CN116158447B - 一种玉米芽苗生物诱抗剂及其应用 - Google Patents

一种玉米芽苗生物诱抗剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种玉米芽苗生物诱抗剂及其应用；所述生物诱抗剂包括深绿木霉菌、木犀草素、载体和交联剂，按照一定比例进行包埋，制备得到生物诱抗剂。通过诱导处理玉米种子后进而提高玉米芽苗的抗逆性。该生物诱抗剂可以有效保护深绿木霉菌、木犀草素免受暴晒、水淹等恶劣自然环境的破坏，提高生防菌在土壤中的存活率和生物活性，为活性成分发挥作用提供保护环境。同时，本发明生物诱抗剂诱导玉米种子后产生多种与植物抗逆有关的物质，可提高玉米种子生长能力，对玉米产量和品质提高有促进作用。本发明操作方法简单，产品绿色环保无污染，具有较高的应用推广价值。

Description

一种玉米芽苗生物诱抗剂及其应用
技术领域
本发明属于植物保护技术领域，涉及玉米芽苗生物诱抗剂，尤其涉及一种玉米芽苗生物诱抗剂及其应用。
背景技术
玉米是我国重要的谷类作物，其总产量仅次于水稻位居第二，是我国重要的粮食、饲料和工业原料作物。目前，严重影响玉米生产的主要病害有玉米大斑病、小斑病、瘤黑粉病、茎基腐病等。传统农药、化肥使用过程中对农业***产生的负面影响日益严重，部分或全部利用生防制剂或生物方法对解决上述问题有积极作用。
植物在长期与自然界多种病原体互作的过程中形成多种级别的防御机制，抵抗外界不良环境对植物自身的伤害。植物的防御体系可分三个层面：组成性防御、先天免疫和***免疫。组成性防御形成于植物进化早期，构成植物抵制病原物侵染的第一道防线，可阻挡大部分病原物的侵染。因此，通过诱抗使玉米苗产生抗逆物质，提高对土传病害、盐胁迫、旱涝等逆境抗性，利于种苗成活和植株生长，减少化学农药和肥料的使用，对大气、土壤无污染，不伤天敌。
对玉米种子进行处理可以诱导种苗产生防卫反应，增强幼苗抵抗病原物侵染能力，加快农作物生长发育，增加作物产量、提高农作物品质。我国使用种子处理剂的历史较悠久，古代就有温汤泡种和药剂浸种，早在西汉年间的农书《农胜之书》中就有记载。种衣剂的功能主要是通过活性成分发挥作用，而非活性成分的作用则是促进活性成分更好地发挥作用实现其功能。我国疆域辽阔，不同地区气候条件、土壤条件、环境等有较大差异，生物诱抗剂使用效果容易受田间环境影响或短期无法表现出来，比如以荧光假单胞菌为主要成分的生物种衣剂对温度和湿度要求高，不同温湿度条件下菌种活性表现不同。
生物固定化技术是通过物理或化学手段将细胞固定在有限的空间区域内，并且能保持其原有的生物活性的技术。生物固定化技术不仅具有稳定性好、操作简单易于实现等优点，而且能一定程度避免外界环境中不利因素对细胞的影响，有利于细胞的生长和繁殖。根据载体的类型、载体与生物结合的形式，生物固定化方法可分为吸附法、交联法、包埋法、复合固定化法等。其中包埋法是将生物包埋在高聚物的凝胶网格中或高分子半透膜内，小分子底物和产物可以通过高聚物或半透膜自由扩散，对生物的影响较小。
发明内容
本申请的目的在于提供一种玉米芽苗生物诱抗剂及其应用；通过选用合适的生防菌、植物活性成分及生物固定包埋技术，获得的生物诱抗剂效果稳定，持效期长，不受土壤环境、温湿度、ph等影响，可以诱导玉米幼苗产生抗逆物质，提高作物对土传病害、盐胁迫、旱涝等逆境抗性。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种玉米芽苗生物诱抗剂，所述生物诱抗剂包括微生物、植物活性成分、载体和交联剂；所述微生物为深绿木霉菌Trichoderma sp.CJCCSJ-F-KY10039CCTCC No.M 20221135，所述植物活性成分为木犀草素，所述载体为海藻酸钠、壳聚糖、角叉菜胶。通过采用上述技术方案，微生物和植物活性成分共同作为有效成分，可以克服微生物起作用慢，植物活性成分起作用持效期短的问题；另外载体选用三种物质，可以克服单独使用一种载体带来的局限性。海藻酸钠作为载体对微生物无毒，传质性好，价格低，好操作等优点，使用广泛，但是耐机械强度低，在土壤中易被微生物分解等缺点。壳聚糖、角叉菜胶由分子结构决定其性能稳定，可以提高包埋颗粒的强度，易固定，且微生物存活率、繁殖率高，同时壳聚糖还可以为微生物的繁殖和生长提供碳源等。
作为一个实施方案，所述交联剂为氯化钙溶液。
第二方面，本发明还涉及一种玉米芽苗生物诱抗剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
S1、将深绿木霉菌株CJCCSJ-F-KY10039接种至PDA培养基中，于27-30℃光照培养箱培养3-5d后，制备孢子悬浮液，在PD中接种浓度为1×105-107个/ml木霉孢子，27-30℃，150-300rpm培养4-6天，得到菌液，9000-12000rpm离心15-25分钟后得到菌体；在一些实施示例中，于28℃光照培养箱培养4d后，制备孢子悬浮液，在PD中接种浓度为1×106个/ml木霉孢子，28℃，200rpm培养5天，得到菌液，10000rpm离心20分钟后得到菌体；
S2、以海藻酸钠、壳聚糖、角叉菜胶为载体，灭菌操作后，将所述菌体-植物活性成分包埋到载体中得到菌体-植物活性成分-载体混合物；
S3、将所述菌体-植物活性成分-载体混合物通过物理挤压的方式滴入无菌交联剂中制成球状物，用无菌生理盐水清洗8-15次，得到深绿木霉菌CJCCSJ-F-KY10039-木犀草素包埋小珠，26-30℃干燥20-30h，0-4℃保存。在一些实施示例中，用无菌生理盐水清洗10次，得到深绿木霉菌CJCCSJ-F-KY10039包埋小珠，27℃干燥24h，4℃保存。通过采用上述技术方案，固定剂氯化钙中的钙离子与载体分子螯合形成不溶于水的凝胶从而将细胞固定。
作为一个实施方案，所述载体是将海藻酸钠、壳聚糖、角叉菜胶溶解在无菌水中形成的质量浓度是1-3％的载体溶液；所述载体溶液与菌体-植物活性成分的用量比为5-20ml:1g；载体中海藻酸钠、壳聚糖、角叉菜胶的质量比为1-4:2-5:1-10。在一些实施示例中，形成质量浓度是2％的载体溶液；所述载体溶液与菌体的用量比为10ml:1g；载体中海藻酸钠、壳聚糖、角叉菜胶的质量比为1:3:2。
作为一个实施方案，所述菌液中有效活菌数为1×109个/ml以上。
作为一个实施方案，所述菌体和植物活性成分的比例是10:(1-7)。
作为一个实施方案，步骤S2中，所述载体进行灭菌操作，所述灭菌条件为121℃，0.12MPa压力下蒸汽灭菌20min。
作为一个实施方案，所述交联剂是质量浓度为0.5-2％的氯化钙溶液；所述氯化钙溶液与菌体的用量比为20ml:1g。在一些实施示例中，所述交联剂是质量浓度为1％的氯化钙溶液。
作为一个实施方案，所述物理挤压方式为将所述菌剂-植物活性成分-载体混合物用移液枪均匀滴加到交联剂中，每滴体积为0.02ml。
作为一个实施方案，所述包埋小珠的固化时间为15-20h。优选包埋小珠的固化时间为18h。
第三方面，本发明涉及玉米芽苗生物诱抗剂在诱导玉米芽苗产生抗逆物质中的应用。通过生物诱抗剂对玉米种子进行诱导后定殖。
本发明中，所述深绿木霉菌Trichoderma sp.CJCCSJ-F-KY10039于2022年7月19日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号是：CCTCC No.M 20221135。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、采用本发明特定的生物诱抗剂对玉米种子进行诱导，使玉米芽苗产生抗逆物质，提高作物对土传病害、盐胁迫、旱涝等逆境抗性，提高产量和品质，安全无毒，从而减少化学农药和化学肥料的使用，符合绿色农业和碳减排的发展需求。
2、本发明生物诱抗剂采用微生物和植物活性成分的组合物，可以避免微生物起作用慢，植物活性成分起作用持效期短的问题。
3、本发明通过对生物诱抗剂进行包埋处理，避免了施入土壤后菌体被直接暴露在开放、多变的土壤环境下导致菌体的大量死亡，不易形成优势菌群难以发挥菌剂的应有效果的缺点。
4、本发明对包埋载体进行了筛选和组合，克服了单一使用一种载体造成的机械强度弱、微生物存活率低等缺点，施入土壤中后，在自然环境中耐冲击等，更好的起到保护微生物活性成分的作用。
5、本发明特定的生物诱抗剂可以诱导玉米芽苗产生多种抗逆物质比如丙二醛、钙离子、茉莉酸、水杨酸升高，进而提高作物对干旱、盐碱等逆境环境的适应，产品制备方法简单，使用方便，安全可靠，具有较好的应用潜力和价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。本申请中所使用的原料均可通过市售获得。
实施例
1、制备生物诱抗剂
(1)制备菌体
将深绿木霉菌株CJCCSJ-F-KY10039接种至PDA培养基中，于28℃光照培养箱培养4d后，制备孢子悬浮液，在PD中接种浓度为1×106个/ml木霉孢子，28℃，200rpm培养5天，得到菌液，有效活菌数为1×109个/ml，10000rpm离心20分钟后得到菌体。
(2)制备菌体-植物活性成分-载体混合物
制备海藻酸钠、壳聚糖、角叉菜胶的混合载体。海藻酸钠、壳聚糖、角叉菜胶、聚乙烯醇按照不同质量比例配制10ml载体溶液Z1、Z2、Z3、Z4和Z5，载体质量浓度是2％，具体组成见表1，海藻酸钠、壳聚糖、角叉菜胶、聚乙烯醇均为化学纯，用前取一定量分别溶于80℃热水，冷却至约35℃恒温备用；在121℃，0.12MPa压力下蒸汽灭菌20min后，分别加入表2中的不同菌体-植物活性成分组合物，于恒温磁力搅拌器上振荡混均。
表1不同比例载体组成
载体 海藻酸钠 壳聚糖 角叉菜胶 聚乙烯醇
Z1 1 3 2 0
Z2 0 3 2 0
Z3 1 0 2 0
Z4 1 3 0 0
Z5 0 3 2 1
表2不同菌体-植物活性成分组成
活性成分 绿木霉菌 木犀草素
A1 1 0.1
A2 1 0.3
A3 1 0.7
A4 0 0.3
A5 1 0
A6 0 0
(3)交联包埋固定
用移液枪按照一定的速度均匀分别将上述菌体-植物活性成分-载体混合物滴加到20mL含有1％ CaCl2的交联溶液中，每滴体积为0.02ml，交联18h，滤出颗粒，用无菌生理盐水清洗10次，分别得到深绿木霉菌CJCCSJ-F-KY10039包埋颗粒即诱抗剂，27℃干燥24h，4℃保存。
2、性能检测试验
生物诱抗剂的活性、机械强度等直接影响生物诱抗剂的实际效果。
(1)诱抗剂颗粒机械强度的测定
以活性成分A1为例制备生物诱抗剂，载体按表1中各比例，制备得生物诱抗剂Y1、Y2、Y3、Y4和Y5。分别取5粒大小一致的生物诱抗剂颗粒Y1、Y2、Y3、Y4和Y5，呈正方形摆在一玻璃板上，在其上放一个玻璃皿，慢慢向玻璃皿里添加破码，直至颗粒完全变形，记录使颗粒完全变形的玻璃皿及所加按码总重1/4为每颗包埋颗粒承重量，以此来表示小球的机械强度。每个处理3次重复，结果取平均值。
表3不同比例载体生物诱抗剂颗粒机械强度的测定
(2)生物诱抗剂颗粒活菌数测定
称取新鲜包埋颗粒1g，分别于0.2mol/L的柠檬酸钠溶液中，定容至10mL，以旋涡式振荡器充分振荡至颗粒完全溶解，使菌体全部溶出，用稀释平板法于28℃培养3d，菌落计数。每个处理3次重复，结果取平均值。各项指标按下式计算。
颗粒活菌数(cfu/g)＝(一定稀释度的活菌数×稀释倍数×菌液量)/颗粒重
表4不同比例载体生物诱抗剂颗粒活菌数测定
由表3和4可以看出，生物诱抗剂Y1的机械强度最大，达到50.9g/g，颗粒活菌数最高，为13×108cfu/g，说明载体Z1的组合海藻酸钠、壳聚糖、角叉菜胶三者质量比为1：3：2时菌体-植物活性物质-载体进行交联包埋固定的生物诱抗剂性能最佳，可以抵抗外界不同自然环境的干扰，有利于活性物质发货作用。载体选用三种物质，可以克服单独使用一种载体带来的局限性。海藻酸钠作为载体对微生物无毒，传质性好，价格低，好操作等优点，使用广泛，但是耐机械强度低，在土壤中易被微生物分解等缺点。壳聚糖、角叉菜胶由分子结构决定其性能稳定，可以提高包埋颗粒的强度，易固定，且微生物存活率、繁殖率高，同时壳聚糖还可以为微生物的繁殖和生长提供碳源等。
3、诱导抗逆试验
将玉米种子先用75％的乙醇进行表面消毒10min，置于超净台中风干。选用载体Z1，按照表2不同菌体-植物活性成分组成制备生物诱抗剂，分别为Y1、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10，生物诱抗剂和种子质量比10：1称取，将其倒入烧杯中，摇动烧杯混匀后进行定殖。空白对照为未进行诱导的玉米种子。
(1)发芽率调查
将供试样品放置在28℃黑暗培养箱中，每天统计发芽数。
发芽率％＝发芽数/玉米总数×100％
(2)对玉米苗期生长的影响
将诱导后的种子播种于花盆中，每盆10粒，每个处理三个重复，以未诱导的种子为对照。7天后计算发芽率，14天后测定根长、根数、株高、植株鲜重和干重，参见表5。
表5不同指标的测定
由表5可以看出，生物诱抗剂Y1、Y6、Y7处理后玉米种子发芽率、根长、根数、株高、植株鲜重和干重均高于单一活性物质、不含活性物质或者未用生物诱抗剂处理的玉米种子。说明在相同载体成分下，本发明活性成分组合物制备的生物诱抗剂有利于玉米种子的萌发和对营养物质的吸收，长势良好。
(3)玉米芽苗抗逆指标的测定
分别测定处理后7天种子芽苗中丙二醛、钙离子、茉莉酸、水杨酸等与植物抗逆相关的指标。
表6不同处理种子抗逆指标测定
丙二醛是由于植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的一种有机物。会将植物体内的淀粉转化为葡萄糖，应为糖溶液的凝固点比较低，所以植物在低温的环境下体液就不容易凝固，以适应寒冷的环境。通过测量植物丙二醛的含量可以判断植物抗逆性的高低。
钙离子是植物生长发育所必需的一种大量元素，它同时作为重要信使参与调节植物对环境胁迫的抗逆过程。钙离子含量的升高说明植物在环境胁迫作用下调节能力的增强。
茉莉酸及其衍生物是基于脂质的植物激素，可调节植物的各种过程，从生长和光合作用到生殖发育。特别是，茉莉酸对于植物防御食草动物和植物对恶劣环境条件和其他类型的非生物和生物挑战的反应至关重要。
水杨酸是植物体内普遍存在的内源信号分子之一,已被确认为是一种植物激素，具有重要的生理功能。研究表明，水杨酸在植物的抗病、抗低温、抗旱和抗盐等方面,以及对果实成熟、产品保鲜和种子萌发等具有明显的作用。
由表6可以看出，本发明生物诱导剂Y1、Y6、Y7处理后的玉米种子芽苗中丙二醛、钙离子、茉莉酸、水杨酸物质含量均高于Y 8、Y 9、Y 10和对照。说明在相同载体成分下，本发明活性成分组合物制备的生物诱抗剂处理玉米种子后的玉米芽苗含有较高的植物抗逆调节物质，在逆境环境中可以更好地适应生长，进而提高玉米产量和品质。作为生物诱导剂，微生物和植物活性成分共同作为有效成分，可以克服微生物起作用慢，植物活性成分起作用持效期短的问题。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (8)

1.一种玉米芽苗生物诱抗剂，其特征在于，所述生物诱抗剂包括微生物、植物活性成分、载体和交联剂；所述微生物为深绿木霉菌Trichoderma sp.CJCCSJ-F-KY10039CCTCCNo.M 20221135，所述植物活性成分为木犀草素，菌体和植物活性成分的比例是10:(1-7)；所述载体为海藻酸钠、壳聚糖、角叉菜胶；将海藻酸钠、壳聚糖、角叉菜胶溶解在无菌水中形成的质量浓度是1-3％的载体溶液，所述载体溶液与微生物-植物活性成分的用量比为5-20ml:1g；载体中海藻酸钠、壳聚糖、角叉菜胶的质量比为1-4:2-5:1-10。
2.根据权利要求1所述的玉米芽苗生物诱抗剂，其特征在于，所述交联剂为氯化钙溶液。
3.一种根据权利要求1所述的玉米芽苗生物诱抗剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、将深绿木霉菌株CJCCSJ-F-KY10039接种至PDA培养基中，于27-30℃光照培养箱培养3-5d后，制备孢子悬浮液，在PD中接种浓度为1×105-107个/ml木霉孢子，27-30℃，150-300rpm培养4-6天，得到菌液，9000-12000rpm离心15-25分钟后得到菌体；
S2、将海藻酸钠、壳聚糖、角叉菜胶溶解在无菌水中形成的质量浓度是1-3％的载体溶液；灭菌操作后，将菌体-植物活性成分包埋到载体中得到菌体-植物活性成分-载体混合物；
S3、将所述菌体-植物活性成分-载体混合物通过物理挤压的方式滴入无菌交联剂中制成球状物，用无菌生理盐水清洗8-15次，得到深绿木霉菌CJCCSJ-F-KY10039-木犀草素包埋小珠，26-30℃干燥20-30h，0-4℃保存。
4.根据权利要求3所述的玉米芽苗生物诱抗剂的制备方法，其特征在于，所述菌液中有效活菌数为1×109个/ml以上。
5.根据权利要求3所述的玉米芽苗生物诱抗剂的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述载体进行灭菌操作，所述灭菌条件为121℃，0.12MPa压力下蒸汽灭菌20min。
6.根据权利要求3所述的玉米芽苗生物诱抗剂的制备方法，其特征在于，所述交联剂是质量浓度为0.5-2％的氯化钙溶液；所述氯化钙溶液与菌体的用量比为20ml:1g。
7.根据权利要求3所述的玉米芽苗生物诱抗剂的制备方法，其特征在于，所述物理挤压方式为将所述菌剂-植物活性成分-载体混合物用移液枪均匀滴加到交联剂中，每滴体积为0.02ml；所述包埋小珠的固化时间为15-20h。
8.一种如权利要求1所述玉米芽苗生物诱抗剂，或如权利要求3所述方法制备得到的玉米芽苗生物诱抗剂在诱导玉米芽苗产生抗逆物质中的应用。
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