CN109400679B - 一种源于黄姑鱼鱼鳔的降血脂六肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种源于黄姑鱼鱼鳔的降血脂六肽及其应用,属于降血脂寡肽技术领域,由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽,ESI‑MS测定分子量为687.75Da。上述降血脂六肽在制备降血脂药品和/或保健产品和/或食品添加剂的应用。本发明降血脂六肽能下调成脂基因表达水平,促进脂肪酸β氧化,减少脂质的生成,具有良好的降脂活性的源于黄姑鱼鱼鳔的降血脂六肽,该降血脂六肽可应用于开发降血脂药品、保健产品以及食品添加剂。

Description

一种源于黄姑鱼鱼鳔的降血脂六肽及其应用
技术领域
本发明属于降血脂寡肽技术领域,具体涉及一种源于黄姑鱼鱼鳔的降血脂六 肽及其应用。
背景技术
海鱼鱼鳔为“海洋八珍”之一,素有“海洋人参”之誉。鱼鳔主要成分为 高级胶原蛋白、黏多糖,并含有多种维生素及钙、锌、铁、硒等多种微量元素。 鱼鳔能很好的被人体消化吸收利用,是因为其脂肪含量低,主要成分是生物大分 子胶原蛋白质。和大多数肉类一样它是人体补充合成蛋白质的原料。人体中胶原 蛋白以水溶液的形式藏于组织器官中,起到了改善组织营养状态的作用。同时胶 原蛋白质也可加速新陈代谢。富含胶原蛋白质的食物是通过胶原蛋白的结合水去 影响着组织的生理功能,它不仅仅可以增强人体的营养同时也能促进人体的生长 发育,增强人体抵抗力,延缓衰老。我国食用鱼鳔有悠久的历史,北魏《齐民要 术》、唐代《新唐书·地理志》和李时珍的《本草纲目》等对鱼鳔的性能均有记载。现代中药学认为:鱼鳔味甘性平、养血止血,补肾固精。用鱼镖配合中药可治疗 消化性溃疡、肺结核、风湿性心脏病、再生障碍性贫血及脉管炎等疾患。最近, 我国医务工作者还发现鱼鳔能增强胃肠道的消化吸收功能,提高食欲,有利于防 治食欲不振、厌食、消化不良、腹胀、便秘等症,鱼鳔还能增强肌肉组织的韧性 和弹力,增强体力,消除疲劳;又能滋润皮肤,使皮肤细腻光滑;还能加强脑与 神经及内分泌功能,促进生长发育,维持腺体正常分泌,并可防治智力减退、神 经传导滞缓、反应迟钝、小儿发育不良、产妇乳汁分泌不足、老年健忘失眠等, 由于鱼鳔含有大量胶汁,又具有活血、补血、止血、御寒、祛湿等功效,所以能提高机体免疫力。
鱼鳔具有高蛋白低脂肪含量的特点,因此是优良的蛋白质来源,它既能补 充人体的蛋白质和必须氨基酸,也具有很高的药用价值。现在市场上鱼螺的应用 主要是烹饪和干制品加工为主,干制生产的鱼螺附加值低,并且有明显的地域化 特点,主要集中在沿海地区,而内地少有食用,从一定程度上制约了鱼鳔的销售, 经济价值有限,因此研究出一种经济、可行的鱼螺深加工技术成为当务之急。而 目前以黄姑鱼鱼鳔为原料,利用酶解技术制备黄姑鱼鱼鳔降血脂肽的工艺研究处 于空白阶段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能下调成脂基因表达水平,促进脂肪酸β氧化, 减少脂质的生成,具有良好的降脂活性的源于黄姑鱼鱼鳔的降血脂六肽,该降血 脂六肽可应用于开发降血脂药品、保健产品以及食品添加剂。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为:
一种源于黄姑鱼鱼鳔的降血脂六肽,由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽,ESI-MS测定分子量为687.75Da。本发明黄姑鱼鱼鳔降血脂寡肽 Trp-Gly-Ile-Glu-Ala-Leu(WGIEAL)可以降低细胞内甘油三酯(TG)和总胆固 醇(TC)水平;Trp-Gly-Ile-Glu-Ala-Leu(WGIEAL)能下调成脂基因醇调节元 件结合蛋白(SREBP)1c和2的表达水平,上调脂质氧化基因肉毒碱棕榈酰转 移酶-1(CPT-1)和酰基辅酶A氧化酶(ACOX)的表达水平。因此, Trp-Gly-Ile-Glu-Ala-Leu(WGIEAL)既能下调成脂基因表达水平,又能促进脂肪 酸β氧化,减少脂质的生成,具有良好的降脂活性,可开发为降血脂药品、保健 产,以及食品添加剂。
本发明还提供如下:
一种用于下调成脂基因表达水平的试剂,包含上述降血脂六肽作为活性成 分,给药方式为注射给药。
一种用于促进脂肪酸β氧化的药剂,包含上述降血脂六肽作为活性成分,给 药方式为注射给药。
一种源于黄姑鱼鱼鳔的降血脂六肽的应用,在制备降血脂药品和/或保健产 品和/或食品添加剂的应用。
一种源于黄姑鱼鱼鳔的降血脂六肽的制备方法,包括,
将黄姑鱼鱼鳔匀浆、酶解;
将所得黄姑鱼鱼鳔酶解液经超滤、离子交换层析,收集洗脱部分,冻干;
将所得离子交换层析酶解物溶液经凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化,即 得黄姑鱼鱼鳔降血脂六肽。
作为优选,黄姑鱼鱼鳔的酶解步骤为:取新鲜黄姑鱼,摘取鱼鳔、洗净匀浆 后,按料液比1g:10~15mL加入蒸馏水,调节pH值至9.0~10.0,加入鱼鳔重 量1.5~2.5%碱性蛋白酶(酶活力≥2.0×105U/g),50~60℃酶解4~6h,于95~ 100℃、15~20min灭酶,冷却至室温,12,000r/min离心20~25min,收集上清 液,即黄姑鱼鱼鳔酶解液。
作为优选,黄姑鱼为日本黄姑鱼(Nibea japonica)。
作为优选,离子交换层析用大孔吸附树脂柱为D101。
作为优选,凝胶柱层析的具体步骤为:将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸 水配成浓度为40~50mg/mL的溶液,于4℃、10,000~12,000r/min离心15~20min, 上清液按照体积比1mL:20~25mL加入到葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析柱中, 用超纯水进行洗脱,根据215nm下的吸光度曲线收集洗脱组分,其中,降血脂 活性最强组分为凝胶层析酶解物。
作为优选,RP-HPLC纯化的具体步骤为:将所述凝胶层析酶解物用双蒸水 配成50~80μg/mL的溶液,利用RP-HPLC进行纯化,根据各组分降血脂活性筛 选获得降血脂六肽;其中进样量为15~20μL;色谱柱Kromasil C18(250mm×4.6 mm,5μm);流动相为35%乙腈;洗脱速度为1.0~1.5mL/min;紫外检测波长为 215nm。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
本发明黄姑鱼鱼鳔降血脂寡肽Trp-Gly-Ile-Glu-Ala-Leu(WGIEAL)可以降 低细胞内甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)水平;Trp-Gly-Ile-Glu-Ala-Leu (WGIEAL)能能下调成脂基因醇调节元件结合蛋白(SREBP)1c和2的表达 水平,上调脂质氧化基因肉毒碱棕榈酰转移酶-1(CPT-1)和酰基辅酶A氧化酶 (ACOX)的表达水平。因此,Trp-Gly-Ile-Glu-Ala-Leu(WGIEAL)既能下调成脂 基因表达水平,又能促进脂肪酸β氧化,减少脂质的生成,具有良好的降脂活性, 可开发为降血脂药品、保健产,以及食品添加剂。
本发明采用了上述技术方案提供一种源于黄姑鱼鱼鳔的降血脂六肽及其应 用,弥补了现有技术的不足,设计合理,操作方便。
附图说明
图1是实施例1中大孔树脂纯化组分的葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析图;
图2是实施例1中葡聚糖凝胶Sephadex LH-20制备酶解物的RP-HPLC分 析;
图3是实施例1中降血脂六肽的质谱图;
图4是实施例1中降血脂六肽对HepG2细胞增殖的影响;
图5是实施例1中降血脂六肽对HepG2细胞内甘油三酯(TG)含量的影响;
图6是实施例1中降血脂六肽对HepG2细胞内总胆固醇(TC)含量的影响;
图7是实施例1中降血脂六肽对HepG2细胞内脂质合成相关基因--固醇调 节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)表达的影响;
图8是实施例1中降血脂六肽对HepG2细胞内脂质合成相关基因--固醇调 节元件结合蛋白2(SREBP-2)表达的影响;
图9是实施例1中降血脂六肽对HepG2细胞内脂质氧化相关基因--肉毒碱 棕榈酰转移酶-1(CPT-1)表达的影响;
图10是实施例1中降血脂六肽对HepG2细胞内脂质合成相关基因--酰基辅 酶A氧化酶(ACOX)表达的影响。
具体实施方式
下面,结合具体实施例对本发明一实施方式的一种源于黄姑鱼鱼鳔的降血脂 六肽及其应用作进一步说明。
实施例1:
一种源于黄姑鱼鱼鳔的降血脂六肽,由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽, 其氨基酸序列为Trp-Gly-Ile-Glu-Ala-Leu(WGIEAL)。
一种源于黄姑鱼鱼鳔的降血脂六肽的制备方法,包括,
1)黄姑鱼鱼鳔的酶解:取新鲜日本黄姑鱼(Nibea japonica),摘取鱼鳔、 洗净匀浆后,按料液比1g:12mL加入蒸馏水,调节pH值至9.5,加入鱼鳔重量 2.0%碱性蛋白酶(酶活力≥2.0×105U/g),55℃酶解5h,于95℃、15min灭酶,冷 却至室温,12000r/min离心25min,收集上清液,即黄姑鱼鱼鳔酶解液;
2)黄姑鱼鱼鳔降血脂寡肽的制备:将黄姑鱼鱼鳔酶解液经截留分子量为 1kDa超滤膜进行分级,收集截留分子量小于1kDa组分,得到超滤酶解液。超滤 酶解液按照体积比1mL:8mL加入到装有D101大孔吸附树脂柱中,先用3柱体 积洗脱,然后用2柱体积95乙醇洗脱,收集乙醇洗脱部分,冻干,冻干后样品 配成一定浓度的溶液分别用凝胶柱层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化, 得到黄姑鱼鱼鳔降血脂六肽,利用氨基酸序列分析仪和质谱测定其结构,具体过 程为:
①凝胶柱层析:将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为45mg/mL 的溶液,于4℃、12000r/min离心20min,上清液按照体积比1mL:20~25mL加 入到葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析柱中,用超纯水进行洗脱,根据280nm下 的吸光度曲线(如图1)收集洗脱组分NJ-II,即为凝胶层析酶解物;
②RP-HPLC纯化:将上述凝胶层析酶解物NJ-II用双蒸水配成40~50μg/mL 的溶液,利用RP-HPLC进行纯化,其中进样量15~20μL;色谱柱Kromasil C18 (250mm×4.6mm,5μm);流动相:35%乙腈;洗脱速度1.0~1.5mL/min;紫外检 测波长215nm,根据降血脂活性制备降血脂活性寡肽(如图2),经RP-HPLC检 测为单一峰,利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为 Trp-Gly-Ile-Glu-Ala-Leu(WGIEAL),ESI-MS测定分子量为687.75Da(如图3)。
将制得的黄姑鱼鱼鳔降血脂寡肽Trp-Gly-Ile-Glu-Ala-Leu(WGIEAL)进行 活性评价,结果(图4-10)表明:Trp-Gly-Ile-Glu-Ala-Leu(WGIEAL)可以降 低细胞内甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)水平;另外,Trp-Gly-Ile-Glu-Ala-Leu (WGIEAL)能下调成脂基因醇调节元件结合蛋白(SREBP)1c和2的表达水 平,上调脂质氧化基因肉毒碱棕榈酰转移酶-1(CPT-1)和酰基辅酶A氧化酶 (ACOX)的表达水平。因此,Trp-Gly-Ile-Glu-Ala-Leu(WGIEAL)在降脂机制方 面既能下调成脂基因表达水平,又能促进脂肪酸β氧化,减少脂质的生成,降脂 质水平大于脂质生成能力,具有良好的降脂活性。
实施例2:
为了提高降血脂六肽的产率,一种源于黄姑鱼鱼鳔的降血脂六肽的制备方法 的优化方案为:
黄姑鱼鱼鳔匀浆采取间歇式超高压匀浆,具体方法为:将洗净后的鱼鳔在压 力为168MPa的条件下均质30s,然后保压60s;泄压后重复两次相同的高压处 理,即三次循环。超高压压力、均质时间、保压时间之间有着明显交互作用,且 与匀浆速率、平均匀浆能耗以及匀浆液之间存在二次非线性关系,本实施例的间 歇式超高压匀浆能够严重破坏鱼鳔的完整性,然后在泄压的过程中使得细胞内的 内容物质如蛋白质等快速释放出来,随后在继续升压及超高压的条件下继续作用 于蛋白质的性质十分稳定的三股超螺旋结构,破坏氢键,进而使得蛋白质特定的 空间构象被改变为无序的松散的伸展状结构,原来处于分子内部的疏水基团大量 暴露在分子表面,提高后续酶解过程中碱性蛋白酶和蛋白质的接触机会,如此反 复,能够最大化的提高降血脂六肽的产率,且能耗低。
测定实施例1和实施例2制备的酶解液中游离氨基氮含量:
游离氨基的测定参考文献方法为:取甲醛200ml,电磁搅拌过程中用 0.01mol/l的NaOH标准溶液调节pH值至8.2,备用。
取待测溶液5ml,加60ml水脱气,用0.01mol/l的NaOH标准溶液调节pH 至8.2并保持1min,缓慢加入配置的甲醛20ml,磁力搅拌3min后,用0.01mol/l 的NaOH标准溶液滴定至pH为9.2,记录NaOH消耗体积,记作V1;以蒸馏水 为空白,按照上述步骤,记录所消耗NaOH的体积,记作V2
游离氨基氮含量(%)计算公式:
Figure BDA0001875507720000061
式中,c:NaOH标准溶液的浓度(mol/l);
V1:水解液在加入甲醛后滴定至pH 9.2所消耗NaOH标准溶液的体积(ml);
V2:空白加入甲醛后滴定至pH 9.2所消耗NaOH标准溶液的体积(ml);
M:为所取水解度液的体积(ml);
0.014为氮的毫摩尔质量(g/mmol);
实施例1和实施例2得到的酶解液中游离氨基氮含量分别为:65.4%和 72.1%,这说明实施例2的酶解效果好于实施例1,黄姑鱼鱼鳔匀浆采取间歇式 超高压匀浆能够提高黄姑鱼鱼鳔的酶解效果,最终提高降血脂六肽的产率。
实施例3:
一种用于下调成脂基因表达水平的试剂,包含上述降血脂六肽作为活性成 分。
一种用于促进脂肪酸β氧化的药剂,包含上述降血脂六肽作为活性成分。
一种源于黄姑鱼鱼鳔的降血脂六肽的应用,在制备降血脂药品和/或保健产 品和/或食品添加剂的应用。
对小鼠实验性高脂血症的影响:
取小鼠30只,雌雄兼有,随机分成3组,每组10只。禁食16h后,给药组 灌胃制备的降血脂药品2g/kg(即0.1ml/10g),正常组和高脂对照组喂蒸馏水 0.1ml/只。给药后1小时除正常对照组外,均腹腔注射75%新鲜蛋乳液0.5ml/只。 20小时后取眼球血测血清胆固醇,给药组、正常组和高脂对照组的血清胆固醇 含量分别为6.95mmol/L、3.86mmol/L、14.58mmol/L,本发明制备的含有降血脂 六肽的降血脂药品能明显降低血清胆固醇含量。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术,故在此不再 详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明,而并非对本发明的限制,本领域的普通技 术人员,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,还可以做出各种变化和变型。 因此,所有等同的技术方案也属于本发明的范畴,本发明的专利保护范围应由权 利要求限定。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种源于黄姑鱼鱼鳔的降血脂六肽及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 黄姑鱼(Nibea albiflora)
<400> 2
Trp Gly Ile Glu Ala Leu
1 5

Claims (5)

1. 一种源于黄姑鱼鱼鳔的降血脂六肽,其特征在于:由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽,ESI-MS测定分子量为687.75Da。
2.一种用于下调成脂基因醇调节元件结合蛋白SREBP1c和SREBP2表达水平的试剂,包含权利要求1降血脂六肽作为活性成分。
3. 一种用于上调脂质氧化基因肉毒碱棕榈酰转移酶-1 CPT-1和酰基辅酶A氧化酶ACOX表达水平的试剂,包含权利要求1降血脂六肽作为活性成分。
4.一种用于降低细胞内甘油三酯TG和总胆固醇TC水平的药剂,包含权利要求1所述的降血脂六肽作为活性成分。
5.权利要求1或2所述的一种源于黄姑鱼鱼鳔的降血脂六肽的应用,其特征在于:在制备降血脂药品的应用。
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Optimization of Extraction Conditions and Characterization of Pepsin-Solubilised Collagen from Skin of Giant Croaker (Nibea japonica);Fangmiao Yu 等;《marine drugs》;20180114;第16卷(第29期);全文 *

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