在。
本发明化合物还涵盖可能存在的N-氧化物，本领域技术人员能够确定稳定和可行的本发明化合物的N-氧化物。本发明化合物还涵盖本发明化合物的代谢物，即给药本发明化合物时在体内通过氧化、还原、水解、酰胺化、酯化等形成的物质，其可通过本领域公知的技术进行鉴定。
具体地，一方面，本发明提供式(I)化合物、其立体异构体、互变异构体、稳定的同位素变体、药学上可接受的盐或溶剂合物：
Figure BDA0004025733960000091
其中，
R1和R2各自独立地为C1-6烷基；
Z选自N或CR3，其中R3选自H、卤素或任选被卤素取代的C1-6烷基；
A1、A2和A6各自独立地选自C或N；
A3、A4和A5各自独立地选自CR4或N；或者A3、A4和A5之一不存在，其余各自独立地选自CR4、N或NR5；
R4选自H、氧代、卤素、C1-6烷基、C3-6环烷基或-C1-6亚烷基-C3-6环烷基，所述C1-6烷基、C1-6亚烷基和C3-6环烷基各自任选被选自卤素、羟基或任选被卤素取代的C1-6烷基的基团取代；
R5选自H、C1-6烷基、C3-6环烷基或-C1-6亚烷基-C3-6环烷基，所述C1-6烷基、C1-6亚烷基和C3-6环烷基各自任选被选自卤素或任选被卤素取代的C1-6烷基的基团取代；
条件是：A1和A2中至多一个是N，且A3、A4、A5和A6中包含至少一个且至多三个N原子。
在一种式(I)化合物的实施方案中，A3、A4和A5之一不存在，且包含A1、A2、A3、A4、A5和A6的环中包含至少两个N杂原子。
在一种式(I)化合物的实施方案中，A3、A4和A5各自独立地选自CR4或N。
在一种式(I)化合物的实施方案中，包含Z和A1～A6的双环稠合杂芳基部分具有选自以下的结构：
Figure BDA0004025733960000092
Figure BDA0004025733960000101
Figure BDA0004025733960000102
优选/>
Figure BDA0004025733960000103
Figure BDA0004025733960000104
在前述式(I)化合物的实施方案中，包含Z和A1～A6的双环稠合杂芳基部分进一步优选为
Figure BDA0004025733960000105
Figure BDA0004025733960000106
最优选/>
Figure BDA0004025733960000107
在一种式(I)化合物的实施方案中，R4为H。
在一种式(I)化合物的实施方案中，R4为氧代；或R4为卤素，优选氟或氯。
在一种式(I)化合物的实施方案中，R4为C1-6烷基，任选被卤素或羟基取代，例如但不限于甲基、乙基、丙基(包括正丙基和异丙基)、丁基(包括正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基)、戊基(包括正戊基、异戊基、新戊基)、正己基、2-甲基戊基、-CH2F、-CHF2、-CF3、-C2F5、-CH2CF3、-CH2Cl、-CH2CH2CF3、-CH(CF3)2、-CH2OH或-CH2CH2OH。在该实施方案中，优选R4是-C1-3烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基，最优选甲基。
在一种式(I)化合物的实施方案中，R4为C3-6环烷基，任选被选自卤素、羟基或任选被卤素取代的C1-6烷基的基团取代，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、取代的环丙基例如但不限于
Figure BDA0004025733960000111
以及被类似取代的环丁基、环戊基或环己基。在该实施方案中，优选R4是-C3-5环烷基，选自环丙基、环丁基和环戊基，最优选环丙基。
在一种式(I)化合物的实施方案中，R4为-C1-6亚烷基-C3-6环烷基，优选-C1-3亚烷基-C3-6环烷基，任选被选自卤素、羟基或任选被卤素取代的C1-6烷基的基团取代，例如但不限于-亚甲基-环丙基、-亚甲基-环丁基、-亚甲基-环戊基、-亚甲基-环己基、-亚乙基-环丙基、-亚乙基-环丁基、-亚乙基-环戊基、-亚乙基-环己基、
Figure BDA0004025733960000112
Figure BDA0004025733960000113
以及被类似取代的-亚甲基或亚乙基或亚丙基-环丁基或环戊基或环己基。在该实施方案中，优选R4是-C1-3亚烷基-C3-5环烷基，例如-亚甲基-环丙基、-亚甲基-环丁基、-亚甲基-环戊基、-亚乙基-环丙基、-亚乙基-环丁基、-亚乙基-环戊基，最优选-亚甲基-环丙基、-亚甲基-环丁基、-亚甲基-环戊基。
在前述式(I)化合物的实施方案中，R4优选是H或C3-6环烷基，最优选H或环丙基。
在一种式(I)化合物的实施方案中，R5为H。
在一种式(I)化合物的实施方案中，R5为C1-6烷基，任选被卤素或羟基取代，例如但不限于甲基、乙基、丙基(包括正丙基和异丙基)、丁基(包括正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基)、戊基(包括正戊基、异戊基、新戊基)、正己基、2-甲基戊基、-CH2F、-CHF2、-CF3、-C2F5、-CH2CF3、-CH2Cl、-CH2CH2CF3、-CH(CF3)2、-CH2OH或-CH2CH2OH。在该实施方案中，优选R5是-C1-3烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基，最优选甲基。
在一种式(I)化合物的实施方案中，R5为C3-6环烷基，任选被选自卤素、羟基或任选被卤素取代的C1-6烷基的基团取代，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、取代的环丙基例如但不限于
Figure BDA0004025733960000114
以及被类似取代的环丁基、环戊基或环己基。在该实施方案中，优选R5是-C3-5环烷基，选自环丙基、环丁基和环戊基，最优选环丙基。
在一种式(I)化合物的实施方案中，R5为-C1-6亚烷基-C3-6环烷基，优选-C1-3亚烷基-C3-6环烷基，任选被选自卤素、羟基或任选被卤素取代的C1-6烷基的基团取代，例如但不限于-亚甲基-环丙基、-亚甲基-环丁基、-亚甲基-环戊基、-亚甲基-环己基、-亚乙基-环丙基、-亚乙基-环丁基、-亚乙基-环戊基、-亚乙基-环己基、
Figure BDA0004025733960000121
Figure BDA0004025733960000122
以及被类似取代的-亚甲基或亚乙基或亚丙基-环丁基或环戊基或环己基。在该实施方案中，优选R5是-C1-3亚烷基-C3-5环烷基，例如-亚甲基-环丙基、-亚甲基-环丁基、-亚甲基-环戊基、-亚乙基-环丙基、-亚乙基-环丁基、-亚乙基-环戊基，最优选-亚甲基-环丙基、-亚甲基-环丁基、-亚甲基-环戊基。
在前述式(I)化合物的实施方案中，R5优选是C1-3烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基，最优选甲基。
在一种式(I)化合物的实施方案中，Z为N。
在一种式(I)化合物的实施方案中，Z为CR3，其中R3为H。
在一种式(I)化合物的实施方案中，Z为CR3，其中R3为卤素，优选氟或氯。
在前述式(I)化合物的实施方案中，Z优选为N或R3，其中R3为H。
在前述式(I)化合物的实施方案中，R1和R2各自独立地为C1-6烷基，例如但不限于甲基、乙基、丙基(包括正丙基和异丙基)、丁基(包括正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基)、戊基(包括正戊基、异戊基、新戊基)、正己基、2-甲基戊基；优选R1和R2各自独立地为C1-3烷基，例如甲基、乙基、丙基，最优选R1和R2均为甲基。
在前述式(I)化合物的实施方案中，R1和/或R2呈立体异构现象；具体地，在化学上可行的情况下，R1和/或R2可以呈R或S构型，例如R,R、R,S、S,R或S,S构型，优选R,R构型。
需要说明的是，本发明的化合物涵盖以上各个独立的实施方案或各个具体示例的实施方式，也涵盖上述各个实施方案或具体示例的实施方式的任何组合或亚组合构成的实施方案，还涵盖以上任何优选或示例的实施方案的任何组合所构成的实施方案。
在一种式(I)化合物的实施方案中，其为式(I’)化合物、其药学上可接受的盐或溶剂合物：
Figure BDA0004025733960000123
其中Z、A1、A2、A3、A4、A5和A6如前述对式(I)化合物给出的任意实施方案中所定义。
在式(I’)化合物的优选实施方案中，
Z选自N或CR3，其中R3选自H或卤素；
A1、A2和A6各自独立地选自C或N；
A3、A4和A5各自独立地选自CR4或N；或者A3、A4和A5之一不存在，其余各自独立地选自CR4、N或NR5；
R4和R5各自独立地选自H、C1-6烷基、C3-6环烷基或-C1-6亚烷基-C3-6环烷基；
条件是：A1和A2中至多一个是N，且A3、A4、A5和A6中包含至少一个且至多三个N原子。
在进一步优选的式(I’)化合物的实施方案中，Z为N或CR3，其中R3为H。
在进一步优选的式(I’)化合物的实施方案中，包含Z和A1～A6的双环稠合杂芳基部分具有选自以下的结构：
Figure BDA0004025733960000131
Figure BDA0004025733960000132
优选/>
Figure BDA0004025733960000133
Figure BDA0004025733960000134
最优选/>
Figure BDA0004025733960000135
在上述进一步优选的式(I’)化合物的实施方案中，
R4为H；或
R4为C1-6烷基，优选C1-3烷基，例如甲基、乙基或丙基；或
R4为C3-6环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基或环己基；或
R4为-C1-6亚烷基-C3-6环烷基，优选-C1-3亚烷基-C3-6环烷基，例如-亚甲基-环丙基、-亚甲基-环丁基、-亚甲基-环戊基、-亚甲基-环己基、-亚乙基-环丙基、-亚乙基-环丁基、-亚乙基-环戊基、-亚乙基-环己基。
在上述进一步优选的式(I’)化合物的实施方案中，
R5为C1-6烷基，优选C1-3烷基，例如甲基、乙基或丙基；或
R5为C3-6环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基或环己基；或
R5为-C1-6亚烷基-C3-6环烷基，优选-C1-3亚烷基-C3-6环烷基，例如-亚甲基-环丙基、-亚甲基-环丁基、-亚甲基-环戊基、-亚甲基-环己基、-亚乙基-环丙基、-亚乙基-环丁基、-亚乙基-环戊基、-亚乙基-环己基。
需要说明的是，本发明的化合物涵盖以上任何优选或示例的实施方案的任何组合所构成的实施方案。
本发明化合物的具体实施方式包括以下具体化合物、其立体异构体、互变异构体、稳定的同位素变体、药学上可接受的盐或溶剂合物，
Figure BDA0004025733960000141
对于下文所述用作药物的本发明化合物、本发明的预防或治疗方法、药物组合物、药物组合或用途而言，优选本文所定义的式(I)或式(I’)化合物的各个优选实施方式，更优选所列的具体化合物。
发明的有益效果
如前文所述，已知ATR激酶在肿瘤发生以及多种其它疾病中发挥作用。我们已令人惊讶地发现，上述式(I)化合物能够强效抑制ATR激酶，从而在遏制和/或治疗实体和/或液体肿瘤疾病方面具有作为抗增生、凋亡和/或抗侵袭药物的价值。特别地，预期本发明化合物可用于预防或治疗那些对ATR的抑制敏感的肿瘤。另外，预期本发明化合物有用于预防或治疗那些由ATR单独或部分介导的肿瘤。
具体地，经研究发现，本发明的化合物可有效抑制ATR激酶及肿瘤细胞株活性，能够实现以下一种或多种技术效果：
·高的ATR激酶抑制活性：在激酶ATR抑制测定实验中显示IC50在0.1nM～0.5μM范围，
优选在0.1nM～0.1μM范围，更优选0.1nM～50nM范围，最优选0.1nM～10nM范围，如活性实施例1所验证；和/或
·高的LOVO细胞株增殖抑制活性，如活性实施例2所验证；和/或
·具有良好的药物代谢动力学性质，例如具有更长的t1/2，从而例如可以加大给药间隔，更长的半衰期，使患者具有更好的依从性，如活性实施例3所验证；和/或
·具有改善的AUC0-t数据，具有更好的成药性，更高的生物利用度，如下文活性实施例4所验证；和/或
·良好的安全性，如透膜性、P450(减少的药物相互作用风险)、较低的毒性和/或较少的副作用；和/或
·优异的理化性质，如溶解度、物理和/或化学稳定性。
基于以上本发明化合物的有益效果，本发明还提供以下各个方面的技术方案。
用于治疗或用作药物的本发明化合物
一方面，本发明提供用作药物、尤其是用作ATR抑制剂、更尤其是用作抗癌剂或抗肿瘤剂的本发明化合物。
另一方面，本发明提供用于治疗和/或预防与ATR相关疾病的本发明化合物。
在具体的实施方式中，本发明提供用于治疗和/或预防ATR对所述疾病的发生和发展起到促进作用或抑制ATR将降低疾病的发生率、减少或消除疾病病状的疾病的本发明化合物，所述疾病例如肿瘤或癌症，包括但不限于：血液恶性肿瘤，例如白血病(包括慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病和慢性骨髓性白血病)、多发性骨髓瘤、淋巴***恶性肿瘤(例如淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤)、骨髓增生异常综合症，以及实体瘤、例如癌和肉瘤及其转移灶，例如乳腺癌、肺癌(非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌)、中枢神经***肿瘤(例如胶质瘤、胚胎期发育不良性神经上皮肿瘤、多形性成胶质细胞瘤、混合胶质瘤、成髓细胞瘤、成视网膜细胞瘤、成神经细胞瘤、生殖细胞瘤及畸胎瘤)、胃肠道癌(例如胃癌、食管癌、肝癌、胆管癌、结直肠癌、小肠癌、胰腺癌)、皮肤癌、黑色素瘤、甲状腺癌、骨癌、头颈癌、唾液腺癌、***癌、睾丸癌、卵巢癌、子***、子宫癌、子宫内膜癌、外阴癌、膀胱癌、肾癌、鳞状细胞癌、肉瘤(例如骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、软组织肉瘤、尤因式肉瘤、胃肠组织癌、胃肠基质肿瘤、卡波西氏肉瘤)，以及儿科癌症(例如横纹肌肉瘤和成神经细胞瘤)。
本发明尤其提供可用于治疗患有肺癌、***癌、黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肾癌、胃癌、肉瘤、头颈癌、中枢神经***肿瘤及其转移灶、以及患有急性髓性白血病的患者的式(I)化合物、其立体异构体、互变异构体、稳定的同位素变体、药学上可接受的盐或溶剂合物。
药物组合物及其施用
另一方面，为了实现治疗或预防目的，可以将本发明化合物根据标准药学实践配制为药物组合物。同时，基于本发明化合物良好的药物代谢动力学性质、改善的AUC0-last、良好的成药性，由本发明化合物可制备具有更好的药动学性质、更高生物利用度的药物。
因此，本发明提供一种药物组合物，其包含有效量的上述本发明化合物和药学可接受的赋形剂。
选择包含在特定组合物中的赋形剂将取决于多种因素、例如给药方式和所提供的组合物的形式。合适的药学可接受的赋形剂是本领域技术人员熟知的且描述于例如Ansel,Howard C.,等,Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems.Philadelphia:Lippincott,Williams&Wilkins,2004中，包括例如佐剂、稀释剂(例如葡萄糖、乳糖或甘露醇)、载体、pH调节剂、缓冲剂、甜味剂、填充剂、稳定剂、表面活性剂、润湿剂、润滑剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、助流剂、加工助剂、着色剂、加香剂、调味剂、其它已知添加剂。
本发明的药物组合物可以通过本领域技术人员已知的技术来配制，如在Remington’s Pharmaceutical Sciences第20版中公开的技术。
本发明的药物组合物可以以标准方式施用。例如，合适的施用方式包括口服、静脉内、直肠、肠胃外、局部、经皮、眼、鼻、颊或肺(吸入)给药，其中肠胃外输注包括肌肉、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。为了这些目的，本发明的化合物可以通过本领域已知的方法配制成例如片剂、胶囊、糖浆、粉末、颗粒、水性或油性溶液或悬浮液、(脂质)乳剂、可分散粉末、栓剂、软膏、乳膏、滴剂、气溶胶、干粉制剂和无菌可注射水性或油性溶液或悬浮液的形式。
本发明化合物的预防或治疗剂量的大小将根据一系列因素而变化，包括所治疗的个体、病症或病况的严重性、给药的速率、化合物的处置及处方医师的判断。对于特定疾病的治疗，有效量是足以改善或减轻与疾病有关的症状的药量。这样的药量可作为单一剂量施用，或者可依据有效的治疗方案施用。一般而言，有效剂量在每日每kg体重约0.0001至约5000mg，例如约0.01至约1000mg/kg/日(单次或分次给药)。对70kg的人而言，这会合计为约0.007mg/日至约7000mg/日，例如约0.7mg/日至约1500mg/日。根据给药模式，本发明化合物在药物组合物中的含量或用量可以是约0.01mg至约1000mg，适合地是0.1-500mg，优选0.5-300mg，更优选1-150mg，特别优选1-50mg，例如1.5mg、2mg、4mg、10mg、25mg等；相应地，本发明的药物组合物将包含0.05至99％w/w(重量百分比)，例如0.05至80％w/w，例如0.10至70％w/w，例如0.10至50％w/w的本发明化合物，所有重量百分比均基于总组合物。应当理解，可能有必要在某些情况下使用超出这些限制的剂量。
在一种具体实施方式中，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明化合物和一种或多种药学可接受的赋形剂，该组合物被配制用于口服施用。该组合物可以以单位剂型提供，例如以片剂、胶囊或口服液体制剂的形式。这样的单位剂型可以含有0.1mg至1g，例如5mg至250mg的本发明化合物作为活性成分。
在一种具体实施方式中，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明化合物和一种或多种药学可接受的赋形剂，该组合物被配制用于局部施用。局部施用可以是以例如乳膏剂、洗剂、软膏剂或透皮贴剂的形式，其中本发明化合物的浓度可以是每克载体约0.01至100mg。
在一种具体实施方式中，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明化合物和一种或多种药学可接受的赋形剂，该组合物被配制用于吸入施用。吸入施用可以通过口服吸入，也可以通过鼻内施用。当通过口服吸入施用时，本发明的化合物可以以每日剂量有效地用于本发明，例如至多500μg，如0.1-50μg、0.1-40μg、0.1-30μg、0.1-20μg或0.1-10μg的本发明化合物。口服吸入的本发明药物组合物可以配制成干粉、悬浮液(在液体或气体中)或溶液(在液体中)，且可以以任何合适的形式和使用任何本领域已知的合适的吸入器装置施用，包括例如定量吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)、喷雾器和软雾吸入器。多室装置可用于递送本说明书的化合物和一种或多种其它活性成分(当存在时)。
在一个具体的实施方式中，本发明的药物组合物可以另外包含适合与本发明化合物组合使用的另外的治疗活性成分。
适合于与本发明化合物组合施用的其他治疗活性成分可以是已知的抗癌药物，特别是其他与DNA损伤和修复机制相关的抗癌药物，包括PARP抑制剂、HDAC抑制剂等。适合于与本发明化合物组合施用的其他治疗活性成分还可以选自与细胞***检查点有关的抗癌药物，包括ChK1/2抑制剂、CDK4/6抑制剂、ATM/ATR抑制剂。其他可用于联合使用的已知抗癌药包括烷化剂、拓扑异构酶I/II抑制剂、RNA/DNA抗代谢物、抗有丝***剂、抗体药物、激酶抑制剂等。对于联合施用而言，本发明化合物与至少一种已知的抗癌药可作为单一药物组合物施用，也可以作为分离的实体分开、同时或依次施用，例如作为试剂盒施用。
本发明化合物还可以作为生物偶联体施用。该生物偶联体由本发明化合物与至少一种已知有治疗活性的抗体如赫赛汀或美罗华、或生长因子如EGF或FGF、或细胞激素如白细胞介素2或4或任意能与细胞表面结合的分子组成。该抗体和其他分子可把本发明化合物递送至其靶点发挥作用，同时也可提高所述抗体或其他分子的治疗活性。
本发明化合物还可以与放射疗法联合治疗，二者可在相同或不同的时间施用。
本发明提供的上述药物组合物，可用于在例如哺乳动物如人个体中预防或治疗如上所定义的与ATR相关的疾病。
治疗方法和用途
基于上述本发明化合物具有的有益效果，本发明化合物可用于治疗动物、特别是哺乳动物例如人的ATR相关疾病的方法中。
因此，另一方面，本发明提供了调节、尤其是抑制ATR激酶活性的方法，所述方法包括使细胞与如前所述的本发明化合物相接触以调节、尤其是抑制细胞中ATR的活性。
基于同样的性质，本发明还相应地提供一种抑制哺乳动物中异常细胞增殖的方法，包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的本发明的化合物、或包含本发明化合物的药物组合物。
另一方面，本发明提供了预防或治疗与ATR相关的疾病的方法，所述方法包括向需要其的个体施用有效量的如前所述的本发明化合物或包含其的本发明药物组合物。
另一方面，本发明提供了如前所述的本发明化合物或包含其的药物组合物的用途，用于抑制ATR活性，或者用于治疗和/或预防与ATR相关的疾病、例如通过ATR抑制可治疗或预防的疾病。
另一方面，本发明还提供了如前所述的本发明化合物或包含其的药物组合物在制备药物中的用途、尤其是具有ATR激酶抑制剂活性的药物中的应用。
另一方面，本发明提供如前所述的本发明化合物或包含其的药物组合物在制备用于治疗或预防与ATR相关的疾病、例如通过ATR激酶抑制可治疗或预防的疾病的药物中的用途，其中所述化合物或药物组合物任选地与一种或多种化学治疗或免疫治疗联合。
本发明化合物的制备方法
本发明还提供了制备式(I)化合物的方法，下文举例说明了合成本发明化合物的通用合成方案。对于各反应步骤而言，适当的反应条件是本领域技术人员已知的或可以常规确定的。
如果没有特别说明，在制备这些化合物中使用的原料和试剂通常可商购获得，或者可以通过下文的方法、与下文给出的方法类似的方法或本领域已知的方法制得。
如果需要，合成反应流程中的原料和中间体可以采用常规技术进行分离和纯化，所述技术包括但不限于过滤、蒸馏、结晶、色谱法等。所述材料可以采用包括物理常数和波谱数据在内的常规方法表征。
合成方案1：
Figure BDA0004025733960000181
如方案1所示例，本发明化合物可通过包含以下步骤的方法合成：
步骤1：将式(1-1)化合物与相应的胺在碱如DIEA存在下、在溶剂如NMP中加热反应，得到式(I-2)化合物；
步骤2：式(I-2)化合物与碘化试剂如NIS、在溶剂如ACN中于室温反应，得到式(I-3)化合物；
步骤3：式(I-3)化合物通过Suzuki偶联、在偶联剂如Pd(dtbpf)Cl2/H3PO4存在下、在溶剂如二噁烷/水中加热反应，得到式(1)化合物。
合成方案2：
Figure BDA0004025733960000191
如方案2所示例，本发明化合物可通过包含以下步骤的方法合成：
步骤1：式(2-1)化合物与氯化试剂如POCl3加热反应，得到式(2-2)化合物；
步骤2：式(2-2)化合物与相应的胺在碱如K2CO3存在下、在溶剂如DMF中于约室温反应，得到式(2-3)化合物；
步骤3：式(2-3)化合物与胺在碱如DIEA存在下、在溶剂如NMP中加热反应，得到式(2-4)化合物；
步骤4：式(2-4)化合物与氰化剂如Zn(CN)2、在催化剂如Pd2(dba)3/DPPF存在下、在溶剂如DMF存在下加热反应，得到式(2-5)化合物；
步骤5：式(2-5)化合物通过还原反应、在催化剂如雷尼镍/氨水存在下、在溶剂如THF中反应，得到式(2-6)化合物；
步骤6：式(2-6)化合物通过缩合反应、在缩合剂如HATU/DIEA存在下、在溶剂如THF中反应，得到式(2-7)化合物；
步骤7：式(2-7)化合物在POCl3存在下加热如在100-150℃关环，得到式(2)化合物。
合成方案3：
Figure BDA0004025733960000201
如方案3所示例，本发明化合物可通过包含以下步骤的方法合成：
步骤1：式(3-1)化合物在催化剂如Pd/C下氢化，得到式(3-2)化合物；
步骤2：式(3-2)化合物与相应的酮反应，得到式(3-3)化合物；
步骤3：式(3-3)化合物在碱如LiHMDS作用下关环，得到式(3-4)化合物；
步骤4：式(3-4)化合物在氯化试剂如POCl3作用下得到式(3-5)化合物；
步骤5：式(3-5)化合物在催化剂如在偶联剂如Pd(dtbpf)Cl2/CsCO3存在下、在溶剂如NMP中加热，与相应的胺偶联，得到式(3-6)化合物；
步骤6：式(3-6)化合物在溴化试剂如NBS存在下、在溶剂如DCM中于室温反应，得到式(3-7)化合物；
步骤7：式(3-7)化合物通过Suzuki偶联、在偶联剂如Pd(dtbpf)Cl2/H3PO4存在下、在溶剂如1,4-二氧六环/水中加热反应，得到式(3-8)化合物；
步骤8：式(3-8)化合物在酸如HCl的作用下脱保护基，得到式(3)化合物。
合成方案4：
Figure BDA0004025733960000202
如方案4所示例，本发明化合物可通过包含以下步骤的方法合成：
步骤1：式(4-1)化合物在碱如LDA作用下与相应的醛反应，得到式(4-2)化合物；
步骤2：式(4-2)化合物与相应的肼反应形成亚胺结构，得到式(4-3)化合物；
步骤3：式(4-3)化合物加热条件下关环，得到式(4-4)化合物；
步骤4：式(4-4)化合物与相应的(R)-甲基吗啉在加热条件下发生亲核取代反应，得到式(4-5)化合物；
步骤5：式(4-5)化合物在酸如TsOH催化下上保护剂，得到式(4-6)化合物；
步骤6：式(4-6)化合物在偶联剂如Pd(dtbpf)Cl2/CsCO3存在下、在溶剂如NMP中加热，与相应的胺偶联，得到式(4-7)化合物；
步骤7：式(4-7)化合物在酸如HCl的作用下脱保护基，得到式(4)化合物。
合成方案5：
Figure BDA0004025733960000211
如方案5所示例，本发明化合物可通过包含以下步骤的方法合成：
步骤1：式(5-1)化合物与碘化试剂如NIS、在酸如TFA存在下、在溶剂如CHCl3中反应，得到式(5-2)化合物；
步骤2：式(5-2)化合物与相应的胺在碱如DIEA存在下、在溶剂如THF中加热反应，得到式(5-3)化合物；
步骤3：式(5-3)化合物通过Suzuki偶联、在偶联剂如Pd(dtbpf)Cl2/H3PO4存在下、在溶剂如二噁烷/水中加热反应，得到式(5-4)化合物；
步骤4：式(5-4)化合物与相应的胺在催化剂如RuPhos-G2作用下、在碱如碳酸铯存在下、在溶剂如甲苯中加热反应，得到式(5-5)化合物；
步骤5：式(II-5)化合物在酸如HCl的作用下脱保护基，得到式(5)化合物。
合成方案6：
Figure BDA0004025733960000221
如方案6所示例，本发明化合物可通过包含以下步骤的方法合成：
步骤1：式(6-1)化合物在酸如TsOH催化下，与保护试剂如DHP反应，得到式(6-2)化合物；
步骤2：式(6-2)化合物在碱如DIEA存在下，在溶剂如NMP中与相应的胺反应，得到式(6-3)化合物；
步骤3：式(6-3)化合物在碱如DIEA存在下，在溶剂如NMP中，与相应的胺加热反应，得到式(6-4)化合物；
步骤4：式(6-4)化合物在酸的作用下脱保护基，得到式(6-5)化合物；
步骤5：式(6-5)化合物CuI存在下，在碱如Cs2CO3存在下，加热，与相应的卤代杂芳族化合物发生沃尔曼反应，得到式(6-6)化合物；
步骤6：式(6-6)化合物在酸的作用下脱保护基，得到式(6)化合物。
合成方案7：
Figure BDA0004025733960000222
如方案7所示例，本发明化合物可通过包含以下步骤的方法合成：
步骤1：式(7-1)化合物与相应的酮反应，得到式(7-2)化合物；
步骤2：式(7-2)化合物在碱如LiHMDS作用下关环，得到式(7-3)化合物；
步骤3：式(7-3)化合物在催化剂如在偶联剂如Pd(dtbpf)Cl2/K3PO4存在下、在溶剂如1,4-二氧六环中加热，与相应的杂芳基硼酸酯偶联，得到式(7-4)化合物；
步骤4：式(7-4)化合物在氯化试剂如POCl3作用下，得到式(7-5)化合物；
步骤5：式(7-5)化合物在碱如DIEA作用下上保护基，得到式(7-6)化合物；
步骤6：式(7-6)化合物在偶联剂如RuPhos-G2/Cs2CO3存在下、在溶剂如甲苯中、在加热下与相应的胺反应，得到式(7)化合物。
合成方案8：
Figure BDA0004025733960000231
如方案8所示例，本发明化合物可通过包含以下步骤的方法合成：
步骤1：式(8-1)化合物在缩合剂如HATU的作用下发生缩合反应，得到式(8-2)化合物；
步骤2：式(8-2)化合物在加热条件下关环，得到式(8-3)化合物；
步骤3：式(8-3)化合物在碱如DIEA存在下、在加热下与相应的胺反应，得到式(8-4)化合物；
步骤4：式(8-4)化合物在碱如TEA作用下上保护基如OTf，得到式(8-5)化合物；
步骤5：式(8-5)化合物通过Suzuki偶联、在偶联剂如Pd(dtbpf)Cl2/H3PO4存在下、在溶剂如二噁烷/水中、在加热下与相应的杂芳基硼酸酯反应，得到式(8-6)化合物；
步骤6：式(8-6)化合物在酸如HCl的作用下脱保护基，得到式(8)化合物。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明的技术方案做的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照这类反应的常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。下列实施例中未注明手性中心构型时，意味着可以以单独的对映异构体或对映体混合物形式存在，且本领域技术人员能够确定化合物的稳定和可行的异构体形式。除非另外说明，否则百分比和份数分别是重量百分比和重量份数。除非另外说明，否则液体的比为体积比，本发明使用的温度均为摄氏度℃。
以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得、依据现有技术的方法制得或根据与本申请公开的类似的方法制得。除非另有说明，本发明使用的原料都是市售原料，无需进一步纯化可以直接使用，其中以下实施例中使用的5,7-二氯吡唑并[1,5-A]嘧啶购自上海皓鸿生物医药科技有限公司(乐研，CAS:57489-77-7,批次号：Ld102321002)，8-溴-6-氯咪唑并[1,2-B]哒嗪购自韶远科技(上海)有限公司(CAS:933190-51-3,批次号：J140-1157-27)，4,6-二氯-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶购自毕得医药(CAS:42754-96-1,批次号BD92758)。
本申请使用的缩写具有本领域通常理解的含义，除非说明书中另外清楚定义。在下面列出说明书中使用的缩写的含义：
Figure BDA0004025733960000241
Figure BDA0004025733960000251
合成实施例
本发明提供的目标化合物制备方法中，柱层析色谱采用乳山太阳干燥剂有限公司生产的硅胶(300-400目)；薄层色谱采用GF254(0.25毫米)；核磁共振色谱(NMR)使用Varian-400核磁共振仪测定；液质联用(LC/MS)使用岛津LCMS2020液质联用仪，制备HPLC用Shimadzu LC-20AP。
LC-MS
实施例中提供的LCMS数据以保留时间、纯度和/或质量(m/z)给出，采用以下方法获得：方法A：岛津LCMS2020；柱：SunFire C18 50*4.6mm 5um；流动相A：0.1％ FA and 10％ACN in H2O，流动相B：0.1％ FA and 10％ H2O in ACN；流速：2.0ml/min，2.6min；254nm，柱温40℃。
方法B：岛津LCMS2020；柱：Luna 3um C18 100A 30*2mm；流动相A：0.1％ FA inH2O，流动相B：0.1％ FA in ACN；流速：1.0ml/min，1.8min；254nm。
方法C：岛津LCMS2020；柱：Waters SunFire C18 50*4.6mm 5um；流动相A：0.1％FA/10％ACN in H2O，流动相B：0.1％ FA/10％ H2O in ACN；梯度：5％B保持0.2min，1.40min内升到95％B，保持0.9min，然后0.01分钟内降到5％B；流速：2.0ml/min，2.6min；254nm，柱温40℃。
方法D：岛津LCMS2020；柱：Agilent Pursuit XRs C18 30*2.0mm 5um，流动相A：0.1％ FA in H2O，流动相B：0.1％ FA in ACN；梯度：1.40min内升5％B到95％B，保持95％B0.5min，然后0.01分钟内降到5％B；流速：1.2ml/min，2.0min；254nm，柱温40℃。
方法E：Shimadzu LCMS-2020；柱：Shim-Pack Scepter C18-120，3.0*33mm，3um；流动相A：水/0.1％ FA，流动相B：乙腈/0.1％ FA；流速：1.2mL/min；梯度：在1.10min内30％ B至90％ B,保持0.4min，然后1min 30％ B；检测波长254nm，柱温40℃。
方法F：岛津LCMS2020；柱：Agilent Pursuit C18 20*2.0mm 5um，流动相A：0.1％FA/H2O，流动相B：0.1％ FA/ACN；流速：1.5mL/min；梯度：0.7min内从5％B升到95％B，95％B保持0.4min，然后0.01min内到5％B；检测波长254nm，柱温50℃。
方法G：岛津LCMS2020；柱：Luna C18 30*2.0mm 3um，流动相A：0.1％ FA/H2O，流动相B：0.1％ FA/ACN；流速：1.2mL/min；梯度：0.7min内从5％B升到95％B，95％B保持0.4min，然后0.01min内到5％B；检测波长254nm，柱温50℃。
方法H：岛津LCMS2020；柱：Waters XBridge C18 30*2.1mm 3.5um，流动相A：0.1％NH3.H2O/H2O，流动相B：0.1％NH3.H2O/CAN；流速：1.00ml/min；梯度：5％保持0.2min，0.7min内升到95％B，保持95％B 0.7min,然后0.01min内到5％B；检测波长254nm，柱温50℃。
方法I：LC：Waters 2695；MS:Waters 2487；柱：Agilent Eclipse C18 4.6*100mm3.5um；流动相A：0.1％ FA/H2O，流动相B：MeOH；流速：1.0ml/min，8.0min；254nm，柱温40℃。
此外，凡涉及易氧化或易水解的原料的所有操作都在氮气保护下进行。
当本发明化合物结构与化合物名称不一致时，通常以结构式所示为准，除非通过上下文可以确定化合物名称正确。
实施例1：(3R,3'R)-4,4'-(3-(1H-吡唑-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5,7-二基)双 (3-甲基吗啉)
Figure BDA0004025733960000261
步骤1：(3R,3'R)-4,4'-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-5,7-二基)双(3-甲基吗啉)的制备
Figure BDA0004025733960000262
将原料5,7-二氯吡唑并[1,5-a]嘧啶(400mg,2.13mmol)溶于NMP(1.5mL)中，然后加入(R)-3-甲基***啉(1.08g,10.64mmol)，DIEA(824mg,6.38mmol)，微波150℃搅拌反应4小时。反应完成后，用水(5mL)淬灭，用EA(10.0mL×2)萃取，合并有机相，用饱和食盐水(5.0mL×2)洗涤后经无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，所得残留物经柱层析分离纯化(PE:EA＝1:2)，得到目标化合物(320mg，产率47.39％，黄色油状物)。LC-MS(方法A)：RT＝1.24min，(ESI)m/z318.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.83(d,J＝2.0Hz,1H),6.00(d,J＝2.0Hz,1H),5.76(s,1H),5.18–5.03(m,1H),4.48–4.38(m,1H),4.06–3.98(m,1H),3.96–3.89(m,2H),3.84–3.78(m,1H),3.74–3.42(m,7H),3.19–3.09(m,1H),1.21–1.13(m,3H),1.15–1.06(m,3H).
步骤2：(3R,3'R)-4,4'-(3-碘吡唑并[1,5-a]嘧啶-5,7-二基)双(3-甲基吗啉)的制备
Figure BDA0004025733960000271
向(3R,3'R)-4,4'-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-5,7-二基)双(3-甲基吗啉)(300mg,0.94mmol)的乙腈(5.0mL)溶液中加入NIS(233.9mg,1.04mmol)。将反应混合液室温搅拌反应0.5小时，停止反应。反应液直接减压浓缩，所得残留物经层析分离纯化(PE:EA＝1:1)，得到目标化合物(300mg，产率71.6％，黄色油状物)。LC-MS(方法A)，RT＝1.99min，(ESI)m/z444.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.82(s,1H),5.48(s,1H),5.04–4.92(m,1H),4.37–4.27(m,1H),4.18(dd,1H),4.07–3.98(m,3H),3.91–3.71(m,4H),3.66–3.52(m,2H),3.33–3.26(m,1H),3.18(d,1H),1.36–1.31(m,3H),1.19–1.12(m,3H).
步骤3：(3R,3'R)-4,4'-(3-(1H-吡唑-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5,7-二基)双(3-甲基吗啉)的制备
Figure BDA0004025733960000272
室温下，在氮气保护下，向(3R,3'R)-4,4'-(3-碘吡唑并[1,5-a]嘧啶-5,7-二基)双(3-甲基吗啉)(120mg,0.27mmol)的二氧六环/水(5.00mL，V:V＝4:1)溶液中依次加入3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)-1H-吡唑(78.79mg,0.406mmol)、磷酸钾(172mg,0.812mmol)和Pd(dtbpf)Cl2(19.7mg,0.027mmol)。将反应混合液在100℃氮气保护下搅拌反应1.5小时，停止反应。待反应液冷却后，加入水(5.0mL)淬灭，再用EA(10.0mL×2)萃取，合并有机相，用饱和食盐水(5.0mL)洗涤后经无水硫酸钠干燥，减压浓缩，所得残留物经层析板(100％ EA)和反相制备型HPLC(流动相：乙腈，0.1％FA水溶液，流速：20ml/min；方法：38-48％乙腈，出峰时间：7.5-8.5min分离纯化，得到目标化合物(14.5mg，产率13.97％，白色固体)。LC-MS(方法B)，RT＝0.92min，(ESI)m/z 384.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.68(Brs,1H),8.24(s,1H),7.75–7.40(m,1H),6.86–6.59(m,1H),5.82(s,1H),5.17–5.04(m,1H),4.61–4.50(m,1H),4.16(d,J＝12.4Hz,1H),4.01–3.91(m,2H),3.86–3.80(m,1H),3.79–3.74(m,1H),3.72–3.61(m,3H),3.59–3.46(m,2H),3.40–3.37(m,1H),3.25–3.16(m,1H),1.25(d,J＝6.7Hz,3H),1.12(d,J＝6.8Hz,3H).
实施例2：(3R,3'R)-4,4'-(7-(1H-吡唑-3-基)咪唑并[1,5-b]哒嗪-2,4-二基)双 (3-甲基吗啉)
Figure BDA0004025733960000281
步骤1：4-溴-3,6-二氯哒嗪的制备
Figure BDA0004025733960000282
将4-溴-1,2-二氢哒嗪-3,6-二酮(30.0g,157mmol)溶于三氯氧磷(150mL)，将反应混合液加热至100℃反应16小时，停止反应。待反应液冷却至室温后，将反应液慢慢倒入冰水中，然后调节pH至7左右，再用EA(500mL×3)萃取，有机相用饱和食盐水(300mL×3)洗涤后经无水硫酸钠干燥、过滤，减压浓缩，所得残留物经柱层析分离纯化(PE:EA＝20:1-5:1)，得到目标化合物(30.7g，产率85.8％，淡黄色固体)。LC-MS(方法C)，RT＝1.57min，(ESI)m/z227.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.67(s,1H)。
步骤2：(R)-4-(3,6-二氯哒嗪-4-基)-3-甲基吗啉的制备
Figure BDA0004025733960000283
向4-溴-3,6-二氯哒嗪(30.7g,135mmol)和(R)-3-甲基吗啉(27.2g,269mmol)的DMF(200mL)溶液中加入碳酸钾(55.8g,404mmol)，氮气保护下，将反应混合液在30℃下搅拌反应16小时后，停止反应。将反应液过滤除去固体残渣，滤液加入水(200mL)，然后用EA(200mL×3)萃取，有机相用水(150mL×3)和饱和食盐水(150mL×3)洗涤后用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压浓缩，所得残留物经柱层析分离纯化(PE:EA＝5:1-2:1)，得到目标化合物(29.3g，收率87.7％，白色固体)。LC-MS(方法C)，RT＝1.48min，(ESI)m/z 248.1[M+H]+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.43(s,1H),4.17–4.07(m,1H),3.89–3.80(m,1H),3.75–3.68(m,1H),3.66–3.54(m,2H),3.50(t,J＝11.7Hz,1H),3.19–3.09(m,1H),1.14(d,J＝6.6Hz,3H)。
步骤3：(3R,3'R)-4,4'-(6-氯哒嗪-3,5-二基)双(3-甲基吗啉)的制备
Figure BDA0004025733960000291
向(R)-4-(3,6-二氯哒嗪-4-基)-3-甲基吗啉(1.80g,7.25mmol)和(R)-3-甲基吗啉(14.7g,145mmol)的N-甲基吡咯烷酮(23.0mL)溶液中加入DIEA(18.7g,145mmol)，将反应混合液在145℃下搅拌20小时后，停止反应。将反应混合物冷却至室温后，加入水(25.0mL)，用EA(30.0mL×2)萃取，合并有机相，然后用饱和食盐水(25.0mL×4)洗涤后用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压浓缩，所得残留物经柱层析分离纯化(PE:EA＝10:1-1:1)，得到目标化合物(810mg，收率35.7％，棕色油状物)。LC-MS(方法C)，RT＝1.28min，(ESI)m/z 313.3[M+H]+。
步骤4：4,6-双((R)-3-甲基吗啉代)哒嗪-3-甲腈的制备
Figure BDA0004025733960000292
向(3R,3'R)-4,4'-(6-氯哒嗪-3,5-二基)双(3-甲基吗啉)(810mg,2.59mmol)在水(6滴)和DMF(28.0mL)的混合物中的溶液中依次加入氰化锌(608mg,5.18mmol)、DPPF(287mg,0.518mmol)和Pd2(dba)3(237mg,0.259mmol)。氮气保护下，将反应混合液在145℃搅拌反应过夜后，停止反应。待反应液冷却至室温后加入水(30.0mL)，然后用EA(25.0mL×3)萃取，合并有机相用饱和食盐水(40.0mL×4)洗涤后经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，所得残留物经柱层析分离纯化(PE:EA＝5:1-1:1)，得到目标化合物(650mg,收率82.7％,棕色固体)。LC-MS(方法C)，RT＝1.49min，(ESI)m/z 304.2[M+H]+。
步骤5：(4,6-双((R)-3-甲基吗啉代)哒嗪-3-基)甲胺的制备
Figure BDA0004025733960000293
向4,6-双((R)-3-甲基吗啉代)哒嗪-3-甲腈(650mg,2.14mmol)的四氢呋喃(25.0mL)溶液中依次加入氨水(4.50mL)和雷尼镍(450mg)，氢气置换三次后使反应混合物在氢气保护下室温反应过夜，停止反应。将反应混合物过滤除去固体残渣、滤液减压浓缩，得到目标化合物(600mg,收率91.1％,棕色固体)。LC-MS(方法C)，RT＝0.34min，(ESI)m/z308.4[M+H]+。
步骤6：N-((4,6-双((R)-3-甲基吗啉代)哒嗪-3-基)甲基)-1H-吡唑-5-甲酰胺的制备
Figure BDA0004025733960000301
向(4,6-双((R)-3-甲基吗啉代)哒嗪-3-基)甲胺(320mg,1.04mmol)和1H-吡唑-5-羧酸(123mg,1.10mmol)的四氢呋喃(10.0mL)溶液中加入HATU(594mg,1.56mmol)和DIEA(269mg,2.08mmol)，使反应混合物在室温下反应2小时，停止反应。反应混合物减压浓缩，所得残留物经柱层析分离纯化(DCM:甲醇＝100:1-30:1)，得到目标化合物(210mg,收率50.2％,棕色固体)。LC-MS(方法C)，RT＝0.58min，(ESI)m/z 402.2[M+H]+。
步骤7：(3R,3'R)-4,4'-(7-(1H-吡唑-3-基)咪唑并[1,5-b]哒嗪-2,4-二基)双(3-甲基吗啉)的制备
Figure BDA0004025733960000302
将N-((4,6-双((R)-3-甲基吗啉代)哒嗪-3-基)甲基)-1H-吡唑-5-甲酰胺(210mg,0.523mmol)溶于三氯氧磷(6.00mL)溶液中，使反应混合物在120℃下反应1.5小时后，停止反应。待反应混合液冷却至室温后，将反应液慢慢滴加到0℃的饱和碳酸氢钠溶液中，然后在0℃下用饱和碳酸氢钠溶液调节pH至9后，用EA(20.0mL×3)萃取，合并的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤、滤液减压浓缩，所得残留物经反相制备型HPLC(流动相：乙腈，0.1％FA水溶液，方法：36％乙腈，)分离纯化，得到目标化合物(20.47mg,收率10.2％,白色固体)。LC-MS(方法D)，RT＝0.85min，(ESI)m/z 384.3[M+H]+。1HNMR(400MHz,MeOD-d4)δ7.70(s,1H),7.60(s,1H),7.14(s,1H),5.86(s,1H),4.36–4.23(m,2H),4.06–3.99(m,2H),3.95–3.89(m,1H),3.84–3.62(m,6H),3.58–3.48(m,1H),3.44–3.33(m,2H),1.31(d,J＝6.7Hz,3H),1.27(d,J＝6.7Hz,3H)。
实施例3：(3R,3'R)-4,4'-(1-甲基-3-(1H-吡唑-3-基)-1H-吡唑并[4,3-b]吡啶- 5,7-二基)双(3-甲基吗啉)
Figure BDA0004025733960000311
步骤1：4-氨基-1-甲基-1H-吡唑-5-甲酸甲酯的制备
Figure BDA0004025733960000312
将1-甲基-4-硝基-1H-吡唑-5-羧酸甲酯(2.00g,10.8mmol)加入到装有无水甲醇(30mL)的单口瓶中，往混合液中加入10％钯碳(1.15g)，用氢气置换三次并氢气球环境下搅拌过夜，LC-MS检测原料反应完全，停止搅拌，反应液通过抽滤漏斗经硅藻土垫过滤，减压除去溶剂，得到目标化合物(1.6g,粗品，淡黄色固体)。LC-MS(方法E)，RT＝0.50min，(ESI)m/z:156.2[M+H]+.
步骤2：(R,E)-1-甲基-4-((1-(3-甲基吗啉基)亚乙基)氨基)-1H-吡唑-5-甲酸甲酯的制备
Figure BDA0004025733960000313
将4-氨基-1-甲基-1H-吡唑-5-羧酸甲酯(2.50g,16.1mmol)加入到1,2-二氯乙烷(20mL)中，将混合液降温至0℃，向反应混合物中加入1-[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]乙烷-1-酮(3.46g,24.2mmol)，将反应液在0℃下搅拌反应10分钟后，向反应混合物中加入三氯氧磷(4.5mL,48.3mmol)，将反应液在80℃下搅拌0.5小时后，LC-MS监测反应完成，减压浓缩并通过硅胶柱分离(PE:EA＝1:1)，得到目标化合物(3.50g，产率77.5％，黄色油状物)。LC-MS(方法E)，RT＝0.38min，(ESI)m/z:281.1[M+H]+.
步骤3：(R)-1-甲基-5-(3-甲基吗啉基)-1H-吡唑并[4,3-b]吡啶-7-醇的制备
Figure BDA0004025733960000314
将(R,E)-1-甲基-4-((1-(3-甲基吗啉基)亚乙基)氨基)-1H-吡唑-5-甲酸甲酯(3.50g,12.5mmol)溶于DMF(94.5mL)中，于0℃下缓慢加入1M的双三甲基硅基胺基锂四氢呋喃溶液(37.5mL)。所得混合物在氮气保护下0℃搅拌3小时，LC-MS监测反应后，加入少量氯化铵水溶液淬灭，减压蒸馏后经硅胶柱分离纯化(DCM:MeOH＝20:1-10:1)，得到目标化合物(2.80g,产率90.3％,黄色油状物)。LC-MS(方法E)，RT＝0.45min，(ESI)m/z:249.2[M+H]+。
步骤4：(R)-4-(7-氯-1-甲基-1H-吡唑并[4,3-b]吡啶-5-基)-3-甲基吗啉的制备
Figure BDA0004025733960000321
将(R)-1-甲基-5-(3-甲基吗啉基)-1H-吡唑并[4,3-b]吡啶-7-醇(4.00g,16.1mmol)溶解于乙腈(40mL)中。室温搅拌半小时后，向反应混合物中加入三氯氧磷(4.5mL,48.3mmol)，并且在80℃下搅拌反应过夜。LC-MS监测反应结束后，将反应混合物旋干，经硅胶柱分离纯化(硅胶，EA:PE＝1:2)，得到目标化合物(2.41g,收率56.1％,黄色固体)。LC-MS(方法E)，RT＝2.49min，(ESI)m/z:267.1[M+H]+。
步骤5：(3R,3'R)-4,4'-(1-甲基-1H-吡唑并[4,3-b]吡啶-5,7-二基)双(3-甲基吗啉)的制备
Figure BDA0004025733960000322
将(R)-4-(7-氯-1-甲基-1H-吡唑并[4,3-b]吡啶-5-基)-3-甲基吗啉(1.20g,4.50mmol)溶解于N-甲基吡咯烷酮(12mL)中，加入(3R)-3-甲基吗啉(455mg,4.50mmol)、RuphosPdG2(349mg,0.450mmol)以及碳酸铯(4.40g,13.5mmol)。将所得混合物氮气保护下110℃搅拌2小时，LC-MS监测反应结束后，将反应混合物加至水(50mL)中，水相用EA(20mL×2)萃取，饱和食盐水(10mL)洗涤。有机相干燥旋干后经硅胶柱分离纯化(DCM:MeOH＝20:1)，得到目标化合物(568mg,收率38.1％,棕色固体)。LC-MS(方法E)，RT＝0.44min，(ESI)m/z:332.2[M+H]+。
步骤6：(3R,3'R)-4,4'-(3-溴-1-甲基-1H-吡唑并[4,3-b]吡啶-5,7-二基)双(3-甲基吗啉)的制备
Figure BDA0004025733960000323
将(3R,3'R)-4,4'-(1-甲基-1H-吡唑并[4,3-b]吡啶-5,7-二基)双(3-甲基吗啉)(568mg,1.71mmol)溶于DCM(10mL)中。反应混合物在氮气保护下加入NBS(305mg,1.71mmol)，将反应液在室温下搅拌10分钟。LC-MS监测反应结束后，向反应混合物中加入水(5mL)，用DCM(5mL×3)萃取。合并有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液减压浓缩得到粗产品。经硅胶柱分离纯化(EA:PE＝1:4)，得到目标化合物(245mg,收率34.8％,黄色固体)。LC-MS(方法E)，RT＝2.93min，(ESI)m/z:410.1[M+H]+。
步骤7：(3R,3'R)-4,4'-(1-甲基-3-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吡唑并[4,3-b]吡啶-5,7-二基)双(3-甲基吗啉)的制备
Figure BDA0004025733960000331
将(3R,3'R)-4,4'-(3-溴-1-甲基-1H-吡唑并[4,3-b]吡啶-5,7-二基)双(3-甲基吗啉)(245mg,0.597mmol)溶于1,4-二氧六环(3mL)和水(0.5mL)中，加入1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼烷-2-基)-1H-吡唑(830mg,2.99mmol)、Pd(dtbpf)Cl2(39mg,0.060mmol)和磷酸钾(380mg,1.79mmol)。将所得混合物氮气保护下110℃搅拌2小时，LC-MS监测反应结束后，向反应混合物中加入水(5mL)，用EA(10mL×2)萃取。合并有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液减压浓缩得到粗产品，经硅胶柱分离纯化(PE:EA＝1:2)，得到目标化合物(83mg,收率28.9％,棕色油状物)。LC-MS(方法E)，RT＝3.00min，(ESI)m/z:482.2[M+H]+。
步骤8：(3R,3'R)-4,4'-(1-甲基-3-(1H-吡唑-3-基)-1H-吡唑并[4,3-b]吡啶-5,7-二基)双(3-甲基吗啉)的制备
Figure BDA0004025733960000332
在(3R,3'R)-4,4'-(1-甲基-3-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吡唑并[4,3-b]吡啶-5,7-二基)双(3-甲基吗啉)(83mg,0.172mmol)的甲醇(2mL)溶液中，加入4M的盐酸1,4-二氧六环溶液(2mL)。将所得混合物氮气保护下室温搅拌2小时，LC-MS监测反应结束后，减压除去溶剂，残余物经prep-HPLC(柱：YMC-Actus Triart C18 250*20.0mm，5um；流动相A：水/0.1％ TFA，流动相B：乙腈。梯度：2min 5％ B，在18分钟内5％ B至95％B，保持2min95％ B，然后1min 5％ B)分离纯化，得到目标化合物(9.3mg,收率13.6％,白色固体)。LC-MS(方法E)，RT＝2.24min，(ESI)m/z:398.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.86(d,J＝2.1Hz,1H),6.94(d,J＝2.1Hz,1H),6.60(s,1H),4.44–4.34(m,1H),4.21(s,3H),4.07–3.96(m,2H),3.97–3.91(m,1H),3.92–3.85(m,2H),3.83–3.75(m,2H),3.75–3.64(m,3H),3.36–3.27(m,2H),2.98–2.91(m,1H),1.25(d,J＝6.7Hz,3H),1.00(d,J＝6.3Hz,3H).
实施例4：(3R,3'R)-4,4'-(1-(1H-吡唑-3-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-4,6-二 基)双(3-甲基吗啉)
Figure BDA0004025733960000341
中间体3-肼基-1H-吡唑的制备
Figure BDA0004025733960000342
将3-氨基吡唑(1.00g,12.0mmol)加入到6mol/L的盐酸水溶液(7mL)中，将混合液降温至-5℃，向反应混合物中加入1mol/L的亚硝酸钠水溶液(12mL,12.0mmol)，将反应液在室温下搅拌反应2小时。向反应混合物中加入氯化亚锡二水合物(5.43g,24.1mmol)的浓盐酸溶液(24mL)，将反应液在室温下搅拌1小时后，减压浓缩得到粗产品(9.50g,粗品,亮黄色固体)。步骤1：2,6-二氟-4-碘烟醛的制备
Figure BDA0004025733960000343
将2,6-二氟-4-碘吡啶(5.00g,20.7mmol)加入到装有无水四氢呋喃(75mL)的三口瓶中。所得混合物在氮气保护下降温至-78℃，加入二异丙基氨基锂(2mol/L的四氢呋喃溶液)(12.4mL,24.9mmol)，搅拌1小时后，缓慢加入甲酸乙酯(2.31g,31.1mmol)，继续在-78℃下搅拌30分钟后，向反应液中加入甲酸(1.91g,41.5mmol)，在-78℃搅拌10分钟后，加入EA(25mL)，然后升温至0℃，加入水(30mL)。停止搅拌，加入额外的EA(25mL)进行萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离纯化(PE:EA＝5:1)，得到目标化合物(3.50g,收率62.7％,黄色固体)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.97(s,1H),8.02(d,J＝2.4Hz,1H).
步骤2：3-((2-(1H-吡唑基-3-基)肼基)甲基)-2,6-二氟-4-碘吡啶的制备
Figure BDA0004025733960000344
将2,6-二氟-4-碘烟醛(1.00g,3.72mmol)和3-肼基-1H-吡唑(9.50g,粗品)加入到95％乙醇水溶液(20mL)中。将所得混合物氮气保护下室温搅拌15分钟，减压除去溶剂，残余物加入EA(30mL)并搅拌均匀，向搅拌均匀的悬浊液中缓慢滴加饱和碳酸氢钠溶液并剧烈搅拌，使混合液至碱性，继续搅拌15分钟后，用EA萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏后经硅胶柱分离纯化(PE:EA＝1:2)，得到目标化合物(1.85g，粗品，黄色固体)。LC-MS(方法E)，RT＝2.63min，(ESI)m/z:349.9[M+H]+。
步骤3：6-氟-4-碘-1-(1H-吡唑-3-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶的制备
Figure BDA0004025733960000351
将3-((2-(1H-吡唑基-3-基)肼基)甲基)-2,6-二氟-4-碘吡啶(1.85g,5.30mmol)溶解于N-甲基吡咯烷酮(25mL)中。将反应混合物在200℃下搅拌反应1小时。LC-MS监测反应结束后，将反应混合物滴加到水(50mL)中，析出棕色固体，将混合液在室温下搅拌10分钟后降至0℃，继续搅拌10分钟，悬浊液用抽滤漏斗抽滤，收集固体，水相用EA(20mL×2)萃取。合并有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液减压浓缩得到粗产品。经硅胶柱分离纯化(EA:PE＝1:1)，得到目标化合物(556mg,两步收率45.4％,棕黄色固体)。LC-MS(方法E)，RT＝2.63min，(ESI)m/z:329.9[M+H]+。
步骤4：(R)-4-(4-碘-1-(1H-吡唑-3-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)-3-甲基吗啉的制备
Figure BDA0004025733960000352
将6-氟-4-碘-1-(1H-吡唑-3-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶(556mg,1.69mmol)溶解于二甲基亚砜(2mL)中。将所得混合物氮气保护下室温搅拌均匀，加入(3R)-3-甲基吗啉(513mg,5.07mmol)，反应液升温至120℃搅拌45分钟，LC-MS监测反应结束后，将反应混合物滴加到水(30mL)中，析出棕黄色固体，将混合液在室温下搅拌10分钟后降至0℃，继续搅拌10分钟，悬浊液用抽滤漏斗抽滤，收集固体，水相用EA(10mL×2)萃取。残余物经硅胶柱分离纯化(PE:EA＝1:2)，得到目标化合物(535mg,收率77.2％,黄色固体)。LC-MS(方法E)，RT＝2.74min，(ESI)m/z:411.0[M+H]+。
步骤5：(3R)-4-(4-碘-1-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)-3-甲基吗啉的制备
Figure BDA0004025733960000353
将(R)-4-(4-碘-1-(1H-吡唑-3-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)-3-甲基吗啉(535mg,1.30mmol)、DHP(3,4-二氢-2H-吡喃)(219mg,2.61mmol)、对甲苯磺酸一水合物(25mg,0.130mmol)依次加入到DCM(6mL)中。将反应混合物在室温下搅拌反应过夜。LC-MS监测反应结束后，向反应混合物中加入水(10mL)，用EA(10mL×2)萃取。合并有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液减压浓缩得到粗产品。经制备板分离纯化(硅胶，EA:PE＝1:2)，得到目标化合物(405mg,收率62.8％,无色油状物)。LC-MS(方法E)，RT＝3.16min，(ESI)m/z:495.0[M+H]+。
步骤6：(3R,3'R)-4,4'-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-4,6-二基)双(3-甲基吗啉)的制备
Figure BDA0004025733960000361
将(3R)-4-(4-碘-1-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)-3-甲基吗啉(100mg,0.202mmol)、(R)-3-甲基吗啉(41mg,0.404mmol)、RuPhosPdG2(16mg,0.0202mmol)、碳酸铯(198mg,0.607mmol)加入到N-甲基吡咯烷酮(2mL)中。将所得混合物氮气保护下110℃搅拌2小时，LC-MS监测反应结束后，向反应混合物中加入水(10mL)，用EA(10mL×2)萃取。合并有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液减压浓缩得到粗产品，经硅胶柱分离纯化(PE:EA＝1:2)，得到目标化合物(45mg,收率47.6％,无色油状物)。LC-MS(方法E)，RT＝2.74min，(ESI)m/z:468.2[M+H]+。
步骤7：(3R,3'R)-4,4'-(1-(1H-吡唑-3-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-4,6-二基)双(3-甲基吗啉)的制备
Figure BDA0004025733960000362
在(3R,3'R)-4,4'-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-4,6-二基)双(3-甲基吗啉)(45mg,0.096mmol)的甲醇(2mL)溶液中，加入4mol/L的盐酸1,4-二氧六环溶液(2mL)。将所得混合物氮气保护下室温搅拌2小时，减压除去溶剂，残余物经prep-HPLC(柱：YMC-Actus Triart C18 250*20.0mm，5um；流动相A：水/0.1％ TFA，流动相B：乙腈。梯度：2min 5％ B，在18分钟内5％ B至95％ B，保持2min 95％ B，然后1min5％ B)分离纯化，得到目标化合物(6.2mg,收率16.8％,白色固体)。LC-MS(方法E)，RT＝2.32min，(ESI)m/z:384.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.72(s,1H),8.14(s,1H),7.90–7.66(m,1H),6.92–6.55(m,1H),5.84(s,1H),4.45–4.36(m,1H),4.36–4.28(m,1H),3.99–3.88(m,3H),3.81–3.67(m,3H),3.65–3.54(m,3H),3.51–3.41(m,1H),3.26–3.04(m,2H),1.15(d,J＝6.6Hz,6H).
实施例5：(3R,3'R)-4,4'-(3-(1H-吡唑基-3-基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-6,8-二基) 双(3-甲基吗啉)
Figure BDA0004025733960000371
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步骤1：8-溴-6-氯-3-碘咪唑并[1,2-b]哒嗪的制备
Figure BDA0004025733960000372
向8-溴-6-氯咪唑并[1,2-b]哒嗪(1g,4.30mmol)的乙腈(10.0mL)溶液中加入NIS(967mg,4.30mmol)，将反应混合液在室温下搅拌反应2小时，停止反应。然后加水(25.0mL)，再用EA(25.0mL×3)萃取，合并有机相用饱和食盐水(20.0mL)洗涤后经无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，所得残留物经柱层析分离纯化(PE：EA＝10:1)得到目标化合物(500mg，产率32.4％,黄色固体)。LC-MS(方法G)，RT＝1.06min，(ESI)m/z 359.2[M+H]+。
步骤2：(R)-4-(6-氯-3-碘咪唑并[1,2-b]哒嗪-8-基)-3-甲基吗啉的制备
Figure BDA0004025733960000373
向8-溴-6-氯-3-碘咪唑并[1,2-b]哒嗪(500mg,1.40mmol)和(R)-3-甲基***啉(211mg,2.09mmol)的四氢呋喃(10.0mL)溶液中加入DIEA(541mg,4.19mmol)。将反应混合液在氮气保护下100℃搅拌反应2小时，停止反应。然后将反应液用EA(35.0mL)，用饱和食盐水(35.0mL×3)洗涤后用无水硫酸钠干燥、过滤，减压浓缩，所得残留物经柱层析分离纯化(PE：EA＝5:1)，得到目标化合物(230mg，产率43.5％，黄色油状物)。LC-MS(方法F)，RT＝0.95min，(ESI)m/z 378.8[M+H]+。
步骤3：(3R)-4-(6-氯-3-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-3-基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-8-基)-3-甲基吗啉的制备
Figure BDA0004025733960000381
氮气保护下向(R)-4-(6-氯-3-碘咪唑并[1,2-b]哒嗪-8-基)-3-甲基吗啉(230mg,0.607mmol)和1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼烷-2-基)-1H-吡唑(253mg,0.911mmol)在1,4-二氧六环(5.00mL)和水(1.00mL)中的溶液中加入Pd(dtbpf)Cl2(38.7mg,0.061mmol)和磷酸钾(387mg,1.82mmol)，将反应混合液在60℃下搅拌反应16小时，停止反应。然后加水(20.0mL)，再用EA(20.0mL×3)萃取，合并有机相用饱和食盐水(20.0mL)洗涤后经无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，所得残留物经柱层析分离纯化(PE：EA＝1:1)，得到目标化合物(200mg,收率81.7％,黄色固体)。LC-MS(方法G)，RT＝1.13min，(ESI)m/z 403.1[M+H]+。
步骤4：(3R,3'R)-4,4'-(3-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-3-基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-6,8-二基)双(3-甲基吗啉)的制备
Figure BDA0004025733960000382
氮气保护下，向(3R)-4-(6-氯-3-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-3-基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-8-基)-3-甲基吗啉(200mg,0.496mmol)和RuPhosPdG2(38.7mg,0.0496mmol)在甲苯(6.00mL)中的溶液中加入碳酸铯(485mg,1.49mmol)和(R)-3-甲基***啉(75.3mg,0.745mmol)，将反应混合液在110℃下搅拌反应16小时，停止反应。然后加水(15.0mL)，再用EA(15.0mL×3)萃取，合并有机相用饱和食盐水(20.0mL)洗涤后经无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，所得残留物经柱层析分离纯化(PE：EA＝1:1)，得到目标化合物(120mg,收率51.7％,黄色固体)。LC-MS(方法G)，RT＝1.11min，(ESI)m/z 468.5[M+H]+。
步骤5：(3R,3'R)-4,4'-(3-(1H-吡唑基-3-基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-6,8-二基)双(3-甲基吗啉)的制备
Figure BDA0004025733960000383
室温下向反应瓶中加入(3R,3'R)-4,4'-(3-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-3-基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-6,8-二基)双(3-甲基吗啉)(120mg,0.256mmol)和盐酸乙酸乙酯(5.00mL,3M)，将反应混合液在室温下搅拌反应2小时，停止反应。减压浓缩，所得残留物经反相制备型HPLC(制备柱：sunfire C18 19*250mm*10um，流动相：乙腈，0.1％FA水溶液，方法：34-40％乙腈，流速：20ml/min)纯化，得到目标化合物(53.54mg，产率54.4％，白色固体)。LC-MS(方法C)，RT＝1.47min，(ESI)m/z 384.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.30–12.86(m,1H),7.89–7.79(m,1H),7.75–7.56(m,1H),7.09–6.93(m,1H),6.12–5.97(m,1H),5.56–5.30(m,1H),4.33–4.06(m,2H),4.00–3.93(m,2H),3.81–3.70(m,5H),3.69–3.51(m,3H),3.23–3.15(m,1H),1.19-1.16(m,6H)。
实施例6：(3R,3'R)-4,4'-(1-(1H-吡唑基-3-基)-1H-吡唑基[3,4-d]嘧啶-4,6-二 基)双(3-甲基吗啉)
Figure BDA0004025733960000391
步骤1：4,6-二氯-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶的制备
Figure BDA0004025733960000392
将4,6-二氯-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶(1.00g,5.3mmol)，DHP(3,4-二氢吡喃)(889mg,10.6mmol)和对甲基苯磺酸(86mg,0.5mmol)加入DCM(10mL)中，所得混合物氮气保护下室温搅拌过夜，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离纯化(PE:EA＝1:1)，得到目标化合物(1.4g,收率100％,白色固体)。LC-MS(ESI)m/z:272.9[M+H]+。
步骤2：(3R)-4-(6-氯-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)-3-甲基吗啉的制备
Figure BDA0004025733960000393
将4,6-二氯-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶(500mg,1.8mmol)、(R)-3-甲基吗啉盐酸盐(304mg,2.2mmol)、DIEA(475mg,3.7mmol)加入到乙腈(10mL)中。所得混合物在氮气保护下室温搅拌反应3小时，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离纯化(PE:EA＝3:7)，得到目标化合物(566mg,收率91.1％,白色固体)。LC-MS(方法I)，RT＝5.55min，(ESI)m/z:359.9[M+Na]+。
步骤2：(3R，3'R)-4,4'-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4,6-二酰基)双(3-甲基吗啉)的制备
Figure BDA0004025733960000401
将(3R)-4-(6-氯-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)-3-甲基吗啉(566mg,1.7mmol)、(R)-3-甲基吗啉盐酸盐(277mg,2.0mmol)、DIEA(432mg,3.4mmol)依次加入到NMP(10mL)中。反应混合物在微波170℃反应5小时。反应冷却后向反应混合物中加入水(15mL)，用EA(20mL×3)萃取，合并有机相用水(30mL×5)和饱和食盐水(30mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液减压浓缩得到粗产品，硅胶柱分离纯化(PE:EA＝1:4)得到目标产物(216mg,收率31.5％,白色固体)。LC-MS(方法I)，RT＝5.75min，(ESI)m/z:403.0[M+H]+。
步骤3：(3R,3'R)-4,4'-(1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4,6-二酰基)双(3-甲基吗啉)的制备
Figure BDA0004025733960000402
将(3R,3'R)-4,4'-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4,6-二酰基)双(3-甲基吗啉)(216mg,0.5mmol)加入到6M盐酸水溶液/四氢呋喃(2mL/4mL)，室温搅拌0.5h。反应结束后，用饱和碳酸氢钠水溶液调pH>8，用EA(20mL×3)萃取，合并有机层，用饱和食盐水(30mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液减压浓缩得到粗产品。硅胶柱分离纯化(EA)得到目标产物(109mg,收率34.2％,白色固体)。
步骤4：(3R,3'R)-4,4'-(1-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4,6-二基)双(3-甲基吗啉)的制备
Figure BDA0004025733960000403
将((3R,3'R)-4,4'-(1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4,6-二酰基)双(3-甲基吗啉)(109mg,0.3mmol)、(1S,2S)-N1,N2-二甲基环己烷-1,2-二胺(91mg,0.6mmol)、3-碘-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑(132mg,0.5mmol)，碘化亚铜(61mg,0.3mmol)和碳酸铯(261mg,0.8mmol)依次加入到NMP(5mL)中。反应混合物在120℃油浴下过夜反应。反应结束后，向反应混合物中加入水(15mL)，用EA(20mL×3)萃取。合并有机相用水(30mL×5)和饱和食盐水(30mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液减压浓缩得到粗产品。硅胶柱分离纯化(PE:EA＝1:4)(45mg,收率30.0％,白色固体)。LC-MS(方法I)，RT＝5.82min，(ESI)m/z:468.95[M+H]+。
步骤5：(3R,3'R)-4,4'-(1-(1H-吡唑基-3-基)-1H-吡唑基[3,4-d]嘧啶-4,6-二基)双(3-甲基吗啉)的制备
Figure BDA0004025733960000411
将(3R,3'R)-4,4'-(1-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4,6-二基)双(3-甲基吗啉)(45mg,0.1mmol)加入到6M盐酸水溶液/四氢呋喃(2mL/4mL)混合液中，50℃下搅拌反应1h。反应结束后，用饱和碳酸氢钠水溶液调pH>8，用EA(20mL×3)萃取，合并有机层，用饱和食盐水(30mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液减压浓缩得到粗产品。硅胶柱分离纯化(DCM/MeOH＝30:1)得到目标化合物(22.9mg,收率59.6％,白色固体)。LC-MS(方法I)，RT＝5.34min，(ESI)m/z:384.80[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.82(s,1H),8.18(s,1H),7.82(s,1H),6.76(d,J＝2.3Hz,1H),4.72-4.52(m,2H),4.27(d,J＝13.8Hz,2H),4.03-3.85(m,2H),3.81-3.64(m,3H),3.63-3.47(m,2H),3.46-3.35(m,2H),3.22-3.08(m,1H),1.29(d,J＝6.6Hz,3H),1.19(d,J＝6.7Hz,3H)。
实施例7：(3R,3'R)-4,4'-(8-(1H-吡唑-3-基)-1,7-萘啶-2,4-二基)双(3-甲基吗 啉)
Figure BDA0004025733960000412
步骤1：(R)-1-(3-甲基吗啉基)乙烷-1-酮的制备
Figure BDA0004025733960000413
0℃下，向(R)-3-甲基吗啉(5.00g,49.4mmol)的二氯甲烷(50.0mL)溶液中加入三乙胺(20.6mL,148mmol)和乙酰氯(3.88mL,54.4mmol)。将反应混合液室温搅拌反应0.5小时后，停止反应。反应液直接减压浓缩，所得残留物经层析板分离纯化(PE：EA＝4:1)，得到目标化合物(7.05g，产率99.6％，无色油状物)。LC-MS(方法F)，RT＝0.24min，(ESI)m/z 144.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.69–4.17(m,1H),3.98–3.85(m,1H),3.72–3.66(m,1H),3.62–3.39(m,3H),3.00(t,J＝12.4Hz,1H),2.15–2.02(m,3H),1.36–1.23(m,3H)。
步骤2：(R)-2-氯-3-((1-(3-甲基吗啉基)亚乙基)氨基)异烟酸甲酯的制备
Figure BDA0004025733960000421
在氩气保护和0℃温度下，将三氯氧磷(7.49mL,12.3g,80.4mmol)加入到(R)-1-(3-甲基吗啉基)乙烷-1-酮(7.76g,53.6mmol)的二氯乙烷溶液(50.0mL)中。在室温下混合黄色溶液搅拌30分钟，然后添加3-氨基-2-甲基氯异烟酸(5.00g,26.8mmol)。在80℃搅拌混合物3小时后。减压浓缩除去二氯乙烷。粗品通过层析柱分离纯化(硅胶，乙酸乙酯/甲醇＝1:1)，得到目标产物(8.00g，黄色油状物，产率95.8％)。LC-MS(方法G)，RT＝0.93min，(ESI)m/z 312.1[M+H]+。步骤3：2-((1R,5S)-8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-8-氯-1,7-萘啶-4-醇的制备
Figure BDA0004025733960000422
在氩气保护和0℃下，将双(三甲基甲基硅烷基氨基锂)(9.62mL,9.62mmol,1M)滴至(R)-2-氯-3-((1-(3-甲基吗啉基)亚乙基)氨基)异烟酸甲酯(2.00g,6.42mmoL)的干燥四氢呋喃溶液(20.0mL)中。在室温下混合液搅拌3小时后，加入乙醇(5.00mL)淬灭并进行浓缩。所得残留物经层析分离纯化(DCM：甲醇＝10:1)，得到目标化合物(500mg，产率27.9％，黄色固体)。LC-MS(方法F)，RT＝0.71min，(ESI)m/z 280.0[M+H]+。
步骤4：2-((R)-3-甲基吗啉基)-8-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-3-基)-1,7-萘啶-4-醇的制备
Figure BDA0004025733960000423
室温下，在氮气保护下向(R)-8-氯-2-(3-甲基吗啉基)-1,7-萘啶-4-醇(600mg,2.14mmol)的二氧六环/水(10.0mL,V:V＝4:1)溶液中依次加入1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼烷-2-基)-1H-吡唑(895mg,3.22mmol)、磷酸钾(1.37g,6.43mmol)和Pd(dtbpf)Cl2(139mg,0.214mmol)。氮气保护下，将反应混合液在100℃搅拌反应16小时后，停止反应。待反应液冷却后，加入水(50.0mL)，再用EA(100mL×2)萃取，合并有机相用，饱和食盐水(25.0mL)洗涤后经无水硫酸钠干燥，减压浓缩，所得残留物经层析板分离纯化(100％EA)，得到目标化合物(400mg，产率47.2％，黄色油状物)。LC-MS(方法G)，RT＝0.94min，(ESI)m/z 396.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.49(s,1H),8.33(d,J＝5.3Hz,1H),7.77(d,J＝5.3Hz,1H),7.60(s,1H),6.91(dd,J＝15.3,1.5Hz,1H),6.59(d,J＝4.1Hz,1H),6.14–6.02(m,1H),4.39–4.20(m,1H),4.05–3.89(m,2H),3.77–3.57(m,3H),3.50–3.41(m,1H),3.29–3.08(m,3H),2.43–2.28(m,1H),2.00–1.92(m,2H),1.65–1.53(m,1H),1.51–1.41(m,2H),1.20–1.16(m,3H)。
步骤5：(R)-4-(4-氯-8-(1H-吡唑-3-基)-1,7-萘啶-2-基)-3-甲基吗啉的制备
Figure BDA0004025733960000431
氮气保护下，向反应瓶中加入2-((R)-3-甲基吗啉)-8-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-3-基)-1,7-萘啶-4-醇(380mg,0.961mmol)和三氯氧磷(10.0mL)，将反应混合液在100℃下搅拌反应16小时，停止反应。减压浓缩，所得残留物经柱层析分离纯化(PE：EA＝1:1)，得到目标化合物(300mg,产率94.7％,黄色固体)。LC-MS(方法G)，RT＝0.96min，(ESI)m/z 330.1[M+H]+。
步骤6：(R)-3-(4-氯-2-(3-甲基吗啉基)-1,7-萘啶-8-基)-1H-吡唑-1-羧酸叔丁酯的制备
Figure BDA0004025733960000432
氮气保护下，向(R)-4-(4-氯-8-(1H-吡唑-3-基)-1,7-萘啶-2-基)-3-甲基吗啉(300mg,0.909mmol)和二碳酸二叔丁酯(297mg,1.36mmol)的DCM(6.00mL)溶液中加入DIEA(276mg,2.73mmol)，将反应混合液在室温下搅拌反应16小时，停止反应。然后加水(15.0mL)，再用EA(20.0mL×3)萃取，合并有机相用饱和食盐水(20.0mL)洗涤后经无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，所得残留物经柱层析分离纯化(PE：EA＝1:1)，得到目标化合物(200mg,产率51.1％,黄色固体)。LC-MS(方法H)，RT＝1.38min，(ESI)m/z 430.2[M+H]+。
步骤7：(3R,3'R)-4,4'-(8-(1H-吡唑-3-基)-1,7-萘啶-2,4-二基)双(3-甲基吗啉)的制备
Figure BDA0004025733960000433
氮气保护下，向(R)-3-(4-氯-2-(3-甲基吗啉基)-1,7-萘啶-8-基)-1H-吡唑-1-羧酸叔丁酯(200mg,o.465mmol)和RuPhosPdG2(36.3mg,o.o465mmol)的甲苯(6.oomL)的溶液中加入碳酸铯(455mg,1.40mmol)和(R)-3-甲基***啉(23.5mg,o.233mmol)，将反应混合液在11o℃下搅拌反应16小时，停止反应。然后加水(25.omL)，再用EA(25.omL×3)萃取，合并有机相用饱和食盐水(25.0mL)洗涤后经无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，所得残留物经反相制备型HPLC(制备柱：sunfire C18 19*250mm*10um，流速：20ml/min流动相：乙腈，0.1％FA水溶液方法：24％乙腈)纯化，得到目标化合物(9.o6mg,产率3.94％,白色固体)。LC-MS(方法C)，RT＝1.10min，(ESI)m/z 395.3[M+H]+。1H NMR(4ooMHz,MeOD-d4)δ8.34(d,J＝5.4Hz,1H),7.81(d,J＝5.4Hz,1H),7.75–7.66(m,1H),7.33–7.24(m,1H),6.88(s,1H),4.57–4.46(m,1H),4.14–3.98(m,4H),3.92–3.77(m,4H),3.74–3.62(m,2H),3.56–3.45(m,2H),2.98–2.87(m,1H),1.42(d,J＝6.8Hz,3H),1.o5(d,J＝6.4Hz,3H)。
实施例8：(3R,3'R)-4,4'-(4-(1H-吡唑基-3-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶-6,8-二基) 双(3-甲基吗啉)
Figure BDA0004025733960000441
步骤1：3-氨基-4,6-二氯吡啶甲基酰胺的制备
Figure BDA0004025733960000442
将3-氨基-4,6-二氯吡啶甲酸(2.00g,9.66mmol)、氯化铵(5.17g,96.61mmol)、三乙胺(2.93g,96.6mmol)、HATU(4.41g,11.6mmol)在DMF(60.0mL)中的溶液在室温下搅拌16小时后，停止反应。向反应混合物加入EA(150mL)，用饱和食盐水(30.0mL×5)洗涤后用无水硫酸钠干燥、过滤，减压浓缩，所得残留物经柱层析分离纯化(PE:EA＝1:2)，得到目标化合物(1.95g，收率98.0％，白色固体)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.92(s,1H),7.74(s,1H),7.65(s,1H),7.23(Brs,2H).
步骤2：6,8-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-醇的制备
Figure BDA0004025733960000443
将3-氨基-4,6-二氯吡啶酰胺(1.95g,9.46mmol)的原甲酸三乙酯(15.0mL)溶液在140℃下搅拌1.5小时后，停止反应。将反应混合物减压浓缩，所得残留物经柱层析分离纯化(PE:EA＝3:1-1:2)，得到目标化合物(1.96g，收率95.9％，白色固体)。LC-MS(方法B)，RT＝0.86min，(ESI)m/z 216.0[M+H]+1。H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.94(Brs,1H),8.29(s,1H),8.25(s,1H).
步骤3：6,8-双((R)-3-甲基吗啉基)吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-醇的制备
Figure BDA0004025733960000451
将6,8-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-醇(700mg,3.24mmol)、(R)-3-甲基吗啉(1.97g,19.4mmol)和三乙胺(1.35mL,9.72mmol)在N-甲基吡咯烷酮(1.50mL)中的溶液在145℃下搅拌反应72小时后，停止反应。反应混合液加入水(10.0mL)，用EA(10.0mL×3)萃取，有机相用饱和食盐水(10.0mL×2)洗涤后用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压浓缩，所得残留物经柱层析板分离纯化(100％EA)，得到目标化合物(400mg，收率35.7％，黄色油状物)。LC-MS(方法F)，RT＝0.67min，(ESI)m/z 346.0[M+H]+。
步骤4：6,8-双((R)-3-甲基吗啉代)吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-基三氟甲磺酸酯的制备
Figure BDA0004025733960000452
0℃下，在氮气保护下向(6,8-双((R)-3-甲基吗啉基)吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-醇(400mg,0.694mmol)的DCM(10.0mL)溶液中缓慢加入三乙胺(0.289mL,0.208mmol)和三氟甲磺酸酐(0.177mL,0.104mmol)。将反应混合液在氮气保护下室温搅拌反应0.5小时后，停止反应。待反应液冷却后，减压浓缩，所得残留物经正相层析分离纯化(EA:PE＝1:1)，得到目标化合物(500mg，收率75.4％，50％纯度，黄色固体)。LC-MS(方法G)，RT＝1.24min，(ESI)m/z 478.1[M+H]+。步骤4：(3R,3'R)-4,4'-(4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-3-基)吡啶[3,2-d]嘧啶-6,8-二基)双(3-甲基吗啉)的制备
Figure BDA0004025733960000453
室温下，在氮气保护下向6,8-双((R)-3-甲基吗啉代)吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-基三氟甲磺酸酯(250mg,0.262mmol,50％纯度)的二氧六环/水(5mL，V:V＝4:1)溶液中依次加入1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)-1H-吡唑(109mg,0.392mmol)、磷酸钾(167mg,0.785mmol)和Pd(dtbpf)Cl2(17.1mg,0.0262mmol)。将反应混合液在氮气保护下80℃搅拌反应16小时后，停止反应。待反应液冷却后，加入水(15.0mL)，再用EA(20.0mL×2)萃取，合并有机相用，饱和食盐水(15.0mL)洗涤后经无水硫酸钠干燥，减压浓缩，所得残留物经层析分离纯化(100％EA)，得到目标化合物(70.0mg，收率55.8％，黄色油状物)。LC-MS(方法F)，RT＝0.90min，(ESI)m/z 408.2[M+H]+。
步骤5：(3R,3'R)-4,4'-(4-(1H-吡唑基-3-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶-6,8-二基)双(3-甲基吗啉)的制备
Figure BDA0004025733960000461
室温下,向反应瓶中加入(3R,3'R)-4,4'-(4-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-3-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶-6,8-二基)双(3-甲基吗啉)(70mg,0.146mmol)和氯化氢乙酸乙酯溶液(1.00mL,3M)，将反应混合液在室温下搅拌反应2小时后，停止反应。减压浓缩，所得残留物经反相制备型HPLC(乙腈/水含0.05％氨水)纯化，得到目标化合物(11.0mg，产率18.97％,淡黄色固体)。LC-MS(方法G)，RT＝0.90min，(ESI)m/z 396.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.69(Brs,1H),8.93(s,1H),7.73–7.64(m,1H),7.57–7.46(m,1H),6.63(s,1H),5.22–5.14(m,1H),4.61–4.52(m,1H),4.17–4.11(m,1H),4.06–4.00(m,1H),3.99–3.93(m,1H),3.91–3.86(m,1H),3.84–3.79(m,1H),3.74–3.68(m,2H),3.68–3.65(m,1H),3.59–3.47(m,2H),3.41–3.35(m,1H),3.30–3.24(m,1H),1.27(d,J＝6.7Hz,3H),1.08(d,J＝6.7Hz,3H).
活性实施例
如无特别说明，以下活性实施例中所用的实验材料、试剂、操作和方法均可从市售渠道获得或基于现有技术容易地获知或制备。
活性实施例1：激酶ATR抑制测定
本实验采用Cisbio公司的均相时间分辨荧光技术
Figure BDA0004025733960000462
进行检测。
实验方法：如下配制缓冲液：
名称 来源 终浓度 母液浓度 体积(uL)
HEPES(mM) Gibco,Cat#15630-080 25 1000 75
Brij35 Sigma,Cat#9002-92-0 0.01％ 1％ 30
BSA(mg/mL) Sigma,Cat#B2064-50G 1 100 30
DTT(mM) Sigma,Cat#D0632-10G 5 1000 15
甘油 Sigma,Cat#G5516-500ML 1％ 50％ 60
MnCl2(mM) Sigma,Cat#7773-01-5 10 1000 30
H2O 2760
共计(uL) 3000
配制供试化合物溶液。将下表所示实施例化合物用DMSO作为溶剂配制溶液，母液通常为10mM。本实验中最大起始浓度为3μM，DMSO 3倍系列稀释，共10个浓度，加入至相应的384孔板(geriner bio-one,Cat#784075)的孔中，终浓度分别为3000、1000、333、111、37、12.3、4.12、1.37、0.457、0.152nM，在另外的孔中添加相应量的DMSO，待分别用作阴性对照孔或阳性对照孔。
将酶与底物用上述制备的缓冲液分开溶解并稀释于两管中，浓度如下表：
名称 来源 加入平板后的终浓度 配制浓度 母液浓度
ATR(A管) eurofins,Cat#14-953M 30nM 60nM 410.26nM
p53(B管) eurofins,Cat#14-953M 40nM 80nM 9720nM
ATP(B管) Sigma,Cat#R0441 150nM 300nM 10000nM
使用电动多通道移液器以每孔5uL的体积将A管的ATR溶液添加至实验板的化合物孔以及阴性对照孔中，在阳性对照孔中添加同等体积的上述制备的缓冲液(仅介质，不加酶)。使用离心机以1000转每分钟的转速离心一分钟，随后将实验板置于恒温孵育箱中以25℃孵育15分钟。之后用同样的方法将B管的底物混合溶液添加5uL至实验板的阳性对照、阴性对照以及化合物孔中，离心并以25℃孵育90分钟。
反应过程中，当ATR将底物p53磷酸化以后加入两种抗体，其中anti-phospho-p53-Eu作为能量供体能与p53上的磷酸化位点特异性结合，而anti-GST-d2作为能量受体能与p53上携带的GST标签特异性结合。若使用一定波长的激光(本实验的激发光波长为340nm)激发，能量供体能发射出615nm波长的发射光，同时当能量供体与能量受体的空间距离足够接近时(即两个抗体同时连接在p53上)，能量供体与能量受体之间能发生能量转移，使得能量受体发射出665nm波长的发射光。使用读板机对两个发射光进行检测并求出665nm与615nm两种信号的比值，通过作图和计算即可求出待测样品的IC50。
检测时，将两种抗体稀释于HTRF检测缓冲液(Cisbio，Cat#62SDBRDF，Lot#17A)中，如下表：
检测试剂 来源 稀释倍数 母液浓度
anti-phospho-p53-Eu Cisbio,Cat#61P08KAZ 400 400单位
anti-GST-d2 Cisbio,Cat#61GSTDLB 200 200单位
使用电动多通道移液器以每孔10uL的体积将检测溶液添加至实验板的阳性对照、阴性对照以及化合物孔中，离心并以4℃孵育过夜，使用读板机Envision 2104读数。
使用内插法计算化合物抑制率：分别计算阳性对照和阴性对照的平均值，使用公式：
单孔抑制率＝1-(单孔信号值-阳性对照信号平均值)/(阴性对照信号平均值-阳性对照信号平均值)
即可计算出化合物孔的抑制率。使用四参数罗吉斯方程曲线作出化合物抑制曲线：将化合物浓度转化成以10为底的对数，将浓度和抑制率导入XLfit软件中，公式为：
抑制率＝最低响应+(化合物浓度^曲线坡度)*(最高响应-最低响应)/(化合物浓度^曲线坡度+半抑制浓度^曲线坡度)
从而得出所试验的本发明化合物对酶活性的IC50值。
表1 ATR激酶抑制活性
化合物编号. ATR IC50(nM)
1 6.3
2 2.6
3 6.8
4 1.3
5 40.0
7 35.3
8 31.8
活性实施例2：LOVO细胞增殖试验
采用CellTiter-GloTM活细胞检测试剂盒，测试了本发明化合物对细胞增殖的抑制作用。该试剂盒采用萤光素酶作检测物，发光过程中萤光素酶需要ATP的参与，向细胞培养基中加入CellTiter-GloTM试剂，测量发光值，光信号和体系中ATP量成正比，而ATP又和活细胞数正相关，由此确定细胞的增殖活性。
细胞培养和接种：收获处于对数生长期的细胞LOVO(人结肠癌细胞)(ATCC CCL-229)，并采用血小板计数器进行细胞计数。用台盼蓝排斥法检测细胞活力，确保细胞活力在90％以上。分别添加90μL细胞悬液(RPMI1640+10％胎牛血清)至96孔透明平底黑壁板(Thermo,165305)中，调整细胞浓度到3000/孔/90ul。将96孔板中的细胞置于37℃、5％CO2、95％湿度条件下培养过夜(Thermo，Model 3100Series)。
先用DMSO作为溶剂配制10mM的待测化合物母液，然后用PBS稀释100倍，配制成10倍终浓度的溶液，最高浓度为100μM，在接种有细胞的96孔板中每孔加入10μL待测化合物溶液，即又稀释10倍，浓度达到最终终浓度10μM。将待测化合物终浓度从10μM开始，3倍系列稀释，共9个浓度，每个3个复孔。将已加入待测化合物和细胞的96孔板置于37℃、5％CO2、95％湿度条件下继续培养96小时，之后进行CellTiter-Glo分析。
融化CellTiter-Glo试剂(CellTiter-
Figure BDA0004025733960000481
Luminescent Cell Viability Assay,Promega,G7572)并平衡细胞板至室温30分钟。每孔加入等体积的CellTiter-Glo溶液，在定轨摇床上振动5分钟使细胞裂解。将细胞板放置于室温20分钟以稳定冷光信号，用SpectraMax多标记微孔板检测仪(MD,M3)读取冷光值。
使用GraphPad Prism 7.0软件分析数据，利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算IC50值。
细胞存活率(％)＝(Lum待测药-Lum培养液对照)/(Lum细胞对照-Lum培养液对照)×100％
结果显示，本发明实施例化合物对所测试的LOVO细胞显示良好的增殖抑制作用，IC50值在1nM～200nM之间，例如10nM～100nM之间，优选小于0.05μM，例如实施例2、3、4、7和8抑制LOVO细胞的IC50值分别为0.051、0.09、0.088、0.02和0.081μM。
活性实施例3：人和小鼠肝微粒体代谢稳定性实验
根据本领域常规的体外代谢稳定性研究的标准方法，例如(Kerns,Edward H.andDi Li(2008).Drug-like Properties:Concepts,Structure Design and Methods:fromADME to Toxicity Optimization.San Diego:Academic Press；Di,Li等人，Optimizationof a Higher Throughput Microsomal Stability Screening Assay for ProfilingDrug Discovery Candidates,J.Biomol.Screen.2003,8(4),453.)中所述的方法，类似地如下进行本发明化合物的肝微粒体代谢稳定性试验。
Figure BDA0004025733960000491
将肝微粒体(蛋白浓度为0.56mg/mL)加入1μM化合物工作液(由10mM DMSO储备液用100％乙腈稀释到100μM，有机相含量：99％ACN，1％DMSO)，37℃预孵育10min后，加入辅助因子(NADPH)(由氯化镁溶液配制)启动反应。孵育适当时间(如5、10、20、30和60分钟)后取样，加入适当终止液(含有200ng/mL甲苯磺丁脲和200ng/mL拉贝洛尔的冰乙腈(即4℃的乙腈))，终止反应。
样品处理(n＝1)：各加合适样品，涡旋后高速离心，取上清液，采用HPLC-MS/MS对底物进行检测。把0min时间点峰面积作为100％。其他时间点的峰面积转换为百分剩余量，各时间点的百分剩余量的自然对数对孵育时间作图，求算出斜率(-k)，然后按固有清除率(Clint)＝(k*孵育液体积)/肝微粒体质量，计算出Clint(μL/min/mg)及化合物半衰期(T1/2，min)。结果见表3。
表3.人和小鼠肝微粒体代谢稳定性实验结果
Figure BDA0004025733960000492
结果显示，本发明化合物具有良好的药物代谢稳定性，与参比化合物相比具有更长的t1/2和更低的清除速率，从而使得药物可以在延长的时间内在体内发挥药理活性，由此允许加大给药间隔，减少给药剂量，使患者具有更好的依从性并降低潜在的毒副作用。
活性实施例4：本发明化合物在小鼠中的药代动力学(PK)测定
每个化合物的PK测定方法如下：6只CD-1小鼠(上海灵畅生物科技有限公司)分为两组，每组3只。其中一组通过静脉(IV)给药，剂量为1mg/kg，溶媒为5％DMSO/95％(20％Captisol)；一组通过口服(Po)灌胃给药，剂量为5mg/kg，溶媒为1％HPMC。每一组在给药后0、0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、24h分别通过小腿隐静脉采血。将约40μL血液收集到含EDTA-K2的抗凝管中。在收集完成后迅速将采血管倒置至少5次，以确保混合均匀，然后放置在冰上。采集到的各时间点血液在4℃/8000rpm离心5分钟以获得血浆。另取1.5mL离心管，标记化合物名称，动物编号，时间点，将血浆转移至该管中。血浆保存在-80℃直至分析。
采用UPLC-MS/MS方法测定血浆中化合物浓度，用Phoenix WinNolin 6.4药代动力学软件对所得数据进行药代动力学参数计算。
具体实验结果如下，结果表明化合物药代吸收较好，具有药代动力学优势。
表4.实施例化合物体内PK结果
Figure BDA0004025733960000501
结果显示，与参比化合物相比，本发明化合物具有改善的AUC0-t数据，预期具有更好的成药性和更高的生物利用度。
上述实验中使用的参比化合物BAY-1895344的结构式是
Figure BDA0004025733960000502
(购自上海前
衍生物科技有限公司，CAS NO.1876467-74-1)，或可按照WO2016020320实施例111的方法制备和表征。
本领域技术人员将了解，上文描述本质上为示例性及说明性的，且欲说明本发明及其优选实施方案。通过常规实验，技术人员将了解可作出明显修正及变化而不悖离本发明的精神。在随附申请专利范围内的所有此类修正欲包括于其中。因此，本发明意欲并非由上述描述而是由以下权利要求范围及其等效物定义。
本说明书中所引用的所有公开出版物以引用方式并入。

Claims (21)

1.通式(I)的化合物、其药学上可接受的盐、异构体或其溶剂合物，
Figure FDA0004025733950000011
其中，
R1和R2各自独立地为C1-6烷基；
Z选自N或CR3，其中R3选自H、卤素或任选被卤素取代的C1-6烷基；
A1、A2和A6各自独立地选自C或N；
A3、A4和A5各自独立地选自CR4或N；或者A3、A4和A5之一不存在，其余各自独立地选自CR4、N或NR5；
R4选自H、氧代、卤素、C1-6烷基、C3-6环烷基或-C1-6亚烷基-C3-6环烷基，所述C1-6烷基、C1-6亚烷基和C3-6环烷基各自任选被选自卤素、羟基或任选被卤素取代的C1-6烷基的基团取代；
R5选自H、C1-6烷基、C3-6环烷基或-C1-6亚烷基-C3-6环烷基，所述C1-6烷基、C1-6亚烷基和C3-6环烷基各自任选被选自卤素或任选被卤素取代的C1-6烷基的基团取代；
条件是：A1和A2中至多一个是N，且A3、A4、A5和A6中包含至少一个且至多三个N原子。
2.根据权利要求1的式(I)化合物、其药学上可接受的盐、异构体或其溶剂合物，其中A3、A4和A5之一不存在，且包含A1、A2、A3、A4、A5和A6的环中包含至少两个N杂原子。
3.根据权利要求1的式(I)化合物、其药学上可接受的盐、异构体或其溶剂合物，其中A3、A4和A5各自独立地选自CR4或N。
4.根据权利要求1的式(I)化合物、其药学上可接受的盐、异构体或其溶剂合物，其中包含Z和A1～A6的双环稠合杂芳基部分具有选自以下的结构：
Figure FDA0004025733950000021
Figure FDA0004025733950000022
优选/>
Figure FDA0004025733950000023
Figure FDA0004025733950000024
5.根据权利要求1-4任一项的式(I)化合物、其药学上可接受的盐、异构体或其溶剂合物，其中R4选自H或C3-6环烷基，优选H或环丙基。
6.根据权利要求1-4任一项的式(I)化合物、其药学上可接受的盐、异构体或其溶剂合物，其中R5选自C1-6烷基，优选甲基。
7.根据权利要求1-6的式(I)化合物、其药学上可接受的盐、异构体或其溶剂合物，其中R1和R2各自为甲基。
8.式(I’)化合物、其药学上可接受的盐、异构体或其溶剂合物，
Figure FDA0004025733950000031
其中Z、A1、A2、A3、A4、A5和A6如权利要求1-6任一项所定义。
9.根据权利要求8的式(I’)化合物、其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中：
Z选自N或CR3，其中R3选自H或卤素；
A1、A2和A6各自独立地选自C或N；
A3、A4和A5各自独立地选自CR4或N；或者A3、A4和A5之一不存在，其余各自独立地选自CR4、N或NR5；
R4和R5各自独立地选自H、C1-6烷基、C3-6环烷基或-C1-6亚烷基-C3-6环烷基；
条件是：A1和A2中至多一个是N，且A3、A4、A5和A6中包含至少一个且至多三个N杂原子。
10.根据权利要求8或9的式(I’)化合物、其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中包含Z和A1～A6的双环稠合杂芳基部分具有选自以下的结构：
Figure FDA0004025733950000032
Figure FDA0004025733950000033
优选/>
Figure FDA0004025733950000034
Figure FDA0004025733950000035
最优选/>
Figure FDA0004025733950000036
11.根据权利要求8-10任一项的式(I’)化合物、其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中R4为H；或R4为C3-6环烷基，优选环丙基。
12.根据权利要求8-10任一项的式(I’)化合物、其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中R5为C1-6烷基，优选甲基。
13.化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，所述化合物选自
Figure FDA0004025733950000041
14.药物组合物，包含权利要求1至13任一项的化合物或其药学上可接受的盐或异构体，以及任选的一种或多种药学上可接受的载体。
15.根据权利要求14的药物组合物，其还包含至少一种另外的药物活性成分。
16.根据权利要求1至13任一项的化合物或根据权利要求14-15任一项的药物组合物，用于治疗或预防与ATR激酶相关疾病。
17.根据权利要求1至13任一项的化合物或根据权利要求14-15任一项的药物组合物用于治疗或预防与ATR激酶相关疾病的用途。
18.根据权利要求1至13任一项的化合物或根据权利要求14-15任一项的药物组合物在制备用于治疗或预防与ATR激酶相关疾病的药物中的用途。
19.用于治疗或预防与ATR激酶相关疾病的方法，其包括对有需要的对象施用治疗有效量的根据权利要求1至13任一项的化合物或根据权利要求14-15任一项的药物组合物。
20.根据权利要求16的化合物或药物组合物、根据权利要求17或18的用途或根据权利要求19的方法，其中与ATR激酶相关疾病选自血液恶性肿瘤，例如白血病(包括慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病和慢性骨髓性白血病)、多发性骨髓瘤、淋巴***恶性肿瘤(例如淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤)、骨髓增生异常综合症，和实体瘤、例如癌和肉瘤及其转移灶，例如乳腺癌、肺癌(非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌)、中枢神经***肿瘤(例如胶质瘤、胚胎期发育不良性神经上皮肿瘤、多形性成胶质细胞瘤、混合胶质瘤、成髓细胞瘤、成视网膜细胞瘤、成神经细胞瘤、生殖细胞瘤及畸胎瘤)、胃肠道癌(例如胃癌、食管癌、肝癌、胆管癌、结直肠癌、小肠癌、胰腺癌)、皮肤癌、黑色素瘤、甲状腺癌、骨癌、头颈癌、唾液腺癌、***癌、睾丸癌、卵巢癌、子***、子宫癌、子宫内膜癌、外阴癌、膀胱癌、肾癌、鳞状细胞癌、肉瘤(例如骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、软组织肉瘤、尤因式肉瘤、胃肠组织癌、胃肠基质肿瘤、卡波西氏肉瘤)，以及儿科癌症(例如横纹肌肉瘤和成神经细胞瘤)。
21.根据权利要求20的化合物、用途或方法，其中与ATR激酶相关疾病选自肺癌、***癌、黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肾癌、胃癌、肉瘤、头颈癌、中枢神经***肿瘤及其转移灶、以及急性髓性白血病。
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