CN112280852B - 一种smn1基因突变检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学诊断领域,具体涉及一种SMN1基因突变的检测试剂盒。在一管长片段PCR反应中利用3种引物专一性扩增SMN1基因蛋白编码区域基因序列,搭配SMN基因测序引物组直接进行测序,只需一次PCR实验即可检测出SMN1基因突变情况,包括:点突变、缺失突变和***突变等,检测技术流程简单,容易实现标准化。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学诊断领域,具体涉及一种SMN1基因突变的检测试剂盒,突变类型主要包括:点突变、缺失突变和***突变等。
背景技术
脊髓性肌萎缩症(SMA)是一种脊髓前角运动神经元退化变性导致肌无力、肌萎缩和瘫痪的疾病,根据发病年龄及临床表现分为Ⅰ型(严重型)、Ⅱ型(中间型)、Ⅲ型(轻型)和Ⅳ型(成人型)。根据发病年龄、临床表现及病情进展程度进行临床诊断,同时可行相关辅助检查方法包括肌电图、肌酶和肌肉活检,结合家族史和 SMN1 基因分析以进行确诊。SMA Ⅰ型为最严重的亚型,患者在出生后6个月内发病,一般生存期在2岁以内;SMA Ⅱ型为中度型,患者通常在6~18个月内发病,其生存期仰赖于外来健康支援照护,可存活至成年;SMAⅢ型为轻度型,患者由出生后18个月至成年都有可能发病,其病情进展较为缓慢,最终仍死于呼吸肌麻痹,SMA Ⅳ型为成人型,30岁后发病,症状轻微,生存期正常。
SMN基因(Survival motor neuron)位于染色体5q11.2~q13.3 上,全长约为27kb,含有9个外显子,分别为外显子1、2a、2b、3、4、5、6、7和8,人基因组有两个紧邻的高度同源的SMN 基因为SMN1基因(survival motor neuron gene 1,运动神经元存活基因1)与SMN2基因(survival motor neuron gene 2,运动神经元存活基因2),两基因序列上仅有5个碱基的差异,其中2个碱基位在第7、8外显子上,另3个碱基则位在内含子6、7中。
SMNl 是主要功能基因,该基因突变可导致 SMA 发病。SMN2为临床表型的调节基因,影响病情的严重程度,其拷贝数增加可减轻SMA 表型。SMN1基因与SMN2基因的第7外显子上存有关键的碱基差异,导致SMN2表达的蛋白无法取代SMN1基因的作用。SMN蛋白广泛分布于全身组织,其表达水平在脑部、脊髓与肌肉组织中最高;SMN基因缺失或突变可使SMN蛋白的数目、结构与功能产生异常从而致病。
SMA的突变(致病)基因型分为三种,最常见的为SMN1基因纯合缺失,由于SMN1 第7号外显子和/或的第8号外显子产生缺失或转换所致,即两个SMN1基因均缺失,此基因型发生率占SMA患者的90-95%;第二种突变基因型为SMN1基因复合杂合突变,即1个SMN1基因缺失,另一个SMN1基因发生致病性微小变异(点突变),此种突变SMN1拷贝数为1,发生率为3-5%,先证患者如果确诊为此种基因型,再生育产品诊断时需格外注意,运用额外的检测技术进行排查;第三种突变基因型也是SMN1基因复合杂合突变,虽然患者拥有两个SMN1基因,但这两个基因皆存在致病性点突变,此种情况较为罕见。
现有多种方法进行SMA遗传学检测,如聚合酶链反应─限制酶片段长度多态性(PCR-RFLP)、变性高效液相分析(DHPLC)、多重连接探针扩增(MLPA) 、高分辨熔解曲线(HRM)、实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time qPCR)等技术,主要用于检测SMA患者SMN1基因纯合缺失的检测,大多检测SMN1和/或SMN2基因在第7外显子的拷贝数,无法检测基因的点突变或者其他外显子的缺失。
对于SMA患者中SMN1基因复合杂合突变的检测,需进行基因拷贝数分析、SMN1靶向序列分析或连锁分析,才能得到基因确诊,其中SMN1靶向序列分析主要在于需准确的识别出SMN1基因的突变,不被SMN2基因干扰影响判读结果。目前主要有几种方法: (1)利用RT-PCR结合克隆与测序进行,但克隆技术操作繁琐、耗时,不易实现检测SMN1基因复合杂合突变的检测标准化流程(2)提取RNA,再利用SMN1特异性引物反转录成cDNA,再进行PCR与测序,一样具有操作繁琐耗时问题;(3)另外一种常见方法为透过LR-PCR(Long Range PCR)进行SMN1基因专一性的扩增,再针对各外显子进行第二次PCR扩增与定序,确认SMN1基因点突变的位置,但因SMN1和SMN2基因只有5个核甘酸的差异,专一性的扩增SMN1基因是有难度的,而干扰SMN1基因复合杂合突变检测判读。因此寻求一种新的检测SMN1基因突变的方法,能增加SMN1扩增专一性,简化操作流程,实现突变检测标准化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种SMN1基因突变的检测方法与脊髓性肌萎缩症相关基因核酸检测试剂盒及其应用。
为实现前述发明目的,本发明采用的技术方案包括:
一种SMN1基因长片段PCR扩增反应检测引物,所述引物包含3种不同的引物,
其中第一引物为黏合SMN1与SMN2第1外显子上游区域的通用引物,第二引物特异性黏合SMN1第8外显子序列;第三引物特异性黏合SMN2第8外显子的差异位点区域,同时第三引物5’端包含非人源性基因组序列。
第二引物的3’端末端碱基分别与SMN1第8外显子的差异位点保持一致,同时第二引物的3’端倒数第二个或第三个碱基引入错配碱基。
第三引物3’端进行双脱氧碱基修饰,或磷酸化修饰。图1为引物设计示意图。
所述引物包含:
第一引物SEQ ID No.1:5'- ATAGCTGAGCGTGGTGGCGCACGC-3'
第二引物SEQ ID No.2:5'- TGCTGGCCTCCCACCCCCACTC-3'
第三引物SEQ ID No.3:5'-ACGCACGCTCCTGCACAGCCTCTGCTGGCCTCCCACCCCCACCT-3'
其中画单线为非人源性基因组序列。
进一步地,将所述SMN1基因长片段PCR扩增反应检测引物应用于制备脊髓性肌萎缩症相关基因核酸检测试剂盒中:所述检测试剂盒,组成成分包括LR反应液、SMN1引物混合液、DNA聚合酶、SMN测序引物;
所述SMN1引物混合液中包含SEQ ID No.1~3引物组合获得;
所述SMN测序引物,包含SEQ ID No.4~ SEQ ID No.11。
所述LR反应液中包含增强剂,所述增强剂包括甜菜碱、二甲基亚砜、甘油或乙二醇中的一种或多种;
所述SEQ ID No.4~ SEQ ID No.11序列如下:
SEQ ID No.4:5'-AGGTGGGAGGATCGCTTGAGC-3';
SEQ ID No.5:5'-AAGATGACTCTTGGTACTAACATAC-3';
SEQ ID No.6:5'-CTAATGTTACAGAGAGGTTG-3';
SEQ ID No.7:5'-TTCCAAATCTCTACCCTCTATCCT-3';
SEQ ID No.8:5'-AACAGTATACACAGTTGTCAGT-3';
SEQ ID No.9:5'-TTGTCATTTGACTTATGAGTCTG-3';
SEQ ID No.10:5'-AGACCAGTCTGGGCAACATAGC-3';
SEQ ID No.11:5'-TCAAGCTCCAGGTCTCAAGTGATC-3'。
本发明的有益效果在于:
(1)透过特殊引物设计,提高检测特异性:
第二引物的3’端末端碱基分别与SMN1第8外显子的差异位点保持一致,同时第二引物的3’端倒数第二个或第三个碱基引入错配碱基,与第一引物进行长片段扩增,能专一性的扩增SMN1基因;
在同一管PCR反应中,包含第三引物能专一性的结合SMN2第8外显子的差异位点,同时此引物的3’端进行双脱氧碱基,或磷酸化修饰,以阻止SMN2基因的扩增,加上5端具非人源基因组序列,使第三引物的退火温度高于第二引物的退火温度,所以在此条件下第三引物优先与SMN2基因结合,不与SMN1基因结合,而使第二引物更能有效的结合SMN1基因,因此第三引物可避免SMN2基因干扰之后SMN1基因的突变测序结果。
(2)检测灵敏度高,操作简便:利用本发明的SMN1长片段扩增的特殊引物设计,无须进行第二次PCR扩增,可直接利用测序引物,进行SMN1基因蛋白质编码区序列进行测序,以实现SMN1基因突变的标准化检测。同时DNA加样量为25-300ng,灵敏度高,样本浓度低至5ng/ul,依旧能准确检测出SMN1基因的突变。
(3)提高诊断率,满足临床需求:目前市售SMN基因检测试剂主要检测SMN基因拷贝数,占90-95% SMA患者的检出率,以此发明应用的试剂盒,可检测5-10%的SMN1基因复合杂合突变,提高诊断率,满足临床需求。
附图说明
图1为引物设计示意图。
图2为长片段PCR产物的电泳结果图。
图3为以长片段PCR为模板,针对第7外显子定序结果图。
图4为SMN基因正常型与SMN1基因c.22_23insA复合杂合突变检测结果。
具体实施方式
实施例1
1、LR反应液与SMN1引物混合液配制
表1 LR反应液组份配制表
表2 SMN1引物混合液组份配制表
实施例2 长片段PCR扩增与SMN1基因外显子定序
1、样本处理:核酸提取仪(MagCore)以及核酸提取试剂盒(MagCore Genomic DNAWholeBlood Kit) 提取人类基因组DNA用于后续的PCR反应,DNA浓度为5ng/uL~60ng/uL,OD260nm/OD280nm的比值在1.6-2.0之间。
2、扩增试剂配制:
(1)从试剂盒取出LR反应液、SMN1引物混合液,于室温解冻,上下颠倒混匀后,用微量离心机短暂离心,使所有液体沉降于管底。
(2)扩增试剂配制:按下表3配制扩增试剂
表3 扩增试剂配制表
* 为了减少分液误差,建议在配制扩增试剂时根据样本数量(n)分别取(n+1)人份的反应液和混合酶。
(3)将配制好的试剂用震荡器震荡均匀,用微量离心机短暂离心,使液体沉降于管底。
(4)在PCR反应管中分别加入95μL配制好的扩增试剂,转移到样本处理区加样。
3、加样:在对应的含有95μL 的扩增试剂的PCR反应管中分别加入5μL待测样本基因组DNA,盖上PCR反应管盖后,短暂离心。
4、PCR扩增与琼脂糖凝胶电泳分析:
(1)将PCR反应管放入PCR仪按表4方法设定反应程序,反应体积设定:100μL;
表4 扩增反应程序
(2)琼脂糖凝胶电泳分析:PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,确定扩增片段大小与预期目的片段大小一致(如图2),目的条带大小为27985kbp。
5、SMN1基因外显子定序:
PCR产物纯化后采用ABI公司BigDye3 .1测序试剂盒,在ABI公司 3130基因测序仪以SMN测序引物直接进行测序,用Chromas软件将测序结果与GeneBank中的正常参考序列进行比对分析,确定基因突变位点。
6、结果分析
(1)针对SMN1和SMN2基因在第7外显子的差异位点进行分析,以确认长片段PCR扩增产物皆为SMN1基因,证实长片段PCR的专一性,只扩增出SMN1基因,如图3。
(2)将SMN测序引物针对长片段PCR扩增产物直接测序的结果与SMN1基因参考序列(NG_008691.1)比对,分析待测样本的测序结果。
(2)样本A与样本B分别为SMN基因正常型与SMN1基因c.22_23insA复合杂合突变,经由长片段扩增后并直接测序后发现,结果一致,如图4,可见样本B多了A的***。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学
<120> 一种SMN1基因突变检测试剂盒及其应用
<130> 11
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atagctgagc gtggtggcgc acgc 24
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgctggcctc ccacccccac tc 22
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acgcacgctc ctgcacagcc tctgctggcc tcccaccccc acct 44
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aggtgggagg atcgcttgag c 21
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aagatgactc ttggtactaa catac 25
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctaatgttac agagaggttg 20
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ttccaaatct ctaccctcta tcct 24
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aacagtatac acagttgtca gt 22
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ttgtcatttg acttatgagt ctg 23
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
agaccagtct gggcaacata gc 22
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tcaagctcca ggtctcaagt gatc 24
Claims (2)
1.一种用于检测SMN1基因点突变、缺失突变、***突变的引物,其特征在于:所述引物包含3种不同的引物,
其中第一引物为黏合SMN1与SMN2第1外显子上游区域的通用引物,第二引物特异性黏合SMN1第8外显子序列;第三引物特异性黏合SMN2第8外显子的差异位点区域,同时第三引物5’端包含非人源性基因组序列;
所述第二引物的3’端末端倒数第1个碱基与SMN1第8外显子序列保持一致,同时第二引物的3’端倒数第2个碱基引入错配碱基;
第三引物3’端进行双脱氧碱基修饰,或磷酸化修饰;
所述引物包含以下序列:
第一引物SEQ ID No.1:5’-ATAGCTGAGCGTGGTGGCGCACGC-3’;
第二引物SEQ ID No.2:5’-TGCTGGCCTCCCACCCCCACTC-3’;
第三引物SEQ ID No.3:
5’-ACGCACGCTCCTGCACAGCCTCTGCTGGCCTCCCACCCCCACCT-3’;
其中画单线为非人源性基因组序列。
2.一种如权利要求1所述引物在制备脊髓性肌萎缩症相关基因核酸检测试剂盒中的应用,其特征在于:所述检测试剂盒,组成成分包括LR反应液、SMN1引物混合液、DNA聚合酶、SMN1测序引物;
所述SMN1引物混合液中包含权利要求1中所述的第一引物、第二引物、第三引物;
所述SMN1测序引物,包含SEQ ID No.4~SEQ ID No.11所示的引物;
所述LR反应液中包含增强剂,所述增强剂包括甜菜碱、二甲基亚砜、甘油或乙二醇中的一种或多种;
所述SEQ ID No.4~SEQ ID No.11序列如下:
SEQ ID No.4:5’-AGGTGGGAGGATCGCTTGAGC-3’;
SEQ ID No.5:5’-AAGATGACTCTTGGTACTAACATAC-3’;
SEQ ID No.6:5’-CTAATGTTACAGAGAGGTTG-3’;
SEQ ID No.7:5’-TTCCAAATCTCTACCCTCTATCCT-3’;
SEQ ID No.8:5’-AACAGTATACACAGTTGTCAGT-3’;
SEQ ID No.9:5’-TTGTCATTTGACTTATGAGTCTG-3’;
SEQ ID No.10:5’-AGACCAGTCTGGGCAACATAGC-3’;
SEQ ID No.11:5’-TCAAGCTCCAGGTCTCAAGTGATC-3’。
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