CN117230032B - 半乳糖氧化酶突变体gao-ar/ht、基因、质粒、重组菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种半乳糖氧化酶突变体GAO‑AR/HT、基因、质粒、重组菌及其应用，属于酶工程领域，所述半乳糖氧化酶突变体GAO‑AR/HT的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，与半乳糖氧化酶GAO‑5F/AR相比，第484位精氨酸突变为组氨酸，第634位丝氨酸突变为苏氨酸。本发明还提供了编码所述突变体的基因及含有该基因的重组质粒和重组工程菌株。所述突变体的半乳糖氧化酶活性是GAO‑5F/AR的3倍，能够催化半乳糖产生半乳糖醛酸，且产物含量是GAO‑5F/AR的1.5倍。
Description
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT、基因、质粒、重组菌及其应用。
背景技术
半乳糖氧化酶（E.C. 1.1.3.9）是一种高效的铜依赖性氧化酶，能够催化多种醇（糖）的羟基氧化生成相应的醛，具有广泛的底物特异性；同时半乳糖氧化酶在催化糖反应中表现出严格的区域选择性，仅针对半乳糖分子上的C6位羟基进行氧化。基于这一特性，半乳糖氧化酶已成功应用于多个领域，在食品分析中可用于奶类产品和相关乳制品中的乳糖测定；在医学诊断中可用于粘液分泌细胞的组织化学检查；在造纸行业中，形成的醛衍生物可用于提高纸张的强度；在化学合成领域，醛基产物可以进一步氧化形成羧基，这种方法在合成药物中间体、制备新型糖类以及核苷酸等产品中具有广泛的应用。
由酶催化的氧化反应通常具有高度的化学、立体和区域选择性，且反应条件温和、绿色环保。而这些生物氧化最常见的是由一个脱氢酶或多个脱氢酶级联实现的，尽管这些应用很成功，但是NAD(P)H依赖的氧化级联存在一些固有的缺点，如它们经常会在不利的平衡中出现可逆性，并且需要有一个辅因子再生***来驱动反应。而由氧依赖性酶参与的氧化级联则代表了一种不可逆和更有效的顺序底物氧化方案，且不需要昂贵的辅因子。已有研究表明，在延长反应时间和高酶浓度的条件下，野生型半乳糖氧化酶在完成C6位羟基的氧化以后，会以极低的速率继续将醛基进一步氧化成羧基。因此，如果能够在单一半乳糖氧化酶中实现羧酸的完整合成流程，对于提高半乳糖氧化酶的高值化利用，同时为羧酸合成开辟新的途径具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能够由半乳糖生成半乳糖醛酸的高效半乳糖氧化酶。
针对现有技术的不足，本发明提供了一种半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT、基因、质粒、重组菌及其应用，通过对半乳糖氧化酶进行分子改造，实现半乳糖氧化酶催化活性的提高，为其工业化应用奠定基础；其催化产物半乳糖醛酸具有抗肿瘤、免疫调节等生理活性，可应用于医药、保健食品等领域。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT，所述半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，与半乳糖氧化酶GAO-5F/AR相比，第484位精氨酸突变为组氨酸，第634位丝氨酸突变为苏氨酸。
进一步，所述半乳糖氧化酶GAO-5F/AR是来源于Fusarium odoratissimum的半乳糖氧化酶GAO-5F的突变体。
本发明还提供编码所述半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供一种重组质粒，其携带有SEQ ID NO.2所示核苷酸，表达载体优选为pET-28a(+)。
本发明还提供含有上述重组质粒转化得到的重组工程菌株，表达宿主优选为E. coli BL21(DE3)。
本发明还提供所述半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT的应用，所述的应用具体为利用所述半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT催化半乳糖生成半乳糖醛酸。
本发明与现有技术相比的有益效果：本发明针对现有半乳糖氧化酶催化半乳糖制备半乳糖醛酸活性低的问题，以GAO-5F/AR为研究起点，通过对其进行蛋白质工程改造，首次获得了将第484位精氨酸和634位丝氨酸分别突变为组氨酸和苏氨酸的双突变体GAO-AR/HT，突变体的酶活得到进一步提升，是GAO-5F/AR的3倍。进而测定了GAO-5F/AR与GAO-AR/HT催化半乳糖生成的半乳糖醛酸的含量。结果显示，GAO-AR/HT催化生成的半乳糖醛酸含量始终高于GAO-5F/AR，在半乳糖醛酸含量最高点时，GAO-AR/HT产生的半乳糖醛酸含量是GAO-5F/AR的1.5倍。本发明这一发现为利用半乳糖氧化酶制备半乳糖醛酸的制备奠定了基础。
附图说明
图1为温度和pH对半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT酶活力的影响；a为温度影响图；
图2为pH对半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT酶活力的影响；a为温度影响图；
图3为温度对半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT酶稳定性的影响；a为温度影响图；
图4为pH对半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT酶稳定性的影响；a为温度影响图；
图5为GAO-5F/AR与GAO-AR/HT生成半乳糖醛酸含量随时间变化曲线。
具体实施方式
下面通过实施例结合附图对本发明的技术方案做进一步说明。但实施例中所用到的实验条件可以根据已有技术进行选择。对于实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明的技术方案而非用于限定本发明技术方案的范围。
实施例1、半乳糖氧化酶突变位点的构建：以半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR【半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR，与野生型半乳糖氧化酶GAO-5F（GenBank ID：XM_031208735.1）相比，对第403和484位氨基酸进行了定点突变，所述野生型半乳糖氧化酶GAO-5F来源于Fusarium odoratissimum。】的质粒为模板，分别以表1中的484F、484R和634F、634R为引物对进行PCR扩增，构建半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR/484H和GAO-5F/AR/634T，与GAO-5F/AR相比，GAO-5F/AR/484H将第484位精氨酸突变为组氨酸，GAO-5F/AR/634T将第634位丝氨酸突变为苏氨酸；
表1 引物序列
。
实施例2、半乳糖氧化酶突变体的活性检测：将上述实施例1中构建的两个突变体进行酶活检测，并与GAO-5F/AR比较。半乳糖氧化酶的酶活测定采用过氧化物酶偶联法，具体操作如下：将含有ABTS（4.41 mg）、辣根过氧化物酶（45 U）、D-半乳糖（90 mM）、适量的半乳糖氧化酶和磷酸二氢钠缓冲液（100 mM，pH 7.0）的混合物在40℃下反应3 min，420 nm处测定吸光值的变化。一个单位（U）的半乳糖氧化酶活性定义为在上述条件下每分钟氧化2 μmol ABTS或1 μmol O2（半乳糖）所需的酶量。GAO-5F/AR的催化活性为160 U/mg，测得的半乳糖氧化酶突变体GAO-5F/AR/484H和GAO-5F/AR/634T的酶活分别提高了1.55和1.77倍。
实施例3、半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT的构建、诱导表达及纯化：将上述两个位点进行组合突变，以GAO-5F/AR/484H的质粒为模板，634F、634R为引物对进行PCR扩增，产物经DpnI酶消化后，转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，构建半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT，其第484位精氨酸和634位丝氨酸分别突变为组氨酸和苏氨酸。
将上述半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT的重组菌接种至LB液体培养基中，在37℃培养约3 h，然后用IPTG（终浓度为0.1 mM）在20℃继续培养18 h。离心收集菌体，超声破碎后，使用Ni-NTA亲和柱纯化蛋白，并用NPI-150洗脱目标蛋白，然后在4℃下进行超滤除盐和浓缩，得到纯化后的半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT。
半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT的氨基酸序列：
VAISQPAAKAETPEGSLQFLSLRASAPIGTAINRDKWRVTCDSQHEGDECSKAIDGDRDTFWHTAWAAGATNDPKPPHTITIDMGSSQNVNGLSVLPRQDGSDHGWIGRHNVFLSTDGKNWGDAVATGTWFADNTEKYSNFETRPARYVRLVAVTEANDQPWTSIAEINVFKAASYTSPQPGLGRWGPTLDFPIVPVAAAVEPTSGKVLVWSSYRNDAFGGSPGGVTLTSTWDPSTGVISQRTVTVTKHDMFCPGISMDGNGQVVVTGGNDAQKTSLYDSSSDSWIPGPDMKVARGYQSSATLSNGRVFTIGGSWSGGIFEKNGEVYDPSSKTWTSLPKALVKPMLTADQQGLYRSDNHGWLFGWKKGSVFQAGPSTAMNWYYTTGNGDVKSAGKRQSSRGTAPDAMCGNAVMYDAVKGKILTFGGSPSYQDSDATTNAHIITISEPGSTPKTVFASNGLYYPRTFHTSVVLPDGNVFITGGQHRGIPFADSTPQLTPELYVPNDDTFYKQQPNSIVRVYHSISLLLPDGRVFNGGGGLCGDCDTNHFDAQIYTPNNLYDSNGKLARRPKITKVSAKSVKVGGKITITADTSIKQASLIRYGTSTHTVNTDQRRIPLSLRRTGTGNSYSFQVPTDSGIALPGYWMLFVMNSAGVPSVASTLLVTQ；
半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT的核苷酸序列：
gtggctatcagccagccggcggctaaagctgaaaccccggaaggctctctgcagttcctgtctctgcgtgctagcgcaccgatcggcaccgctatcaaccgtgataaatggcgtgtgacctgtgactctcagcacgaaggcgacgaatgctctaaagcgatcgacggcgaccgtgacaccttctggcacaccgcatgggctgcgggcgctaccaacgacccgaaaccgccgcacacgatcaccatcgacatgggttcctctcagaacgtgaacggtctgtctgttctgccgcgtcaggacggttctgaccacggttggattggtcgtcacaacgtttttctgtctaccgacggcaaaaactggggcgacgcggttgcgaccggcacctggttcgcagacaacaccgaaaaatactctaacttcgaaacccgtccggcgcgttacgttcgtctggttgcggttaccgaagcgaacgaccagccgtggacctctatcgcggaaatcaacgttttcaaagctgcttcctacacctctccgcagccgggtctgggtcgttggggtccgaccctggacttcccgatcgttccggttgcagcggccgttgaaccgacctccggtaaagtgctggtttggtcctcttaccgtaacgacgctttcggtggttcgccgggtggtgttaccctgacctccacctgggacccgtccaccggtgttatctctcagcgtaccgttaccgttactaaacacgacatgttctgccctggtatctctatggacggcaacggtcaggttgttgttaccggtggtaacgacgcgcagaaaacctctctgtacgactcctcttctgattcttggattccgggtccggacatgaaagtggcgcgtggctaccagtctagcgctaccctgtctaacggtcgtgttttcaccatcggtggttcttggtctggtggtatcttcgagaaaaacggtgaggtttatgacccgtcctctaaaacctggacctctctgccgaaagcgctggttaaaccgatgctgaccgctgaccagcagggtctgtaccgttctgataaccacggttggctgttcggttggaaaaaaggttctgttttccaggctggtccgtctaccgctatgaactggtactacaccaccggtaacggcgatgttaaatctgcgggtaaacgtcagtctagccgtggtaccgccccggatgcaatgtgcggtaacgcggttatgtacgatgcggttaaaggtaaaatcctgaccttcggtggttccccgtcttaccaggactctgatgcgaccaccaacgcgcacatcatcaccatctccgaaccgggttctaccccgaaaaccgttttcgcgtctaacggtctgtactacccgcgtaccttccacactagcgttgttctgccggacggtaacgtgttcatcaccggtggccagcatcgtggtatcccgttcgcggactctaccccgcagctgaccccggaactgtacgttccgaacgacgataccttctacaaacagcagccgaactctattgttcgtgtttaccactctatctccctgctgctgccggatggccgtgttttcaacggtggcggcggcctgtgcggtgactgcgacaccaaccacttcgacgcacagatctacaccccgaacaacctgtacgactctaacggtaaactggctcgtcgtccgaaaatcaccaaagtgtctgctaaatctgtgaaagttggtggtaaaatcactatcaccgcagacaccagcatcaaacaggcatctctgatccgttacggtacctccacccacaccgttaacaccgaccagcgtcgtatcccgctgtctctgcgtcgtaccggtaccggtaactcttacagcttccaggttccgacggactctggtatcgctctgccgggttactggatgctgttcgttatgaactctgcgggtgttccgtctgttgcgtctaccctgctggttacccagctcgagcaccaccaccaccaccactgagatccggctgctaacaaagcccgaaag。
实施例4、半乳糖氧化酶突变体的酶学性质表征。
（1）半乳糖氧化酶突变体的活性分析：采用上述实施例2中半乳糖氧化酶的活性检测方法，测得的半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT相对酶活470 U/mg，是GAO-5F/AR的3倍。
（2）温度和pH对半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT酶活力的影响：将所得的半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT用磷酸二氢钠缓冲液（100 mM，pH 7.0）稀释至适当的浓度，分别在20-60℃下进行酶促反应以探究温度对酶活力的影响。然后分别用pH为3.0-10.0的缓冲液【柠檬酸钠缓冲液（50 mM，pH 3.0-6.0）、磷酸盐缓冲液（50 mM，pH 6.0-8.0）、Tris-HCl缓冲液（50 mM，pH 8.0-9.0）和甘氨酸-NaOH缓冲液（50 mM，pH 9.0-10.0）】稀释，然后在40℃下反应以探究pH对其酶活力的影响。酶活力的最高值记为100%，结果如图1、图2所示。结果显示，半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT的最适温度为40℃，最适pH为7.0。
（3）温度和pH对半乳糖氧化酶GAO-AR/HT酶稳定性的影响：将所得的半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT用磷酸二氢钠缓冲液（100 mM，pH 7.0）稀释至适当的浓度，分别在30℃、40℃和50℃下孵育不同时间后测定残余酶活以探究温度对其稳定性的影响。将所得的半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT在不同pH的磷酸盐缓冲液（pH 6.0-8.0）中孵育不同时间后，40℃下测定残余酶活以探究pH对其稳定性的影响。结果如图3所示，GAO-AR/HT在50℃下孵育25 h，可保留25%的初始酶活；在30℃下孵育25 h后，保留了大约40%的初始活性。如图4所示，GAO-AR/HT在pH 7.0的条件下孵育42 h后仍可保持45%以上的活性；在pH 6.0-8.0条件下储存42 h后，其残余酶活也在35%以上。
实施例5、半乳糖氧化酶催化半乳糖生成半乳糖醛酸的含量测定：半乳糖醛酸含量测定采用间羟基联苯比色法，具体操作如下：将含有D-半乳糖（5 mM）、适量的半乳糖氧化酶和磷酸二氢钠缓冲液（100 mM，pH 7.0）的反应混合物在40℃下反应不同时间。取1 mL反应液，置于冰水浴中，加入四硼酸钠/硫酸溶液6 mL，待全部加完后，用旋涡混合器混匀，沸水中加热5 min，冰水浴中冷却后加入间羟基联苯溶液100 μL。混匀后振摇5 min，超声除去气泡。以1 mL不加酶的反应液同上操作制得空白液作为对照，525 nm波长处测定吸光值的变化。结果如图5所示，随着反应的进行，半乳糖醛酸含量变化的整体趋势是先升高后趋于平缓，在含量最高点时，GAO-AR/HT产生的半乳糖醛酸含量是GAO-5F/AR的1.5倍。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，并不能以此限制本发明的保护范围。本领域人员可以根据本发明做各种改动或修饰，这些等效形式同样涵盖在本申请所附权利要求书所限定的范围之内。
Claims (6)
1.一种半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT，其特征在于，所述半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，与半乳糖氧化酶GAO-5F/AR相比，第484位精氨酸突变为组氨酸，第634位丝氨酸突变为苏氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT，其特征在于，所述半乳糖氧化酶GAO-5F/AR是来源于Fusarium odoratissimum的半乳糖氧化酶GAO-5F的突变体。
3.编码权利要求1所述半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒携带有SEQ ID NO.2所示核苷酸，表达载体为pET-28a(+)。
5.一种重组工程菌株，其特征在于，所述菌株含有权利要求4所述重组质粒，表达宿主为E.coliBL21(DE3)。
6.权利要求1所述半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT的应用，其特征在于，所述的应用具体为利用所述半乳糖氧化酶突变体GAO-AR/HT催化半乳糖生成半乳糖醛酸。
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Non-Patent Citations (3)
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| Ma,L.-J. et al..galactose oxidase [Fusarium odoratissimum NRRL 54006]，ACCESSION：XP_031061741.1.GenBank.2020,第1-2页. * |
| 贾能勤等.半乳糖氧化酶的生物电化学特性.上海师范大学学报(自然科学版).2002,第31卷(第4期),第38-41页. * |
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