CN116355872B - 半乳糖氧化酶突变体gao-5f/ar、质粒、重组菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种半乳糖氧化酶突变体GAO‑5F/AR、质粒、重组菌及其应用，属于基因工程技术领域，所述半乳糖氧化酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，与野生型半乳糖氧化酶GAO‑5F相比，对第403和484位氨基酸进行定点突变，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，本发明还提供含有SEQ ID NO.2所示核苷酸重组质粒和重组菌株，本发明所述突变体的酶活是野生型的6倍。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR、质粒、重组菌及其应用。
背景技术
半乳糖氧化酶(E.C.1.1.3.9)是一种单体的自由基铜氧化酶，以铜离子作为辅助因子。这种胞外单体酶是由一些丝状真菌分泌的，主要是镰刀菌属。半乳糖氧化酶催化双电子氧化，并氧化各种初级醇和醛，特别是带有C6羟基的半乳糖，产生相应的醛，同时在催化反应中将水还原成过氧化氢。半乳糖氧化酶具有严格的立体选择性和广泛的底物特异性，可以氧化单糖、多糖、脂肪族和芳香族醇、多元醇和许多其他含有半乳糖单位的化合物。这些特点使半乳糖氧化酶能够在各个领域得到应用，如生物传感器、化学合成、生物医学和分子交联等。
酶分子良好的催化活性、热稳定性和催化效率是其工业化生产和商业化应用的基础。目前获得具有更高催化活性的酶，一种方法是挖掘新型的酶分子，但分离筛选过程工作量大、效率低。而蛋白质工程基于结构生物信息学的指导，可对酶分子进行改造进一步合理提升酶分子的催化活性。为了后续的工业化生产，半乳糖氧化酶的催化活性需要进一步提高。结合三维结构和序列分析，通过蛋白质工程可以合理的提升酶的活性、热稳定性或催化效率。因此需要对半乳糖氧化酶挖掘并鉴定影响其催化活性的关键氨基酸位点，在此基础上，对半乳糖氧化酶进行定向改造，获得具有高催化活性的半乳糖氧化酶突变体。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR、质粒、重组菌及其应用，通过对半乳糖氧化酶进行分子改造，实现半乳糖氧化酶催化活性的提高，为其工业化应用奠定基础。
GAO-5F是本实验室前期在大肠杆菌中构建的一个半乳糖氧化酶，该酶具有优良的热稳定性，可适应于工业化生产过程，具有较好的应用前景。为提高其催化活性，本发明基于已得到的半乳糖氧化酶在大肠杆菌中的表达平台，选取已报道具有较高催化活性的半乳糖氧化酶为模板，基于多序列比对，选取影响其催化活性的潜在位点，通过定点突变对半乳糖氧化酶GAO-5F进行分子改造，获得催化活性提高的半乳糖氧化酶突变体。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR，所述半乳糖氧化酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，与野生型半乳糖氧化酶GAO-5F(GenBank ID：XM_031208735.1)相比，对第403和了484位氨基酸进行定点突变。
进一步，所述野生型半乳糖氧化酶GAO-5F来源于Fusarium odoratissimum。
本发明还提供编码所述半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供一种重组质粒，其携带有SEQ ID NO.2所示核苷酸，表达载体优选为pET28a。
本发明还提供含有上述重组质粒转化得到的重组工程菌株，表达宿主优选为E.coli BL21(DE3)。
本发明还提供所述半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR酶的应用。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明针对现有半乳糖氧化酶催化活性低的问题，以半乳糖氧化酶GAO-5F为基础，采用多序列比对的方法，选取了多个可能影响其催化活性的潜在氨基酸位点，通过定点突变对其进行改造，首次获得了将第403位天冬氨酸和484位谷氨酰胺分别突变为丙氨酸和精氨酸的双突变GAO-5F/AR，所得突变体的酶活显著提升，是野生型的6倍。本发明这一发现和催化活性提高的突变体，为半乳糖氧化酶的开发改造及应用奠定了基础。
附图说明
图1：温度和pH对半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR酶活力的影响；
图2：温度和pH对半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR酶稳定性的影响。
具体实施方式
下面通过实施例结合附图对本发明的方法做进一步说明。但实施例中所用到的实验条件可以根据已有技术进行选择。对于实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1、半乳糖氧化酶突变位点的构建
以野生型半乳糖氧化酶GAO-5F的质粒为模板，分别以表1中的403F、403R和484F、4844R为引物对进行PCR扩增，构建半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/403A和GAO-5F/484R，与野生型壳聚糖酶GAO-5F相比，GAO-5F/403A将第403位天冬氨酸突变为丙氨酸，GAO-5F/484R将第484位谷氨酰胺突变为精氨酸。
表1引物序列
实施例2、半乳糖氧化酶突变体的活性检测
将上述实施例1中所构建的两个突变体进行酶活检测，与野生型半乳糖氧化酶GAO-5F进行比较。半乳糖氧化酶的活性采用过氧化物酶偶联法测定，具体操作如下：将含有ABTS(4.41mg)，辣根过氧化物酶(45U)，D-半乳糖(90mM)、适量的半乳糖氧化酶和磷酸二氢钾缓冲液(100mM，pH 7.0)的反应混合物在40℃下反应3min，测量OD420吸光值的改变量。一个单位(U)的半乳糖氧化酶活性定义为在上述条件下每分钟氧化2μmolABTS或1μmol O2(半乳糖)所需的酶量。GAO-5F的催化活性为62.84U/mg，相对酶活记为100％，测得的半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/403A和GAO-5F/484R的相对酶活分别为149.40％和144.39％。
实施例3、半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR的构建、诱导表达及纯化
将上述两个位点进行组合突变，以GAO-5F/403A的质粒为模板，484F、4844R为引物对进行PCR扩增，产物经DpnI消化后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，构建壳聚糖酶突变体GAO-5F/AR，与野生型壳聚糖酶GAO-5F相比，GAO-5F/AR将第403位天冬氨酸和484位谷氨酰胺分别突变为丙氨酸和精氨酸。
将上述含有半乳糖氧化酶酶突变体GAO-5F/AR的重组菌接种至LB培养基中，在37℃培养约3h，然后用终浓度为0.1mM的IPTG在25℃继续培养18h。离心收集菌体，超声破碎后，使用Ni-NTA亲和柱纯化蛋白，并用NPI-200洗脱目标蛋白，然后在4℃下进行超滤除盐和浓缩，得到纯化的半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR。
半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR的氨基酸序列：
VAISQPAAKAETPEGSLQFLSLRASAPIGTAINRDKWRVTCDSQHEGDECSKAI
DGDRDTFWHTAWAAGATNDPKPPHTITIDMGSSQNVNGLSVLPRQDGSDHG
WIGRHNVFLSTDGKNWGDAVATGTWFADNTEKYSNFETRPARYVRLVAVTE
ANDQPWTSIAEINVFKAASYTSPQPGLGRWGPTLDFPIVPVAAAVEPTSGKVL
VWSSYRNDAFGGSPGGVTLTSTWDPSTGVISQRTVTVTKHDMFCPGISMDGN
GQVVVTGGNDAQKTSLYDSSSDSWIPGPDMKVARGYQSSATLSNGRVFTIGG
SWSGGIFEKNGEVYDPSSKTWTSLPKALVKPMLTADQQGLYRSDNHGWLFG
WKKGSVFQAGPSTAMNWYYTTGNGDVKSAGKRQSSRGTAPDAMCGNAVM
YDAVKGKILTFGGSPSYQDSDATTNAHIITISEPGSTPKTVFASNGLYYPRTFHT
SVVLPDGNVFITGGQRRGIPFADSTPQLTPELYVPNDDTFYKQQPNSIVRVYHS
ISLLLPDGRVFNGGGGLCGDCDTNHFDAQIYTPNNLYDSNGKLARRPKITKVS
AKSVKVGGKITITADTSIKQASLIRYGTSTHTVNTDQRRIPLSLRRTGTGNSYS
FQVPSDSGIALPGYWMLFVMNSAGVPSVASTLLVTQ
半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR的核苷酸序列：
gtggctatcagccagccggcggctaaagctgaaaccccggaaggctctctgcagttcctgtctctgcgtgctagcgcacc
gatcggcaccgctatcaaccgtgataaatggcgtgtgacctgtgactctcagcacgaaggcgacgaatgctctaaagcga
tcgacggcgaccgtgacaccttctggcacaccgcatgggctgcgggcgctaccaacgacccgaaaccgccgcacacg
atcaccatcgacatgggttcctctcagaacgtgaacggtctgtctgttctgccgcgtcaggacggttctgaccacggttgga
ttggtcgtcacaacgtttttctgtctaccgacggcaaaaactggggcgacgcggttgcgaccggcacctggttcgcagaca
acaccgaaaaatactctaacttcgaaacccgtccggcgcgttacgttcgtctggttgcggttaccgaagcgaacgaccagc
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实施例4、半乳糖氧化酶突变体的酶学性质检测
(1)半乳糖氧化酶突变体的活性分析
采用上述实施例2中半乳糖氧化酶的活性检测方法，测得的半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR的相对酶活451.1U/mg，是野生型半乳糖氧化酶GAO-5F的6.01倍。
(2)温度和pH对半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR酶活力的影响
将所得的半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR用磷酸二氢钾缓冲液(100mM，pH 7.0)稀释至适当的浓度，分别在20-80℃下进行酶促反应以研究温度对其酶活力的影响。将所得的半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR分别用pH为3.0-10.0的缓冲液【柠檬酸钠缓冲液(50mM，pH3.0-6.0)、磷酸盐缓冲液(50mM，pH6.0-8.0)、Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 8.0-9.0)和甘氨酸-NaOH缓冲液(50mM，pH 9.0-10.0)】稀释，然后在40℃下进行反应以研究pH对其酶活力的影响。分别以酶活力的最高值作为100％，结果如图1所示。结果显示半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR的最适温度为60℃，最适pH为7.0。
(3)温度和pH对半乳糖氧化酶GAO-5F/AR酶稳定性的影响
将所得的半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR用磷酸二氢钾缓冲液(100mM，pH 7.0)稀释至适当的浓度，分别在30℃、40℃和50℃下孵育不同时间后测试其残余酶活以研究温度对其稳定性的影响。将所得的半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR在不同pH的磷酸盐缓冲液(pH6.0-8.0)中孵育不同时间，然后在40℃反应检测残余酶活以研究pH对其稳定性的影响。结果如图2所示，当GAO-5F/AR在50℃下储存24h时，可保留其30％的初始酶活。在pH 7.0时表现出最大的稳定性，在孵育40h后仍可保留90％以上的活性。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，并不能以此限制本发明的保护范围。本领域人员可以根据本发明做各种改动或修饰，这些等效形式同样涵盖在本申请所附权利要求书所限定的范围之内。
Claims (6)
1.一种半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR，其特征在于，所述半乳糖氧化酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的一种半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR，其特征在于，所述半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR来自野生型半乳糖氧化酶GAO-5F第403和484位氨基酸进行定点突变，所述野生型半乳糖氧化酶GAO-5F来源于Fusariumodoratissimum。
3.编码权利要求1所述半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种重组质粒，其特征在于，其携带有SEQ ID NO.2所示核苷酸，表达载体为pET28a。
5.一种重组工程菌株，其特征在于，其含有权利要求3所述重组质粒，表达宿主为E.coliBL21(DE3)。
6.权利要求1所述半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR酶的应用。
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