CN116355872B - 半乳糖氧化酶突变体gao-5f/ar、质粒、重组菌及其应用 - Google Patents
半乳糖氧化酶突变体gao-5f/ar、质粒、重组菌及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116355872B CN116355872B CN202310158953.XA CN202310158953A CN116355872B CN 116355872 B CN116355872 B CN 116355872B CN 202310158953 A CN202310158953 A CN 202310158953A CN 116355872 B CN116355872 B CN 116355872B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- galactose oxidase
- gao
- mutant
- application
- oxidase mutant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010015133 Galactose oxidase Proteins 0.000 title claims abstract description 71
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title abstract description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 claims abstract description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 claims description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 27
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 108010089807 chitosanase Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 2
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- -1 aromatic alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010037176 copper oxidase Proteins 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000007986 glycine-NaOH buffer Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 150000003138 primary alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
- C12Y101/03009—Galactose oxidase (1.1.3.9)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种半乳糖氧化酶突变体GAO‑5F/AR、质粒、重组菌及其应用,属于基因工程技术领域,所述半乳糖氧化酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,与野生型半乳糖氧化酶GAO‑5F相比,对第403和484位氨基酸进行定点突变,核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,本发明还提供含有SEQ ID NO.2所示核苷酸重组质粒和重组菌株,本发明所述突变体的酶活是野生型的6倍。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR、质粒、重组菌及其应用。
背景技术
半乳糖氧化酶(E.C.1.1.3.9)是一种单体的自由基铜氧化酶,以铜离子作为辅助因子。这种胞外单体酶是由一些丝状真菌分泌的,主要是镰刀菌属。半乳糖氧化酶催化双电子氧化,并氧化各种初级醇和醛,特别是带有C6羟基的半乳糖,产生相应的醛,同时在催化反应中将水还原成过氧化氢。半乳糖氧化酶具有严格的立体选择性和广泛的底物特异性,可以氧化单糖、多糖、脂肪族和芳香族醇、多元醇和许多其他含有半乳糖单位的化合物。这些特点使半乳糖氧化酶能够在各个领域得到应用,如生物传感器、化学合成、生物医学和分子交联等。
酶分子良好的催化活性、热稳定性和催化效率是其工业化生产和商业化应用的基础。目前获得具有更高催化活性的酶,一种方法是挖掘新型的酶分子,但分离筛选过程工作量大、效率低。而蛋白质工程基于结构生物信息学的指导,可对酶分子进行改造进一步合理提升酶分子的催化活性。为了后续的工业化生产,半乳糖氧化酶的催化活性需要进一步提高。结合三维结构和序列分析,通过蛋白质工程可以合理的提升酶的活性、热稳定性或催化效率。因此需要对半乳糖氧化酶挖掘并鉴定影响其催化活性的关键氨基酸位点,在此基础上,对半乳糖氧化酶进行定向改造,获得具有高催化活性的半乳糖氧化酶突变体。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供了一种半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR、质粒、重组菌及其应用,通过对半乳糖氧化酶进行分子改造,实现半乳糖氧化酶催化活性的提高,为其工业化应用奠定基础。
GAO-5F是本实验室前期在大肠杆菌中构建的一个半乳糖氧化酶,该酶具有优良的热稳定性,可适应于工业化生产过程,具有较好的应用前景。为提高其催化活性,本发明基于已得到的半乳糖氧化酶在大肠杆菌中的表达平台,选取已报道具有较高催化活性的半乳糖氧化酶为模板,基于多序列比对,选取影响其催化活性的潜在位点,通过定点突变对半乳糖氧化酶GAO-5F进行分子改造,获得催化活性提高的半乳糖氧化酶突变体。
本发明是通过以下技术方案实现的:
一种半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR,所述半乳糖氧化酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,与野生型半乳糖氧化酶GAO-5F(GenBank ID:XM_031208735.1)相比,对第403和了484位氨基酸进行定点突变。
进一步,所述野生型半乳糖氧化酶GAO-5F来源于Fusarium odoratissimum。
本发明还提供编码所述半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR的基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供一种重组质粒,其携带有SEQ ID NO.2所示核苷酸,表达载体优选为pET28a。
本发明还提供含有上述重组质粒转化得到的重组工程菌株,表达宿主优选为E.coli BL21(DE3)。
本发明还提供所述半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR酶的应用。
本发明与现有技术相比的有益效果:
本发明针对现有半乳糖氧化酶催化活性低的问题,以半乳糖氧化酶GAO-5F为基础,采用多序列比对的方法,选取了多个可能影响其催化活性的潜在氨基酸位点,通过定点突变对其进行改造,首次获得了将第403位天冬氨酸和484位谷氨酰胺分别突变为丙氨酸和精氨酸的双突变GAO-5F/AR,所得突变体的酶活显著提升,是野生型的6倍。本发明这一发现和催化活性提高的突变体,为半乳糖氧化酶的开发改造及应用奠定了基础。
附图说明
图1:温度和pH对半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR酶活力的影响;
图2:温度和pH对半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR酶稳定性的影响。
具体实施方式
下面通过实施例结合附图对本发明的方法做进一步说明。但实施例中所用到的实验条件可以根据已有技术进行选择。对于实施例中未注明具体条件的实验方法,通常可按常规条件,或按照制造厂商所建议的条件运行。
以下结合具体实施例,对本发明作进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1、半乳糖氧化酶突变位点的构建
以野生型半乳糖氧化酶GAO-5F的质粒为模板,分别以表1中的403F、403R和484F、4844R为引物对进行PCR扩增,构建半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/403A和GAO-5F/484R,与野生型壳聚糖酶GAO-5F相比,GAO-5F/403A将第403位天冬氨酸突变为丙氨酸,GAO-5F/484R将第484位谷氨酰胺突变为精氨酸。
表1引物序列
实施例2、半乳糖氧化酶突变体的活性检测
将上述实施例1中所构建的两个突变体进行酶活检测,与野生型半乳糖氧化酶GAO-5F进行比较。半乳糖氧化酶的活性采用过氧化物酶偶联法测定,具体操作如下:将含有ABTS(4.41mg),辣根过氧化物酶(45U),D-半乳糖(90mM)、适量的半乳糖氧化酶和磷酸二氢钾缓冲液(100mM,pH 7.0)的反应混合物在40℃下反应3min,测量OD420吸光值的改变量。一个单位(U)的半乳糖氧化酶活性定义为在上述条件下每分钟氧化2μmolABTS或1μmol O2(半乳糖)所需的酶量。GAO-5F的催化活性为62.84U/mg,相对酶活记为100%,测得的半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/403A和GAO-5F/484R的相对酶活分别为149.40%和144.39%。
实施例3、半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR的构建、诱导表达及纯化
将上述两个位点进行组合突变,以GAO-5F/403A的质粒为模板,484F、4844R为引物对进行PCR扩增,产物经DpnI消化后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,构建壳聚糖酶突变体GAO-5F/AR,与野生型壳聚糖酶GAO-5F相比,GAO-5F/AR将第403位天冬氨酸和484位谷氨酰胺分别突变为丙氨酸和精氨酸。
将上述含有半乳糖氧化酶酶突变体GAO-5F/AR的重组菌接种至LB培养基中,在37℃培养约3h,然后用终浓度为0.1mM的IPTG在25℃继续培养18h。离心收集菌体,超声破碎后,使用Ni-NTA亲和柱纯化蛋白,并用NPI-200洗脱目标蛋白,然后在4℃下进行超滤除盐和浓缩,得到纯化的半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR。
半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR的氨基酸序列:
VAISQPAAKAETPEGSLQFLSLRASAPIGTAINRDKWRVTCDSQHEGDECSKAI
DGDRDTFWHTAWAAGATNDPKPPHTITIDMGSSQNVNGLSVLPRQDGSDHG
WIGRHNVFLSTDGKNWGDAVATGTWFADNTEKYSNFETRPARYVRLVAVTE
ANDQPWTSIAEINVFKAASYTSPQPGLGRWGPTLDFPIVPVAAAVEPTSGKVL
VWSSYRNDAFGGSPGGVTLTSTWDPSTGVISQRTVTVTKHDMFCPGISMDGN
GQVVVTGGNDAQKTSLYDSSSDSWIPGPDMKVARGYQSSATLSNGRVFTIGG
SWSGGIFEKNGEVYDPSSKTWTSLPKALVKPMLTADQQGLYRSDNHGWLFG
WKKGSVFQAGPSTAMNWYYTTGNGDVKSAGKRQSSRGTAPDAMCGNAVM
YDAVKGKILTFGGSPSYQDSDATTNAHIITISEPGSTPKTVFASNGLYYPRTFHT
SVVLPDGNVFITGGQRRGIPFADSTPQLTPELYVPNDDTFYKQQPNSIVRVYHS
ISLLLPDGRVFNGGGGLCGDCDTNHFDAQIYTPNNLYDSNGKLARRPKITKVS
AKSVKVGGKITITADTSIKQASLIRYGTSTHTVNTDQRRIPLSLRRTGTGNSYS
FQVPSDSGIALPGYWMLFVMNSAGVPSVASTLLVTQ
半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR的核苷酸序列:
gtggctatcagccagccggcggctaaagctgaaaccccggaaggctctctgcagttcctgtctctgcgtgctagcgcacc
gatcggcaccgctatcaaccgtgataaatggcgtgtgacctgtgactctcagcacgaaggcgacgaatgctctaaagcga
tcgacggcgaccgtgacaccttctggcacaccgcatgggctgcgggcgctaccaacgacccgaaaccgccgcacacg
atcaccatcgacatgggttcctctcagaacgtgaacggtctgtctgttctgccgcgtcaggacggttctgaccacggttgga
ttggtcgtcacaacgtttttctgtctaccgacggcaaaaactggggcgacgcggttgcgaccggcacctggttcgcagaca
acaccgaaaaatactctaacttcgaaacccgtccggcgcgttacgttcgtctggttgcggttaccgaagcgaacgaccagc
cgtggacctctatcgcggaaatcaacgttttcaaagctgcttcctacacctctccgcagccgggtctgggtcgttggggtcc
gaccctggacttcccgatcgttccggttgcagcggccgttgaaccgacctccggtaaagtgctggtttggtcctcttaccgt
aacgacgctttcggtggttcgccgggtggtgttaccctgacctccacctgggacccgtccaccggtgttatctctcagcgta
ccgttaccgttactaaacacgacatgttctgccctggtatctctatggacggcaacggtcaggttgttgttaccggtggtaac
gacgcgcagaaaacctctctgtacgactcctcttctgattcttggattccgggtccggacatgaaagtggcgcgtggctacc
agtctagcgctaccctgtctaacggtcgtgttttcaccatcggtggttcttggtctggtggtatcttcgagaaaaacggtgagg
tttatgacccgtcctctaaaacctggacctctctgccgaaagcgctggttaaaccgatgctgaccgctgaccagcagggtct
gtaccgttctgataaccacggttggctgttcggttggaaaaaaggttctgttttccaggctggtccgtctaccgctatgaactg
gtactacaccaccggtaacggcgatgttaaatctgcgggtaaacgtcagtctagccgtggtaccgccccggatgcaatgt
gcggtaacgcggttatgtacgatgcggttaaaggtaaaatcctgaccttcggtggttccccgtcttaccaggactctgatgc
gaccaccaacgcgcacatcatcaccatctccgaaccgggttctaccccgaaaaccgttttcgcgtctaacggtctgtactac
ccgcgtaccttccacactagcgttgttctgccggacggtaacgtgttcatcaccggtggccagcggcgtggtatcccgttc
gcggactctaccccgcagctgaccccggaactgtacgttccgaacgacgataccttctacaaacagcagccgaactctatt
gttcgtgtttaccactctatctccctgctgctgccggatggccgtgttttcaacggtggcggcggcctgtgcggtgactgcga
caccaaccacttcgacgcacagatctacaccccgaacaacctgtacgactctaacggtaaactggctcgtcgtccgaaaat
caccaaagtgtctgctaaatctgtgaaagttggtggtaaaatcactatcaccgcagacaccagcatcaaacaggcatctctg
atccgttacggtacctccacccacaccgttaacaccgaccagcgtcgtatcccgctgtctctgcgtcgtaccggtaccggta
actcttacagcttccaggttccgtctgactctggtatcgctctgccgggttactggatgctgttcgttatgaactctgcgggtgt
tccgtctgttgcgtctaccctgctggttacccag
实施例4、半乳糖氧化酶突变体的酶学性质检测
(1)半乳糖氧化酶突变体的活性分析
采用上述实施例2中半乳糖氧化酶的活性检测方法,测得的半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR的相对酶活451.1U/mg,是野生型半乳糖氧化酶GAO-5F的6.01倍。
(2)温度和pH对半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR酶活力的影响
将所得的半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR用磷酸二氢钾缓冲液(100mM,pH 7.0)稀释至适当的浓度,分别在20-80℃下进行酶促反应以研究温度对其酶活力的影响。将所得的半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR分别用pH为3.0-10.0的缓冲液【柠檬酸钠缓冲液(50mM,pH3.0-6.0)、磷酸盐缓冲液(50mM,pH6.0-8.0)、Tris-HCl缓冲液(50mM,pH 8.0-9.0)和甘氨酸-NaOH缓冲液(50mM,pH 9.0-10.0)】稀释,然后在40℃下进行反应以研究pH对其酶活力的影响。分别以酶活力的最高值作为100%,结果如图1所示。结果显示半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR的最适温度为60℃,最适pH为7.0。
(3)温度和pH对半乳糖氧化酶GAO-5F/AR酶稳定性的影响
将所得的半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR用磷酸二氢钾缓冲液(100mM,pH 7.0)稀释至适当的浓度,分别在30℃、40℃和50℃下孵育不同时间后测试其残余酶活以研究温度对其稳定性的影响。将所得的半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR在不同pH的磷酸盐缓冲液(pH6.0-8.0)中孵育不同时间,然后在40℃反应检测残余酶活以研究pH对其稳定性的影响。结果如图2所示,当GAO-5F/AR在50℃下储存24h时,可保留其30%的初始酶活。在pH 7.0时表现出最大的稳定性,在孵育40h后仍可保留90%以上的活性。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点,并不能以此限制本发明的保护范围。本领域人员可以根据本发明做各种改动或修饰,这些等效形式同样涵盖在本申请所附权利要求书所限定的范围之内。
Claims (6)
1.一种半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR,其特征在于,所述半乳糖氧化酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的一种半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR,其特征在于,所述半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR来自野生型半乳糖氧化酶GAO-5F第403和484位氨基酸进行定点突变,所述野生型半乳糖氧化酶GAO-5F来源于Fusariumodoratissimum。
3.编码权利要求1所述半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR的基因,其特征在于,核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种重组质粒,其特征在于,其携带有SEQ ID NO.2所示核苷酸,表达载体为pET28a。
5.一种重组工程菌株,其特征在于,其含有权利要求3所述重组质粒,表达宿主为E.coliBL21(DE3)。
6.权利要求1所述半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR酶的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310158953.XA CN116355872B (zh) | 2023-02-23 | 2023-02-23 | 半乳糖氧化酶突变体gao-5f/ar、质粒、重组菌及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310158953.XA CN116355872B (zh) | 2023-02-23 | 2023-02-23 | 半乳糖氧化酶突变体gao-5f/ar、质粒、重组菌及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116355872A CN116355872A (zh) | 2023-06-30 |
CN116355872B true CN116355872B (zh) | 2023-09-01 |
Family
ID=86926574
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310158953.XA Active CN116355872B (zh) | 2023-02-23 | 2023-02-23 | 半乳糖氧化酶突变体gao-5f/ar、质粒、重组菌及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116355872B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117230032B (zh) * | 2023-11-16 | 2024-01-30 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 半乳糖氧化酶突变体gao-ar/ht、基因、质粒、重组菌及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7115403B1 (en) * | 2000-05-16 | 2006-10-03 | The California Institute Of Technology | Directed evolution of galactose oxidase enzymes |
CN112673097A (zh) * | 2018-07-09 | 2021-04-16 | 科德克希思公司 | 工程化半乳糖氧化酶变体酶 |
WO2022076263A1 (en) * | 2020-10-06 | 2022-04-14 | Codexis, Inc. | Engineered galactose oxidase variant enzymes |
-
2023
- 2023-02-23 CN CN202310158953.XA patent/CN116355872B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7115403B1 (en) * | 2000-05-16 | 2006-10-03 | The California Institute Of Technology | Directed evolution of galactose oxidase enzymes |
CN112673097A (zh) * | 2018-07-09 | 2021-04-16 | 科德克希思公司 | 工程化半乳糖氧化酶变体酶 |
WO2022076263A1 (en) * | 2020-10-06 | 2022-04-14 | Codexis, Inc. | Engineered galactose oxidase variant enzymes |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN116355872A (zh) | 2023-06-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4348563B2 (ja) | 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ | |
WO2010053161A1 (ja) | 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ | |
CN116355872B (zh) | 半乳糖氧化酶突变体gao-5f/ar、质粒、重组菌及其应用 | |
CN107189991B (zh) | 一种葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用 | |
CN113862233B (zh) | 提高葡萄糖氧化酶的酸稳定性的方法及突变体q241e/r499e、基因和应用 | |
CN116410960B (zh) | 嗜盐适冷及pH适应性改良的β-木糖苷酶突变体D41G及其应用 | |
CN117625581B (zh) | 一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体Ea2F及其应用 | |
JP2024504439A (ja) | エステラーゼ変異体及びその用途 | |
Li et al. | Characterization of a uronate dehydrogenase from Thermobispora bispora for production of glucaric acid from hemicellulose substrate | |
WO2013099294A1 (ja) | グルコース脱水素酵素 | |
CN116676296A (zh) | 酶活提高的β-1,3-葡聚糖酶突变体 | |
WO2015008637A1 (ja) | キサンチンオキシダーゼ遺伝子とそれをコードするアミノ酸配列 | |
CN112921025B (zh) | 一种差向异构酶的突变体,其编码基因、氨基酸序列及其应用 | |
JP4405324B2 (ja) | 改変型ザルコシンオキシダーゼ、改変型ザルコシンオキシダーゼ遺伝子及び改変型ザルコシンオキシダーゼの製造法 | |
WO2015137565A1 (ko) | 신규 포름알데하이드 탈수소효소 및 이를 이용한 포름알데하이드의 생산방법 | |
JP4371312B2 (ja) | 改変型ザルコシンオキシダーゼ、その遺伝子、組み換え体dna及び改変型ザルコシンオキシダーゼの製造法 | |
CN117230032B (zh) | 半乳糖氧化酶突变体gao-ar/ht、基因、质粒、重组菌及其应用 | |
KR101228974B1 (ko) | 락토바실러스 람노수스 유래 내열성물 생성 nadh 산화효소 및 그 생산 방법 | |
CN116790538B (zh) | 一种具有耐碱性的氧化硫化酶突变体及其应用 | |
CN114621944B (zh) | 酶活提高的精氨酸脱亚胺酶突变体 | |
CN110577961B (zh) | 一种热稳定性苹果酸脱氢酶基因的构建方法、编码蛋白及其应用 | |
CN118165959B (zh) | 壳聚糖酶OUC-CsnA4-E59V及其编码基因与应用 | |
CN115975964A (zh) | 一种高活性酮基泛解酸内酯还原酶突变体及其编码基因和应用 | |
CN118086265A (zh) | 一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用 | |
CN115873831A (zh) | 一种高催化活性及温度稳定性的壳聚糖酶突变体及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |