CN116360087A - 一种多通道光片照明显微成像装置及其操作方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多通道光片照明显微成像装置，图像采集模块包括有多个图像探测器；激光器组发射多路不同波长的激发光、后通过光路模块合束为一束入射光经过扫描振镜和成像模块后照射到载物台中的样品上，载物台安装在三维位移平台上；成像模块内的成像物镜收集样品内的荧光信号、后经过所述分光模块形成多个不同波段的荧光信号投射到多个图像探测器中。每个图像探测器均形成一个图像成像通道，多个图像成像通道接收多个不同波段的荧光信号并传输至相应的图像探测器，三维位移平台实现样品切片的三维位移运动，通过采用样品切片连续运动成像和多个图像探测器同时检测采集荧光信号的策略，可减少样品制备与成像的时间间隔以及成像中的停顿。

Description

一种多通道光片照明显微成像装置及其操作方法

技术领域

本发明涉及显微成像技术领域，具体涉及一种多通道光片照明显微成像装置及其操作方法。

背景技术

在现代显微成像技术中，三维显微成像技术正在快速发展。在不降低分辨率的前提下快速地连续成像荧光染色标记的样品是三维显微成像方法的重要追求。

一般的，三维数字成像以某种产生衬度响应(如荧光)的方法探测样品(激发)，以某种方法记录这些衬度(光电转换并数字化)，并以待测区域内每一个体单元的衬度数字化为体像素作为最终产出。以此，体像素的数目，即样品待测区域的体积除以体像素对应的体积(由要求的分辨率决定)和数字化的速度决定了三维数字成像速度的一个上限，通过多个图像探测器同步成像的策略能大大缩短多色标记样品的成像时间，从而进一步提高三维数字成像速度的上限。

现有的光片照明显微成像技术为例，比如现有论文文献：Wang,Hao,et al."Scalable volumetric imaging for ultrahigh-speed brain mapping at synapticresolution."National Science Review 6.5(2019):982-992中公开了用高通量三维荧光成像VISoR技术以单个通道对小鼠全脑成像需要近1.5小时，其分辨率为0.5μm×0.5μm×3.5μm，相较于其他成像技术，VISoR成像技术以成像速度和分辨率已稳居第一梯队。该技术虽已实现在显微成像过程中不间断的连续移动成像，但为了研究脑内不同的细胞或基因的分布，需要不同标志物对各细胞或基因进行特异性表达，进而需要采用单个通道进行多次成像需要较长的时间。

上述显微成像技术的过程包含了大量的中断成像的过程，每次完成样品的成像后需要更换滤光片和激光光源，才能开始继续成像，从而产生长时间的成像中断，当进行多轮不同波长的激光照射并显微成像时，需要重复以上操作与成像，对于多荧光标记的样本切片成像的时间花费极大。且在样品体积较大，分辨率要求较高且标记物较多的情况下，上述成像所消耗的时间会更长，严重影响成像效率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于：如何解决对于多标记样本的显微成像，目前单通道成像造成的成像效率低、以及成像时间长等问题。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种多通道光片照明显微成像装置，包括激光器组、光路模块、扫描振镜、成像模块、分光模块、三维位移平台以及图像采集模块，所述图像采集模块包括有多个图像探测器；所述激光器组发射多路不同波长的激发光、后通过光路模块合束为一束入射光经过所述扫描振镜和成像模块后照射到载物台中的样品上，所述载物台安装在三维位移平台上；所述成像模块内的成像物镜收集样品内的荧光信号、后经过所述分光模块形成多个不同波段的荧光信号投射到多个所述图像探测器中。

本发明通过设置多个图像探测器，每个图像探测器均形成一个图像成像通道，多个图像成像通道接收多个不同波段的荧光信号并传输至相应的图像探测器，在成像过程中其成像效率相比于现有技术就已提高了N倍(其中N为图像探测器的个数)，同时三维位移平台存放样品切片，并实现样品切片的三维位移运动，因此通过采用样品切片连续运动成像和多个图像探测器同时检测采集荧光信号的策略，可以减少样品制备与成像的时间间隔，减少三维显微成像中的成像停顿；与现有的单通道成像技术相比，本发明可以实现同时以多个通道对样品同时成像，可提高三维成像通量，改善成像质量，提高成像速度，缩短成像时间，提高成像准确度，可应用于多荧光标记样品的三维成像。

作为本发明进一步的方案：所述激光器组包括有四个发射不同波长激光的激光器一、激光器二、激光器三和激光器四，且四个激光器等距水平分布在成像装置的工作台上。

作为本发明进一步的方案：所述光路模块安装在成像装置的工作台上，且位于激光器组的一侧；所述光路模块包括有反射镜一、反射镜二、反射镜三和反射镜四，其中反射镜一、反射镜二、反射镜三和反射镜四分别与激光器一、激光器二、激光器三和激光器四相对应。

作为本发明进一步的方案：所述光路模块还包括有反射镜五、反射镜六、反射镜七、反射镜八、反射镜十、反射镜十一、反射镜十二、透镜一和透镜二，其中反射镜五、反射镜六、反射镜七和反射镜八分别与反射镜一、反射镜二、反射镜三和反射镜四相对应；

所述光路模块还包括有反射镜九、合束镜一、合束镜二和合束镜三，其中反射镜九、合束镜一、合束镜二和合束镜三分别与反射镜五、反射镜六、反射镜七和反射镜八相对应。

作为本发明进一步的方案：所述反射镜九、合束镜一、合束镜二和合束镜三的四束反射光合束为一束入射光，并依次经过反射镜十、反射镜十一、反射镜十二、扫描振镜、透镜一和透镜二后进入到正三棱镜，所述正三棱镜将接收到的激光反射到五棱镜一上，所述五棱镜一将接收到的激发光反射到照明物镜中，所述正三棱镜和五棱镜一设在成像装置的工作台。

作为本发明进一步的方案：所述成像模块包括有设在成像装置工作台上的照明物镜和成像物镜，其中照明物镜的焦线与成像物镜的焦线垂直，并分别与载物台桌面成45°角放置；

所述照明物镜和成像物镜位于载物台的正上方，且照明物镜将接收到的激光照射到载物台中的样品上，所述成像物镜将收集到的荧光信号经过五棱镜二反射到分光模块，其中五棱镜二位于成像物镜末端。

作为本发明进一步的方案：所述照明物镜的后侧还设有精密平移台，其中精密平移台固定在成像装置工作台的端部，所述精密平移台的驱动轴通过连接件可拆卸连接到照明物镜。

作为本发明进一步的方案：所述分光模块包括有采用不同型号的二向色镜一、二向色镜二和二向色镜三，还包括有滤光片一、滤光片二、滤光片三和滤光片四，其中二向色镜以及滤光片的有效波长区间与样品受入射光束照射产生的荧光信号波长对应。

作为本发明进一步的方案：多个所述图像探测器包括有图像探测器一、图像探测器二、图像探测器三和图像探测器四，所述滤光片一、滤光片二、滤光片三和滤光片四分别位于图像探测器一、图像探测器二、图像探测器三和图像探测器四探测头的前端。

作为本发明进一步的方案：所述二向色镜一将接收的荧光信号分成两个方向垂直且波段不重叠的荧光信号；分割后的两个荧光信号分别经过二向色镜二和二向色镜三又形成两个方向垂直且波段不重叠的荧光信号，四个方向的荧光信号分别通过四个滤光片过滤后被相应的图像探测器采集。

作为本发明进一步的方案：还包括有控制模块，所述控制模块同步控制激光器组的多路激光光源的发射、扫描振镜的运动和图像采集模块的曝光；

所述控制模块包括运动控制卡，运动控制卡输出模拟信号控制扫描振镜振动的振幅和偏振，运动控制卡输出数字信号控制激光器组的多路激光光源和图像采集模块的触发。

本发明还提供了一种多通道光片照明显微成像装置的操作方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、首先设置包括激光器组、光路模块、扫描振镜、成像模块、分光模块以及图像采集模块的各个器件的参数；

S2、取样品切片，并将样品切片置于载物台并确定样品切片在载物台内的位置信息；

S3、随后三维位移平台载着样品切片从起始位置沿位移平台的x轴开始运动，控制模块按给定频率产生同步信号，在一个曝光时间内，多组激光器按设定的功率大小打开，扫描振镜开始按给定的振幅和偏置完成一次扫描；

S4、在样品切片上其中一个平面内的染色标记激发荧光，激发的荧光通过三组二向色镜后分为四个不同波长的光束；

S5、上述四个光束分别经过滤光片后被图像采集模块采集，图像采集模块完成曝光并存储这个平面的图像数据，直到样品切片运动到终点位置，重复上述操作，从而完成样品切片的多通道连续成像。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

一、本发明通过设置多个图像探测器，每个图像探测器均形成一个图像成像通道，多个图像成像通道接收多个不同波段的荧光信号并传输至相应的图像探测器，在成像过程中其成像效率相比于现有技术就已提高了N倍(其中N为图像探测器的个数)，同时三维位移平台存放样品切片，并实现样品切片的三维位移运动，因此通过采用样品切片连续运动成像和多个图像探测器同时检测采集荧光信号的策略，可以减少样品制备与成像的时间间隔，减少三维显微成像中的成像停顿；与现有的单通道成像技术相比，本发明可以实现同时以多个通道对样品同时成像，可提高三维成像通量，改善成像质量，提高成像速度，缩短成像时间，提高成像准确度，可应用于多荧光标记样品的三维成像；

二、本发明通过设置多个激光器，且每个激光器的激发光波长不同，多个激光器同时工作，可同时采集多个波长的激发光，而传统的成像装置每采集到一种波长的激发光后还需要中断调节下一个波长，再重复以上运动和成像，本发明则无需重复上述运动，单次便可采集多个波长的激发光，从而提高成像效率；

三、本发明通过设置多个图像探测器，多个图像探测器在多个二向色镜的反射下同时采集成像，具有很高的数据传输率；

四、本发明通过设置多通道成像，则样品进行连续移动的次数远远少于现有的单通道成像技术，会大大减少三维位移平台在连续运动过程中产生的位移误差，避免了多次单通道成像中同一位置产生偏差的问题。

附图说明

图1为本发明实施例一种多通道光片照明显微成像装置的结构示意图；

图2为本发明实施例激光器组、光路模块以及扫描振镜的光路图；

图3为本发明实施例成像模块的结构示意图；

图4为本发明实施例图1的俯视图；

图5为本发明实施例另一种形式的多通道光片照明显微成像装置的俯视图；

图6为本发明实施例图5的光路图；

图7为本发明实施例图4的光路图；

图8为本发明实施例三维成像原理图；

图9为本发明实施例移动时的三维成像原理图；

图10为本发明实施例连续移动时的三维成像原理图；

图11为本发明实施例显微成像装置的工作流程图；

附图标记说明：1、图像探测器一；2、图像探测器二；3、图像探测器三；4、图像探测器四；5、二向色镜一；6、二向色镜二；7、二向色镜三；8、激光器组；81、激光器一；82、激光器二；83、激光器三；84、激光器四；9、光路模块；91、反射镜一；92、反射镜二；93、反射镜三；94、反射镜四；95、反射镜五；96、反射镜六；97、反射镜七；98、反射镜八；99、反射镜九；910、合束镜一；911、合束镜二；912、合束镜三；913、反射镜十；914、反射镜十一；915、反射镜十二；916、透镜一；917、透镜二；10、扫描振镜；11、三维位移平台；12、载物台；13、正三棱镜；14、五棱镜一；15、照明物镜；16、成像物镜；17、五棱镜二；18、精密平移台；19、滤光片一；20、滤光片二；21、滤光片三；22、滤光片四。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种多通道光片照明显微成像装置，涉及显微成像技术领域，更具体地是涉及一种以生物和医学为主要应用领域的用于荧光标记样品的多通道光片照明显微成像的装置，用于四通道三维显微成像装置，需要注意的是，本发明还可以扩展为更多通道的光片照明显微成像，本发明仅是给出其中四通道的光片照明显微成像的一个实施方式，工作人员可以视实际情况而定。

参见图1所示，四通道显微成像装置包括图像探测器一1、图像探测器二2、图像探测器三3、图像探测器四4、二向色镜一5、二向色镜二6、二向色镜三7，激光器组8、光路模块9、扫描振镜10、三维位移平台11、载物台12、正三棱镜13、五棱镜一14、五棱镜二17、照明物镜15、成像物镜16、精密平移台18、滤光片一19、滤光片二20、滤光片三21、滤光片四22、控制模块和处理主机，控制模块，控制模块同步控制激光器组8的多路激光光源的发射、扫描振镜10的运动和图像采集模块的曝光；其中本发明核心内容为多通道同时成像，此处为四通道同时成像，以减少不必要的成像中断。围绕这一内容采用一系列技术的组合，其基本内容包括样品连续移动的同时连续的成像，减少样品制备和成像之间的时间间隔，减少必须中断成像的视野转换，四台图像探测器同时采集不同波长的荧光标记激发光等。

需要注意的是，控制模块包括运动控制卡，运动控制卡输出模拟信号控制扫描振镜10振动的振幅和偏振，运动控制卡输出数字信号控制激光器组8的多路激光光源和图像采集模块的触发，处理主机控制多路激光光源中不同波长激光器的通断和激光功率，三维位移平台11在各方向上的运动速度和运动距离，图像探测器的成像区域，触发模式和曝光时间，控制模块的模拟输出信号和数字输出信号，本发明像探测器一1、图像探测器二2、图像探测器三3、图像探测器四4分别用来接收不同波长的荧光信号获得图像数据，并将图像数据传递给主机进行存储。

需要注意的是，图像探测器可采用滨松ORCA-Fusion数字CMOS相机，相机最大采集范围为2304×2304像素，像素尺寸6.5×6.5微米，全幅帧率89Hz即11.2毫秒每帧。

参照图2，激光器组8包括有四个发射不同波长激光的激光器一81、激光器二82、激光器三83和激光器四84，且四个激光器等距水平分布在成像装置的工作台上。光路模块9也安装在成像装置的工作台上，且位于激光器组8的一侧；

参照图2，光路模块9包括有反射镜一91、反射镜二92、反射镜三93、反射镜四94、反射镜五95、反射镜六96、反射镜七97、反射镜八98、反射镜九99、合束镜一910、合束镜二911和合束镜三912、反射镜十913、反射镜十一914、反射镜十二915、透镜一916和透镜二917，其中反射镜一91、反射镜二92、反射镜三93和反射镜四94分别与激光器一81、激光器二82、激光器三83和激光器四84相对应；即激光器一81、激光器二82、激光器三83和激光器四84发射的激发光被相应的反射镜一91、反射镜二92、反射镜三93和反射镜四94接收；反射镜五95、反射镜六96、反射镜七97和反射镜八98分别与反射镜一91、反射镜二92、反射镜三93和反射镜四94相对应，即反射镜一91、反射镜二92、反射镜三93和反射镜四94发射的激发光被相应的反射镜五95、反射镜六96、反射镜七97和反射镜八98接收；反射镜九99、合束镜一910、合束镜二911和合束镜三912分别与反射镜五95、反射镜六96、反射镜七97和反射镜八98相对应，即反射镜五95、反射镜六96、反射镜七97和反射镜八98发射的激发光被相应的反射镜九99、合束镜一910、合束镜二911和合束镜三912接收，随后反射镜九99、合束镜一910、合束镜二911和合束镜三912的四束反射光合束为一束入射光，并依次经过反射镜十913、反射镜十一914、反射镜十二915、扫描振镜10、透镜一916和透镜二917后进入到正三棱镜13，正三棱镜13将接收到的激光反射到五棱镜一14上，五棱镜一14将接收到的激发光反射到照明物15镜中，正三棱镜13和五棱镜一14也设在成像装置的工作台，且扫描振镜10、透镜一916和透镜二917位于同一水平线上。

参照图1，本发明扫描振镜10输入连续的三角波信号进行同步扫描，保证每幅成像时间内一次同相位全视野扫描。设置运动控制卡的输出信号同步控制图像探测器的曝光和扫描振镜的触发，且本发明扫描振镜10采用大族思特的ST210，最大扫描角度为40°。

参照图1，本发明三维位移平台11由Aerotech公司生产的高精度单轴位移平台组成，X轴的型号为ABL2000,Y和Z轴的型号为PRO165SL，需要注意的是，本发明载物台12安装在三维位移平台11上，可通过三维位移平台11实现对载物台12的驱动，即实现载物台12X轴、Y轴以及Z轴三个方向的位移调节，进而实现对载物台上样品的全方位位置调节，确保后续成像的完整。

参照图3，照明物镜15的焦线与成像物镜16的焦线垂直，并分别与载物台12桌面成45°角放置。照明物镜15和成像物镜16位于载物台12的正上方，且照明物镜15将接收到的激光照射到载物台12中的样品上，成像物镜16将收集到的荧光信号经过五棱镜二17反射到分光模块，其中五棱镜二17位于成像物镜16末端，需要注意的是，本发明照明物镜15为THROLABS公司的TL20X-MPL，数值孔径为0.8，工作距离为3mm；而成像物镜16为THROLABS公司的N16XLWD-PF，数值孔径为0.6，工作距离为5.5mm。

进一步的，参照图3，照明物镜15的后侧还设有精密平移台18，其中精密平移台18固定在成像装置工作台的端部，精密平移台18的驱动轴通过连接件可拆卸连接到照明物镜15，精密平移台18用于调整照明物镜15的位置，使激光经过照明物镜15聚焦后的束腰在图像探测器视野中间，从而得到最薄的光片，其中精密平移台18采用大恒光电的GCM-T13精密平移台，工作行程为±6.5mm。

参照图5和图6还提供了新的结构形式的四通道光片照明显微成像装置结构图和光路图，其中的成像方法、成像装置和图1相似，光路图和图7相似。

图8、图9和图10展示了四通道成像装置的三维成像原理，该装置的光路部分(包括照明光路和成像光路)和样品的移动相互独立，在成像的同时，样品与成像***之间保持连续、匀速运动，运动方向不在成像方向上，同时也不与成像方向垂直，这样样品移动范围和移动方向的尺度不受成像装置的限制，图像采集可以长时间持续，可以适用于大尺寸样品的成像。图8展示了运动方向与成像方向成45°夹角的例子；如图9和图10所示，持续不间断的对样品的新位置成像，最终完成样品的三维成像。由此可见，样品移动方向不与成像方向垂直，从而使相邻的成像在样品内对应的区域不共面，相邻的成像之间没有重叠。

本发明具体的操作原理如下：

在工作前，先设置各器件参数，包括激光光源的通断，功率；扫描振镜10的振幅，偏置；运动控制卡的同步信号；四台图像探测器的采集的图像大小信息，图像存储位置，曝光时间；随后取样品切片，并将样品切片置于载物台12并确定样品切片在载物台12内的位置信息，确定样品切片在载物台内的位置信息后，导入该参数，即为位移平台11在连续运动过程中起点和终点位置，设置位移平台11的运动速度，随后三维位移平台11载着样品切片从起始位置沿位移平台的x轴开始运动，控制模块按给定频率产生同步信号，在一个曝光时间内，多组激光器按设定的功率大小打开，扫描振镜10开始按给定的振幅和偏置完成一次扫描，其中入射激光被扫描振镜10反射后经过透镜和照明物镜15的聚焦后，照射到样品切片上；在样品切片上其中一个平面内的染色标记受入射光激发产生荧光信号，荧光信号通过三组二向色镜后分为四个不同波段的光束，上述四个光束分别经过特定的滤光片后被多个图像探测器采集，图像探测器完成曝光并存储这个平面的图像数据，直到样品切片运动到终点位置，待X轴运动结束后，继续Y轴以及Z轴的运动，并重复上述操作，从而完成样品切片的多通道连续成像。

本发明可针对300微米厚的样品，分辨率要求为微米级甚至亚微米级，具体样品的厚度范围可以采用不大于300微米厚的样品。成像所依赖的样品标记的荧光由405nm、488nm、561nm、640nm激光激发荧光小球提供。载物台12内装有折射率匹配溶液，照明物镜15的前端、成像物镜16的前端和样品切片均置于纯水中。四路激光器的激发光选择640nm、561nm、488nm和405nm的连续激光，分别由连续激光器一81、激光器二82、激光器三83、激光器四84产生；

需要注意的是，样品可以选用哺乳动物(如小鼠、猴等)组织切片，其中用Hoechst33342染色剂标记细胞核(Hoechst33342可以与核酸结合)，可以被波长为405nm的激发光激发；用NeuroTrace Nissl 500/525绿色荧光染色剂标记神经元胞体，可以被波长为488nm的激发光激发；血管内皮细胞免疫染色分别被一抗标记、二抗标记后，二抗可以被波长为561nm的激发光激发；中性粒细胞的免疫染色分别被一抗标记、二抗标记后，二抗可以被波长为640nm的激发光激发；

640nm连续激光经过反射镜一91、反射镜五95、反射镜九99传输至反射镜十913；

561nm连续激光经过反射镜二92、反射镜六96传输至合束镜一910(LM01-613-25，Semrock)，合束镜一910将561nm激光反射传输至反射镜十913；

488nm连续激光经过反射镜三93、反射镜七97传输至合束镜二911(LM01-503-25，Semrock)，合束镜二911将488nm激光反射传输至反射镜十913；

405nm连续激光经过反射镜四94、反射镜八98传输至合束镜三912(LM01-427-25，Semrock)，合束镜三912将405nm激光反射传输至反射镜十913；

405nm、488nm、561nm和647nm的连续激光都照射在反射镜十913上的同一位置，反射镜十913镜将该激光束反射至扫描振镜10，扫描振镜10周期性地振动产生线形激发光传输至透镜一916。透镜一916和透镜二917为双胶合消色差透镜，使扫描振镜10与照明物镜15的后焦面共轭。线性激光束经过正三棱镜13和五棱镜一14的连续反射照射到照明物镜15的后焦面；照明物镜15将入射激光聚焦后照射到载物台12中的样品上面，产生在与成像物镜16主轴方向垂直的平面内扫描的线形激发光，激发光束聚集在样品内，以激发荧光。照明物镜15和成像物镜16光路主轴垂直，并与载物台12的桌面成45°角。载物台12水平固定在三维位移平台11上，平行于水平面，用于装载样品切片并移动样品切片至成像位置，在成像时带动样品匀速、连续而非步进地进行水平运动，从而提高样品成像速度。

参照图6和图7，样品受激发产生的激发光经过五棱镜二17改变方向后照射到二向色镜一5(其中具体型号为T560lpxr,CHROMA)，波长大于560nm的荧光信号通过二向色镜一5，照射到二向色镜二6(其中具体型号为T647lpxr,CHROMA)上，其中波长大于647nm的荧光信号被通过，再经过滤光片二20(其中具体型号为ET655lp,CHROMA)过滤出有用信号后被图像探测器二2捕获，获得样品在647nm激光照射下产生的荧光信息；波长小于647nm的荧光信号被反射，再经过滤光片一19(其中具体型号为ET600/50m,CHROMA)过滤出有用信号后被图像探测器一1捕获，获得样品在561nm激光照射下产生的荧光信息；

波长小于560nm的荧光信号被二向色镜一5反射，照射到二向色镜三7(其中具体型号为T470lpxr,CHROMA)上，其中波长大于470nm的荧光信号被通过，再经过滤光片三21(其中具体型号为ET520/40m,CHROMA)过滤出有用信号后被图像探测器三3捕获，获得样品在488nm激光照射下产生的荧光信息；波长小于470nm的荧光信号被反射，再经过滤光片四22(其中具体型号为ET455/50m,CHROMA)过滤出有用信号后被图像探测器四4捕获，获得样品在405nm激光照射下产生的荧光信息。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (12)

1.一种多通道光片照明显微成像装置，其特征在于，包括激光器组(8)、光路模块(9)、扫描振镜(10)、成像模块、分光模块、三维位移平台(11)以及图像采集模块，所述图像采集模块包括有多个图像探测器；

所述激光器组(8)发射多路不同波长的激发光、后通过光路模块(9)合束为一束入射光经过所述扫描振镜(10)和成像模块后照射到载物台(12)中的样品上，所述载物台(12)安装在三维位移平台(11)上；

所述成像模块内的成像物镜(16)收集样品内的荧光信号、后经过所述分光模块形成多个不同波段的荧光信号投射到多个所述图像探测器中。

2.根据权利要求1所述的一种多通道光片照明显微成像装置，其特征在于：所述激光器组(8)包括有四个发射不同波长激光的激光器一(81)、激光器二(82)、激光器三(83)和激光器四(84)，且四个激光器等距水平分布在成像装置的工作台上。

3.根据权利要求2所述的一种多通道光片照明显微成像装置，其特征在于：所述光路模块(9)安装在成像装置的工作台上，且位于激光器组(8)的一侧；所述光路模块(9)包括有反射镜一(91)、反射镜二(92)、反射镜三(93)和反射镜四(94)，其中反射镜一(91)、反射镜二(92)、反射镜三(93)和反射镜四(94)分别与激光器一(81)、激光器二(82)、激光器三(83)和激光器四(84)相对应。

4.根据权利要求3所述的一种多通道光片照明显微成像装置，其特征在于：所述光路模块(9)还包括有反射镜五(95)、反射镜六(96)、反射镜七(97)、反射镜八(98)、反射镜十(913)、反射镜十一(914)、反射镜十二(915)、透镜一(916)和透镜二(917)，其中反射镜五(95)、反射镜六(96)、反射镜七(97)和反射镜八(98)分别与反射镜一(91)、反射镜二(92)、反射镜三(93)和反射镜四(94)相对应；

所述光路模块(9)还包括有反射镜九(99)、合束镜一(910)、合束镜二(911)和合束镜三(912)，其中反射镜九(99)、合束镜一(910)、合束镜二(911)和合束镜三(912)分别与反射镜五(95)、反射镜六(96)、反射镜七(97)和反射镜八(98)相对应。

5.根据权利要求4所述的一种多通道光片照明显微成像装置，其特征在于：所述反射镜九(99)、合束镜一(910)、合束镜二(911)和合束镜三(912)的四束反射光合束为一束入射光，并依次经过反射镜十(913)、反射镜十一(914)、反射镜十二(915)、扫描振镜(10)、透镜一(916)和透镜二(917)后进入到正三棱镜(13)，所述正三棱镜(13)将接收到的激发光反射到五棱镜一(14)上，所述正三棱镜(13)和五棱镜一(14)设在成像装置的工作台。

6.根据权利要求1所述的一种多通道光片照明显微成像装置，其特征在于：所述成像模块包括有设在成像装置工作台上的照明物镜(15)和成像物镜(16)，其中照明物镜(15)的焦线与成像物镜(16)的焦线垂直，并分别与载物台(12)桌面成45°角放置；

所述照明物镜(15)和成像物镜(16)位于载物台(12)的正上方，且照明物镜(15)将接收到的激光照射到载物台(12)中的样品上，所述成像物镜(16)将收集到的荧光信号经过五棱镜二(17)反射到分光模块，其中五棱镜二(17)位于成像物镜(16)末端。

7.根据权利要求6所述的一种多通道光片照明显微成像装置，其特征在于：所述照明物镜(15)的后侧还设有精密平移台(18)，其中精密平移台(18)固定在成像装置工作台的端部，所述精密平移台(18)的驱动轴通过连接件可拆卸连接到照明物镜(15)。

8.根据权利要求1所述的一种多通道光片照明显微成像装置，其特征在于：所述分光模块包括有采用不同型号的二向色镜一(5)、二向色镜二(6)和二向色镜三(7)，还包括有滤光片一(19)、滤光片二(20)、滤光片三(21)和滤光片四(22)，其中二向色镜以及滤光片的有效波长区间与样品受入射光束照射产生的荧光信号波长对应。

9.根据权利要求8所述的一种多通道光片照明显微成像装置，其特征在于：多个所述图像探测器包括有图像探测器一(1)、图像探测器二(2)、图像探测器三(3)和图像探测器四(4)，所述滤光片一(19)、滤光片二(20)、滤光片三(21)和滤光片四(22)分别位于图像探测器一(1)、图像探测器二(2)、图像探测器三(3)和图像探测器四(4)探测头的前端。

10.根据权利要求9所述的一种多通道光片照明显微成像装置，其特征在于：所述二向色镜一(5)将接收的荧光信号分成两个方向垂直且波段不重叠的荧光信号；分割后的两个荧光信号分别经过二向色镜二(6)和二向色镜三(7)又形成两个方向垂直且波段不重叠的荧光信号，四个方向的荧光信号分别通过四个滤光片过滤后被相应的图像探测器采集。

11.根据权利要求1所述的一种多通道光片照明显微成像装置，其特征在于：还包括有控制模块，所述控制模块同步控制激光器组(8)的多路激光光源的发射、扫描振镜(10)的运动和图像采集模块的曝光；

所述控制模块包括运动控制卡，运动控制卡输出模拟信号控制扫描振镜(10)振动的振幅和偏振，运动控制卡输出数字信号控制激光器组(8)的多路激光光源和图像采集模块的触发。

12.采用如权利要求1-11任意一项的一种多通道光片照明显微成像装置的操作方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、首先设置包括激光器组、光路模块、扫描振镜、成像模块、分光模块以及图像采集模块的各个器件的参数；

S2、取样品切片，并将样品切片置于载物台并确定样品切片在载物台内的位置信息；

S3、随后三维位移平台载着样品切片从起始位置沿位移平台的x轴开始运动，控制模块按给定频率产生同步信号，在一个曝光时间内，多组激光器按设定的功率大小打开，扫描振镜开始按给定的振幅和偏置完成一次扫描；

S4、在样品切片上其中一个平面内的染色标记激发荧光，激发的荧光通过三组二向色镜后分为四个不同波长的光束；

S5、上述四个光束分别经过滤光片后被多个图像探测器采集，图像探测器完成曝光并存储这个平面的图像数据，直到样品切片运动到终点位置，待X轴运动结束后，继续Y轴以及Z轴的运动，并重复上述操作，从而完成样品切片的多通道连续成像。

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