CN112341532A

CN112341532A - OsDSK2a蛋白或其编码基因在调控水稻稻瘟病抗性方面的应用

Info

Publication number: CN112341532A
Application number: CN202011449973.5A
Authority: CN
Inventors: 晏石娟; 刘清; 李文燕; 陈中健; 孔谦; 黄文洁
Original assignee: Guangdong Academy Of Agricultural Sciences-Agricultural Biological Gene Research Center
Current assignee: Guangdong Academy Of Agricultural Sciences-Agricultural Biological Gene Research Center
Priority date: 2020-12-09
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2021-02-09

Abstract

本发明公开了OsDSK2a蛋白或其编码基因在调控水稻稻瘟病抗性方面的应用。所述的OsDSK2a蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明首次证明了水稻DSK2a基因(Os10g0542200)是水稻稻瘟病感病的功能基因，该基因的克隆和生物学功能验证对于水稻稻瘟病抗性的分子机制研究有重要的参考意义。本发明提供了Cas9介导的Os10g0542200基因编辑载体。该载体转化水稻后能大幅降低Os10g0542200的表达量，伴随着表达量的降低，转化植株的稻瘟病感病性降低、抗病性明显增强，并且转基因植株在生长状态及农艺性状上没有明显的改变。本发明通过Cas9介导的Os10g0542200基因敲除技术可以应用于水稻的基因遗传工程育种，并能够应用于生产实践中，改良水稻的稻瘟病抗性，从而保障目前水稻病害频发的气候条件下的水稻生产安全。

Description

OsDSK2a蛋白或其编码基因在调控水稻稻瘟病抗性方面的应用

技术领域：

本发明属于作物遗传技术领域，具体地涉及OsDSK2a蛋白或其编码基因在调控水稻稻瘟病抗性方面的应用。

背景技术：

由真菌Magnaporthe grisea(Hebert)Barr引起的水稻稻瘟病是世界各稻区危害最严重的水稻病害之一，对全球稻作栽培产生毁灭性的影响。稻瘟病在水稻生长各个时期都可能发生，尤以叶瘟和穗瘟的危害最大。全球每年因稻瘟病造成的产量损失达11～30％，直接经济损失约50亿美元，损失的粮食足以养活6000万人口。在我国，凡有水稻栽培的地方都有稻瘟病发生。南北稻区每年均受到不同程度危害，一般减产10～20％，重的达40～50％，局部田块甚至颗粒无收。

目前，利用品种的抗性，开展稻瘟病抗性育种被认为是最经济、有效和环境友好的防治途径。近年来，育种学家利用常规育种技术培育出了许多水稻稻瘟病抗病品种。但是，大部分抗病品种推广应用2～3年后即丧失其稻瘟病抗性。如高抗稻瘟病品种“窄叶青8号”推广种植不到三年便丧失抗性，高产抗病优质品种“粳籼89”推广不到四年，其抗病性也明显下降。由此可见，水稻品种稻瘟病抗性周期短是水稻生产中一个普遍而突出的问题，延长水稻品种稻瘟病的持性寿命已成为我国乃至各水稻生产国水稻改良中需要优先解决的问题。

稻瘟病在水稻生长各个时期都可能发生，尤以叶瘟和穗瘟最为常见。已有研究表明，水稻叶瘟抗性和穗瘟抗性具有共通性。对稻瘟病持久抗性品种Moroberekan、谷梅2号和三黄占2号的抗病遗传分析结果表明，稻瘟病持久抗性由质量抗性(主效基因控制)和数量抗性(微效基因控制)两部分组成。国际上迄今已至少报道了69个抗稻瘟病位点共84个主效基因，以及鉴定和定位了300多个稻瘟病数量抗性的QTL。然而，有关水稻感病基因的鉴定、克隆及应用的研究鲜见报道。因此，发掘、鉴定及利用稻瘟病感病基因也是水稻稻瘟病抗性分子育种取得突破的重要途径。

发明内容：

本发明的目的是提供OsDSK2a蛋白或其编码基因在调控水稻稻瘟病抗性方面的应用。

本发明利用CRISPR技术敲除水稻中所含有的OsDSK2a基因(Os10g0542200)，再将转化后的水稻细胞培育成植株，得到稻瘟病抗性改变的转基因水稻，其中，Os10g0542200基因敲除后水稻稻瘟病抗性是提高的。

因此本发明提供了OsDSK2a蛋白或其编码基因-OsDSK2a基因在调控水稻稻瘟病抗性方面的应用，所述的OsDSK2a蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选，所述的OsDSK2a基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选，敲除水稻中的OsDSK2a基因在提高水稻稻瘟病抗性中的应用。

本发明的第二个目的是提供一种提高水稻稻瘟病抗性的方法，是将水稻中的OsDSK2a基因敲除，从而提高水稻稻瘟病抗性，所述的OsDSK2a基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

优选，是利用CRISPR技术敲除水稻细胞中所含有的OsDSK2a基因，再将转化后的水稻细胞培育成植株，得到稻瘟病抗性提高的转基因水稻。

优选，所述的利用CRISPR技术敲除水稻中所含有的OsDSK2a基因，其特异编辑位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第三个目的是提供一种在利用Crispr/Cas9特异性敲除OsDSK2a基因的特异编辑位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第四个目的是提供上述特异编辑位点在提高水稻稻瘟病抗性中的应用。如在制备提高水稻稻瘟病抗性的药物中应用。

本发明还提供了上述OsDSK2a基因的基因编辑靶位点，sgRNA、特异引物对；含有靶位点序列的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

本发明具有以下有益效果：

1.本发明首次证明了水稻DSK2a基因(Os10g0542200)是水稻稻瘟病感病的功能基因，该基因的克隆和生物学功能验证对于水稻稻瘟病抗性的分子机制研究有重要的参考意义。

2.本发明提供了Cas9介导的Os10g0542200基因编辑载体。该载体转化水稻后能大幅降低Os10g0542200的表达量，伴随着表达量的降低，转化植株的稻瘟病感病性降低、抗病性明显增强，并且转基因植株在生长状态及农艺性状上没有明显的改变。因此，本发明通过Cas9介导的Os10g0542200基因敲除技术可以应用于水稻的基因遗传工程育种，并能够应用于生产实践中，改良水稻的稻瘟病抗性，从而保障目前水稻病害频发的气候条件下的水稻生产安全。

附图说明

图1为实施例1中所使用的过表达载体pYLCRISPR/Cas9P_ubi-H和pYLgRNA-OsU6b的载体图谱；

图2为实施例2中Os10g0542200基因敲除获得转基因植株的PCR鉴定及靶位点测序图，其中OsDSK2aCas9-6、OsDSK2aCas9-14和OsDSK2aCas9-17是Os10g0542200基因敲除的转基因纯合突变体苗，+表示阳性对照，-表示阴性对照；

图3为实施例3中敲除Os10g0542200基因对水稻植株的叶瘟抗性的影响，其中**表示与对照相比存在极显著差异，其中OsDSK2aCas9-6、OsDSK2aCas9-14和OsDSK2aCas9-17是Os10g0542200基因敲除的转基因纯合突变体苗，Wildtype代表野生型。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均可自常规生化试剂公司购买得到。

实施例1 Os10g0542200基因敲除靶位点的选择及敲除载体的构建

1、敲除靶位点的选择

针对Os10g0542200基因(其核苷酸序列如SEQIDNo:1)设计敲除靶序列。利用E-CRISP(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/)筛选出了一条20bp的特异靶序列用于产生sgRNA。该序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)位于Os10g0542200基因第二外显子、全长1728bp CDS序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)的352-371bp处(5’-GCTTCAGCTGCTCCTAGCAG-3’)。Os10g0542200基因的编码蛋白DSK2a的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

2、敲除载体pYLCRISPR/Cas9-OsDSK2a的构建

(1)菌种活化和质粒提取制备：将来自华南农业大学刘耀光院士实验室的含质粒pYLCRISPR/Cas9-H(AddgeneID66187，其载体图谱如图1所示)的菌种(TOP10F’)和pYLgRNA-OsU6b(AddgeneID66196，其载体图谱如图1所示)的菌种(DH10B)分别在含有卡那霉素(25μg/ml)和氨苄青霉素(50μg/ml)的LB平板培养基划出单菌落，取单菌落培养1ml种子液，再扩大培养用于提取质粒。采用TIANGEN公司EndoFreeMaxiPlasmidKit)提取纯化，备用。

(2)sgRNA表达盒的构建：

①取2-5ng pYLgRNA-OsU6b质粒为模板，在一个反应中使用4种引物：U-F和gR-R各0.2μM，DSK6b-F和DSK6b-R各0.1μM。25-28循环：94℃10s，58℃15s，68℃20s。在扩增过程中，开头的若干循环时U-F/DSK6b-R扩出U6a启动子+DSK2a靶位点序列，DSK6b-F/gR-R扩出DSK2a靶位点+sgRNA序列。后期的循环中通过Overlapping PCR产生2个片段合并的sgRNA表达盒片段(含OsU6b启动子、DSK2a靶位点和sgRNA序列)。PCR引物：U-F：CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG；gR-R：CGGAGGAAAATTCCATCCAC；DSK6b-F:CTGCTAGGAGCAGCTGAAGcaacacaagcggcagc；DSK6b-R:CTTCAGCTGCTCCTAGCAG gttttagagctagaaat.

②取第一轮①的PCR产物1μl用H₂O稀释10倍，取1μl为模板，在50μl的PCR反应体系中加入Pps-GGL和Pgs-GG2引物各0.15μM、适量高保真KOD-Plus酶。扩增17-20循环：95℃10s，58℃15s，68℃20s，得到sgRNA表达盒。取2-3μl电泳检查，并估计样品的大致浓度。PCR引物：Pps-GGL:TTCAGAggtctcTctcgACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG；Pgs-GG2:AGCGTGggtctcGtcagggTCCATCCACTCCAAGCTC.

(3)双元载体pYLCRISPR/Cas9-H与sgRNA表达盒的酶切-连接反应：

用变温循环进行酶切连接约10-15循环:37℃5min；10℃5min，20℃5min；最后37℃5min。得到连接产物。

(4)连接产物转化(电激法转化)：将步骤(3)的连接产物滴载在悬浮式透析膜Millipore VSWP04700(0.025μm孔径)对1/3xTE透析30min脱盐后取1μl连接产物电激转化E.coli DH10B感受态细胞。

(5)阳性克隆筛选：用常规碱裂解法提取质粒，取约80～100ng用～3UAscI(20μl反应)切出串联的gRNA表达盒片段，电泳检查其大小是否符合预期(各gRNA表达盒片段大小之和)。选择阳性克隆进行测序验证，由此得到靶向OsDSK2a基因的敲除载体pYLCRISPR/Cas9-OsDSK2a。测序引物：SP1:CCCGACATAGATGCAATAACTTC；SP2:GCGCGGTGTCATCTATGTTACT.

实施例2 Os10g0542200基因敲除转基因植株的获得及鉴定

采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法将构建好的敲除载体pYLCRISPR/Cas9-OsDSK2a转入正常粳稻品种日本晴中。水稻转化工作委托武汉伯远生物科技有限公司完成。转化的大致过程如下：提取出pYLCRISPR/Cas9-OsDSK2a质粒，转化进入农杆菌EHA105中，将含有pYLCRISPR/Cas9-OsDSK2a质粒的农杆菌EHA105侵染粳稻品种日本晴愈伤组织，再转到共培养基上26℃暗培养2～4天，清洗后的愈伤组织转到含潮霉素的选择培养基上进行抗性筛选，经选择后的抗性愈伤转到预分化培养基10～14天，再转到分化培养基光照培养，待小苗长至2～4cm时转至生根培养基生长3周。T0代小苗炼苗3天后移栽至土中，并进行PCR鉴定。

以野生型和T0代叶片基因组DNA为模板，用Hyg-F/Hyg-R进行PCR扩增(引物Hyg-F：AGCCTGACCTATTGCATCTCCC；Hyg-R：CTGCTCCATACAAGCCAACCAC)，有特异扩增条带者为转基因阳性植株。然后，在编辑靶序列两侧设计特异引物DSK2a-F和DSK2a-R(引物序列DSK2a-F：TCTTTTCTTGCTTCTCACACTCC；DSK2a-R：TTGCCAGTAGAACCTGCCCG)，以阳性转基因植株基因组DNA为模板，对其PCR扩增产物(图2-A)进行测序来检测T0代靶序列。以野生型为对照，T0代鉴定了20株转化苗，其中3株纯合突变体苗，分别为OsDSK2aCas9-6、-14和-17，突变序列如图2-B所示。其中，OsDSK2aCas9-6和OsDSK2aCas9-17均为相同位点的单碱基***，导致移码突变并从N端第124个氨基酸开始与野生型不同，且在第186个氨基酸后提前终止。OsDSK2aCas9-14为四碱基缺失，导致移码突变并从N端第122个氨基酸开始与野生型不同，且在第164个氨基酸后提前终止。

实施例3 Os10g0542200基因敲除转基因植株稻瘟病抗性的叶瘟表型鉴定

把实施例2中纯合的3个基因敲除T0代株系(OsDSK2aCas9-6、OsDSK2aCas9-14、OsDSK2aCas9-17)和野生型水稻种子在32℃发芽，2天后将幼芽分别移至装有泥土的塑料盘中播种，待幼苗长到3-4叶期时移栽到黑色塑料桶(直径约30cm，高约45cm)中，每个桶种4株，每个株系种16株，4周之后采用打孔接种的方法进行叶瘟抗性鉴定。每个植株的第二或第三片叶子用打孔器压出一个伤口，然后将10微升含有5x10⁵个孢子(PyriculariaoryzaeCav.)的菌液滴到叶片伤口处，而后用防水胶布将叶片粘住，以防菌液溢出。接种后的植株先在人工气候箱中黑暗培养24h，期间2-3小时喷水2分钟以保持湿度，24h之后移到网室正常光周期培养，继续每2-3小时喷水2分钟以保持湿度，7天之后测量病斑大小。结果见图3，结果表明Os10g0542200基因敲除植株叶瘟抗性明显增强，与野生型相比，病叶面积明显减小。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广东省农业科学院农业生物基因研究中心

<120> OsDSK2a蛋白或其编码基因在调控水稻稻瘟病抗性方面的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1728

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atgggcggcg gaggaggcga ggccgggggc ggcgacggag gggagtcctc tcctgctgcg 60

gctgcggcgg cggcggtggc gggggccgcg gcgctgcaca tccggtgcgc gaacgggtcc 120

aagttcaccg tgcgggccga cctcgacgcc acggtggggg cgttcaagga ggtggtggcg 180

gggagctgcg acgtgccggc ggcgcagcag cgcctgatct acaagggccg gatcctcaag 240

gacgagcaaa ccctagaaag ctatggtgtt gaaacagatc ataccattca tatggtgcgt 300

ggcgctggtc ccccagccgg atcagctgca cctgctgcag ccagccccca agcttcagct 360

gctcctagca gcggcccaac agatggtctt ggaagtttgt ttcctggcct tggtggtaca 420

ggaactgctg gtaccaggcc atctggtctt tttgggtctg gatttccaga attggatcaa 480

atgcagcagc agttaagcca aaaccccaac ttaatgaggg aaataatgaa tatgccaatg 540

atgcagaatc tcatgaataa ccctgattta attcgtaaca tgatcatgaa caatcctcaa 600

atgcgtgata tcatcgaccg gaatccagat cttgctcatg ttctcaatga tccaagtgtt 660

ctccgccaga cccttgaagc agccagaaac cctgaaatca tgagggagat gatgcggaac 720

acagacagag caatgagcaa cattgagtct tctcctgaag ggtttaatat gctccgacgc 780

atgtatgaaa ctgtccagga gcctttccta aatgcgacaa caatgggtgg agaaggcaac 840

acagctccaa acccattctc agctcttctt ggaaatcagg gttctaacca accaagggat 900

cctgctacaa atgctccaaa tactggctca gagtctacaa caggaacccc tgctccaaac 960

actaatccac ttccaaatcc ttggagctcc aatgctggag gtgcgcaagg agcaacacgg 1020

gcaggttcta ctggcaatgc aagaaccggt gccactgggg gccttggagg gttggggtca 1080

gctgatctga gcagtttatt tggtggtctt gccggtaata caggaactgg tgctactggt 1140

ggtctaggag ggttgggttc agcagatttg ggaagtttgc ttggtggttc tcctgattct 1200

tcttccttga gccagatttt gcaaaaccct gttatgatgc agatgatgca gaatatcatg 1260

tctgatccac agtccatgaa ccagttgctt aacttcaacc caaatacacg caacctcatg 1320

gaatcaaaca ctcagttgag ggaaatgttc caaaatccag aatttattcg ccagcttaca 1380

tccccagaaa ctatgcagca attactctcg ttccagcaga cattattatc acagcttggt 1440

caaaatcaac ctaggcagga tggtagccaa ggaggcaatg cgacaggcat gcggggaaat 1500

gttagcctcg acaccttgat gggcatgctt agtgggcttg gtgctggagg tggcataggt 1560

gtacccaata catccaatgt tccaccggaa gaactgtatg caacacagct cactcagctc 1620

cgagagatgg gtttcatcga cactgcagag aacatccagg cgctagtcgc aactgctggg 1680

aatgtgaatg ctgcggtgga gcgtcttctt ggcaatcttg gccagtag 1728

<210> 2

<211> 575

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Gly Gly Gly Asp Gly Gly Glu Ser

1 5 10 15

Ser Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu

20 25 30

His Ile Arg Cys Ala Asn Gly Ser Lys Phe Thr Val Arg Ala Asp Leu

35 40 45

Asp Ala Thr Val Gly Ala Phe Lys Glu Val Val Ala Gly Ser Cys Asp

50 55 60

Val Pro Ala Ala Gln Gln Arg Leu Ile Tyr Lys Gly Arg Ile Leu Lys

65 70 75 80

Asp Glu Gln Thr Leu Glu Ser Tyr Gly Val Glu Thr Asp His Thr Ile

85 90 95

His Met Val Arg Gly Ala Gly Pro Pro Ala Gly Ser Ala Ala Pro Ala

100 105 110

Ala Ala Ser Pro Gln Ala Ser Ala Ala Pro Ser Ser Gly Pro Thr Asp

115 120 125

Gly Leu Gly Ser Leu Phe Pro Gly Leu Gly Gly Thr Gly Thr Ala Gly

130 135 140

Thr Arg Pro Ser Gly Leu Phe Gly Ser Gly Phe Pro Glu Leu Asp Gln

145 150 155 160

Met Gln Gln Gln Leu Ser Gln Asn Pro Asn Leu Met Arg Glu Ile Met

165 170 175

Asn Met Pro Met Met Gln Asn Leu Met Asn Asn Pro Asp Leu Ile Arg

180 185 190

Asn Met Ile Met Asn Asn Pro Gln Met Arg Asp Ile Ile Asp Arg Asn

195 200 205

Pro Asp Leu Ala His Val Leu Asn Asp Pro Ser Val Leu Arg Gln Thr

210 215 220

Leu Glu Ala Ala Arg Asn Pro Glu Ile Met Arg Glu Met Met Arg Asn

225 230 235 240

Thr Asp Arg Ala Met Ser Asn Ile Glu Ser Ser Pro Glu Gly Phe Asn

245 250 255

Met Leu Arg Arg Met Tyr Glu Thr Val Gln Glu Pro Phe Leu Asn Ala

260 265 270

Thr Thr Met Gly Gly Glu Gly Asn Thr Ala Pro Asn Pro Phe Ser Ala

275 280 285

Leu Leu Gly Asn Gln Gly Ser Asn Gln Pro Arg Asp Pro Ala Thr Asn

290 295 300

Ala Pro Asn Thr Gly Ser Glu Ser Thr Thr Gly Thr Pro Ala Pro Asn

305 310 315 320

Thr Asn Pro Leu Pro Asn Pro Trp Ser Ser Asn Ala Gly Gly Ala Gln

325 330 335

Gly Ala Thr Arg Ala Gly Ser Thr Gly Asn Ala Arg Thr Gly Ala Thr

340 345 350

Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gly Ser Ala Asp Leu Ser Ser Leu Phe Gly

355 360 365

Gly Leu Ala Gly Asn Thr Gly Thr Gly Ala Thr Gly Gly Leu Gly Gly

370 375 380

Leu Gly Ser Ala Asp Leu Gly Ser Leu Leu Gly Gly Ser Pro Asp Ser

385 390 395 400

Ser Ser Leu Ser Gln Ile Leu Gln Asn Pro Val Met Met Gln Met Met

405 410 415

Gln Asn Ile Met Ser Asp Pro Gln Ser Met Asn Gln Leu Leu Asn Phe

420 425 430

Asn Pro Asn Thr Arg Asn Leu Met Glu Ser Asn Thr Gln Leu Arg Glu

435 440 445

Met Phe Gln Asn Pro Glu Phe Ile Arg Gln Leu Thr Ser Pro Glu Thr

450 455 460

Met Gln Gln Leu Leu Ser Phe Gln Gln Thr Leu Leu Ser Gln Leu Gly

465 470 475 480

Gln Asn Gln Pro Arg Gln Asp Gly Ser Gln Gly Gly Asn Ala Thr Gly

485 490 495

Met Arg Gly Asn Val Ser Leu Asp Thr Leu Met Gly Met Leu Ser Gly

500 505 510

Leu Gly Ala Gly Gly Gly Ile Gly Val Pro Asn Thr Ser Asn Val Pro

515 520 525

Pro Glu Glu Leu Tyr Ala Thr Gln Leu Thr Gln Leu Arg Glu Met Gly

530 535 540

Phe Ile Asp Thr Ala Glu Asn Ile Gln Ala Leu Val Ala Thr Ala Gly

545 550 555 560

Asn Val Asn Ala Ala Val Glu Arg Leu Leu Gly Asn Leu Gly Gln

565 570 575

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

gcttcagctg ctcctagcag 20

Claims

1.OsDSK2a蛋白或其编码基因-OsDSK2a基因在调控水稻稻瘟病抗性方面的应用，所述的OsDSK2a蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的OsDSK2a基因，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，敲除水稻中的OsDSK2a基因在提高水稻稻瘟病抗性中的应用。

4.一种提高水稻稻瘟病抗性的方法，其特征在于，是将水稻中的OsDSK2a基因敲除，从而提高水稻稻瘟病抗性，所述的OsDSK2a基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，是利用CRISPR技术敲除水稻细胞中所含有的OsDSK2a基因，再将转化后的水稻细胞培育成植株，得到稻瘟病抗性提高的转基因水稻。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的利用CRISPR技术敲除水稻中所含有的OsDSK2a基因，其特异编辑位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

7.一种在利用Crispr/Cas9特异性敲除OsDSK2a基因的特异编辑位点，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

8.权利要求7所述的特异编辑位点在提高水稻稻瘟病抗性中的应用。