CN116356056A - 用于结核分枝杆菌耐药基因检测的引物组、产品及应用 - Google Patents
用于结核分枝杆菌耐药基因检测的引物组、产品及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及生物技术领域,具体提供一种检测结核分枝杆菌耐药基因突变的引物、产品及应用,本申请能够在核酸质谱平台中同时完成多种治疗结核药物相关16基因53SNP位点的准确检测。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域,尤其是涉及一种用于结核分枝杆菌耐药基因突变检测相关的引物、产品及应用。
背景技术
WHO将耐药结核病分为五类:耐异烟肼结核病、利福平耐药结核病和耐多药结核病,以及准广泛耐药结核病和广泛耐药结核病。
结核病患者一旦出现耐药,预后极差,成为结核病控制工作中亟待解决的难题。WHO于2018年12月出版发行了“MDR-TB和RR-TB治疗指南(2018更新版)”,2019年3月又发布了“耐药结核病治疗指南(2019整合版)”,WHO同时指出,这2个指南是在评估大量最新证据的基础上制定的,将取代之前所有的WHO关于耐药结核病的治疗指南。为更好地推广和使用WHO“MDR-TB和RR-TB治疗指南(2018更新版)”和“耐药结核病治疗指南(2019整合版)”,中华医学会结核病学分会制定了“中国MDR-TB和RR-TB治疗专家共识(2019年版)”。该共识在化学治疗中明确说明在治疗前需进行表型药敏试验(drugsusceptibility testing,DST),包括一线及二线抗结核药物,有条件时应同时采用快速分子药敏检测。并且将长程MDR-TB治疗方案中使用的抗结核药物重新划分为3组:A组:首选药物,包括左氧氟沙星(levofloxacin,Lfx)或莫西沙星(moxifloxacin,Mfx)、贝达喹啉(bedaquilin,Bdq)和利奈唑胺(linezolid,Lzd)。B组:次选药物,包括氯法齐明(clofazinmine,Cfz)、环丝氨酸(cycloserine,Cs)。C组:备选药物,依次为吡嗪酰胺(pyrazinamide,Z)、乙胺丁醇(ethambutol,E)、德拉马尼(delamanid,Dlm)、丙硫异烟胺(protionamid,Pto)、阿米卡星(amikacin,Am)或卷曲霉素(capreomycin,Cm)、对氨基水杨酸(p-aminosalicylic acid,PAS)、亚胺培南/西司他丁(imipenem/cilastatin,Ipm-Cln)或美罗培南(meropenem,Mpm)。该共识明确了左氧氟沙星(levofloxacin,Lfx)或莫西沙星(moxifloxacin,Mfx)、贝达喹啉(bedaquilin,Bdq)和利奈唑胺(linezolid,Lzd)及氯法齐明(clofazinmine,Cfz)等在治疗MDR-TB中的重要地位。目前已有报道出现了这些药物的耐药性,随着这些药物的应用,其耐药性的检测也是迫在眉睫,而目前上市的结核分枝杆菌耐药基因突变检测的产品主要针对利福平与异烟肼耐药,贝达喹啉(bedaquilin,Bdq)和利奈唑胺(linezolid,Lzd)及氯法齐明(clofazinmine,Cfz)等的耐药检测产品目前市场上较少出现;而且目前市场上耐药结核基因突变检测产品的适用样本类型单一,约80%为培养物样本,这样无疑增加了患者等待时间。所以,综合考虑目前市场需求及未来耐药结核患者化学治疗的用药趋势,建立有效、快速、适用样本类型丰富的耐药结核病检测方法是临床合理用药和控制疫情发展的关键。
有鉴于此,提出本申请。
发明内容
本申请的第一个目的在于提供一种用于结核分枝杆菌耐药基因突变检测的特异引物组。
本申请的第二个目的在于提供上述的用于检测结核分枝杆菌耐药基因突变的引物组在制备结核分枝杆菌耐药基因检测产品中的应用。
本申请的第三个目的在于提供一种用于结核分枝杆菌耐药基因突变检测的产品,以补充现有技术中缺少的能够高通量、易操作且低成本的针对结核分枝杆菌耐药基因突变进行检测的产品的技术问题。
本申请的第四个目的在于提供一种检测结核分枝杆菌耐药基因突变的方法,以缓解现有的检测方法通量低、适用样本类型单一、适用抗结核药物较少、价格昂贵等技术问题。
为实现上述目的,本申请具体提供如下技术方案:
本申请首先提供一种用于检测结核分枝杆菌耐药基因突变的引物组,所述指标包含多种治疗结核药物相关的16个基因共53个SNP位点。
进一步地,所述结核分枝杆菌耐药基因突变位点详见表1。
进一步地,所述引物组包括48条PCR扩增引物,其序列如SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.48所示,或者与SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.48具有至少85%同一性。
进一步地,所述引物组还包括55条UEP延伸引物,其序列如SEQ ID NO.49-SEQ IDNO.103所示,或者与SEQ ID NO.49-SEQ ID NO.103具有至少85%同一性。
进一步地,所述引物组还包括2条内参扩增引物,序列如SEQ ID NO.35-SEQ IDNO.36所示,或者与SEQ ID NO.35-SEQ ID NO.36具有至少85%同一性。
进一步地,所述内参引物组还包括SEQ ID NO.73所示的延伸引物,或者与SEQIDNO.73具有至少85%同一性。
进一步的,所述引物进行分组完成目的基因的PCR扩增;
优选的,分为3个PCR扩增体系,分别为组1-3:组1:包括36种PCR引物,其序列如SEQID NO.1-36所示,或者与SEQ ID NO.1-36具有至少85%同一性;组2:包括22种PCR引物,其序列如SEQ ID NO.1-6、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQID NO.35-46,或者与SEQ ID NO.1-6、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.17、SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.35-46具有至少85%同一性;组3:包括18种PCR引物,其序列如SEQ IDNO.1-4、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.27、SEQ IDNO.28、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.43、SEQ IDNO.44、SEQ ID NO.47-48,或者与SEQ ID NO.1-4、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQ IDNO.35、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.47-48具有至少85%同一性。
进一步地,所述引物也进行分组完成单碱基延伸;
优选的,分为3个UEP延伸引物体系,对应上述组1和组3:组1:包括25种UEP引物,其序列如SEQ ID NO.49-73所示,或者与SEQ ID NO.49-73具有至少85%同一性;组2:包括17种UEP引物,其序列如SEQ ID NO.73-89所示,或者与SEQ ID NO.73-91具有至少85%同一性;组3:包括15种UEP引物,其序列如SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.90-103所示,或者与SEQ IDNO.73、SEQ ID NO.90-103具有至少85%同一性。
本申请还提供了一种用于结核分枝杆菌耐药基因突变检测的产品,所述产品包括上述的用于检测结核分枝杆菌耐药基因突变的引物组。
进一步地,所述用于结核分枝杆菌耐药基因突变检测的产品还包括用于检测的试剂和/或设备;
优选地,所述试剂包括10×PCR Buffer、dNTP Mix、MgCl2、Primer Mix、PCREnzyme、dUTP、UDG和无核酸酶水;
更优选地,所述设备包括为MassARRAY核酸质谱。
本申请还提供了一种检测结核分枝杆菌耐药基因突变的方法,所述方法包括应用上述的引物组对待测样品中的耐药基因进行检测。
进一步地,应用上述的引物组对待测样品基因组进行PCR扩增及碱基延伸反应,然后应用MassARRAY对反应得到的产物进行检测,确定所述待测样品中的耐药基因突变位点基因型;
优选地,所述方法还包括在碱基延伸反应前对PCR产物进行去磷酸化的步骤;
优选地,所述方法还包括在碱基延伸反应后对所述反应得到的产物进行纯化的步骤,然后再应用MassARRAY检测所述反应产物。
本申请还提供了上述的引物组在制备结核分枝杆菌耐药基因突变检测产品中的应用。
相比于现有技术,本申请具有如下技术优势:
1)本申请通过前期试验对耐药基因和位点进行严谨选择和组合,而在引物设计上,至少包括引物设计思路、筛选、分组等多方面。比如为最大程度的降低多重体系压力,本申请通过设计最少扩增引物(24对),去匹配大量的延伸引物(55条);而在具体引物序列筛选和优化上,本申请对每组引物序列都进行比较优化,同时还巧妙的进行了分组;不仅保证单snp的最优检出,还保证多重体系下对样本进行准确、特异和灵敏的检出,能够实现应用MassARRAY***同时对待测样品中的多结核分枝杆菌耐药基因突变快速有效检测;
2)本申请体系实现了在同一平台,同时完成多种治疗结核药物相关的16个基因共53个SNP位点的有效检测,准确性高,灵敏度高,能够极大的缩短检测周期,同时降低检测成本,并且,检测结果可以为结核分枝杆菌耐药情况提供参考依据;
3)本申请提供的检测结核分枝杆菌耐药基因突变的方法,包括应用上述的引物组检测待测样品中结核分枝杆菌耐药基因突变。该方法应用本申请提供的引物组能够对多种治疗结核药物相关的16个基因共53个SNP位点进行检测,具有准确性强、灵敏度高、重复性好、成本低、检测周期短、结果直观等特点;
4)本申请将飞行时间质谱平台运用于多种治疗结核药物相关SNP位点的检测中,具有广谱适用性,极大提高了检测效率,特别适用于批量检测。本申请克服了现有技术中PCR重数低的缺陷,且成本低廉,适用于广泛推广;发明适用结核病患者,能够及时检测耐药情况,有利于合理用药,能够改善患者生存质量。
附图说明
为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本申请的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例1提供的alr344位点PCR引物筛选电泳图。其中M:代表Marker,从上到下条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp;1:代表模板为结核分枝杆菌扩增产物;2:代表空白对照;alr344-1:代表引物组合1扩增产物;alr344-2:代表引物组合2扩增产物;alr344-3:代表引物组合3扩增产物。
图2为本申请实施例1提供的inhA94位点PCR引物筛选电泳图。其中,M:代表Marker,从上到下条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp;1:代表模板结核分枝杆菌扩增产物;2:代表空白对照;inhA94体系1:代表引物组合1扩增产物;inhA94体系2:代表引物组合2扩增产物。
图3为本申请实施例1提供的inhA94启动子区域PCR引物筛选电泳图。M:代表Marker,从上到下条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp;1:代表模板结核分枝杆菌扩增产物;2:代表空白对照;inhA-1:代表引物组合1扩增产物;inhA-2:代表引物组合2扩增产物;inhA-3:代表引物组合3扩增产物。
图4为本申请实施例1提供的embB497-1位点UEP引物优化前后质谱图。
图5为本申请实施例1提供的rpob526-2位点UEP引物优化前后质谱图。
图6为本申请实施例3提供的TB61样本ahpC-10位点质谱图及sanger测序结果图。
图7为本申请实施例1提供的TB109样本embB306-1位点质谱图及sanger测序结果图。
图8为本申请实施例1提供的TB28样本rpob511-2位点质谱图及sanger测序结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本申请,而不应视为限制本申请的范围,并且所述实施例是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本申请保护的范围。
本申请中MassARRAY基因分析技术是基于MALDT-TOF飞行时间质谱,先通过PCR扩增对目的基因进行富集,延伸引物在目的片段上延伸1个碱基,最终通过比较单碱基延伸产物质量的差异可得出所检测位点的基因型。
下面通过具体的实施例进一步说明本申请,但是,应当理解为,这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用,而不应理解为用于以任何形式限制本申请。
本申请实施例中用到的主要试剂信息如下:
本申请实施例中用到的主要仪器信息如下:
实施例1本申请反应体系建立
通过前期试验探索,同时结合临床需求,本申请最终确定结核分枝杆菌耐药基因突变的检测范围,涵盖了多种治疗结核药物相关的16个基因共53个SNP位点的检测,具***点信息详见表1。
表1耐药基因突变位点详情:
进一步的,本申请通过设计和优化确立适用于各SNP位点核酸质谱检测的PCR和UEP引物。为兼顾多重体系的灵敏度和特异性,本申请从多方面进行考量:比如考虑体系压力,将邻近的位点采用同一对引物进行扩增,尽量设计较少的扩增引物对;为保证每个位点的检测特异性和灵敏度,对每个位点的引物进行比较优化;为避免引物间的干扰,按照位点之间相互影响低的要求进行分组(并非简单划分)。
关于优化设计方面,示例性的实验如下:
1、alr344位点、inhA94位点、inhA启动子区域PCR引物筛选为例(筛选特异性好、扩增效率优的引物)
为了保证各个位点的检出,本申请对各个位点的PCR扩增引物进行了筛选与优化,以alr344位点、inhA94位点、inhA启动子区域PCR扩增引物筛选为例,前期每个位点分别设计2-3组PCR扩增引物(引物信息见下表2),然后按照上述步骤的PCR扩增步骤进行PCR扩增反应,反应结束后,对PCR扩增产物进行电泳检测,检测结果如图1-3所示。
表2alr344位点、inhA94位点、inhA启动子区域PCR引物信息:
从图1可以看出,针对alr344位点区域设计的3组PCR引物,分别对结核分枝杆菌核酸模板进行扩增,第1组引物无目的扩增条带,第2组与第3组引物均存在目的扩增条带,但第2组引物扩增条带亮度明显弱于第3组引物,说明第2组引物的扩增效率低,所以针对alr344位点区域,本申请选择第3组引物作为最终的PCR扩增引物。
从图2可以看出,针对inhA94位点区域设计的2组PCR引物,分别对结核分枝杆菌核酸模板进行扩增,第1组引物与第2组引物虽然均存在目的扩增条带,而且条带亮度几乎无差异,但第1组引物,在1000-2000bp之间存在非特异条带,所以针对inhA94位点区域,本申请选择第2组引物作为最终的PCR扩增引物。
从图3可以看出,针对inhA启动子区域设计的3组PCR引物,分别对结核分枝杆菌核酸模板进行扩增,第1组引物与第2组引物均无目的扩增条带,只有第3组引物存在目的扩增条带,所以针对inhA启动子区域,本申请选择第3组引物作为最终的PCR扩增引物。
2、以embB497-1、rpob526-2位点的UEP延伸引物优化为例(不同UEP引物对特异性以及延伸效率的影响)
为了提高检测灵敏度及特异性,本申请不仅对各位点的PCR扩增引物组合进行了筛选与优化,还对UEP延伸引物也进行了优化。在前期的合管研究中,本申请发现个别位点的UEP延伸引物会出现延伸效率低或产生非特异的情况,对此本申请设计了不同的UEP延伸引物进行对比测试。
embB497-1位点的UEP延伸引物(5’-TCCTGACCGTGGTGTTCGCCGAC-3’)在检测embB497CAG>AAG突变质粒时,其embB497-1位点会出现为C碱基非特异;重新设计UEP之后(5’-CCCTGACCGTGTGGTTCGCTGAC-3’),再检测embB 497CAG>AAG突变质粒时,其embB497-1位点则没有出现C碱基非特异情况,结果如图4所示;从图4中可以看出,调整embB497-1位点UEP引物之后,检测embB 497CAG>AAG突变质粒时,embB497-1位点可以准确检测出A碱基,而且无C碱基的非特异延伸,所以,最终本申请选择调整之后embB497-1位点UEP引物(5’-CCCTGACCGTGTGGTTCGCTGAC-3’)为该位点最终的UEP引物。
rpob526-2位点的UEP延伸引物(5’-TGCAGCGCCGACAGTCGGCGCTTG-3’)检测临床样本TB-123时,发现rpob526-2位点无延伸产物,这条UEP的延伸效率极差;重新设计rpob526-2位点的UEP引物(5’-GGAACCCGCTCGTGGGGTTGACCC-3’)之后,检测同样的临床样本TB123,检测结果如图5所示,从图5可以看出,换UEP之后,526-2位点存在A碱基的延伸产物,检测结果显示rpob526-2位点为A碱基,这与sanger测序结果一致,而且延伸效率接近1.0,所以,本申请选择调整之后的rpob526-2位点UEP引物(5’-GGAACCCGCTCGTGGGGTTGACCC-3’)为该位点最终UEP引物。
通过上述实验,最终确立本发明的引物体下如下表3和表4。
表3PCR扩增引物对应表:
表4UEP延伸引物对应表:
3引物的分组优化
本申请涉及的耐药基因检测SNP位点,个别基因SNP位点分布较近,如rpob基因,该基因涉及的突变检测SNP位点,比较集中,均分布在507-533之间的81bp,而且如526CAC>TAC、526CAC>GAC等相邻2个碱基存在突变,如果这些位点均位于同一管体系中,那么引物之间的互相影响以及对模板的竞争,均会比较大,会直接影响检测灵敏度,为尽量避免引物之间的干扰,本申请根据基因、位点的距离进行了分组优化。具体分如下3组:组1包括SEQ IDNO.1-36扩增引物;组2包括SEQ ID NO.1-6、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.35-46扩增引物;组3SEQ ID NO.1-4、SEQ ID NO.7-8、SEQ IDNO.11-12、SEQ ID NO.27-28、SEQ ID NO.31-32、SEQ ID NO.35-36、SEQ ID NO.43-44、SEQID NO.47-48扩增引物。进一步的,组1还包括SEQ ID NO.49-73延伸引物;组2还包括SEQ IDNO.73-89引物延伸;组3还包括SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.90-103延伸引物。
实施例2本申请最低检测限确认
本实施例确认最优反应体系后,每个检测位点利用由生工生物工程(上海)股份有限公司合成的质粒、结核分枝杆菌利福平耐药基因检测试剂用国家参考品及结核分枝杆菌异烟肼耐药基因检测试剂用国家参考品进行最低检测限确认试验。
验证方案如下:
(1)将本申请检测涉及的各位点的野生型以及突变型合计约103种已知浓度的质粒梯度稀释至50copies/μL、10copies/μL、5copies/μL三个梯度,每个梯度重复检测2次;将可以100%检出的最低浓度作为该产品的最低检测限,然后在该浓度下,重复检测5次,5次全部检出,则可确定该浓度为该产品的最低检测限。具体验证过程为:首先按照本申请实施例1提供的体系加量表配制扩增引物MIX和延伸引物MIX,然后按照实施例1中的操作步骤,分别进行PCR扩增、SAP消化、单碱基延伸和质谱检测分析,最终本申请的质粒最低检测限为10copies/μL。
(2)国家参考品最低检测限
最低检测限国家参考品信息见下表5所示。
表5最低检测限国家参考品信息:
a.单细胞耐药最低检测限
单细胞耐药菌液参考品(94002’、94023’)检测前,按不同细菌含量稀释至1×104个菌/mL、3×103个菌/mL、103个菌/mL三个梯度,每个梯度重复检测2次;将可以100%检出的最低浓度作为该产品的最低检测限,然后在该浓度下,重复检测5次,5次全部检出,则可确定该浓度为该产品的最低检测限。具体验证过程为:首先按照本申请实施例1提供的体系加量表配制扩增引物MIX和延伸引物MIX,然后按照实施例1中的操作步骤,分别进行PCR扩增、SAP消化、单碱基延伸和质谱检测分析,最终本申请的检测单细胞耐药国家的最低检测限为3×103个菌/mL。
b.非100%耐药最低检测限
不同比例敏感菌和耐药菌的混合菌液参考品(S和SI/R)检测前,按不同细菌含量和各种耐药比例进行配制,详见下表6。
表6不同比例敏感菌和耐药菌的混合菌液配制:
每个梯度重复检测2次;将可以100%检出的最低浓度作为该产品的最低检测限,然后在该浓度下,重复检测5次,5次全部检出,则可确定该浓度为该产品的最低检测限。具体验证过程为:首先按照本申请实施例1提供的体系加量表配制扩增引物MIX和延伸引物MIX,然后按照实施例1中的操作步骤,分别进行PCR扩增、SAP消化、单碱基延伸和质谱检测分析,最终本申请的检测耐药比例的国家参考品的最低检测限为50%耐药比例及以上且细菌浓度不低于1×103CFU/mL。
实施例3临床样本检测
本实施例在确认最优反应体系后进行了97例临床样本的验证。包括73例分离株培养物样本、17例痰液样本、7例肺泡灌洗液样本。检测结果与sanger测序结果进行比对,其总符合率大于95%则验证通过。
具体的验证方案如下:
首先按照本申请实施例1提供的体系加量表配制扩增引物MIX和延伸引物MIX,然后按照实施例1中的操作步骤,分别进行PCR扩增、SAP消化、单碱基延伸和质谱检测分析,检测结果见下表。
表7临床样本检测结果:
因本发明检测位点较多,故在PCR体系设计优化分析只以部分检测位点为例说明了调试过程。图6-8分别展示了部分临床样本部分位点的检测质谱结果以及sanger测序结果。
综上,经97例样本的MassARRAY结果和Sanger结果的比对可知(表7),本申请的体系验证实验的总符合率为100%,效果超出预期,临床价值非常显著。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明,但本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种用于结核分枝杆菌耐药基因突变检测的引物组,其特征在于,所述引物针对耐药基因SNP位点。
2.根据权利要求1所述的引物组,其特征在于,所述耐药基因包括katG,ahpC,inhA,rpoB,rpsL,rrs,embB,pncA,gyrA,gyrB,thyA,Rv0678,eis,alr,rplC和rrl。
3.根据权利要求1-2任一所述的引物组,其特征在于,所述引物组包括48条扩增引物,其序列如SEQ ID NO.1-48所示。
4.根据权利要求3所述的引物组,其特征在于,所述引物组还包括55条延伸引物,其序列如SEQ ID NO.49-103所示。
5.根据权利要求4所述的引物组,其特征在于,所述引物组中包括内参扩增引物,其序列如SEQ ID NO.35-36所示;所述引物组还包括内参延伸引物,其序列如SEQ ID NO.73示。
6.如权利要求5所述的引物组,其特征在于,所述引物分为3组:
组1包括36条扩增引物,其序列如SEQ ID NO.1-36所示的扩增引物;
组2包括22条扩增引物,其序列如SEQ ID NO.1-6、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.35-46所示;
组3包括18条扩增引物,其序列如SEQ ID NO.1-4、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.11-12、SEQ ID NO.27-28、SEQ ID NO.31-32、SEQ ID NO.35-36、SEQ ID NO.43-44、SEQ ID NO.47-48所示。
7.如权利要求6所述的引物组,其特征在于:
所述组1进一步包括25条延伸引物,其序列如SEQ ID NO.49-73所示;
所述组2进一步包括17条延伸引物,其序列如SEQ ID NO.73-89所示;
所述组3进一步包括15条延伸引物,其序列如SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.90-103所示。
8.一种用于结核分枝杆菌耐药基因突变检测的产品,其特征在于,所述产品包括权利要求1-6任一项所述的引物组。
9.根据权利要求8所述的用于结核分枝杆菌耐药基因突变检测的产品,其特征在于,
所述产品还包括用于检测指标的试剂和/或设备;优选的,所述试剂包括:10×PCRBuffer、dNTP Mix、MgCl2、Primer Mix、PCR Enzyme、dUTP、UDG和无核酸酶水;所述设备为MassARRAY核酸质谱。
10.权利要求1-6任一所述引物组在制备结核分枝杆菌耐药基因突变检测试剂盒中的应用。
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2023
- 2023-04-07 CN CN202310373186.4A patent/CN116356056B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102123621B1 (ko) * | 2019-01-30 | 2020-06-16 | 주식회사 창 헬스케어 | 실시간 중합효소연쇄반응법과 융해온도 측정을 이용한 비결핵균, 결핵균, 및 다제내성결핵균의 검출방법 |
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Non-Patent Citations (1)
Title |
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Also Published As
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---|---|
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