CN117050163B - 一种分泌表达重组iii型胶原蛋白的毕赤酵母工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物技术领域，具体公开了一种分泌表达重组III型胶原蛋白的毕赤酵母工程菌及其应用。所述重组III型胶原蛋白的氨基酸序列如（a）或（b）所示：（a）氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；（b）在（a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有胶原蛋白活性的由（a）衍生的蛋白质。采用本申请的毕赤酵母工程菌可以高效、安全地进行重组III型胶原蛋白的胞外分泌表达，该重组III型胶原蛋白对细胞增殖及细胞迁移有明显促进作用。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，尤其是涉及一种分泌表达重组III型胶原蛋白的毕赤酵母工程菌及其应用。
背景技术
近年来，重组胶原蛋白受益于合成生物技术的进步以及运用场景不断扩展，增长快速。重组胶原蛋白是采用基因工程中的重组DNA技术，对编码所需人胶原蛋白质的基因进行遗传操作和（或）修饰，利用质粒或病毒载体将目的基因带入适当的宿主细胞（细菌、酵母或其他真核细胞等）中，表达并翻译成胶原蛋白或类似胶原蛋白的多肽，经过提取和纯化等步骤制备而成。基因工程法不仅可避免病毒隐患、免疫排斥反应等；并且人天然形成的胶原与重组类人胶原蛋白、重组人源化胶原蛋白、重组人胶原蛋白的氨基酸序列一致性依次逐增，最终有望实现低成本大量生产胶原蛋白，并成为胶原蛋白大规模产业化应用的未来方向。目前已经有部分企业正在以重组表达技术生产胶原、重组短肽或类似物进行商业布局，并已经实现商业化。
重组III型胶原蛋白是由DNA重组技术制备的含胶原蛋白特定型基因编码的全长或部分氨基酸序列片段，或是含胶原蛋白功能片段的组合，但是精准筛选出特定某类胶原蛋白完整基因中的目标功能区氨基酸序列并非易事，须分析蛋白质全链长基因序列，筛选核心功能区氨基酸，确保筛选的功能区具有期望的功效。
发明内容
本申请的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种分泌表达重组III型胶原蛋白的毕赤酵母工程菌及其应用，采用本申请的毕赤酵母工程菌可以高效、安全地进行重组III型胶原蛋白的胞外分泌表达，该重组III型胶原蛋白对细胞增殖及细胞迁移有明显促进作用。
为实现上述目的，本申请采取的技术方案为：
第一目的，本申请提供了一种重组III型胶原蛋白，所述重组III型胶原蛋白的氨基酸序列如（a）或（b）所示：
（a）氨基酸序列如 SEQ ID NO.1 所示；
（b）在（a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有胶原蛋白活性的由（a）衍生的蛋白质。
本申请发明人经过大量研究及试验发现，采用天然Ⅲ型胶原蛋白整合素信号位点或结合位点序列进行拼接，然后进行12个重复片段的串联组成重组表达胶原蛋白的片段（即本申请的重组Ⅲ型胶原蛋白），全长525个氨基酸，其中1-171、174-342和345-513为相同的人III型胶原蛋白片段，三段人III型胶原蛋白片段之间有RS连接，345-513的人III型胶蛋白原片段后采用GPPGPCCGGG进行修饰（可提高重组III型胶原蛋白的稳定性），本申请获得的重组III型胶原蛋白对细胞增殖、细胞迁移有明显作用。
由于胶原多肽的大小对其分泌的影响，过长的胶原多肽序列（大于90 kDa）在毕赤酵母中可能无法有效分泌；而过短的胶原多肽序列又无疑会增加后续的纯化工艺的难度。本申请选择12个重复片段的串联组成重组表达胶原蛋白的片段，使其大小控制在50 kDa左右。
第二目的，本申请提供了编码所述的重组III型胶原蛋白的核酸分子。
第三目的，本申请提供了携带所述的核酸分子的载体。
根据选择的氨基酸序列重新设计和优化了重组III型胶原蛋白的核苷酸序列（如SEQ ID NO.2所示），将优化后重组III型胶原蛋白的核苷酸序列连接到载体pGSI上，获得含有重组III型胶原蛋白（SEQ ID NO.2）的质粒pGSI- SEQ ID NO.2，双酶切pGSI- SEQ IDNO.2，回收SEQ ID NO.2目的片段；单酶切pGSI- SEQ ID NO.2形成线性化质粒后，将回收的T4目的片段经体外连接成为两个单体的串联体pGSI-( SEQ ID NO.2)2；单酶切pGSI-( SEQID NO.2)2形成线性化质粒后，再将回收的SEQ ID NO.2的目的片段连入线性化质粒pGSI-( SEQ ID NO.2)2成为三串联体pGSI-( SEQ ID NO.2)3；双酶切pGSI-( SEQ ID NO.2)3，回收(SEQ ID NO.2)3三串联体目的片段；双酶切pPIC9K形成线性化质粒后，将回收的(SEQ IDNO.2)3目的片段连入pPIC9K形成重组III胶原蛋白表达质粒pPIC9K-rhCOL3S5。
第四目的，本申请提供了表达所述的重组III型胶原蛋白的基因工程菌。
本申请通过线性化酵母表达质粒pPIC9K-rhCOL3S5，通过电转法转化毕赤酵母GS115，并直接挑取在MD培养基平板上长势较好单菌落影印于含有高浓度 G418的YPD培养基平板上进行筛选，获得本申请的基因工程菌（高拷贝重组酵母），简化了高拷贝重组酵母的筛选的工艺，缩短了该阶段的时间成本，提高了工作效率。
作为本申请所述基因工程菌的优选实施方式，所述基因工程菌为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPIC9K-rhCOL3S5-248b和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPIC9K-rhCOL3S5-523c，所述巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPIC9K-rhCOL3S5-248b的保藏编号为CGMCC No.27541，所述巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPIC9K-rhCOL3S5-523c的保藏编号为CGMCC No.27542，均已2023年6月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本申请的基因工程菌可以高效、安全地进行重组III型胶原蛋白的胞外分泌表达。
作为本申请所述基因工程菌的优选实施方式，所述基因工程菌以pPIC9K为表达载体。
第五目的，本申请提供了一种促进细胞增殖试剂，所述促进细胞增殖试剂含有所述的重组III型胶原蛋白。
第六目的，本申请提供了一种促进细胞迁移试剂，所述促进细胞迁移试剂含有所述的重组III型胶原蛋白。
第七目的，本申请提供了所述的重组III型胶原蛋白在制备促进细胞增殖或迁移试剂中的应用。
第八目的，本申请提供了所述的基因工程菌在生产重组III型胶原蛋白中的应用，所述重组III型胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示，所述重组III型胶原蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本申请使用BMM培养基诱导表达重组III型胶原蛋白的发酵上清液，经过硫酸铵沉淀、透析、超滤的快速纯化，获得的重组III型胶原蛋白可直接用于生物学功能检测。建立了精准筛选功能性片段的工艺，且该工艺用时短，有助于快速进行功能性片段的筛选。
与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：
本申请采用天然Ⅲ型胶原蛋白整合素信号位点或结合位点序列进行拼接，然后进行12个重复片段的串联组成重组表达胶原蛋白的片段，获得本申请的重组III型胶原蛋白，该重组III型胶原蛋白对细胞增殖和细胞迁移具有促进作用。经过CCK-8法实验结果显示，在终浓度为1.3 mg/mL和0.5 mg/mL对ESF细胞的细胞增殖率为123.90%和118.73%，显著高于其阴性对照组（1×维持培养基），认为具有一定促ESF细胞增殖作用。经过细胞划痕实验结果显示，阴性对照组（NC）24 h伤口愈合百分比为59.71%，0.2 mg/mL、0.1 mg/mL重组III型胶原蛋白样品组的24 h伤口愈合百分比（Wound Closure%）均显著大于阴性对照组（NC），分别约为71.17%、82.54%，则认为0.2 mg/mL、0.1 mg/mL重组III型胶原蛋白样品组均有明显促进HaCaT伤口愈合作用。
附图说明
图1为重组III型胶原蛋白表达载体pPIC9K-rhCOL3S5的质粒图谱；
图2为电转后的毕赤酵母GS115平板图；
图3为G418筛选平板图；
图4为PCR鉴定阳性克隆菌株结果图；
图5为248b、523c阳性菌进行诱导表达的电泳结果图。
具体实施方式
为更好的说明本申请的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本申请作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
在前期实验中，采用天然Ⅲ型胶原蛋白整合素信号位点或结合位点序列进行拼接，然后进行12个重复片段的串联组成重组表达胶原蛋白片段的设计思路，共设计了4条以上的序列。根据细胞学功效检测结果和产物纯化难度（以主带和水解条带的分离纯化难易程度为判断）进行评分，本申请的重组Ⅲ型胶原蛋白的评分较其他序列高。
实施例1、重组III胶原蛋白表达质粒的构建
本实施例采用天然Ⅲ型胶原蛋白整合素信号位点或结合位点序列进行拼接，然后进行12个重复片段的串联组成重组表达胶原蛋白的片段（即本申请的重组Ⅲ型胶原蛋白），全长525个氨基酸，其中1-171、174-342和345-513为相同的人III型胶原蛋白片段，三段人III型胶原蛋白片段之间有RS连接，345-513的人III型胶蛋白原片段后采用GPPGPCCGGG进行修饰，重组Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示。
按照毕赤酵母密码子偏好，将选取的天然Ⅲ型胶原蛋白整合素信号位点或结合位点的碱基序列采用上述手段进行密码子优化，获得重组III型胶原蛋白的核苷酸序列如SEQID NO.2 所示。
委托广州艾基生物技术有限公司合成重组III型胶原蛋白的核苷酸序列（SEQ IDNO.2），并克隆至载体pGSI，获得含有一个重组III型胶原蛋白（SEQ ID NO.2）的质粒pGSI-SEQ ID NO.2，并在SEQ ID NO.2片段两端设有同尾酶BamH I和Bgl II限制性内切酶位点。
（3）BamH I和Bgl II双酶切pGSI- SEQ ID NO.2后，回收SEQ ID NO.2目的片段。Bgl II单酶切pGSI- SEQ ID NO.2形成线性化质粒后，将回收的T4目的片段经体外连接成为两个单体的串联体pGSI-( SEQ ID NO.2)2。
（4）Bgl II单酶切pGSI-( SEQ ID NO.2)2形成线性化质粒后，再将回收的SEQ IDNO.2的目的片段连入线性化质粒pGSI-( SEQ ID NO.2)2成为三串联体pGSI-( SEQ IDNO.2)3。
（5）EcoR I和Not I双酶切pGSI-( SEQ ID NO.2)3后，回收(SEQ ID NO.2)3三串联体目的片段。EcoR I和Not I双酶切pPIC9K形成线性化质粒后，将回收的(SEQ ID NO.2)3目的片段连入pPIC9K形成重组III胶原蛋白表达质粒pPIC9K-rhCOL3S5。图1为重组III型胶原蛋白表达载体pPIC9K-rhCOL3S5的质粒图谱。
实施例2、表达重组III型胶原蛋白的高拷贝重组子GS115/pPIC9K-rhCOL3S5的构建
本实施例提供表达重组III型胶原蛋白的高拷贝重组子GS115/pPIC9K-rhCOL3S5的构建，包括以下步骤：
1）提取pPIC9K-rhCOL3S5质粒20 μg，使用Sac I酶切线性化，乙醇沉淀法纯化浓缩待用。
2）电转毕赤酵母细胞GS115：将80 μL电转感受态GS115和回收的线性化质粒10 μg加入到无菌、冰上预冷的1.5 mL离心管中，轻弹管底混匀，以制备电转混合物。将上述电转混合物转移到0.2 cm冰预冷的电转化杯中，再将电转化杯冰浴5 min。使用MicroPluser电穿孔仪上的sc2电转程序进行电击。电击完毕后，立即加入12 mL冰预冷的1 M的山梨醇溶液，将菌体混匀。将菌体悬液涂布于MD平板上，每500 μL菌体悬液涂布一块平板，共涂10个板。将平板倒置于29℃培养箱培养，直至单个菌落出现。于29℃培养箱培养约4天。图2为电转后的毕赤酵母GS115平板图。
3）高拷贝重组酵母的筛选：挑取在MD培养基平板上长势较好单菌落影印于含有4.0 mg/mL G418的YPD培养基平板上，并挑取毕赤酵母GS115（未经转化）的单菌落，使用相同方法影印于含4.0 mg/mL G418的YPD培养基平板上，用作对照。29℃培养箱培养约5天。图3为4.0 mg/mL G418筛选平板图。
4）PCR鉴定阳性克隆菌株：待平板长出菌落，用接种环挑取平板上生长的单菌落248b、523c，将它接入到装有10 μL无菌水的1.5 mL离心管中。混匀后，加入1 μL 10 U/μL的溶细胞酶litycase，30℃孵育10 min。将样品浸入液氮中1 min，室温解冻约5 min。重复1次。短暂离心，取上清液1 μL作为PCR反应模板，使用载体上引物（5´α-Factor：TACTATTGCCAGCATTGCTGC；
3´AOX：GCAAATGGCATTCTGACATCC）PCR鉴定，结果如图4所示。
其中，M：DNA标准品，从上到下5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100 bp；1-2：菌落248b、523c的PCR扩增片段；3：质粒pPIC9K-rhCOL3S5的PCR扩增片段，作为阳性对照；4：未经转化的GS115菌株的PCR扩增片段，作为阴性对照；5：H2O的PCR扩增片段，作为空白对照。
实施例3、重组III型胶原蛋白的诱导表达、快速纯化及功能检测
诱导表达：选取248b、523c阳性菌进行诱导表达。
分别取阳性菌株248b、523c接种到装有25 mL BMG培养基的250 mL锥形瓶中，29℃，转速250 rpm，培养约24 h。从上述培养好的种子液中取出2.5 mL菌液转接至装有22.5mL BMG培养基的250 mL锥形瓶中，29℃，转速250 rpm，培养18-22 h，至OD600=6左右。上述菌液分装至50 mL离心管中，室温下，6000 rpm离心5 min，弃去上清，收集菌体。用适量BMM培养基将收集的菌体重悬至OD600=3.0左右，重悬后菌液转移至1 L锥形瓶中培养，每瓶100 mL重悬液。29℃，250 rpm振荡培养72 h。诱导开始后，每24 h补加甲醇至终浓度1%。诱导表达0、24、48、72 h后，10000 g离心10 min收集发酵上清液，进行SDS-PAGE电泳检测，电泳结果如图5所示。
其中，M：蛋白标准品；1：阳性菌株诱导表达0小时上清；2：阳性菌株诱导表达24小时上清；3：阳性菌株诱导表达48小时上清；4、阳性菌株诱导表达72小时上清；248b、523c阳性菌株分别命名为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115/pPIC9K-rhCOL3S5-248b和巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115/pPIC9K-rhCOL3S5-523c，以上菌种已于2023年6月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115/pPIC9K-rhCOL3S5-248b和巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115/pPIC9K-rhCOL3S5-523c保藏编号分别为CGMCC No.27541和CGMCC No.27542。
快速纯化：按照少量多次添加的方式，向500 mL上述获得的上清液中分批加入121.5 g硫酸铵固体，至硫酸铵饱和浓度为40%。室温（25℃）静置1 h。25℃，10000 g离心15min，去上清，收集沉淀。最后加入5 mL 1×PBS（pH 7.2），吹打混匀，至沉淀完全溶解。将硫酸铵沉淀重悬液加入到10 kDa透析袋中后，把透析袋放入装有1000 mL纯化水的1 L烧杯中进行透析，期间更换透析液4-5次，共透析约24 h。收集的透析保留液，使用10 kDa超滤管进行透析保留液的超滤浓缩，获得的超滤浓缩液用于后续的生物学功能检测实验。
功能检测：
本申请的重组III型胶原蛋白对细胞增殖的促进作用：CCK-8法实验结果显示，在终浓度为1.3 mg/mL和0.5 mg/mL对ESF细胞的细胞增殖率为123.90%和118.73%，显著高于其阴性对照组（1×维持培养基），认为具有一定促ESF细胞增殖作用。
本申请的重组III型胶原蛋白对细胞迁移的促进作用：细胞划痕实验结果显示，阴性对照组（NC）24 h伤口愈合百分比为59.71%，0.2 mg/mL、0.1 mg/mL重组III型胶原蛋白样品组的24 h伤口愈合百分比（Wound Closure%）均显著大于阴性对照组（NC），分别约为71.17%、82.54%，则认为0.2 mg/mL、0.1 mg/mL重组III型胶原蛋白样品组均有明显促进HaCaT伤口愈合作用。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本申请的技术方案而非对本申请保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本申请作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本申请的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本申请技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种重组III型胶原蛋白，其特征在于，所述重组III型胶原蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述的重组III型胶原蛋白的核酸分子。
3.携带权利要求2所述的核酸分子的载体。
4.表达权利要求1所述的重组III型胶原蛋白的基因工程菌。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPIC9K-rhCOL3S5-248b和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPIC9K-rhCOL3S5-523c，所述巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPIC9K-rhCOL3S5-248b的保藏编号为CGMCC No.27541，所述巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPIC9K-rhCOL3S5-523c的保藏编号为CGMCC No.27542，均已2023年6月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以pPIC9K为表达载体。
7.一种促进细胞增殖试剂，其特征在于，所述促进细胞增殖试剂含有权利要求1所述的重组III型胶原蛋白。
8.一种促进细胞迁移试剂，其特征在于，所述促进细胞迁移试剂含有权利要求1所述的重组III型胶原蛋白。
9.如权利要求1所述的重组III型胶原蛋白在制备促进细胞增殖或迁移试剂中的应用。
10.权利要求5所述的基因工程菌在生产重组III型胶原蛋白中的应用，其特征在于，所述重组III型胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重组III型胶原蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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