CN111273433A - 一种高速大视场数字扫描光片显微成像*** - Google Patents

一种高速大视场数字扫描光片显微成像*** Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高速大视场数字扫描光片显微成像***，包括按照光路依次设置的光源模块、横向视场扩展模块、扫描模块、照明模块和探测模块，光源模块产生的光经过横向视场扩展模块以获得扩展最终照明区域的有效视场，扫描模块将从横向视场扩展模块接收的线光束扫描成为面光束，照明模块采用分束镜、第一照明物镜和第二照明物镜进行荧光激发，探测模块采用线探测器实现荧光探测成像。本发明提升了轴向分辨率减小了光毒性和光漂白对样品的影响，并且使用线阵探测器使得成像具有更高的分辨率与对比度，并且具有更高的成像速度，且节省了探测器的成本。

Description

一种高速大视场数字扫描光片显微成像***
技术领域
本发明光学显微成像技术领域，具体涉及一种高速大视场数字扫描光片显微成像***。
背景技术
光学显微镜中，受物镜限制分辨率达到细胞级(1微米左右)视场直径基本在1mm以内，为保持分辨率的同时提升成像视场，一些相关方法被提出。最常见且简单的方法是将样品固定在二维平移台上，在小视场对特定区域成像后，移动样品，多次成像，将多幅图像拼接以获取大视场图像。这种方法速度较慢，不能实时成像，且视场拼接存在误差以及需要图像边缘的堆叠，导致拼接区域附近的图像有所失真。
最近有一些相关研究采用特殊设计的物镜，可以在保持高分辨率的同时具有较大成像视场的，文章(McConnell,G.etal.Anovelopticalmicroscopeforimaging largeembryosandtissuevolumeswithsub-cellularresolutionthroughout.Elife5,1–15(2016).)设计了一款特殊的物镜进行大视场高分辨率成像，该方案采用共聚焦的方式，探测端为点探测器。最终成像图像为20000*20000像素，视场直径可达6mm，分辨率为0.6μm。然而由于采用点探测的方式，最终成像速度较慢，一帧图像需要200s，极大限制了其在高动态样品上的研究前景。
文章(Schniete,J.etal.FastOpticalSectioningforWidefieldFluorescence MesoscopywiththeMesolensbasedonHiLoMicroscopy.Sci.Rep.8,1–10(2018).)采用特殊设计的物镜进行成像，探测端为一个大靶面高像素相机，最终成像视场为视场为4.4mm*3mm，像素为19728*13752像素，单帧成像时间为1.8s。然而宽场照明的方式使得***分辨率受限而且该高像素相机造价仍然较为高昂。
文章(Fan,J.etal.Video-rateimagingofbiologicaldynamicsatcentimetrescale andmicrometreresolution.Nat.Photonics13,809–816(2019).)采用特殊设计的物镜，分辨率在1.2μm的同时视场可达10mm*12mm，探测端采用35个像素为2560*2160像素的相机拼接采集成像，具有较高的成像速度，单帧成像时间为0.033s。然而这种拼接成像的方式导致拼接边缘仍然有失真，且探测器的花费非常高昂，且轴向分辨率较低。
值得注意的是，上述几个方法除了存在上文描述的成像速度慢或探测器造价高昂的缺陷以外，还存在一个共同问题，即它们均采用的是探测光和照明光同轴的方式进行成像。这样带来的问题是轴向分辨率普遍较低，且样品受到的光毒性和光漂白作用明显，不利于对样品进行长时间成像。
因此，现有的大视场荧光显微镜主要缺陷是：均采用是同轴照明与探测，轴向分辨率有限，对样品光漂白和光毒性作用明显，拼接成像的方式图像有失真，且针对大视场的面探测器无法兼顾高成像速度与较低的成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无需拼接视场、具有高横向和轴向分辨率、高成像速度的高速大视场数字扫描光片显微成像***。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种高速大视场数字扫描光片显微成像***，包括按照光路依次设置的光源模块、横向视场扩展模块、扫描模块、照明模块和探测模块，所述光源模块产生的光经过横向视场扩展模块以获得扩展最终照明区域的有效视场，所述扫描模块将从横向视场扩展模块接收的线光束扫描成为面光束；
所述照明模块包括分束镜、第一照明物镜、第二照明物镜、光束偏折中继***和样品，所述分束镜将所述扫描模块的面光束光束分为两路，其中一路直接经第一照明物镜聚焦到样品上进行荧光激发；另一路经过光束偏折中继***后再经过第二照明物镜聚焦到样品上进行荧光激发；
所述探测模块包括大视场高分辨物镜、第六透镜、变焦透镜、第七透镜、第五扫描透镜、第三扫描振镜、线探测器和聚焦透镜，所述大视场高分辨物镜用于收集经过照明模块双路激发的荧光，所述大视场高分辨物镜、第六透镜、变焦透镜、第七透镜、第五扫描透镜、第三扫描振镜、聚焦透镜和线探测器依次设置。
进一步地，所述光源模块包括依次设置的激光器、准直透镜和第一反射镜。
进一步地，所述横向视场扩展模块包括依次设置的空间光调制器、第一透镜、掩膜版、第二透镜和第三透镜，所述空间光调制器用于接收第一反射镜反射的光束。
进一步地，所述横向视场扩展模块包括依次设置的第五反射镜、电动液体变焦透镜、第八透镜和第九透镜，所述第五反射镜用于接收第一反射镜反射的光束。
进一步地，所述第二透镜和第三透镜组成第一4f中继***，所述第八透镜和第九透镜组成第四4f中继***。
进一步地，所述扫描模块包括依次设置的第一扫描振镜、第一扫描透镜、第二扫描透镜、第二扫描振镜、第三扫描透镜以及第四扫描透镜，所述第一扫描透镜和第二扫描透镜组成第二4f中继***，所述第三扫描透镜和第四扫描透镜组成第三4f中继***。
进一步地，所述光束偏折中继***包括依次设置的第二反射镜、第四透镜、第三反射镜、第五透镜和第四反射镜，所述第四透镜和第五透镜组成第四4f中继***。
进一步地，第一扫描振镜的镜面、第二扫描振镜的镜面、第一照明物镜的入瞳面和第二照明物镜的入瞳面四者为共轭面。
进一步地，所述分束镜为50:50分束镜，第一照明物镜和第二照明物镜为相同型号的物镜且二者的入瞳面共轭。
进一步地，第二扫描振镜的镜面与入射光线的角度为45度，电动变焦透镜的屈光度为0度。
本发明提出了一种将大视场高分辨率成像与光片照明相结合的显微镜***，提升了轴向分辨率减小了光毒性和光漂白对样品的影响，并且使用线阵探测器使得成像具有更高的分辨率与对比度，并且具有更高的成像速度，且节省了探测器的成本。有益效果主要包括：
(1)现有技术中采用物镜进行成像都是照明光路和探测光路同轴的方法，导致成像时轴向分辨率有限，且样品受到的光毒性和光漂白作用明显，本发明采用照明光和探测光轴垂直的方式，即光片显微成像模式，提升了这种大视场高横向分辨率场景下的轴向分辨率，且减小了样品所受光毒性和光漂白作用；
(2)常规大视场成像时，探测端采用两种方案，一种是是视场拼接，这种方案在视场较大时拼接工作较为繁琐，且会导致拼接边缘图像失真；另一种是大靶面的面探测器进行探测，这样成像速度往往较慢，不适用于实时成像，本发明采用线探测器与解扫描相结合的方式，不会带来视场拼接导致的失真，且大大减小了探测器的靶面，有效提升成像的速度的同时减小了探测器的成本；
(3)传统的光片显微镜采用面探测器，而照明光束为线光束，在线光束扫描进行照明过程中会受到样品散射或者调制光(如贝塞尔光)的旁瓣作用，导致最终成像受到杂散光的影响，使成像效果恶化，本发明采用在探测光路额外加入一个扫描振镜进行解扫描，使得面状荧光信号光恢复为线信号，并采用线探测器探测，有效滤除杂散光的影响，能够有效提升成像分辨率和对比度。
附图说明
图1是本发明第一实施例高速大视场数字扫描光片显微成像***图。
图2是空间光调制器上加载的相位图。
图3是掩膜版处的光斑图。
图4是照明物镜焦点处生成的贝塞尔光图。
图5是本发明第二实施例高速大视场数字扫描光片显微成像***图。
图6是照明物镜入瞳处的光斑示意图。
图7是探测物镜背瞳面的光斑示意图。
图8是线探测器靶面处的光斑示意图。
图9是线探测还原图像示意图。
图10是***的控制时序图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的实现进行详细的描述。
本发明提出了一种无需拼接视场，具有高横向和轴向分辨率，高成像速度的大视场数字扫描光片显微成像***。采用光片照明的方式进行荧光激发，与照明光轴垂直的方向用一个特殊的大视场高分辨率物镜进行探测成像，以获取同时具有高分辨率和大视场范围的三维荧光图像，且对样本的光漂白和光毒性较小，探测端采用一个额外振镜将面信号光扫描为线信号，并用线探测器探测，极大减少了探测器的靶面，且该探测方式能滤除杂散光提升成像效果。***主要包括光源模块1，横向视场扩展模块2，扫描模块3，照明模块4，探测模块5。
如图1所示，激光器11发出的光经过准直透镜12准直为平行光，经第一反射镜13将光束反射到空间光调制器21上，调制后的光经第一透镜230聚焦后通过掩膜版22，经过第二透镜231以及第三透镜232组成的第一4f中继***。此后光束由第一扫描振镜310扫描，经过第一扫描透镜320以及第二扫描透镜321组成的第二4f中继***后，光束经过第二扫描振镜311扫描，然后经过第三扫描透镜322以及第四扫描透镜323后入射到分束镜41上。分束镜41将光束分为两路，其中一路直接经第一照明物镜440聚焦到样品45上进行荧光激发；另一路依次经过第二反射镜420，第四透镜430，第三反射镜421，第五透镜431，第四反射镜422组成的光束偏折中继***，然后入射到第二照明物镜441上，经过物镜聚焦到样品45上进行荧光激发。样品经过双路激发的荧光由大视场高分辨物镜51收集，物镜51的像面560经过第六透镜520之后入射到变焦透镜53上，再经过第七透镜521使得像面位于561处，通过第五扫描透镜522后，像面的聚焦光成为平行光，入射到第三扫描振镜54上，最后通过聚焦透镜523将线光束聚焦到线探测器55的靶面上成像。
具体地，如图1所示，模块1中激光器11可以采用连续光激光器，进行单光子荧光激发，也可以采用飞秒脉冲激光器，进行多光子荧光激发，后续成像***对激光器的类型并无特殊要求。通常平行的高斯光经物镜聚焦后焦深有限，远离焦点的光束直径会变大，光功率密度降低，只有焦点附近区域有较好的激发效果，因此传统照明方式下样品处的有效视场较小。
模块2的作用是扩展最终照明区域的有效视场，其方法包括但不限于调制高斯光成为具有光束性质不随传播距离改变的无衍射光，使得物镜聚焦后的光束具有较大焦深；或者加入周期性调焦装置，使得经过物镜后光束聚焦点沿着光轴方向扫描，以此扩展焦点覆盖的区域。如图1所示，采用的是空间光调制器调制产生无衍射光方案，以无衍射光中的贝塞尔光为例。其中空间光调制器21上施加贝塞尔光的相位，入射到空间光调制器21靶面的高斯光经过反射后经过第一透镜230聚焦，在透镜焦点处形成一个环形光斑，由环形掩膜版22滤除中心零级光斑以及环状光斑周围的杂散光，经过第二透镜231和第三透镜232组成的4f透镜组后进入后续光路，且在照明物镜440和441物方焦点(样品45处)形成具有大焦深的贝塞尔光。如图2-4所示，图2-4分别为空间光调制器21上加载的相位图、掩膜版22处的光斑图，以及最终照明物镜焦点处生成的贝塞尔光图。如图5所示，横向视场扩展方案可由变焦元件扫描变焦实现，其中光源的光经过第五反射镜24反射后进入电动液体变焦透镜(Electricaltunablemirror)25或相似可调焦器件如可调声学梯度折射率指数透镜(Tunableacousticgradientindex device,TAG)等，后经过第八透镜260和第九透镜261组成的第四4f中继***后进入后续光路，由于此模块引入的周期性变焦效果，在照明物镜440和441焦点处的光斑会沿着光轴进行扫描，使得有效照明视场范围得到扩展。
模块3中，第一扫描振镜310的扫描方向垂直于物镜51的光轴，其作用是将线光束扫描成为面光束，以达到光片照明的目的；第二扫描振镜311的扫描方向沿着物镜51的光轴，其作用是对样品进行深度方向扫进行描，并结合探测模块中5的电动变焦透镜53同步变焦，使得不同深度激发的荧光均能聚焦到探测器的靶面上，实现对样品进行三维成像。模块3中第一扫描透镜320和第二扫描透镜321组成第二4f中继***，第三扫描透镜322和第四扫描透镜323组成第三4f中继***，模块4中第四透镜430和第五透镜431组成第五4f中继***，使得第一扫描振镜310的镜面、第二扫描振镜311的镜面、以及第一照明物镜440的入瞳面和第二照明物镜441的入瞳面四者为共轭面。
模块4中，分束镜41分光比为50:50，第一照明物镜440和第二照明物镜441为相同型号的物镜，且二者的入瞳面共轭，使得光束能量均匀分成两份进入两个照明物镜进行同时照明，可以避免只有单侧光照明不均匀的问题。
模块5中，探测物镜51具有兼顾大视场与高分辨率的特点，在本实施例中以英国MesolensLtd公司的产品Mesolens为例，该物镜在保证视场为5mm的同时数值孔径在0.47，因此在探测绿色荧光时理论横向分辨率可达0.7μm。由于在此专利中可以不考虑物镜的尺寸，且不用为无穷远矫正，相似参数的物镜亦可通过自行设计实现。样品45发射的荧光经过物镜51成像到像面560，通过第六透镜520后为平行光，经过电动变焦透镜53与第二扫描振镜的扫描同步变焦后，样品不同深度的信号均通过第七透镜521成像在像面561，经过第五扫描透镜522后入射到第三扫描振镜54上，经过与第一扫描振镜310的同步反向扫描之后，面信号被还原为线信号，由聚焦透镜523聚焦到线阵相机55的靶面上。如图6-8所示，图6为照明物镜440和441入瞳处的光斑示意图，静态光斑经第一扫描振镜310扫描形成扫描光斑；图7为探测物镜51背瞳面的光斑示意图，由于探测物镜垂直于照明物镜，静态光斑在探测物镜背瞳面处为一条线，经第一扫描振镜310扫描后，形成面状照明；图7为线探测器靶面处的光斑示意图，经过第三扫描振镜54扫描后，面状照明光斑被还原为线状光斑，且由聚焦透镜523聚焦在线探测器靶面。因此只有照明光束中心激发产生的荧光能够被探测器探测，而由于样品散射产生的杂散光以及贝塞尔光的旁瓣作用将被探测器滤除，达到减少成像靶面的同时提升成像效果的目的。
探测物镜51的分辨率为0.7μm视场为5mm，依据奈奎斯特采样定律，探测器单一方向需要的像素数为5mm/0.35μm＝14285，因此线探测器的靶面像素至少为14285*1。若采用面探测器则至少需要14285*14285个像素，因此本方案极大减少了对探测器靶面的需求，降低了成本。具体地，本实施例采用雪崩光电二极管(Avalanchephotodiode，APD)线阵列作为探测器，其像素数量为定制的15000*1，且能采集的信号分区域独立读出。为达到高速成像的目的，其成像像素等分为15个区域同步独立读出，每个区域1000个像素，其成像速率可达到100kHz。最终将读出的行图像与第一扫描振镜和第三扫描振镜的驱动信号相同步，以还原出二维面图像，最终面成像像素为15000*15000，速度可达66Hz，如图9所示，左侧为线探测器同步探测得到的线图像经过拼接还原成为面图像，右侧则为第一扫描振镜310和第三扫描振镜54的扫描时序。在同一个扫描周期内，线探测器获取的连续线图像，均匀的重新排布拼接为面图像，即第一和第三扫描振镜的一个扫描周期内获取的图像为一帧完整的二维面图像。在二维成像模式下，第二扫描振镜311的角度保持为45度，电动变焦透镜53的屈光度保持为0度，此时只探测样品某一固定深度平面的荧光信号，获取二维图像成像速度为66帧每秒。在三维成像模式下，第二扫描振镜311与电动变焦透镜同步扫描，扫描速度为3Hz，此时探测一定深度内所有的荧光信号，每个三维体图像由22个面图像构成，三维成像速度为3个三维体每秒。
具体地，***的控制时序如图10所示，从上至下第一个时序图为线探测器310时序图，每一个触发信号采集一条线，为1000*15＝15000个点像素，在一个二维图像采集周期内，一共有15000个触发信号，则最终图像为15000*15000像素；第二个时序图为第一扫描振镜310时序，每个扫描周期内上升沿为有效扫描时间，下降沿为振镜从扫描边界回到扫描零偏位置的时间；第三个时序图为第三扫描振镜54的时序，其与第一扫描振镜完全同步，且扫描方向相反；第四个时序图为第二扫描振镜311的时序，该振镜一个扫描周期内包含22个第一和第三振镜的扫描周期，即一次轴向扫描包含22个二维扫描面；第四个时序图为变焦透镜53的时序图，该器件的时序与第二扫描振镜完全相同，以保证光片平面扫描到不同深度时探测物镜51焦平面始终位于照明平面。***的控制时序并非唯一，可以根据实际需求进行调整，如增加或减少一个第二扫描振镜周期内的第一扫描振镜周期数，以及增加或减少一个第一振镜扫描周期内线探测器触发信号数。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种高速大视场数字扫描光片显微成像***，其特征在于，包括按照光路依次设置的光源模块(1)、横向视场扩展模块(2)、扫描模块(3)、照明模块(4)和探测模块(5)，所述光源模块(1)产生的光经过横向视场扩展模块(2)以获得扩展最终照明区域的有效视场，所述扫描模块(3)将从横向视场扩展模块(2)接收的线光束扫描成为面光束；
所述照明模块(4)包括分束镜(41)、第一照明物镜(440)、第二照明物镜(441)、光束偏折中继***和样品(45)，所述分束镜(41)将所述扫描模块(3)的面光束光束分为两路，其中一路直接经第一照明物镜(440)聚焦到样品(45)上进行荧光激发；另一路经过光束偏折中继***后再经过第二照明物镜(441)聚焦到样品(45)上进行荧光激发；
所述探测模块(5)包括大视场高分辨物镜(51)、第六透镜(520)、变焦透镜(53)、第七透镜(521)、第五扫描透镜(522)、第三扫描振镜(54)、线探测器(55)和聚焦透镜(523)，所述大视场高分辨物镜(51)用于收集经过照明模块(4)双路激发的荧光，所述大视场高分辨物镜(51)、第六透镜(520)、变焦透镜(53)、第七透镜(521)、第五扫描透镜(522)、第三扫描振镜(54)、聚焦透镜(523)和线探测器(55)依次设置。
2.根据权利要求1所述的高速大视场数字扫描光片显微成像***，其特征在于，所述光源模块(1)包括依次设置的激光器(11)、准直透镜(12)和第一反射镜(13)。
3.根据权利要求2所述的高速大视场数字扫描光片显微成像***，其特征在于，所述横向视场扩展模块(2)包括依次设置的空间光调制器(21)、第一透镜(230)、掩膜版(22)、第二透镜(231)和第三透镜(232)，所述空间光调制器(21)用于接收第一反射镜(13)反射的光束。
4.根据权利要求2所述的高速大视场数字扫描光片显微成像***，其特征在于，所述横向视场扩展模块(2)包括依次设置的第五反射镜(24)、电动液体变焦透镜(25)、第八透镜(260)和第九透镜(261)，所述第五反射镜(24)用于接收第一反射镜(13)反射的光束。
5.根据权利要求3或4所述的高速大视场数字扫描光片显微成像***，其特征在于，所述第二透镜(231)和第三透镜(232)组成第一4f中继***，所述第八透镜(260)和第九透镜(261)组成第四4f中继***。
6.根据权利要求5所述的高速大视场数字扫描光片显微成像***，其特征在于，所述扫描模块(3)包括依次设置的第一扫描振镜(310)、第一扫描透镜(320)、第二扫描透镜(321)、第二扫描振镜(311)、第三扫描透镜(322)以及第四扫描透镜(323)，所述第一扫描透镜(320)和第二扫描透镜(321)组成第二4f中继***，所述第三扫描透镜(322)和第四扫描透镜(323)组成第三4f中继***。
7.根据权利要求6所述的高速大视场数字扫描光片显微成像***，其特征在于，所述光束偏折中继***包括依次设置的第二反射镜(420)、第四透镜(430)、第三反射镜(421)、第五透镜(431)和第四反射镜(422)，所述第四透镜(430)和第五透镜(431)组成第四4f中继***。
8.根据权利要求7所述的高速大视场数字扫描光片显微成像***，其特征在于，第一扫描振镜(310)的镜面、第二扫描振镜(311)的镜面、第一照明物镜(440)的入瞳面和第二照明物镜(441)的入瞳面四者为共轭面。
9.根据权利要求8所述的高速大视场数字扫描光片显微成像***，其特征在于，所述分束镜(41)为50:50分束镜，第一照明物镜(440)和第二照明物镜(441)为相同型号的物镜且二者的入瞳面共轭。
10.根据权利要求9所述的高速大视场数字扫描光片显微成像***，其特征在于，第二扫描振镜(311)的镜面与入射光线的角度为45度，电动变焦透镜(53)的屈光度为0度。
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