CN116179446A - 一种防治柑橘根腐黄化病的微生物菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种防治柑橘根腐黄化病的微生物菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种防治柑橘根腐黄化病的微生物菌剂及其制备方法和应用，所述微生物菌剂包括阿氏芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌，所述阿氏芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的有效活菌数均≥2.0×1010个/g。本发明的微生物菌剂对引起柑橘黄化病菌的镰刀菌（Fusarium）拮抗效果明显，阿氏芽孢杆菌还有分解土壤中的镉等重金属污染、解磷、解钾、解硅、分泌植物生长激素促进植物生长的作用。经过田间大量试验，本发明的微生物菌剂能防止或减轻柑橘黄化现象的发生，促进柑橘稳产、增收，改善和提高柑橘的产量和品质。

Description

一种防治柑橘根腐黄化病的微生物菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及柑橘黄化病防治技术领域，特别是涉及一种防治柑橘根腐黄化病的微生物菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
柑橘生长过程中叶片出现失绿发黄，严重时造成死树，群众称此为“黄化病”。柑橘黄化现象在许多柑橘园区都有不同程度的发生。由于叶片光合作用受阻，导致果实产量低，品质差，是柑橘生产上的一个急需解决的重大问题。引起柑橘黄化问题的原因很多，主要集中在以下几方面：1. 营养元素缺乏。缺少氮、钾、镁、钙、硫、铁、锌、锰、硼、铜等大中微量元素引起的黄化。2. 施肥过量或不当造成黄化。化肥使用不当导致氯、硼、铜、硫等元素过量，或者施用了未经发酵腐熟的有机肥后，造成有机肥在植物根部再次高温发酵，对植物根部造成伤害，阻碍水分和营养的及时供应，地上与地下部分营养失调出现黄叶。3. 环境气候条件造成叶片黄化。土壤质地黏重，土壤板结，水分过多或过低，冻害或树势衰弱等造成叶片黄化。4.病虫害造成柑橘黄化。植物病原菌引起的根腐病，根茎疫病等，红蜘蛛、蚜虫等导致叶片枯黄脱落，甚至整株果树死亡。
目前，柑橘黄化问题的解决主要是针对问题查找原因，进行科学施肥，合理灌溉，喷施化学农药等措施进行病虫害的防治。化肥或农药的使用会造成环境污染，农化残留，农产品品质下降，不利于农业的绿色可持续性发展。
近年来，微生物菌剂的开发和应用日益增多，受到人民的偏爱。菌剂中的微生物有抑制植物病害的作用，可减少化肥农药的使用，增加和改良根际周围有益微生物菌群结构。经本公司技术人员检索，目前未见有阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)、贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）防治柑橘病理性根腐黄化病的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的环境污染，农化残留，农产品品质下降，不利于农业的绿色可持续性发展的技术缺陷，而提供一种防治柑橘根腐黄化病的微生物菌剂及其制备方法和应用。
为实现本发明的目的所采用的技术方案是：
一种防治柑橘根腐黄化病的微生物菌剂，所述微生物菌剂包括阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)和贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），所述阿氏芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的有效活菌数均≥2.0×1010个/g。
阿氏芽孢杆菌 MES85801分类命名为阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai），已于2023年01月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为 CGMCC No.26404。贝莱斯芽孢杆菌MES861分类命名为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），已于2018年12月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为CGMCC No.16857。
在上述技术方案中，所述阿氏芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的质量比为1:1。
本发明的另一方面，提供一种所述的微生物菌剂的制备方法，包括阿氏芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的发酵液的制备、发酵液与稳定剂制备液体制剂和喷雾干燥，优选的，所述稳定剂为黄原胶。
在上述技术方案中，所述阿氏芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的发酵液均通过以下方法制备：
步骤1，一级种子培养：将经试管斜面活化的菌株,进行培养得到一级种子，培养基为一级种子培养基；
步骤2，发酵:在扩发酵罐中装有液体发酵培养基，对液体发酵培养基进行灭菌后，将步骤1得到的一级种子接种液体发酵培养基中发酵培养；
步骤3，至芽孢形成比例大于等于90%时，结束发酵，放罐，得到发酵液。
在上述技术方案中，所述一级种子培养基包括8-13质量份数的蛋白胨、2-5质量份数的牛肉膏、3-5质量份数的氯化钠、19.5质量份数的琼脂和1000质量份数的水，所述一级种子培养基的pH值为7.0-7.5；
所述液体发酵培养基包括葡萄糖2-4%、酵母浸粉0.5-1%和氯化钾0.5-0.75%，所述液体发酵培养基的pH值为7.0-7.5。
在上述技术方案中，所述步骤2中发酵培养的条件为，控制扩发酵罐的压力在0.02Mpa-0.07 Mpa，在35℃培养26h。
本发明的另一方面，提供一种所述的微生物菌剂在防治柑橘根腐黄化病中的应用，将所述微生物菌剂加水稀释后，均匀浇在植株根部或挖沟施用有机肥后在植物根部浇适量水。
在上述技术方案中，所述加水稀释的倍数为400-800倍。
在上述技术方案中，所述微生物菌剂对柑橘黄化病的防效不低于85%。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的微生物菌剂对引起柑橘黄化病菌的镰刀菌（Fusarium）拮抗效果明显，阿氏芽孢杆菌还有分解土壤中的镉等重金属污染、解磷、解钾、解硅、分泌植物生长激素促进植物生长的作用。经过田间大量试验，本发明的微生物菌剂能防止或减轻柑橘黄化现象的发生，促进柑橘稳产、增收，改善和提高柑橘的产量和品质。
附图说明
图1所示为本发明的微生物菌剂对柑橘黄化根腐病的拮抗效果图。
图2所示为本发明微生物菌剂对柑橘黄化根腐病的防效图，其中，a为施加微生物菌剂前，b为施加微生物菌剂防治后。
阿氏芽孢杆菌 MES85801分类命名为阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai），已于2023年01月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为 CGMCC No.26404。贝莱斯芽孢杆菌MES861分类命名为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），已于2018年12月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为CGMCC No.16857。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai），是我司研发人员从天津武清区土壤中分离获得，保藏日期：2023年01月06日，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.26404。阿氏芽孢杆菌为芽孢杆菌属，属于革兰氏阳性菌、芽孢杆菌属，接触酶阳性，菌落光滑。
贝莱斯芽孢杆菌 （Bacillus velezensis），保藏日期：2018年12月03日，保藏单位名称及简称：中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏号：CGMCC No.16857 。该菌为芽胞杆菌科，芽孢杆菌属革兰氏阳性细胞，内生孢子椭圆形。过氧化氢酶阳性，接触酶阳性，明胶液化阳性，不能运动，吲哚阳性，分解淀粉，不分解纤维素。具有广谱抑菌活性，促进植物生长的特性，有巨大的开发研究价值。
实施例1
一种防治柑橘根腐黄化病的微生物菌剂，通过以下步骤制备：
①一级种子培养：将经试管斜面活化的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)和贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）分别进行安碚瓶培养，一级种子培养基为营养琼脂培养基。所述一级种子培养基的配方为：蛋白胨8-15克，牛肉膏3-6克，氯化钠3-5克，琼脂19.5克，超纯水1000毫升，pH值为7.0-7.5。培养条件为：温度 22℃-37℃，培养 24 h。
②发酵:在30 m3扩发酵罐中装有20 L液体发酵培养基， 118℃-122℃湿热灭菌35-40 min后冷却到35℃，将步骤①得到的一级种子分别接种于液体发酵培养基中，控制罐压在0.02 Mpa-0.07 Mpa，在35℃发酵培养26 h；发酵所用培养基的原料及用量为: 葡萄糖2-5%，酵母浸粉0.2-0.6%，氯化钾0.5-0.8%，pH值为7.0-7.5。
③待步骤②中发酵培养的芽孢形成比例大于等于90%时，结束发酵，放罐，得到发酵液；
④将步骤③得到的发酵液与黄原胶复合制成液体制剂：
⑤将液体制剂在喷干塔内进行浓缩喷干成粉末状得到所述微生物菌剂，装入包装袋内，其中，所述阿氏芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的质量比为1:1。
检测计数，贝莱斯芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌产品有效活菌数（CFU）分别达到≥2.0×1010个/g。
实施例2
使用实施例1得到的微生物菌剂对柑橘根腐黄化病原菌的抑菌试验
（一）试验时间和地点：在公司研发中心实验室内进行。
（二）试验方法：
（1）供试菌种来源
引起柑橘根腐黄化病的病菌BYJ-19分离自广西南宁上林县柑橘园，经公司研发人员分离、纯化、培养，纯化菌种经16S rDNA最终鉴定为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），经致病力测定鉴定为强致病力。
所述微生物菌剂为实施例1制备获得。
（2）平板拮抗实验
制备PDA固体平板，用无菌接种针挑取少量的根腐病病原菌菌丝放在培养皿中间，烧红接种针，等接种针冷却后蘸取少量的所述微生物菌剂在距接种病原菌菌斑2.0厘米的四周，设置不接种功能拮抗菌只接种根腐菌的处理为空白对照，每个处理设置三次重复。28℃恒温培养，待空白对照菌丝长满整个培养皿时，测量仅接种根腐病菌的对照菌落面积（菌落半径）和接种微生物菌剂的菌落面积（抑制菌落半径），用拮抗效果表示（拮抗效果（%）=（对照菌落面积-处理菌落面积）/对照菌落面积×100）。
（3）拮抗效果
通过本实验发现贝莱斯芽孢杆菌MES861和阿氏芽孢杆菌MES85801对柑橘黄化根腐病的拮抗效果达80.2%；对照平均菌落半径为4.5 cm，接种贝莱斯芽孢杆菌和阿氏芽孢杆菌的平均菌落半径为2.1 cm（如图1所示）。说明贝莱斯芽孢杆菌和阿氏芽孢杆菌对柑橘黄化根腐病具有明显的抑制作用，具有防治柑橘黄化根腐病的生防潜力。
实施例3
对实施例1得到的微生物菌剂对柑橘黄化根腐病的防治效果测试
（一）试验药剂
（1）微生物菌剂
实施例1制备得到的微生物菌剂，用水稀释500倍；
（2）化学药剂
3%甲霜恶霉灵700倍液（50 ml药兑水35 kg）（德州祥龙生化有限公司）。
（3）空白对照
设置清水处理为空白对照。
（二）试验时间和地点
试验于广西南宁上林县柑橘果园进行。
（三）试验方法
处理设置：发病植株，实验设置4个处理，分别为：1、发病植株不施用菌肥；2、施用化学药剂；3、施用复合微生物菌剂，用水稀释500倍。
实验方法：量取各处理药剂，加水稀释到相应浓度，均匀浇在植株根部或挖沟施用有机肥后在植物根部浇适量水。15-30天后观察效果。
（四）结果
试验结果见表1，从结果可以看出，施用贝莱斯芽孢杆菌MES861和阿氏芽孢杆菌复合菌粉的处理病情指数（10.12）显著低于空白对照处理后的病情指数（85.35），高于使用化学药剂后病情指数（8.38）。说明添加有贝莱斯芽孢杆菌MES861和阿氏芽孢杆菌MES85801的微生物菌剂可作为防治柑橘根腐黄化病的菌剂(如图2所示)，具有广阔的推广利用价值。
表1不同处理对柑橘黄化病的防治效果
处理 病情指数 防效（%）
甲霜恶霉灵700倍液 8.38b 90.28
复合微生物菌剂500倍 10.12ab 87.12
空白对照 85.35a 0.00
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种防治柑橘根腐黄化病的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包括阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)和贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），所述阿氏芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的有效活菌数均≥2.0×1010个/g。
2.如权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于，所述阿氏芽孢杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCC No.26404，保藏日期：2023年01月06日；所述贝莱斯芽孢杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCC No.16857，保藏日期：2018年12月03日。
3.如权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于，所述阿氏芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的质量比为1:1。
4.一种如权利要求1-3任意一项所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括阿氏芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的发酵液的制备、发酵液与稳定剂制备液体制剂和喷雾干燥。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述阿氏芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的发酵液均通过以下方法制备：
步骤1，一级种子培养：将经试管斜面活化的菌株,进行培养得到一级种子，培养基为一级种子培养基；
步骤2，发酵:在扩发酵罐中装有液体发酵培养基，对液体发酵培养基进行灭菌后，将步骤1得到的一级种子接种液体发酵培养基中发酵培养；
步骤3，至芽孢形成比例大于等于90%时，结束发酵，放罐，得到发酵液。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述一级种子培养基包括8-13质量份数的蛋白胨、2-5质量份数的牛肉膏、3-5质量份数的氯化钠、19.5质量份数的琼脂和1000质量份数的水，所述一级种子培养基的pH值为7.0-7.5；
所述液体发酵培养基包括葡萄糖2-4%、酵母浸粉0.5-1%和氯化钾0.5-0.75%，所述液体发酵培养基的pH值为7.0-7.5。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中发酵培养的条件为，控制扩发酵罐的压力在0.02Mpa-0.07 Mpa，在35℃培养26h。
8.一种如权利要求1-3任意一项所述的微生物菌剂在防治柑橘根腐黄化病中的应用，其特征在于，将所述微生物菌剂加水稀释后，均匀浇在植株根部或挖沟施用有机肥后在植物根部浇适量水。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述加水稀释的倍数为400-800倍。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述微生物菌剂对柑橘黄化病的防效不低于85%。
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