CN116286437B - 一种枯草芽孢杆菌2-20及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)2‑20及其应用。涉及农业微生物菌剂及其应用技术领域。保藏编号为CGMCC：NO.24834。本发明提供的菌株，盆栽实验和大田实验均证实对农作物、蔬菜作物具有促生作用；而且，本发明中枯草芽孢杆菌来源于土壤，安全环保、易培养，使用后无污染、无残留、对人畜无害，符合绿色农业的发展要求。
Description
技术领域
本发明涉及农业微生物菌剂及其应用技术领域，更具体的说是涉及一种枯草芽孢杆菌2-20及其应用。
背景技术
微生物肥料是一类含有活的微生物的特定制品，应用于农业生产中，能够获得特定的肥料效应。它不仅能促进作物生长，提高作物产量，改善农产品品质，还能改善土壤，增加土壤肥力。自生固氮菌可以将空气中的氮转化为植物可以吸收利用的氨，从而达到减少化肥使用的目的。芽孢杆菌可以形成芽孢，具有抗逆性强，易仓储等优点，常用于微生物肥料的开发。在具有固氮作用的芽孢杆菌中，筛选可以产生植物激素如生长素(吲哚乙酸)、细胞***素、赤霉素等促生长的菌株用于农业生产，对于减少氮肥投入，提高植物作物生长具有重要意义。
CN106190887A公开了一种枯草芽孢杆菌T400，其固氮酶活性为600～800nmol/(mL·h)，吲哚乙酸浓度为95～103mg/L。
CN105316268A公开了一种短小芽孢杆菌，其发酵液中赤霉素含量为GA3为51.2mg/L、GA4为6.9mg/L、GA7为8.7mg/L，但目前并没有关于具有固氮酶活性还能高产细胞***素和赤霉素的枯草芽孢杆菌的相关报道。
因此，能否提供一种具体的枯草芽孢杆菌克服上述技术障碍是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌2-20及其应用。可以同时具有固氮酶活性、高产细胞***素和赤霉素，因此可应用于制备微生物肥料中，促进植物的生长发育。
保藏信息：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)2-20，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC：NO.24834，保藏日期为2022年5月6日。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)2-20，保藏编号为CGMCC：NO.24834。
本发明还提供了一种微生物菌剂，包括枯草芽孢杆菌2-20，保藏编号为CGMCC：NO.24834。
本发明还提供了一种微生物发酵液，使用枯草芽孢杆菌2-20进行发酵，保藏编号为CGMCC：NO.24834。
本发明还提供了一种微生物菌肥，包括枯草芽孢杆菌2-20，保藏编号为CGMCC：NO.24834。
本发明还提供了上述枯草芽孢杆菌2-20，或上述菌剂，或上述发酵液，或上述菌肥在农业、工业生产中的应用。
优选的：应用于西红柿、小麦、玉米。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种枯草芽孢杆菌2-20及其应用，取得的技术效果为盆栽实验和大田实验均证实枯草芽孢杆菌2-20对农作物、蔬菜作物具有促生作用；而且，本发明中枯草芽孢杆菌2-20来源于土壤，安全环保、易培养，使用后无污染、无残留、对人畜无害，符合绿色农业的发展要求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明提供的HPLC法测定赤霉素GA3含量与吸收峰面积的标准曲线图。
图2附图为本发明提供的玉米素含量与吸收峰面积的标准曲线图。
图3附图为本发明提供的玉米素核苷含量与相对峰面积的标准曲线图。
图4附图为本发明提供的异戊烯基腺嘌呤含量与相对峰面积的标准曲线图。
图5附图为本发明提供的枯草芽孢杆菌2-20菌株的菌落图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种枯草芽孢杆菌2-20及其应用。
实施例中，所用实验材料：
LB培养基：蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化钠10g，琼脂20g，添加蒸馏水定容至1L，混匀后分装于三角瓶中，121℃灭菌30min。
阿须贝氏无氮培养基：甘露醇10g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO4·2H2O 0.1g，CaCO35 g，添加蒸馏水定容至1L，混匀后分装于三角瓶中，121℃灭菌30min，其中，作为固体培养基时需加入琼脂20g。
枯草芽孢杆菌2-20保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC：NO.24834，保藏日期为2022年5月6日；本发明所用其它原料、试剂均购自市场。
未提及的实验材料、实验方法为常规实验方法，在此不再赘述。
实施例1
菌株2-20的分离、筛选
菌株2-20分离土壤采集自河北省保定市莲池区玉米田土壤，具体分离、筛选过程为：
称取10g土壤置于装有90mL含玻璃珠的灭菌生理盐水中，使用涡旋振荡器充分震荡后，将其置于80℃热水中30min，取出后冷却至室温，吸取1mL上清液，采用梯度稀释方法将土壤悬液稀释102、103、104或105倍，取各梯度稀释液0.1mL分别涂布于阿须贝氏无氮培养基上，随后将涂布平板置于30℃恒温培养箱中，倒置培养5天，每天观察培养基上菌落生长情况，采用三区划线得到单菌落，并将其保存于阿须贝氏无氮培养基斜面上，待用；
通过测定分离到的各菌株固氮酶活性，以及各菌株发酵后细胞***素含量和赤霉素含量，筛选具有固氮酶活性，高产细胞***素和赤霉素的细菌。
菌株获得：
首先采用乙炔还原法对各菌株的固氮酶活性进行测定获得具备固氮酶活性的菌株。
试验组将保存的各菌株用阿须贝氏固体培养基活化，用接种环挑取菌体接种到装有5mL阿须贝氏固体培养基的10mL试管中，用橡胶塞密封。以未接种菌体的相同试管为对照组。两组均置于30℃培养48h后，向试管中注入试管1/10体积的乙炔气体，继续培养24h，从试管中抽取0.5mL气体注入气相色谱仪(浙江福立分析仪器有限公司FL9790)中，测定乙炔、乙烯的含量。
按下列公式计算固氮酶活性大小：
C＝(hx×c×V)/(24.9×hs×t)其中，hx为样品峰面积值；hs为标准C2H4峰面积值；c为标准C2H4浓度(nmol/m L)；V为培养容器体积(mL)；t为样品培养时间(h)；C为产生的C2H4浓度[nmol/(m L·h)]。
其次，采用高效液相色谱(HPLC)法测定发酵液上清中赤霉素和细胞***素含量。
将具有固氮酶活性的菌株接种于LB培养基中，置于30℃、180r/min振荡培养48h后得到发酵液，将发酵液于8000r/min离心10min得到发酵液上清，上清液过0.45μm的微孔滤膜，滤液直接进行赤霉素和细胞***素的测定。
赤霉素产生菌的获得。赤霉素种类较多，实验主要对菌株产GA3能力进行测定。测定前使用HPLC对分析纯的GA3做标准曲线，如图1所示。
细胞***素产生菌的获得。细胞***素的种类较多，筛选方法主要对菌株产生玉米素、玉米素核苷和异戊烯基腺嘌呤的能力进行测定。使用HPLC对分析纯的玉米素、玉米素核苷和异戊烯基腺嘌呤分别做标准曲线，如图2～图4所示。
通过以上测定筛选出一株具有固氮酶活性，高产赤霉素和细胞***素的菌株，命名为2-20。
通过上述测定方法得到该菌株固氮酶活性达到1210nmol/(mL·h)，赤霉素GA3含量达68.45mg/L，细胞***素含量达到42.67mg/L。
最后，通过测定细菌16S rDNA序列和菌株生理生化特性对细菌进行鉴定。
将上述分离筛选到的菌株，采用PCR方法扩增16S rDNA序列，PCR产物送北京六合华大基因科技有限公司测序，根据的测序结果(CGGCGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTT如SEQ ID NO.1所示)，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov在线查询分析，利用Blast软件在GenBank中与其它16S rDNA序列进行同源性比较。根据序列比对结果，测定该菌株生理生化特征(糖类、醇类发酵实验、V-P测定实验、甲基红实验、产氨实验、硝酸盐还原实验、淀粉水解实验、吲哚实验、卵磷脂酶、接触酶、明胶液化实验、丙二酸利用实验均为阳性；荧光色素、柠檬酸利用为阴性；耐受7％浓度氯化钠，如表1)，经16S rDNA序列和生理生化性质，该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(B acillus subtilis)，该菌株的菌落图如图4所示；该菌株已于2022年5月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.24834。
表1 2-20菌株生理生化特性
| 实验类型 | 实验结果 | 实验类型 | 实验结果 |
| 厌氧性实验 | 兼性厌氧 | 接触酶 | + |
| 运动性 | + | 荧光色素 | - |
| 丙二酸利用 | + | 产氨实验 | + |
| 柠檬酸利用 | - | 吲哚实验 | + |
| 糖、醇类发酵 | + | 硝酸盐还原 | + |
| 甲基红实验 | + | 2％氯化钠 | + |
| V-P测定 | + | 5％氯化钠 | + |
| 淀粉水解 | + | 7％氯化钠 | + |
| 明胶液化 | + | 10％氯化钠 | - |
| 卵磷脂酶 | + |
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。
实施例2
枯草芽孢杆菌2-20发酵液在西红柿上的应用
西红柿种子表面消毒后，将种子种植在土壤中。实验设置2个处理，每个处理30个重复，分别为：不接菌处理(对照组)和接菌处理(实验组)，接菌处理的接种量为5mL/株(发酵液稀释50倍)。7天后测定出苗率，21天后测量株高、鲜物质量和干物质量，如表2所示；
表2枯草芽孢杆菌2-20对西红柿幼苗生长的影响
结果表明，与未接菌的对照组相比，枯草芽孢杆菌能明显促进了西红柿幼苗的生长，增加了幼苗的生物量。
实施例3
枯草芽孢杆菌2-20发酵液在小麦上的应用
挑选颗粒饱满的小麦种子，用70％的乙醇进行表面消毒，以无菌水冲洗至少6次，最后一次冲洗的无菌水涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，检查小麦表面消毒是否彻底。将消毒的小麦种子播种于花盆土壤中，每盆种6颗，表面覆盖约1cm土壤。试验设2个处理，实验组每个植株接种2-20菌液(约108个/mL)1mL，对照组使用等量的清水，每个处理10个重复。花盆放置于温室，设置培养条件为光照16h/8h、温度25℃/18℃。待小麦出苗后，每隔5天浇一次水，60天后测定植物株高、干重和氮含量。如表3所示；
表3小麦接种2-20菌液前后植物株高、干重和氮含量的变化
结果表明，与未接菌的对照组相比，枯草芽孢杆菌2-20能明显促进小麦的生长，增加植物固氮能力。
实施例4
枯草芽孢杆菌2-20发酵液在玉米上的应用
挑选颗粒饱满的玉米种子，直接种植于大田中。待玉米出苗后，使用稀释后的发酵液1次，1个月后再使用一次。试验采用滴灌方式，设2个处理，实验组每个植株平均使用稀释50倍的2-20菌液5mL，对照组使用等量的清水，每个处理1亩。考察成熟期玉米干物质积累和氮素积累的影响，如表4所示；
表4 2-20发酵液对成熟期玉米干物质及氮素积累的影响
结果表明，与未接菌的对照组相比，枯草芽孢杆菌2-20能明显促进玉米的生长和氮素在植物中的积累量。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (5)
1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)2-20，其特征在于，保藏编号为CGMCC：NO.24834。
2.一种微生物菌剂，其特征在于 ，包括枯草芽孢杆菌2- 20 ，保藏编号为CG MCC ：NO.24834。
3.一种微生物发酵液，其特征在于，使用枯草芽孢杆菌2-20进行发酵，保藏编号为CGMCC：NO .24834。
4.一种微生物菌肥 ，其特征在于 ，包括枯草芽孢杆菌2- 20 ，保藏编号为CG MCC ：NO.24834。
5.权利要求1所述枯草芽孢杆菌2-20，或权利要求2所述菌剂，或权利要求3所述发酵液，或权利要求4所述菌肥在促西红柿、小麦、玉米生长中的应用。
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