CN105154543A - 一种用于生物样本核酸检测的质控方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生化检测技术，尤其涉及一种用于生物样本核酸检测的质控方法。包括以下步骤：1)采集多个待测生物样本并提取样本DNA备用；2)制备质控DNA以备用，所述质控DNA包括常见纯合型质控DNA、杂合型质控DNA和罕见纯合型质控DNA；3)将样本DNA和质控DNA一起进行基因分型检测；4)以质控DNA的检测结果作为参照进行基因分型分析。本发明的用于生物样本核酸检测的质控方法，可以有效降低最小等位基因频率对检测结果影响程度、有效提高检测准确性。
Description
技术领域
本发明涉及一种生化检测技术，尤其涉及一种用于生物样本核酸检测的质控方法。
背景技术
基因分型(Genotyping)是利用生物学检测方法测定个体基因型(Genotype)的技术，又称为基因型分析(Genotypicassay)，使用技术包括聚合酶链反应(PCR)、DNA片段分析、寡核苷酸探针(ASOprobes)、基因测序、核酸杂交、基因芯片技术等。
SNP，全称SingleNucleotidePolymorphism，是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和***。SNP是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。目前，国内外已有的SNP分型检测技术中有以下几种，高分辨率融解曲线检测法(highresolutionmelting，HRM)、基于芯片技术的SNP分型方法、等位基因特异性扩增法(AmplificationRefractoryMutationSystemRealTimePCR，ARMS-RTPCR)、Taqman荧光探针法、质谱法和高效液相层析法等。
SNP决定群体和个体基因序列的细微差别，科学家可凭此找到疾病的易感基因，并使个体化医疗成为可能。先前的研究证实，人类的大部分疾病，如三分之二的肿瘤可以被预防；而通过基因易感性分析，我们便能够确定特定疾病的高发性人群，以对该群人进行生活或饮食方式的干预、促进其健康。这些研究将会为全人类的疾病预防产生巨大贡献。此外，通过对药物代谢相关基因的SNP研究，还能够阐明不同患者间药物代谢及药效差异的遗传基础，可根据不同患者遗传背景，来优化治疗方案，减少不必要的药物浪费。
核酸相关的检测在医疗领域中以疾病的临床分子诊断最具代表性，其检测快速高效、结果准确率高等优点显而易见，但由于样本量大导致操作步骤易出错、对检测本身的质控手段单一等缺点也逐渐突显出来。另外，最小等位基因频率对于基因分型结果的影响也是显而易见的。最小等位基因频率(MinorAlleleFrequency，MAF)通常是指在给定人群中的不常见的等位基因发生频率，例如AA、Aa、aa三个基因型，在人群中A的频率＝0.9，a的频率＝0.1，则等位基因a就为最小等位基因(也称为罕见基因)，MAF＝0.1，等位基因A称为常见基因。那么以100个样本为例，在基因分型检测过程中，理论上存在81个、18个和1个样本分别聚成三个聚类，由于三个聚类中样本数量的明显差异，实际分析过程中聚类结果的准确性受到重要影响，可以预见的是，MAF值越低，聚类结果的准确性越低，基因分型结果的准确性也就越低，而目前没有较好的质控方法来解决这一问题。
有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加以研究创新，以期创设一种用于生物样本核酸检测的质控方法，使其更具有产业上的利用价值。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种可以有效降低最小等位基因频率对检测结果影响程度、有效提高检测准确性的用于生物样本核酸检测的质控方法。
本发明的用于生物样本核酸检测的质控方法，包括以下步骤：
1)采集多个待测生物样本并提取样本DNA备用；
2)制备质控DNA以备用，所述质控DNA包括常见纯合型质控DNA(CC样本)、杂合型质控DNA(CR样本)和罕见纯合型质控DNA(RR样本)，所述常见纯合型质控DNA为包含所有待检SNP位点DNA模板的混合物、且其DNA模板的基因型均为纯合的常见基因；所述杂合型质控DNA为所有待检SNP位点DNA模板的混合物、且其DNA模板的基因型均为杂合型；所述罕见纯合型质控DNA为所有待检SNP位点DNA模板的混合物、且其DNA模板的基因型均为纯合的罕见基因；其中，C代表Common，R代表Rare，CC表示常见基因纯合型，CR代表杂合型，RR代表罕见基因纯合型。
3)将样本DNA和质控DNA一起进行基因分型检测；
4)以质控DNA的检测结果作为参照进行基因分型分析。
CC、CR和RR样本的作用在于，当对某一SNP位点进行检测时，这三个质控DNA样本在基因分型检测的聚类图上会形成具有参照作用的位置点，辅助分析样本DNA的聚类结果，即使某一SNP位点的MAF值较低，样本DNA的分型结果并不能形成明显的聚类，也可以根据这三个质控DNA样本进行聚类的辅助定位分析，有效降低最小等位基因频率对检测结果影响程度，有效提高检测准确性。
应当说明的是，本发明中的CC、CR和RR样本并不局限于每种一个、共计三个质控DNA，可以根据实际使用需求设置为每种质控DNA大于或等于2个，以提高质控的效果，这样在基因分型检测的聚类图上，每一聚类下存在2个或2个以上的具有参照作用的位置点，相对验证，并辅助分析样本DNA的聚类结果。
进一步的，还包括参照DNA(ReferenceDNA)，所述参照DNA上与待检SNP位点相对应的基因分型信息为已知；所述步骤3)中参照DNA与样本DNA和质控DNA一起进行基因分型检测，所述步骤4)中以参照DNA和质控DNA的检测结果作为参照进行基因分型分析。
参照DNA的作用在于，通过加入已知基因分型信息的DNA，经过基因分型检测分析，将检测结果与已知信息进行核对，以判断实验过程中是否存在污染、错加样等影响实验结果的问题，同时进一步验证CC、CR和RR等质控DNA对于基因分析结果的影响。若参照DNA的检测结果与已知信息一致，则在一定程度上证明质控DNA的有效性。
具体的，所述参照DNA包括至少2种(REF1，REF2等)；应当说明的是，参照DNA设置为2个或2个以上，其目的在于形成相互间的对照，若两个参照DNA的结果均与已知基因分型信息一致，则质控DNA、以及整体实验方案的有效性可得到进一步验证，若部分参照DNA的结果与已知基因分型信息一致，则需同时考虑参照DNA已知信息的准确性和整体实验方案的有效性，其中已知信息的准确性可通过对参照DNA的进一步测序得到验证，若所有参照DNA的结果与已知基因分型信息均不一致，则整体实验方案需要进一步核查。
进一步的，还包括空白对照DNA(NTC，notemplatecontrol)，所述空白对照DNA与样本DNA和质控DNA一起进行基因分型检测。应当说明的是，该NTC样本在基因分型检测结果中，应当体现为无荧光、不聚类，若其结果发生变化，则表明整体实验过程可能发生了污染，需要重新取样。
进一步的，所述质控DNA经过以下步骤获得：
S1、扩增：采集目标样本的DNA，通过PCR扩增待检SNP位点的基因片段；
S2、连接：将基因片段与载体连接转化入细菌中培养；
S3、测序：挑选菌落后，PCR扩增测序，若测序结果为纯合基因型，则进行下一步碱基突变扩增、以获得不同等位基因的DNA模板，若测序结果为杂合基因型，则挑选不同等位基因的DNA模板备用；
S4、碱基突变扩增：挑选上述检测结果为纯合基因型的菌落，加入碱基突变引物进行PCR扩增，以获得相对等位基因的DNA模板备用；
S5、制备：将每一待检SNP位点的不同等位基因的DNA模板按基因型分别收集或混合为单一位点DNA模板，所述质控DNA模板由相同基因型下的所有单一位点DNA模板混合而成，所述基因型包括纯合的常见基因、杂合型和纯合的罕见基因三种。
进一步的，所述载体为质粒；应当说明的是，本发明中的载体是指，能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子，应当包括并不限于质粒、噬菌体和病毒，凡是实现将扩增后基因片段转化入培养生物中进行培养的，均应落入本发明的保护范围。在本发明中，为了简化实验过程和提高实验过程的稳定性，较为优选的，采用质粒作为扩增后基因片段的载体。
进一步的，为了实现高通量检测，所述基因分型检测采用TaqMan荧光探针法，除了TaqMan探针法，还可使用SNPtype的方法，或者自己定制设计的检测方法。
若采用96孔板对生物样本进行TaqMan探针法的基因分型检测，且同时采用质控DNA、参照DNA和空白对照DNA，则96孔板中的3个孔可分别放入CC、CR和RR样本，2个孔放入参照DNA，1个孔放入空白对照DNA，剩下90个孔放入样本DNA。
除上述质控方法外，在实际分析过程中还应包括但不限于以下方面的质控：
1)板质控：若3个质控DNA(CC、CR和RR)、以及2个参照DNA(REF1、REF2)中出现任意一个的任意一个SNP位点的检测结果与预期不符，则需要重新返回检测原始结果。在排除使用Assay以及质控/参照样本无误前提下，则判定为单次实验的质控问题，需要重新校验、甚至重新采样。
2)样本质控：任意一个样本如果含2个以上位点未检出或者出现一定数量的分型结果质量较低(如>10％)，则判定该样本失败，需考虑重新取样；
3)针对已获得的检测数据，进行SNP的MAF计算，与原始数据库进行比对，校验探针以及实验结果的准确性；还可以考虑其他通用的分析方案，比如基于Hardy-Weinberg平衡的检测分析，以确认选取SNP的有效性；
4)对样本DNA的检测结果与板内任意一个样本DNA的检测结果进行对比，理论上不可能出现一模一样的检测结果，有则判定样本DNA错误或需检查是否确为同一人或生物；同时采取交叉检验，检测结果会与数据库内已有的样本检测结果进行对比，方法同上，理论上不可能出现一模一样的检测结果，有则判定样本错误或需检查是否确为同一人或生物；
5)探针质控：CC、CR、RR这三个质控DNA也具有验证探针是否工作的功能，如果三个质控DNA其中任意一个不工作，那么存在两种可能性，其一为质控DNA错误，其二为购买或者合成的assay出现问题；
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
由于设置有CC、CR和RR样本，当对某一SNP位点进行检测时，这三个质控DNA样本在基因分型检测的聚类图上会形成具有参照作用的位置点，辅助分析样本DNA的聚类结果，即使某一SNP位点的MAF值较低，样本DNA的分型结果并不能形成明显的聚类，也可以根据这三个质控DNA样本进行聚类的辅助定位分析，有效降低最小等位基因频率对检测结果影响程度，有效提高检测准确性。这种质控方法对低MAF(0.3以下)的SNP位点作用更明显。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是本发明中质控SNPs位点rs16980426的基因分型效果图；
图2是本发明中加有CC、CR、RR基因型DNA的质控SNPs位点rs16980426的基因分型效果图；
图3是本发明中加有ReferenceDNA的质控SNPs位点rs5400的基因分型效果图；
图4是本发明中加有CC、CR、RR基因型DNA和两个ReferenceDNA的质控SNPs位点rs5400的基因分型效果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例一
本发明提供一种质控DNA的制备方法，以应用于生物样本的核酸检测过程，包括以下步骤：
1、DNA模板的获取：
S1、根据实验要求设计引物；
S2、以人的基因组DNA作为模板，配置合适的PCR体系；按如下条件进行PCR反应：首先，将混合好的反应物在PCR仪中，在94℃下，反应4min，然后依次经94℃，30s；60℃，30s；75℃，1min进行反应35个循环，接着，在75℃，反应7min，然后在4℃下贮存；
S3、吸取一定量的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳：若条带单一，将PCR产物进行纯化回收；若条带不单一，将PCR产物进行胶回收；
S4、对纯化后的PCR产物在一定条件下进行连接转化；涂板后，在37℃过夜培养；
S5、挑菌，然后进行菌落PCR，其程序为：首先，样品在94℃反应3min；然后依次经94℃、30s；65℃，30s；70℃，1min，进行28个反应循环；接着在70℃，5min；最后在4℃贮存；
S6、取上述PCR产物在一定条件下进行琼脂糖凝胶检测，若呈阳性，送Sanger测序；
S7、审核序列结果；对序列结果正确的菌液抽提质粒DNA，并测其浓度。
其中，
a、人的基因组DNA提取具体方法为：
由于DNA提取方法较多，本申请以天隆核酸提取试剂盒(磁珠法)，型号EX-DNA全血基因组3.0以及天隆核酸提取仪为例，做进一步说明；该方法中磁珠与核酸分子特异性地识别和高效结合，以此来从全血中分离基因组DNA。具体实验步骤在本申请中不做赘述。
b、DNA样品的处理方法为：
使用BioTekFlx800荧光分析仪处理，PicoGreen荧光染料可以与双链DNA特异结合后激发产生荧光，荧光分光光度计检测荧光强度，建立标准曲线，测定样品浓度。
c、DNA质量检测方法为：
利用琼脂糖电泳技术，检测基因组DNA的完整性及质量。胶成像分为4个等级：
一级：清晰明亮的DNA条带，没有拖尾，样品没有污染，可用于后续实验；
二级：清晰，DNA条带较亮，轻微拖尾，样品大多没有污染，样品可用于后续实验；
三级：较弱的DNA条带，拖尾较长，根据其他检测结果确定是否可用于后续实验；
四级：DNA条带拖尾明显，DNA被污染或是出现降解，样品不可用于后续实验。
胶成像上没有条带的任一样品都需要重复电泳一次，如果第二次仍然没有条带，需要重新提取基因组DNA。
2、突变质粒DNA的获得：
S1、根据实验要求设计碱基突变引物(其中碱基可以是单个，也可以是2个或多个碱基)；
S2、以上述质粒DNA为模板，配置合适的PCR反应体系；在如下条件下进行PCR扩增：首先将待反应物在95℃，反应30s；然后依次经过95℃反应15s、62℃反应15s、75℃反应2.5min，循环反应25次；接着在75℃反应5min，最后在4℃贮存；
S3、取一定量的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳实验；若实验结果符合要求，则将剩余的PCR产物按照一定的体系全部进行消化反应；
S4、将消化产物按照一定的体系并在一定的条件下进行重组反应；然后菌检；
S5、挑取阳性克隆送Sanger测序，审核测序结果；对序列结果正确的菌液抽提质粒，并测浓度。
实施例二
本发明提供一种用于生物样本核酸检测的质控方法，其中：
1、SNPs基因分型检测包括多种方法，例如TaqMan探针法、SNPtype、SNaPshot法、HRM法、MassArray法、IlluminaBeadXpress法以及测序法等等；本申请采用FluidigmJuno***先进行目的片段富集，进而放大信号，以此进行基因分型检测。具体原理为：利用Taq酶的3’->5’外切酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。探针的5’端标记有报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。当探针完整时，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，检测仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3’->5’外切酶活性将会将探针切断，报告基团远离淬灭基团。其能量不能被吸收，即产生荧光信号。
2、参照DNA的选择
参照DNA可选自已知杂合度较高的两个来自国际千人基因组计划的DNA，分别标记为NA18562和NA18541；应当说明的是，NA18562和NA18541仅为参照DNA选取的其中一种方案，实际使用过程中，凡是能够实现参照DNA所对应功能的，均应落入本发明的保护范围；另外，参照DNA的数量也不局限于2个，可为3个或更高，以提高质控的精确度；参照DNA的选取，需要满足较高的杂合度，筛选标准可采用如下办法：
首先对纯合的CC型赋分为0，CR型赋分为1，RR型赋分为2，然后对一定量的随机取样样本的基因型进行检测，接着对样本检测基因型的分值加和，最后，对相应位点的基因型加和分值进行比较，加和分值越高的，其杂合度越高；更进一步的，在样本量巨大时，为使加和值区分明显，并使所选样本尽量多的包含待检测位点中MAF较小位点的RR型，可以对RR型赋分再附加3～5分，即aa型赋分为5～7分。
3、实验过程中可采用96孔板对生物样本进行TaqMan探针法的基因分型检测，且同时采用质控DNA、参照DNA和空白对照DNA，则96孔板中的3个孔可分别放入CC、CR和RR样本，2个孔放入参照DNA，1个孔放入空白对照DNA，剩下90个孔放入样本DNA。在Fluidigm公司的Juno***上进行反应，反应完后在Fluidigm公司的EP1上读取。具体实验操作过程不再赘述。
本实施例的实验结果及分析如下：
如图1所示，对于有些SNP位点(MAF值很低的点)，如果没有质控DNA，则会像图1一样将出现错误分型结果，图1中显示sample1为杂合型，在该组样品中没有加CC、CR、RR三种质控DNA。而实际上Sample1为纯合型。
如图2所示，右图Sample1检测结果显示为普通纯合型CC，相较于图1，添加了CC、CR、RR作为质控，有三个聚类群(Cluster)，从图2中可以看到Sample1和作为参照的纯合CC聚类在一起，因此可以判定Sample1为纯合型，该结果是正确的。
如图3所示，该组样品没有添加CC、CR、RR三个表型的质控DNA，读取的结果显示NA18562和NA18541基因型为杂合，结果是错误的。
如图4所示，存在CC、CR、RR质控DNA和两个ReferenceDNA的质控SNPs位点rs5400的基因分型效果图。该组样品添加了CC、CR、RR三个表型的质控DNA，图中显示三个聚类群分的很开，同时NA18562和NA18541报告结果为纯合，且与CC处在同一聚类群内，根据订购的NA18562和NA18541的信息与测序结果，可以判断这两个参照DNA(ReferenceDNA)为纯合CC，结果正确。
由以上结果可以得出：CC、CR、RR三个表型的DNA样品很好地起到了作为质控的作用，在基因的检测和分析过程中作为参考或坐标，效果明显；参照DNA在基因分型检测中起到双重检查(DoubleCheck)的作用，并且参照DNA和CC、CR、RR三个表型又可以互相验证质控，更进一步地提升了检测结果的可信度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种用于生物样本核酸检测的质控方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)采集多个待测生物样本并提取样本DNA备用；
2)制备质控DNA以备用，所述质控DNA包括常见纯合型质控DNA、杂合型质控DNA和罕见纯合型质控DNA，所述常见纯合型质控DNA为包含所有待检SNP位点DNA模板的混合物、且其DNA模板的基因型均为纯合的常见基因；所述杂合型质控DNA为所有待检SNP位点DNA模板的混合物、且其DNA模板的基因型均为杂合型；所述罕见纯合型质控DNA为所有待检SNP位点DNA模板的混合物、且其DNA模板的基因型均为纯合的罕见基因；
3)将样本DNA和质控DNA一起进行基因分型检测；
4)以质控DNA的检测结果作为参照进行基因分型分析。
2.根据权利要求1所述的用于生物样本核酸检测的质控方法，其特征在于：还包括参照DNA，所述参照DNA上与待检SNP位点相对应的基因分型信息为已知；所述步骤3)中参照DNA与样本DNA和质控DNA一起进行基因分型检测，所述步骤4)中以参照DNA和质控DNA的检测结果作为参照进行基因分型分析。
3.根据权利要求2所述的用于生物样本核酸检测的质控方法，其特征在于：所述参照DNA包括至少2种。
4.根据权利要求1所述的用于生物样本核酸检测的质控方法，其特征在于：还包括空白对照DNA，所述空白对照DNA与样本DNA和质控DNA一起进行基因分型检测。
5.根据权利要求1所述的用于生物样本核酸检测的质控方法，其特征在于：所述质控DNA经过以下步骤获得：
S1、扩增：采集目标样本的DNA，通过PCR扩增待检SNP位点的基因片段；
S2、连接：将基因片段与载体连接转化入细菌中培养；
S3、测序：挑选菌落后，PCR扩增测序，若测序结果为纯合基因型，则进行下一步碱基突变扩增、以获得不同等位基因的DNA模板，若测序结果为杂合基因型，则挑选不同等位基因的DNA模板备用；
S4、碱基突变扩增：挑选上述检测结果为纯合基因型的菌落，加入碱基突变引物进行PCR扩增，以获得相对等位基因的DNA模板备用；
S5、制备：将每一待检SNP位点的不同等位基因的DNA模板按基因型分别收集或混合为单一位点DNA模板，所述质控DNA模板由相同基因型下的所有单一位点DNA模板混合而成，所述基因型包括纯合的常见基因、杂合型和纯合的罕见基因三种。
6.根据权利要求5所述的用于生物样本核酸检测的质控方法，其特征在于：所述载体为质粒。
7.根据权利要求1所述的用于生物样本核酸检测的质控方法，其特征在于：所述基因分型检测采用TaqMan荧光探针法。
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