CN102361689A - 内毒素吸着剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于从生物流体中除去内毒素的吸着剂，该吸着剂具有不溶于水的多孔载体以及固定在该载体上的多粘菌素，该载体具有中性的、疏水的表面并且多粘菌素通过疏水相互作用而被固定在载体的表面上。该吸着剂用于体外血液净化中，特别用于治疗患有败血症的人。

Description

内毒素吸着剂
技术领域
本发明涉及一种用于从生物流体中除去内毒素的吸着剂，该吸着剂具有不溶于水的多孔载体以及固定在该载体上的多粘菌素。
背景技术
内毒素为革兰氏阴性细菌的细胞壁中的脂多糖(LPS)，并且通过细胞裂解被释放。事实上，脂多糖为革兰氏阴性细菌的外细胞膜中最为常见的脂质成分。内毒素为致热物质，即如果内毒素在例如由微生物引起的中毒过程中到达人体，则受感染的个体会产生严重的炎症反应并发烧，以及呈现全身性的效应。内毒素在血液循环中存在会导致免疫细胞不可控的活化，并导致凝血***不平衡。取决于其浓度，其可导致败血症，败血症的病征包括(但不限于)高烧、低血压，而在严重的情况下，病征为多器官衰竭。败血症是一种须非常认真地对待的疾病；患有严重的败血症或败血性休克的人的死亡率为大约30-60％，这取决于该疾病的严重程度。免疫力受损的病人(例如肝病病人或化疗中的病人)也易于受到细菌感染，并因此呈现内毒素中毒的症状。
脂多糖分子的结构为三个部分：脂质A形成了朝向该细菌细胞的分子区域；该分子被脂质A紧固在该革兰氏阴性细菌的外膜中。该LPS分子还具有中部的、被高度保护的核心区域，其被结合至脂质A。第三和最外部的区域由O-特定多糖(O-抗原)形成，其结构在各种革兰氏阴性细菌中变化可以很大。毒性效应归因于脂质A，其在细胞裂解期間首先被释出。
通过使用合适的吸着剂能够从被内毒素污染的生物流体(例如血液或血浆)中除去内毒素。由此可对患有内毒素中毒或败血症的病人，尤其在体外血液净化(除去法(apheresis))的范畴中，提供治疗。
除去方法是在体外进行的方法，当中不但除去与病理生理学相关的血液和血浆成分(例如生物分子如(糖)蛋白、肽、脂质、脂蛋白以及脂多糖)，还除去血液细胞以及血浆。除去方法一方面能够被用于诊断及治疗的目的，另一方面亦代表着非常有效的可能性-可用于从健康的人获取足够的量以及足够高纯度的特定血液成分。重大的意义归因于该治疗性的除去法，因为对于特定的迹象，这经常是药物治疗外非常有效的备选方案，其同时具有少副作用。因此，在血浆除去方法中，血浆能够被完全地分离，并被替代溶液取代，或者通过使用吸着剂从其中仅除去特定的成分(例如LDL，内毒素或免疫球蛋白)，而该血浆随后返回至供体/病人。
为了从被内毒素污染的生物流体(通常为血液或血浆)中除去内毒素，使其与通常位于吸着设备中的吸着剂紧密地接触。内毒素被结合至该吸着剂的表面，并从该生物流体中被除去。没有内毒素的生物流体返回至病人。吸着设备位于体外血液回路中的血液侧，或者位于体外血液净化设备的血浆回路中的滤液侧。与内毒素结合的能力和速度是是基于吸着剂组合物的性质。
通过吸着剂来与内毒素结合的速度对病人的生存是具决定性的。剩余用来从病人的血液中除去内毒素的时间是非常短的(＜12个小时)，而在严重的败血症中，则仅有几个小时。
已经表明了阴离子交换树脂(例如结合至纤维素的DEAE或PEI基团)是非常适合于与内毒素结合。然而，与体内凝固***的重要因子(例如蛋白C和蛋白S)不想要的结合，以及与其相关的凝固问题都是不利的。
通过使用特定的吸着剂，其带有对抗内毒素的固定的抗体，能够避免这些凝固问题。然而，由于经济上的原因，此种可能的应用是有限的。
在一开始提到的吸着剂的类型已知为非常有用的替代物，其中的多粘菌素分子固定在不溶于水的多孔载体。
多粘菌素是用于治疗革兰氏阴性细菌感染的抗生素物质。多粘菌素啮合入细胞壁结构，其提高细胞膜的渗透性，细胞裂解因此而发生。多粘菌素不但与磷脂结合，还更会以高亲和力与脂多糖(内毒素)结合。由于多粘菌素具有毒害神经和毒害肾脏的效应，故仅有多粘菌素B和多粘菌素E(粘菌素)具有一定的治疗意义。多粘菌素B和/或多粘菌素E因此仅适用于口服及外用的治疗形式。由于其毒性效应，其不适用于内毒素中毒或败血症的以非经口服的、全身性的治疗。
然而，已被证实以共价的形式将多粘菌素(特别是多粘菌素B)绑定至不溶于水的载体并使用已涂布多粘菌素B的载体作为吸着剂以从被污染的生物流体中除去内毒素是有好处的。
第EP 0110 409A号欧洲专利公开了由多孔玻璃(FPG 2000)制成的固定多粘菌素B的载体，以及基于纤维素(CellulofineA-3)的固定多粘菌素B的多糖载体。多粘菌素B以共价的形式与由纤维素或衍生的纤维素制成的微粒形成共价键亦是已知的。[Weber V.，Loth F.，Linsberger I.，Falkenhagen D.：Int.J.Artif.Organs 25(7)，679]使用已涂布多粘菌素的纤维素载体能够达至高水平的吸附内毒素，然而，其亦具有缺点，即多粘菌素与这些载体形成共价形式的键，所以在与该多粘菌素结合之前，该纤维素必须在化学上先被活化。
第EP 0 129 786A2号欧洲专利记载了一种具有纤维性载体的内毒素解毒物料，多粘菌素以共价的形式被固定在该载体上。该纤维性载体备有功能团，以共价的形式将多粘菌素结合至载体的表面。来自于第EP 0 129 786号欧洲专利的内毒素解毒物料在市场上作为用于吸附模块的填充物料(商品名：Toraymyxin)[Shoji H.2003.Extracorporeal endotoxin removal for the treatment of sepsis：endotoxin adsorptioncartridge(Toraymyxin)]，而且其在当时是唯一被批准在体外血液净化的范畴中用于临床治疗败血症的吸着剂。关于具有固定的多粘菌素B的纤维载体之有效性的评论文献是在近期才出版[Cruz DN et al.2007；Effectiveness of polymyxin B-immobilized fibercolumn in sepsis：a systematic review.Crit.Care 11(3)：137]，其中所述的治疗质素被阐述为未达到最佳效果。
该已知的基于通过多粘菌素来绑定内毒素的吸着剂具有与内毒素结合能力低以及结合速度慢的缺点。由于多粘菌素经由NH2基团被结合至聚合物，故对内毒素的进入是有难度的。其他的缺点因昂贵和复杂的生产方法以及与其相关的更高的生产成本而起。
虽然通过在临床应用上述的Toraymyxin吸附模块已能够降低患有内毒素中毒(特别是败血症)的病人的死亡率，但是尽管采用了最大程度的治疗，患有严重败血症和败血性休克的病人的死亡率仍然非常高。由于此原因以及发生败血症情况是高且正在增长中，对于对内毒素有着已改良的吸着表现的吸着剂，有着高的需求。
发明内容
本发明的目的为提供一种吸着剂，通过使用该吸着剂可从生物流体中大量及高速地除去内毒素。
此目的通过一开始提到的该种类型的吸着剂而实现，其中根据本发明，该载体具有中性的、疏水的表面，并且多粘菌素通过疏水相互作用而被固定在该载体的表面上。
归功于本发明的吸着剂，吸着内毒素的能力和吸着内毒素的速度得到了显著的提升。在意料不到的程度上，发明人已证实与已知的吸着剂相比，通过本发明的吸着剂在一段短的作用时间之后，便可将大量的内毒素从被内毒素污染的生物流体中被结合(bound)。这在治疗上具有很大的优点，特别是对于患有败血症的病人，因为大量的生物流体能够在短时间内变成没有内毒素。通过本发明的吸着剂，患有严重败血症的病人的生存机会就可提高。如前已经提及，通过吸着剂来结合内毒素的速度对病人的生存是具决定性的。归功于根据本发明的吸着剂，体外血液净化的范畴中治疗的时段也能够被缩短，而时间、金钱和人力资源能被节省。
与已知的吸着剂相比，本发明的另一个优点在于其特别简单的生产过程，因为多粘菌素通过疏水相互作用而被固定(使用多粘菌素分子的疏水部分)在中性的、疏水的载体表面上。根据本发明的吸着剂的对内毒素结合的效力的增强可被解释为如下：透过疏水相互作用而介导的结合使多粘菌素的NH2基团外露，而其全部在实质上可用于与内毒素结合。将多粘菌素固定在载体上无需复杂的化学步骤。因此能够经济地以及可再生地生产根据本发明的吸着剂。
疏水相互作用具有重要的生物化学意义，并是基于以下现象：疏水分子在极性环境中趋向于缔合。疏水相互作用因此就其本身而言不是一种力，而是受极性环境所迫。在本发明中，该疏水相互作用在多粘菌素分子的疏水部分和多孔载体的中性的、疏水的内表面和外表面之间发生。
在本公开的内容中，术语“吸着剂”被理解为进行吸着的剂，更优选的是进行吸附的剂，即位于生物流体中的分子通过吸着剂的表面力而被紧固。在说明书中，还使用了术语“吸附剂(adsorption agent)”或“吸附剂体(adsorbent)”或“吸附体(adsorber)”，以代替术语“吸着剂”。根据本发明，提供吸着剂，以从被内毒素污染的生物流体中吸附内毒素。根据本发明的吸着剂尤其用于所有的体外血液净化中，特别是用于患有败血症情况的病人身上。
在本发明的范畴内使用的措辞“生物流体”可涉及无细胞的液体(特别是血浆)或含有细胞的液体(特别是血液)。由于在体外血液净化的过程中还有需要将其他的液体，例如含有抗凝剂的溶液(肝素溶液、柠檬酸盐溶液)或替代溶液(电解质，补充液体流失的液体)导入体外血液回路或血浆回路中，故生物流体还可被理解为已稀释的血液或已稀释的血浆。本发明主要计划用于人类的医药领域，因此主要涉及人类的生物流体。然而，这不排除本发明还可被用于兽医药领域。
多粘菌素是已知最初起源于多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)的化合物。尤其需注意的是多粘菌素B和多粘菌素E(粘菌素)。
在本公开的内容中，独立权利要求1中所使用的术语“不溶于水的多孔载体，该载体具有中性的、疏水的表面”涉及多孔的、不溶于水的固体，其具有外表面和内表面。该外表面和内表面是中性的和疏水的。术语“中性的”应被理解为非离子性的。本发明尤其指向微粒状的载体。
如果载体是疏水性的聚合物，在实践中是特别有利。因此能确保载体物料良好的可再生性，特别是就孔隙度和颗粒的大小而言。孔隙度和颗粒的大小还能非常恰当地改变。该疏水性的聚合物既能为均聚物，又能为杂聚物。已证实已交联的聚苯乙烯聚合物特别有利于实际的表现。在体外血液净化期间，对与病人的体液接触的装置组件的无菌性有着高要求。这也适用于吸着剂。已交联的聚苯乙烯聚合物以热量和化学物质方面的高稳定性着称，而且已在临床实践中被证实。
多粘菌素和载体之间的疏水相互作用的强度一方面由中性的、疏水的载体的疏水性所决定，另一方面由介质的离子强度所决定。上文已提及，多粘菌素具有毒害神经和毒害肾脏的效应。因此，多粘菌素以尽可能最牢固的方式与载体的外表面和内表面结合是理想的。在特别优选的变体中，已交联的聚苯乙烯聚合物为聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的表面具有高度的疏水性，而多粘菌素达致非常牢固地与载体表面结合。发明人已经证实多粘菌素在经由疏水相互作用而固定之后，无多粘菌素可被释放至生物流体。然而，还可以使用其他为相关领域的技术人员所熟知的中性的、疏水的、具有高度疏水性的聚合物。发明人已证实在对本发明的吸着剂进行高压灭菌之后没有多粘菌素被解吸，故测量不到内毒素结合的减少。这对于病人的安全是非常有利的。
此外，已发现就内毒素的吸附而言，多孔载体的孔隙大小也是重要的。如果多孔载体具有确定的平均孔隙大小则为有利，就可再生性来说亦然。载体的平均孔隙大小总是涉及在经由疏水相互作用引致的多粘菌素的运移之前的平均孔隙大小。
如果多孔载体是由合成的聚合物生产，平均孔隙大小就能被非常恰当地设定。虽然本领域的技术人员知道术语“聚合物的平均孔隙大小”应如何被理解，并知道如何能够特意地设定孔隙度或平均孔隙大小，但尽管如此，为求清晰，此术语在此被简要地定义。平均孔隙大小与孔的平均直径有关。在孔的直径的高斯(Gaussian)大小分布中，孔的平均直径是相应于分布曲线的最大值的孔的直径。例如使用氮吸附法(记载在Weberet et al.2008.Neutral styrene divinylbenzene copolymers for adsorption of toxins inliver failure.Biomacromolecules 9(4)：1322-1328)或使用压汞法可确定孔的平均直径。通过所参与的单体或共单体、溶液、或调制剂的浓度的变化来设定聚合物的孔隙大小。所选定的聚合物的孔越小，则可用于吸着(特别是吸附)的聚合物的内表面面积越大。孔越大，则更大的分子能更好地通过孔。用来生产具有确定的孔隙大小的合成的、疏水的聚合物的方法可以被用于本发明，其记载在上述由Weber等人所著的出版物中。
已经表明了如果该载体的平均孔隙大小为至少15nm，则内毒素可以透过吸着剂而被特别地吸着。优选地，该载体的平均孔隙大小为至少30nm。然而，如果未涂布的载体的平均孔隙大小不大于120nm，则在体外血液净化的临床应用上是有好处的。否则该吸着剂的内表面面积会变得太小；因而降低对内毒素的吸着能力(对内毒素的吸附能力)。在实验室的实验中(见以下的例子)，当未涂布的载体的平均孔隙大小为30-40nm时，可获得非常好的结果。
在特别有利的变体中，未涂布的载体的平均孔隙大小大约为80-100nm。在此变体中，内毒素从生物流体中以特别快的速度和高效率被除去，因此只需要少量的吸着剂去与大量的内毒素结合。例如，当根据本发明的吸着剂的这变体的浓度在体外血浆回路中被用作为悬液时，其能被选择为1％(重量百分比，体积百分比)。包含呈微粒形式的吸着剂悬液的体外血浆回路作为基于微球的解毒***(MDS)的核心成分。从第EP 0776223B号欧洲专利和第US 5855782号美国专利已知MDS。
此外，在吸着步骤期间，吸着剂的形式也是重要的。在有利的变体中，根据本发明的吸着剂呈微粒的形式。粒子的大小影响吸附的动力学。此外，当粒子小时，会导致大的表面积/体积比。在有利的子变体中，该些微粒的粒子大小为20μm或更小。
微粒尤其地被用于MDS中，其已在上文中提及。在膜状过滤器的滤液侧上，微粒以悬液的方式于净化回路中循环。然而，如果膜状过滤器泄漏，则存在着以下的危险：微粒会到达体外血液回路，接着到达病人的身体，并在其中导致肺部栓塞。因此，在另一个子变体中，如果微粒的粒子大小为8μm或更小，理想地为5μm或更小是有利的，因为这些粒子小，肺部栓塞的危险就能够避免。
根据本发明的吸着剂主要用于体外血液净化(除去法)。
在本发明的重要的应用中，该吸着剂能够被用作为吸着设备的填充物料。吸着设备能够以柱状物或药筒进行实施。取决于使用何种血液净化装置或使用何种血液净化方法(血液灌流法(hemoperfusion)、血浆取出法(plasmapheresis)/血浆吸附法(plasmasorption))而定，吸着设备可位于体外血液回路中的血液侧，或者位于滤液侧上的血浆回路中。生物流体(血液或血浆)流过该吸着设备，内毒素与吸着剂中已固定的多粘菌素分子结合。已净化的血液或血浆流回至病人。
另外的可能用途涉及血浆回路，其中提供在血浆中以悬液的形式分布的吸着剂。此种血浆回路的例子可在上述MDS中以装置元件的形式被找到。所提供的在血浆回路中的吸着剂悬液优选地呈微粒的形式。
虽然根据本发明的内毒素吸着剂主要用于体外血液净化(除去法)中，但将其用于色谱法中亦是能想象到的。吸着剂因此能够被用作为色谱柱的填充物料，以净化载有内毒素的血液或血浆。从生物流体或水中除去内毒素的其他应用也是可以想象到的。
根据本发明的吸着剂或含有本发明的吸着剂的吸着设备或含有悬浮着本发明的吸着剂悬液的血浆回路是特别适合用于治疗败血症。
此外，本发明涉及一种从生物流体中除去内毒素的方法，其中使被内毒素污染的生物流体与根据本发明的吸着剂接触。如上所述，该生物流体可流过包含该吸着剂的吸着设备。然而，该吸着剂也能够悬浮在该生物流体中。后者的例子为上述的MDS。生物流体可为血液或血浆。
具体实施方式
以下利用以非限制性为基础的例子更仔细地解释本发明。
1.例1：生产根据本发明的吸着剂(吸附体)
为了生产根据本发明的吸着剂，使用多粘菌素B涂布具有不同孔隙大小的、中性的、疏水的聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，即多粘菌素B经由聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的外表面和内表面上的疏水相互作用而被吸附。
1.1.提供中性的、疏水的聚合物：
表1中列出了聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物(简称为“聚合物”或“载体”或“未涂布的吸附体”)的各种平均孔隙大小。
表1：聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物
  名称   平均孔隙大小[nm]
 #1822   15-20
 #1823   15-20
 #1824   30-40
 #1825   80-100
 #1826   80-100
聚合物的粒子大小为5μm+/-3-4μm。
1.2.在聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物涂布多粘菌素：
使用多粘菌素B涂布表1中所列的聚合物，以生产根据本发明的吸附体。
多粘菌素B(PMB)从Sigma公司获得(商品编号：81334，编号1348744)。为作涂布，生产多粘菌素B溶液(PMB溶液)，并将50mg PMB溶解在10ml的LAL水中。
每1g湿重(damp weight)的聚合物与5ml PMB溶液混合，并在Enviro
Figure BDA0000093516920000081
摇动器中以室温培育60分钟。
接着，将混合物以4000g的离心力离心15分钟，抽取上层清液，将沉淀物与10ml0.9％的NaCl混合，并使用旋涡混合器对其以涡旋式混合(vortexed)。重复此步骤3至5次。随后，再次将该混合物以4000g的离心力离心15分钟，并抽取上层清液，而50％吸附体悬液会在无致热源的0.9％NaCl中产生。表2列出了已涂布多粘菌素B的吸附体。
表2：已涂布多粘菌素B的吸附体
 已涂布多粘菌素B的吸附体的名称   未涂布的吸附体的平均孔隙大小[nm]
  #1822+PMB   15-20
  #1823+PMB   15-20
  #1824+PMB   30-40
  #1825+PMB   80-100
  #1826+PMB   80-100
2.例2：内毒素的吸附-批量测试
#1825+PMB及#1826+PMB号已涂布多粘菌素B的吸附体的聚合物平均孔隙大小(PS)为80-100nm(见例1-表2)，其与对应的#1825及#1826号未涂布的吸附体就内毒素结合作出比较。
2.1.吸附体以及吸附体的制备：
根据例1的方案制备以下的吸附体(PS＝80-100)：
1)#1825
2)#1826
3)#1825+PMB(已涂布PMB)
4)#1826+PMB(已涂布PMB)
如1.2中所述，使用无致热源的NaCl冲洗该些已涂布多粘菌素B的吸附体和未涂布的吸附体5次。50％吸附体悬液最后在无致热源的NaCl中产生。
2.2.肝素血浆：
从供体获得25ml肝素血浆(5x 9ml全血抽取)。
2.3.内毒素溶液：
LPS绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)(Sigma公司，L7018，批号109H4043)。将储藏在-70℃微量离心管中的已被分成多份(每份为100μl 10-3g/ml(1mg/ml))的内毒素解冻，并将其与900μl LAL水混合。随后该内毒素在NaCl中进一步被稀释至所需的50ng/ml的浓度(＝内毒素溶液；ET溶液)。
2.4.测试批次：
在该测试的批次中，将内毒素溶液进一步稀释至5ng/ml的最终浓度。吸附体的最终浓度为10％。对于该些测试批次，将50％吸附体悬液(悬浮着的吸附体的体积)、肝素血浆(血浆)，以及内毒素溶液[50ng/ml](ET溶液)根据本说明书的表3通过移液管移入至试管中。作为对照，不带有吸附体的试管(对照)以及带有未经处理的肝素血浆(血浆)的试管同样被处理。
表3：测试的批次
  吸附体   悬浮着的吸附体的体积   血浆   ET溶液
  #1825   600μL   2100μL   300μL
  #1826   600μL   2100μL   300μL
  #1825+PMB   600μL   2100μL   300μL
  #1826+PMB   600μL   2100μL   300μL
  对照   100μLNaCl   800μL   100μL
  血浆   0   100μL   0
该些测试批次在Enviro Genie摇动器中以37℃培育60分钟。
2.5.取样：
批量测试以及LAL测试的所有步骤(还有稀释和标准曲线)在来自Chromogenix公司的玻璃LAL试管(T100型，带有塑料塞)中进行。只有用于离心的取样在无致热源的微量离心管中进行。
在5、15和60分钟的培育时间之后，使用旋涡混合器对该试管以涡旋式混合。从各个案取0.2ml的样品，并移转到无致热源的微量离心管中。该些样品在离心机(Eppifuge)中以11000g的离心力离心10分钟。将100μL的上层清液移转入玻璃LAL试管中，并在LAL测试中进行测试。
2.6.物料：                    批号：
Figure BDA0000093516920000101
2.7.结果：
结果如表4所列并如图1所示，图1所示的曲线代表在时间曲线中，已涂布PMB的吸附体(平均孔隙大小为80-100nm)对内毒素(ET)的吸附(以内毒素单位(EUI/ml)表示)。
表4：批量测试的结果-内毒素的吸附
Figure BDA0000093516920000102
3.例3：内毒素的吸附-批量测试
平均孔隙大小(PS)为15-20nm或30-40nm的已涂布多粘菌素B的吸附体#1822+PMB、#1823+PMB以及#1824+PMB与对应的未涂布的吸附体#1822、#1823，以及#1824就内毒素结合进行比较。
3.1.吸附体以及吸附体的制备：
根据例1的方案制备以下的吸附体：
1)#1822
2)#1823
2)#1824
3)#1822+PMB(已涂布PMB)
4)#1823+PMB(已涂布PMB)
5)#1824+PMB(已涂布PMB)
如1.2中所述，使用无致热源的NaCl冲洗该些已涂布多粘菌素B的吸附体和未涂布的吸附体5次。50％吸附体悬液最后在无致热源的NaCl中产生。
3.2.肝素血浆及内毒素溶液：对应于2.2以及2.3部分.
3.3.测试批次：
在该测试的批次中，将内毒素溶液进一步稀释至5ng/ml的最终浓度。吸附体的最终浓度为10％。对于该些测试批次，将50％吸附体悬液(悬浮着的吸附体的体积)、肝素血浆(血浆)，以及内毒素溶液[50ng/ml](ET溶液)根据本说明书的表5通过移液管移入至试管中。作为对照，不带有吸附体的试管(无吸附体的对照)以及带有未经处理的肝素血浆(天然血浆)的试管同样被处理。
表5：测试批次
  吸附体   悬浮着的吸附体的体积   血浆   ET溶液
  #1822   600μL   2100μL   300μL
  #1822+PMB   600μL   2100μL   300μL
  #1823   600μL   2100μL   300μL
  #1823+PMB   600μL   2100μL   300μL
  #1824   600μL   2100μL   300μL
  #1824+PMB   600μL   2100μL   300μL
  无吸附体的对照   100μLNaCl   800μL   100μL
  天然血浆   0   100μL   0
该些测试批次在Enviro Genie摇动器中以37℃培育60分钟。
3.4.取样及物料：对应于2.5以及2.6部分
3.5.结果：
结果如表6所列并如图2所示，图2所示的曲线代表在时间曲线中，已涂布PMB的吸附体(平均孔隙大小为15-20或30-40nm)对内毒素(ET)的吸附(以内毒素单位(EUI/ml)表示)。
表6：批量测试的结果-内毒素的吸附
  EU/ml   0分钟   5分钟   15分钟   60分钟
  #1822   9.37   6.06   5.46   4.34
  #1822+PMB   9.37   2.34   0.18   0.53
  #1823   9.37   4.71   4.84   3.33
  #1823+PMB   9.37   2.65   2.16   0.77
  #1824   9.37   5.47   4.30   3.41
  #1824+PMB   9.37   0.68   0.36   0.14
  无吸附体的对照   9.37   6.33   4.95   3.45
  天然血浆   0   0   0   0
4.例4：内毒素的吸附-肝素血浆中各种吸附体最终浓度的批量测试。
已涂布多粘菌素B的吸附体#1823+PMB(平均孔隙大小为15-20nm)以及#1826+PMB(平均孔隙大小为80-100nm)与对应的未涂布的和未经处理的吸附体#1823以及#1826以各种吸附体最终浓度(即10％，4％，2％，以及1％)就内毒素结合进行比较。
4.1.吸附体以及吸附体的制备：
根据例1的方案制备以下的吸附体：
1)#1823
2)#1826
3)#1823+PMB(已涂布PMB)
4)#1826+PMB(已涂布PMB)
如1.2中所述，使用无致热源的NaCl冲洗该些已涂布多粘菌素B的吸附体和未涂布的吸附体5次。50％吸附体悬液最后在无致热源的NaCl中产生。
4.2.肝素血浆及内毒素溶液：对应于2.2以及2.3部分。
4.3.测试批次：
在该测试的批次中，将内毒素溶液进一步稀释至5ng/ml的最终浓度。
总共生产4组具有不同吸附体最终浓度的测试批次A，B，C，和D，每已涂布多粘菌素B的吸附体生产双重的批次。对于该些测试批次，将50％吸附体悬液(悬浮着的吸附体的体积)、肝素血浆(血浆)，以及内毒素溶液(ET溶液)根据本说明书的表7-10通过移液管移入至试管中。作为对照，不带有吸附体的试管(无吸附体的对照)以及带有未经处理的肝素血浆(血浆)的试管同样被处理。
表7：测试批次A-内毒素的浓度5ng/ml，吸附体的最终浓度10％
  吸附体   悬浮着的吸附体的体积   血浆   ET溶液
  #1823   660μL   2367μL   300μL
  #1823+PMB   660μL   2367μL   300μL
  #1826   660μL   2367μL   300μL
  #1826+PMB   660μL   2367μL   300μL
  无吸附体的对照   0   900μL   100μL
  血浆   0   100μL   0
表8：测试批次B-内毒素的浓度5ng/ml，吸附体的最终浓度4％
  吸附体   悬浮着的吸附体的体积   血浆   ET溶液
  #1823   250μL   2575μL   300μL
  #1823+PMB   250μL   2575μL   300μL
  #1826   250μL   2575μL   300μL
  #1826+PMB   250μL   2575μL   300μL
  无吸附体的对照   0   900μL   100μL
  血浆   0   100μL   0
表9：测试批次C-内毒素的浓度5ng/ml，吸附体的最终浓度2％
  吸附体   悬浮着的吸附体的体积   血浆   ET溶液
  #1823   122μL   2639μL   300μL
  #1823+PMB   122μL   2639μL   300μL
  #1826   122μL   2639μL   300μL
  1826+PMB   122μL   2639μL   300μL
  无吸附体的对照   0   900μL   100μL
  血浆   0   100μL   0
表10：测试批次D-内毒素的浓度5ng/ml，吸附体的最终浓度1％
  吸附体   悬浮着的吸附体的体积   血浆   ET溶液
  #1823   60μL   2670μL   300μL
  #1823+PMB   60μL   2670μL   300μL
  #1826   60μL   2670μL   300μL
  #1826+PMB   60μL   2670μL   300μL
  无吸附体的对照   0   900μL   100μL
  血浆   0   100μL   0
该些测试批次在Enviro Genie摇动器中以37℃培育60分钟。
4.4.取样：
批量测试以及LAL测试的所有步骤(还有稀释和标准曲线)在来自Chromogenix公司的玻璃LAL试管(T100型，带有塑料塞)中进行。只有用于离心的取样在无致热源的微量离心管中进行。在5、15和60分钟的培育时间之后，使用旋涡混合器对该试管以涡轮式混合。从各个案取0.3ml的样品，并移转到无致热源的微量离心管中。该些样品在离心机(Eppifuge)中以11000g的离心力离心10分钟。抽取50μL上层清液，并移转入带有450μL LAL水的玻璃LAL试管中，立即以75℃培育5分钟，施加微量滴定板，并在LAL测试中进行测试。
4.5.物料：对应于2.5以及2.6部分。
4.6.结果：
结果如表11，12，13，和14所列并如图3、图4、图5和图6所示。内毒素(ET)的吸附(以内毒素单位(EUI/ml)表示)以时间曲线显示。该些表和图显示为：
表11和图3：以10％吸附体浓度作批量测试(测试批次A)的结果：
表11：
  EU/ml   0分钟   5分钟   15分钟   60分钟
  #1823   15.39   9.55   7.07   7.03
  #1823+PMB   15.39   4.28   4.00   0.90
  #1826   15.39   7.33   6.70   5.37
  #1826+PMB   15.39   0.19   0   0
  无吸附体的对照   15.39   10.91   7.57   7.91
  天然血浆   0   x   x   0
表12和图4：以4％吸附体浓度作批量测试(测试批次B)的结果：
表12：
  EU/ml   0分钟   5分钟   15分钟   60分钟
  #1823   11.12   8.74   9.03   8.94
  #1823+PMB   11.12   6.16   5.14   2.96
  #1826   11.12   9.21   9.02   7.70
  #1826+PMB   11.12   0.69   0.62   0.35
  无吸附体的对照   11.12   11.10   10.69   10.45
  天然血浆   0   x   x   0
表13和图5：以2％吸附体浓度作批量测试(测试批次C)的结果：
表13：
  EU/ml   0分钟   5分钟   15分钟   60分钟
  #1823   12.49   7.85   6.66   7.48
  #1823+PMB   12.49   4.93   4.33   2.33
  #1826   12.49   6.83   6.82   5.77
  #1826+PMB   12.49   0.91   0.65   0.39
  无吸附体的对照   12.49   10.35   9.00   7.59
  天然血浆   0   x   x   0
表14和图6：以1％吸附体浓度作批量测试(测试批次D)的结果：
表14：
  EU/mL   0分钟   5分钟   15分钟   60分钟
  #1823   8.29   5.54   6.80   6.65
  #1823+PMB   8.29   3.78   3.09   1.43
  #1826   8.29   5.95   6.33   5.54
  #1826+PMB   8.29   1.07   0.75   0.47
  无吸附体的对照   8.29   6.61   6.11   6.11
  天然血浆   0   x   x   0
5.例5：内毒素的浓度为1ng/ml时的内毒素吸附的批量测试。
已涂布多粘菌素B的吸附体(参见例1)#1823+PMB(平均孔隙大小为15-20nm)、#1824+PMB(平均孔隙大小为30-40nm)以及#1826+PMB(平均孔隙大小为80-100nm)与对应的未涂布的吸附体#1823、#1824以及#1826就内毒素结合进行比较，批量测试中内毒素的浓度为1ng/ml。
5.1.吸附体以及吸附体的制备：
根据例1的方案制备以下的吸附体：
1)#1823
2)#1824
3)#1826
4)#1823+PMB(已涂布PMB)
5)#1824+PMB(已涂布PMB)
6)#1826+PMB(已涂布PMB)
如1.2中所述，使用无致热源的NaCl冲洗该些已涂布多粘菌素B的吸附体和未涂布的吸附体5次。50％吸附体悬液最后在无致热源的NaCl中产生。
5.2.肝素血浆：对应于2.2部分。
5.3.内毒素溶液：
LPS绿脓杆菌(Sigma公司，L7018，批号109H4043)。将储藏在-70℃微量离心管中的已分成多份(每份为100μl 10-3g/ml(1mg/ml))的内毒素解冻，并将其与900μl LAL水混合。随后该些内毒素在NaCl中进一步被稀释至所需的10ng/ml的浓度(＝内毒素溶液；ET溶液)。
5.4.测试批次：
在该测试的批次中，将内毒素溶液进一步稀释至1ng/ml的最终浓度。吸附体的最终浓度为1％。对于该些测试批次，将50％吸附体悬液(悬浮着的吸附体50％)、肝素血浆(血浆)，以及内毒素溶液[10ng/ml](ET溶液)根据本说明书的表15通过移液管移入至试管中。作为对照，不带有吸附体的试管(无吸附体的对照)以及带有未经处理的肝素血浆(天然血浆)的试管同样被处理。
表15：测试批次
Figure BDA0000093516920000181
该测试批次在Enviro-Genie摇动器中以37℃培育60分钟。
5.5.取样以及物料：对应于2.5和2.6部分。
5.6.结果：
结果如表16所列并如图7所示，图7显示了在时间曲线中，在吸附体的浓度为1％且内毒素的浓度为1ng/mL时，已涂布PMB的吸附体对内毒素(ET)的吸附(以内毒素单位(EUI/ml)表示)的图表。
表16：结果
  0分钟   5分钟   15分钟   60分钟
  #1823   1.874   1.043   0.93   0.85
  #1824   1.874   0.89   0.83   0.84
  #1826   1.874   0.758   0.79   0.75
  #1823+PMB   1.874   0.509   0.35   0.16
  #1824+PMB   1.874   0.195   0.115   0.067
  #1826+PMB   1.874   0.128   0.089   0.062
  无吸附体的对照   1.874   1.169   1.08   0.93
  天然血浆   x   x   x   0
6.例6：已涂布多粘菌素B的吸附体的高压消毒能力的测试。
已涂布多粘菌素B的吸附体#1826+PMB(平均孔隙大小为80-100nm)与基于纤维素的吸附体(其中多粘菌素B与纤维素以共价的形式形成键)就高压消毒能力进行比较。研究出高压消毒对于与内毒素结合的影响。
6.1.吸附体以及吸附体的制备：
根据例1的方案制备两份已涂布多粘菌素B的吸附体#1826+PMB的50％吸附体悬液(A和B)。
此外，制备两份经多粘菌素B改性的微粒纤维素吸附体#1862Cell+PMB的50％吸附体悬液(A和B)(纤维素粒子Fischer公司，编号EA 13/1PCKT 038，其透过表氯醇被活化，并与多粘菌素B产生反应＝＞多粘菌素B分子与纤维素粒子形成共价键)
各个吸附体悬液A、#1826+PMB A以及#1862Cell+PMB A在121℃下高压消毒20分钟。各个吸附体悬液B、#1826+PMB B以及#1862Cell+PMB B不进行高压消毒：
1)#1826+PMB A(已被高压消毒)
2)#1826+PMB B(未被高压消毒)
3)#1862Cell+PMB A(已被高压消毒)
4)#1862Cell+PMB B(未被高压消毒)
将600μL各个50％吸附体悬液置于给定的T100型LAL试管(Ch.River Endosafe，无致热源)中的肝素血浆中。
6.2.肝素血浆：对应于2.2部分。
6.3.内毒素溶液：
LPS绿脓杆菌(Sigma公司，L7018，批号109H4043)。将储藏在-70℃微量离心管中的已分成多份(每份为100μl 10-3g/ml(1mg/ml))的内毒素解冻，并将其与900μl LAL水混合。随后该内毒素在NaCl中进一步被稀释至所需的10ng/ml的浓度(＝内毒素溶液；ET溶液)。
6.4.测试批次：
在该测试的批次中，将内毒素溶液进一步稀释至1ng/ml的最终浓度。吸附体在该些测试批次中的最终浓度为1％。对于该些测试批次，50％吸附体悬液(悬浮着的吸附体的体积)、肝素血浆(血浆)，以及内毒素溶液[10ng/ml](ET溶液)根据本说明书的表17通过移液管移入至试管中。作为对照，不带有吸附体的试管(无吸附体的对照)以及带有未经处理的肝素血浆(天然血浆)的试管同样被处理。
表17：测试批次
该些测试批次在Enviro-Genie摇动器中以37℃培育60分钟。
6.5.取样：
批量测试以及LAL测试的所有步骤(还有稀释和标准曲线)在来自于Chromogenix公司的玻璃LAL试管(T100型，带有塑料塞)中进行。只有用于离心的取样在无致热源的微量离心管中进行。
在5、15和60分钟的培育时间之后，使用旋涡混合器对该试管以涡旋式混合。从各个案取0.2ml的样品，并移转到无致热源的微量离心管中。该些样品在桌面离心机(Eppifuge)中以11000g的离心力离心10分钟。将100μL的上层清液移转入玻璃的LAL试管中，并在LAL测试中进行测试。(LAL测试：Charles River Endosafe胞染色素，试剂盒编号：Y 1892EK1)。
6.6.结果：
结果如表18所列并如图8所示，图8显示了在时间曲线中，已被高压消毒和未被高压消毒的吸附体或纤维素吸附体以及对照对内毒素(ET)的吸附(以内毒素单位(EUI/ml)表示)的图表。
表18：结果
  EU/ml   0分钟   5分钟   15分钟   60分钟
  #1826+PMB A   3.047   0.062   0.00   0.00
  #1826+PMB B   3.047   0.00   0.00   0.00
  #1862Cell+PMB A   3.047   1.696   2.10   1.65
  #1862Cell+PMB B   3.047   0.273   0.20   0.21
  无吸附体的对照   3.047   2.684   2.24   2.27
  天然血浆   x   x   x   0
根据本发明的吸附体#1826+PMB A以及#1826+PMB B在高压消毒之前和之后对内毒素的吸附皆为良好。
相反，高压消毒纤维素吸附体使吸附内毒素显著地变差。

Claims (16)

1.一种用于从生物流体中除去内毒素的吸着剂，该吸着剂具有不溶于水的多孔载体以及固定在该载体上的多粘菌素，
其特征在于
该载体具有中性的、疏水的表面并且多粘菌素通过疏水相互作用而被固定在载体的表面上。
2.根据权利要求1的吸着剂，其特征在于该载体为疏水聚合物。
3.根据权利要求2的吸着剂，其特征在于该疏水聚合物为已交联的聚苯乙烯聚合物，尤其为聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。
4.根据权利要求1至3其中一项的吸着剂，其特征在于该载体的平均孔隙大小为至少15nm，优选地为至少30nm。
5.根据权利要求1至4其中一项的吸着剂，其特征在于该载体的平均孔隙大小为不大于120nm。
6.根据权利要求4和5其中一项的吸着剂，其特征在于该载体的平均孔隙大小大约为80-100nm。
7.根据权利要求1至6其中一项的吸着剂，其特征在于该吸着剂呈微粒的形式。
8.根据权利要求7的吸着剂，其特征在于该微粒的粒子大小为20μm或更小，优选地为8μm或更小，理想地为5μm或更小。
9.一种吸着设备，其包含根据权利要求1至8其中一项的吸着剂。
10.一种血浆回路，其包含根据权利要求1至8其中一项的吸着剂的悬液。
11.一种从生物流体中除去内毒素的方法，其特征在于将被内毒素污染的生物流体与根据权利要求1至8其中一项的吸着剂产生接触。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于该生物流体为血液或血浆。
13.根据权利要求1至8其中一项的吸着剂用于治疗败血症。
14.根据权利要求9的吸着设备用于治疗败血症。
15.根据权利要求10的血浆回路用于治疗败血症。
16.使用根据权利要求1至8其中一项的吸着剂，其用作为在基于微球的解毒***(MDS)中的吸着剂。
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