CN116196905A - 一种内毒素吸附薄膜及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种内毒素吸附薄膜及其制备方法，属于内毒素吸附技术领域包括。内毒素吸附薄膜包括高聚物薄膜基底以及接枝于所述基底上的溶菌酶，高聚物薄膜基底为聚醚砜薄膜或聚砜薄膜。制备时，先用带疏水结构的有机酸修饰溶菌酶，然后将高聚物薄膜基底浸没于溶菌酶修饰液中，于保护气氛围中进行γ射线辐照，得到溶菌酶‑高聚物薄膜基底混合液，再洗涤、干燥，得内毒素吸附薄膜。本发明所制备的内毒素吸附薄膜负载有溶菌酶；溶菌酶可以特异性吸附内毒素，减少内毒素毒性；负载溶菌酶的聚醚砜/聚砜具有良好的血液相容性，可以制备成具有特异性的亲和吸附膜。

Description

一种内毒素吸附薄膜及其制备方法

技术领域

本发明属于内毒素吸附技术领域，具体涉及一种内毒素吸附薄膜及其制备方法。

背景技术

内毒素又称脂多糖，是革兰氏阴性细菌的特有成分，是一种毒性很强的致炎和热原物质。内毒素血症可以出现在多***的多种疾病中，通常导致脓毒血症、致死性脓毒性休克、多器官功能衰竭、弥漫性血管内凝血等。内毒素结构的复杂性、血液环境的复杂性以及内毒素在血液中的低丰度，导致血液中的内毒素分离非常困难。现有的内毒素去除主要是依赖于材料的静电作用和疏水作用，但是其非特异吸附导致材料应用非常有限，因此血液中内毒素吸附的关键是要找到能与内毒素特异性结合的配基和合适的亲和基质，通过适当的方法将配基固定至基质上，得到对内毒素有吸附作用的亲和吸附剂。

用于制备内毒素亲和吸附剂的常用配基包括：免疫性亲和配基、多粘菌素B(polymyxin B)、组胺与组氨酸(His)、脱氧胆酸(DOC)、聚合阳离子、胺类、氨基酸等。多粘菌素B是使用最多且内毒素去除效果很好的一种配基，但本身所具有的神经毒性和肾毒性是限制其广泛应用的主要原因，并且价格较昂贵，使得治疗成本较高。制剂与血液的脱毒是亲和膜技术发展的一个新方向。与传统的活性炭、合成树脂类载体相比，高分子膜材料具有优良的使用特性，如扩散路径通畅、操作压低，有利于亲和吸附毒物分子。此外，聚砜、聚醚砜等不少膜材料的良好血液相容性也已得到认可，可为开发更多不同用途的具有特异性的亲和吸附膜提供合适载体。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供一种内毒素吸附薄膜及其制备方法，以解决内毒素去除困难以及现有技术中溶菌酶在基底上负载量低的技术问题。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是，提供一种内毒素吸附薄膜，该吸附薄膜包括高聚物薄膜基底以及接枝于所述基底上的溶菌酶。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，高聚物薄膜基底为聚醚砜薄膜或聚砜薄膜。

本发明还公开了一种内毒素吸附薄膜的制备方法，制备方法包括以下步骤：

S1：用带疏水结构的有机酸修饰溶菌酶，得到溶菌酶修饰液；

S2：将高聚物薄膜基底浸没于溶菌酶修饰液中，于保护气氛围中进行γ射线辐照，辐射剂量为2～12kGy，辐射剂量率为50～70Gy/h，得到溶菌酶-高聚物薄膜基底混合液；再洗涤、干燥，得内毒素吸附薄膜。

进一步，溶菌酶修饰液经过以下步骤制得：

SS1：将有机酸与碱液混合，并调节混合物的pH至7～8，然后将1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)盐酸碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺加入所得混合液中，完全溶解后于室温下静置35～45min；

SS2：将溶菌酶加入到静置后的混合液中，于30～40℃下搅拌20～25h，然后离心，收集上清，即得溶菌酶修饰液。

进一步，带疏水结构的有机酸为阿魏酸、对香豆酸或水杨酸，碱液为浓度为5mol/L的氢氧化钠溶液。

进一步，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)盐酸碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺与有机酸的质量比为10～15:5～10:1～5。

进一步，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)盐酸碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺与有机酸的质量比为12:8:3。

进一步，SS2所加入的溶菌酶与有机酸的质量比为2:1。

进一步，γ射线为⁶⁰Co-γ射线。

进一步，S2中干燥温度为35℃。

本发明的有益效果是：

1.本发明中用带有疏水结构的有机酸改性溶菌酶，一方面有机酸中的羧酸基团可以修饰溶菌酶的末端残基且不影响活性位置；另一方面由于疏水的脂肪链将溶菌酶的活性部位与水隔开，减少辐射时水中的羟基自由基攻击溶菌酶末端残基，降低溶菌酶二级结构的破坏。

2.本发明中内毒素吸附薄膜上的溶菌酶通过辐照的方式接枝，伽马射线辐照接枝的方法不需要额外的添加剂组分就可以实现接枝，同时接枝在聚醚砜/聚砜分子链上的溶菌酶不会随着吸附内毒素的过程发生脱落；同时，通过改变辐照吸收剂量和剂量率、添加一些阻接枝剂都能够很好的控制产物接枝率的高低，辐照接枝反应过程比较便捷，应用价值较高。

3.本发明所制备的内毒素吸附薄膜负载有溶菌酶，而内毒素的基本结构由三部分共价键连接而成，即O-特异性抗原多糖、核心多糖和类脂A，其中类脂A是内毒素的生物学活性主要毒性成分；溶菌酶可以特异性吸附内毒素，减少内毒素毒性；负载溶菌酶的聚醚砜/聚砜具有良好的血液相容性，可以制备成具有特异性的亲和吸附膜。

附图说明

图1为不同内毒素吸附薄膜的红外检测谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

实施例1

一种内毒素吸附薄膜，包括聚醚砜薄膜基底以及接枝于聚醚砜薄膜上的溶菌酶。

本实施例中的内毒素吸附薄膜经过以下步骤制得：

S1：将30mg阿魏酸溶解于5mL浓度为3mol/L的氢氧化钠溶液中，并用5mol/L的盐酸调混合溶液的pH至7.5，得到有机酸溶液；然后在有机酸溶液中分别加入120mg的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)盐酸碳二亚胺和80mg的N-羟基丁二酰亚胺，完全溶解后置于25℃的室温下静置40min；再向静置后的混合溶液中加入60mg溶菌酶，在35℃的水浴中搅拌24h，反应完成后，通过离心(4000×g，15min)除去体系中不溶部分，收集上清液置于溶液瓶中，所收集的上清液即为溶菌酶修饰液。

S2：将聚醚砜薄膜置于溶液瓶中，溶菌酶修饰液可将薄膜完全浸没。将混合液置于辐射反应装置中，充氮气，密封辐射反应装置；常温常压下经⁶⁰Co-γ射线辐射10kGy，辐射剂量率为60Gy/h，得到溶菌酶-聚醚砜共聚物薄膜混合液；将薄膜经去离子水洗涤、过滤，于35℃条件下真空干燥至恒重，得到溶菌酶-聚醚砜共聚物薄膜，即内毒素吸附薄膜。

实施例2

一种内毒素吸附薄膜，包括聚醚砜薄膜基底以及接枝于聚醚砜薄膜上的溶菌酶。

本实施例中的内毒素吸附薄膜经过以下步骤制得：

S1：将10mg水杨酸溶解于5mL浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液中，并用1mol/L的盐酸调混合溶液的pH至7，得到有机酸溶液；然后在有机酸溶液中分别加入100mg的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)盐酸碳二亚胺和50mg的N-羟基丁二酰亚胺，完全溶解后置于25℃的室温下静置35min；再向静置后的混合溶液中加入20mg溶菌酶，在30℃的水浴中搅拌25h，反应完成后，通过离心(4000×g，15min)除去体系中不溶部分，收集上清液置于溶液瓶中，所收集的上清液即为溶菌酶修饰液。

S2：将聚醚砜薄膜置于溶液瓶中，溶菌酶修饰液可将薄膜完全浸没。将混合液置于辐射反应装置中，充氮气，密封辐射反应装置；常温常压下经⁶⁰Co-γ射线辐射2kGy，辐射剂量率为60Gy/h，得到溶菌酶-聚醚砜共聚物薄膜混合液；将薄膜经去离子水洗涤、过滤，于35℃条件下真空干燥至恒重，得到溶菌酶-聚醚砜共聚物薄膜，即内毒素吸附薄膜。

实施例3

一种内毒素吸附薄膜，包括聚醚砜薄膜基底以及接枝于聚醚砜薄膜上的溶菌酶。

本实施例中的内毒素吸附薄膜经过以下步骤制得：

S1：将50mg水杨酸溶解于5mL浓度为5mol/L的氢氧化钠溶液中，并用1mol/L的盐酸调混合溶液的pH至8，得到有机酸溶液；然后在有机酸溶液中分别加入150mg的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)盐酸碳二亚胺和100mg的N-羟基丁二酰亚胺，完全溶解后置于25℃的室温下静置45min；再向静置后的混合溶液中加入100mg溶菌酶，在40℃的水浴中搅拌20h，反应完成后，通过离心(4000×g，15min)除去体系中不溶部分，收集上清液置于溶液瓶中，所收集的上清液即为溶菌酶修饰液。

S2：将聚醚砜薄膜置于溶液瓶中，溶菌酶修饰液可将薄膜完全浸没。将混合液置于辐射反应装置中，充氮气，密封辐射反应装置；常温常压下经⁶⁰Co-γ射线辐射12kGy，辐射剂量率为60Gy/h，得到溶菌酶-聚醚砜共聚物薄膜混合液；将薄膜经去离子水洗涤、过滤，于35℃条件下真空干燥至恒重，得到溶菌酶-聚醚砜共聚物薄膜，即内毒素吸附薄膜。

对比例1

一种内毒素吸附薄膜，与实施例1相比，将基底由聚醚砜薄膜替换为聚醚砜-g-聚乙二醇薄膜(制备方法参考《聚醚砜接枝聚乙二醇共聚物的点击制备》，孟建强等)，其余操作与实施例1相同。

对比例2

一种内毒素吸附薄膜，与实施例1相比，将基底由聚醚砜薄膜替换为聚醚砜-g-聚乙二醇-聚多巴胺薄膜，其余操作与实施例1相同。聚醚砜-g-聚乙二醇-聚多巴胺薄膜制备方法如下：

精确量取盐酸多巴胺粉末，在高速搅拌的情况下溶解于去离子水中，配制成2g/L的水溶液，然后用Tris调节溶液pH到8.5，配制的溶液呈现浅棕色；将聚醚砜-g-聚乙二醇薄膜基材放入新配制的盐酸多巴胺溶液瓶中，溶液可将薄膜完全浸没；免盖放入摇床中，37℃、100r/min条件下反应24h，反应结束后将薄膜取出，用大量去离子水冲洗除去多余的团聚颗粒，然后在去离子水中浸泡2h，于35℃条件下真空干燥至恒重，得到深棕色的聚醚砜-g-聚乙二醇-聚多巴胺薄膜。

对比例3

一种内毒素吸附薄膜，包括聚醚砜薄膜基底以及接枝于聚醚砜薄膜上的溶菌酶。

本对比例中的内毒素吸附薄膜经过以下步骤制得：

S1：将60mg溶菌酶溶于5mL水中吗，配制成溶菌酶溶液，并将溶菌酶溶液置于溶液瓶中。

S2：将聚醚砜薄膜置于溶液瓶中，溶菌酶溶液可将薄膜完全浸没。将混合液置于辐射反应装置中，充氮气，密封辐射反应装置；常温常压下经⁶⁰Co-γ射线辐射10kGy，辐射剂量率为60Gy/h，得到溶菌酶-聚醚砜共聚物薄膜混合液；将薄膜经去离子水洗涤、过滤，于35℃条件下真空干燥至恒重，得到溶菌酶-聚醚砜共聚物薄膜，即内毒素吸附薄膜。

结果分析

分别对实施例1(PES-Lys)、对比例1(PES-g-PEG-Lys)和对比例2(PES-g-PEG-PDA-Lys)中制得的内毒素吸附薄膜进行红外光谱分析，结果如图1所示。从图1中可以看出，红外光谱中均有溶菌酶的特征峰，表明溶菌酶成功负载到薄膜基底上。

同时考察了实施例1、对比例1、对比例2和对比例3中制得的内毒素吸附薄膜上溶菌酶的负载量，结果如表1所示。

表1不同内毒素吸附薄膜上的溶菌酶负载量(U/mL)

	实施例1	对比例1	对比例2	对比例3
					溶菌酶负载量	3388.0	1633.5	1389.4	1894.3

从表1中可以看出，基底种类以及溶菌酶的处理方式对溶菌酶的负载量具有显著影响，采用本申请中的基底以及制备工艺可以显著提升溶菌酶在聚醚砜/聚砜薄膜上的负载量，使制得的内毒素吸附薄膜能够发挥更加优良的内毒素吸附功效。

虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

Claims (10)

1.一种内毒素吸附薄膜，其特征在于：包括高聚物薄膜基底以及接枝于所述基底上的溶菌酶。

2.根据权利要求1所述的内毒素吸附薄膜，其特征在于：所述高聚物薄膜基底为聚醚砜薄膜或聚砜薄膜。

3.权利要求1或2所述的内毒素吸附薄膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：用带疏水结构的有机酸修饰溶菌酶，得到溶菌酶修饰液；

S2：将高聚物薄膜基底浸没于溶菌酶修饰液中，于保护气氛围中进行γ射线辐照，辐射剂量为2～12kGy，辐射剂量率为50～70Gy/h，得到溶菌酶-高聚物薄膜基底混合液；再洗涤、干燥，得内毒素吸附薄膜。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述溶菌酶修饰液经过以下步骤制得：

SS1：将有机酸与碱液混合，并调节混合物的pH至7～8，然后将1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)盐酸碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺加入所得混合液中，完全溶解后于室温下静置35～45min；

SS2：将溶菌酶加入到静置后的混合液中，于30～40℃下搅拌20～25h，然后离心，收集上清，即得溶菌酶修饰液。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述带疏水结构的有机酸为阿魏酸、对香豆酸或水杨酸，所述碱液为浓度为5mol/L的氢氧化钠溶液。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)盐酸碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺与有机酸的质量比为10～15:5～10:1～5。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)盐酸碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺与有机酸的质量比为12:8:3。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：SS2所加入的溶菌酶与有机酸的质量比为2:1。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述γ射线为⁶⁰Co-γ射线。

10.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：S2中干燥温度为35℃。

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