CN116904366B - 一种嗜线虫沙雷氏菌、微生物包衣制剂及其应用 - Google Patents

一种嗜线虫沙雷氏菌、微生物包衣制剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种嗜线虫沙雷氏菌、微生物包衣制剂及其应用。所述嗜线虫沙雷氏菌(Serratia nematodiphila)菌株编号为ZH3‑2，保藏编号为CGMCC NO.26963。所述微生物包衣制剂包含微生物菌液、载体和粘合剂，可用于制备玉米包衣种子。本发明ZH3‑2菌株直接接菌使用或制备为微生物包衣制剂使用可促进玉米发芽和生长，提高玉米植株株高和地上地下部分干鲜重，增强玉米植株根系活力，促进玉米植株光合作用，提高玉米植株超氧化物歧化酶活性等。其中使用微生物包衣制剂效果更好。另外在高盐环境中，新菌株ZH3‑2直接接菌使用或制备为微生物包衣制剂使用同样发挥了对玉米生长等的促进作用。由此，新菌株ZH3‑2提高了玉米植物的耐盐特性。

Description

一种嗜线虫沙雷氏菌、微生物包衣制剂及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种嗜线虫沙雷氏菌、微生物包衣制剂及其应用。
背景技术
盐土上生长的植物会面临盐胁迫，直接影响植物细胞内离子的动态平衡，进而影响甚至减少植物对水分及营养物质的吸收和利用，从而影响植物正常生命进程相关的作用机制，造成减产甚至使植物死亡。此外，由于土壤中盐分的过量积累会改变土壤和植物的渗透压水平，使植物难以吸水，进而难以维持正常生长。玉米(Zea mays L.)广泛地用于畜牧业、工业以及养殖业等产业，其产量直接关系着粮食供应安全以及社会发展问题。然而，玉米是典型的盐敏感作物，盐胁迫会导致玉米叶片细胞的结构受损，气孔导度以及胞间CO2浓度下降，导致光合速率下降，间接造成叶片干物质量积累的减少，从而造成减产。因此，当前亟待解决的问题是在盐胁迫条件下寻找一种最有效的方式，以促进玉米的健康快速生长发育。
植物促生菌(plant growth-promoting bacteria,PGPB)是指自由生活在根际土壤或植物内部的一类促进植物生长的有益细菌，根据其生活方式可以分为根际自由生长的细菌、定居在根表面的细菌以及在植物组织内的细菌。PGPB能够通过多种机制促进植物生长并保护植物免受各种生物胁迫和非生物胁迫。研究表明，在各种胁迫条件下接种PGPB可以显著改善植物生长、发育、产量和品质。耐盐PGPB是植物促生菌中的一类能够耐盐胁迫并具有促生能力的细菌。从环境中筛选耐盐性好并且可以帮助玉米抵御高盐环境胁迫的PGPB，对于玉米在盐碱地的种植和提高农业生产技术有重要的研究意义。
发明内容
鉴于此，本发明的目的之一是提供一种嗜线虫沙雷氏菌(Serratianematodiphila)，菌株编号为ZH3-2，保藏编号为CGMCC NO.26963，于2023年3月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的目的之二是提供一种微生物包衣制剂，所述制剂包含微生物菌液、载体和粘合剂，所述微生物菌液为OD600＝1的ZH3-2菌液，所述载体为过200目筛的生物炭，所述粘合剂为质量百分数为40％的***胶溶液，微生物菌液、载体和粘合剂的比例为微生物菌液体积(mL)：载体重量(g)：粘合剂体积(mL)＝2：2：1。
本发明的目的之三是提供上述微生物包衣制剂在制备玉米包衣种子中的应用，微生物包衣制剂通过与玉米种子混合使制剂包裹玉米种子成为玉米包衣种子，混合时制剂中生物炭的重量与玉米种子的重量比为1：0.16。包衣操作方法可以为：将浸泡后的种子用干净的厨房用纸擦干表面水分称重后，放入提前用酒精杀菌清洗干净的旋转滚筒机(如种子包衣机)中，然后加入上述比例的微生物包衣制剂(包含生物炭、40％浓度的***胶溶液、OD600为1的菌液)，选择适当的转速(500-800r/min)进行旋转包衣。期间要根据实际情况调转转速大小，时刻观察包衣情况，如果有粘黏到一起的要及时分开，保证制成粒粒分明、大小圆润度一致的玉米包衣种子，然后进行播种。
本发明的目的之四是提供上述ZH3-2菌株在促进玉米发芽和(或)促进玉米生长中的应用，所述ZH3-2菌株制备为菌液直接接菌使用或制备为微生物包衣制剂使用，所述玉米生长在正常环境或高盐环境中。ZH3-2菌直接使用可以为配置成OD600为1～1.5的菌液注射至土壤种子或植株根系附近，也可以将种子在菌液中浸菌处理后播种。所述微生物包衣制剂的组成和使用方法与前述一致。高盐环境中NaCl的浓度可达300mM。
优选的，所述促进玉米生长为促进玉米植株株高的增加或促进玉米植株地上地下部分植株重量的增加或促进玉米植株根的生长。
本发明的目的之五是提供上述ZH3-2菌株在增强玉米植株根系活力中的应用，所述ZH3-2菌株制备为菌液直接接菌使用或制备为微生物包衣制剂，所述玉米生长在正常环境或高盐环境中。ZH3-2菌直接使用的方法和微生物包衣制剂的组成和使用方法与前述一致。高盐环境中NaCl的浓度可达300mM。
优选的，所述增强玉米植株根系活力为通过提高四氮唑还原强度促进根系活力。
本发明的目的之六是提供上述ZH3-2菌株在促进玉米植株光合作用中的应用，所述ZH3-2菌株制备为菌液直接接菌使用或制备为微生物包衣制剂使用，所述玉米生长在正常环境或高盐环境中。ZH3-2菌直接使用的方法和微生物包衣制剂的组成和使用方法与前述一致。高盐环境中NaCl的浓度可达300mM。
优选的，所述促进光合作用为通过提高光合速率、蒸腾速率、气孔导度和水分利用率促进光合作用或通过提高叶绿素含量促进光合作用。
本发明的目的之七是提供上述ZH3-2菌株在提高玉米植株超氧化物歧化酶活性中的应用，所述ZH3-2菌株制备为菌液直接接菌使用或制备为微生物包衣制剂使用，所述玉米生长在正常环境或高盐环境中。ZH3-2菌直接使用的方法和微生物包衣制剂的组成和使用方法与前述一致。高盐环境中NaCl的浓度可达300mM。
本发明的目的之八是提供上述ZH3-2菌株在提高玉米耐盐特性中的应用。
根据本发明技术方案，提供了一种嗜线虫沙雷氏菌新菌株ZH3-2，该菌株能够促进玉米发芽和生长，提高玉米植株株高，提升玉米植株地上地下部分干鲜重，促进玉米根的发育，使根长更长根密度更大。该菌株还能增强玉米根系活力，其中四氮唑还原强度更高。该菌株促进玉米植株光合作用，叶片叶绿素含量增加，光合速率、蒸腾速率、气孔导度和水分利用率均得以提升。该菌株促进玉米植株超氧化物歧化酶(SOD)活性。同样，当玉米在高盐条件下，新菌株ZH3-2同样发挥了上述作用，由此新菌株ZH3-2提高了玉米植物的耐盐特性。另外，本发明提供的新菌株ZH3-2制备的微生物包衣制剂，用于玉米种子包衣处理后，玉米发芽和生长得以更好的提升，在高盐条件下，玉米植株的生长也能得以促进，提高了植物的耐盐特性。由此，本发明新菌株ZH3-2可制备为包衣制剂用于玉米种植。综上，本发明新菌株ZH3-2不仅可以促进玉米发芽和生长，还能提高玉米的耐盐特性。
生物保藏说明
嗜线虫沙雷氏菌ZH3-2，拉丁文为Serratia nematodiphila，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26963，保藏日期为2023年3月30日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
图1为本发明ZH3-2菌株16S rRNA序列***发育树；
图2不同比例生物炭包衣结果；
图3不同处理对玉米植株生物量的影响；
图4为本发明不同处理对玉米株高的影响；
图5为本发明不同处理的玉米根形态；
图6为本发明不同处理对玉米根系活力的影响；
图7为本发明不同处理对玉米叶片光合作用指标的影响；
图8为本发明不同处理对玉米叶片SPAD值的影响；
图9为本发明不同处理对玉米叶片SOD活性的影响。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
下面结合附图和实施方式对本发明作进一步的详细说明：
实验例1耐盐菌株ZH3-2的分离和鉴定
1.1材料
材料采集：采集湖南省冷水江市黄光村(锡矿山)(27°45′56.1″N，111°28′47.99″E)和株洲市石峰区杨家坝(27°52′32.23″N，113°3′58.06″E)的正常生长的植物(红薯、玉米和花生)根际土壤样品，包括一部分玉米植株样品。土壤pH在6.54～6.97间，有机质含量在24.85～28.56g/kg间。采集的根际土保存于4℃用于筛菌，植株样品暂保存于4℃，尽快进行后续筛菌试验。
玉米种子：试验用玉米种子选自重庆本地农户种植较为广泛的玉米品种“京科糯928”，渝审玉2014012。
1.2耐盐菌株的筛选和分离
耐盐根际菌初步筛选：称取5g过筛后的土样，放入100mL无菌水中充分振荡得到土壤悬液，然后进行梯度稀释，每个稀释梯度做两个重复。选择稀释梯度为10-3、10-4、10-5、10-6的土壤悬液稀释液进行后续试验。吸取上述各梯度稀释液100μL滴于3％ NaCl LB琼脂培养基上进行涂布。然后将平板倒置于30℃恒温培养箱培养1-2d，观察结果。选取生长迅速、形态不同的单个菌落，再将每个单菌落进行纯化，可多次纯化直至菌株在生长过程中是单株且不会再出现其他形状和颜色等。然后将确定的单菌株在3％ NaCl LB琼脂培养基上暂存，并在浓度为25％的灭菌甘油管中保存多份，编号在-80℃冰箱中待后续测定用。
耐盐内生菌的初步筛选：将植株根、茎、叶在无菌条件下进行冲洗、消毒，然后把植株组织切成很小的块状或者片状，放置于带有NaCl浓度的LB平板上，于28℃恒温静置培养1-2d。在出现菌落后，挑取植株组织周围菌落，接下来处理同根际细菌，此外需将最后一次冲洗的无菌水涂布于平板上作为对照。
上述初筛共筛选出根际细菌70余株和内生细菌30余株，再提高盐浓度复筛，即将单个菌落接种于4％-15％ NaCl LB琼脂培养基，观察是否生长，测定菌株生长的最高盐浓度。于是结果筛选出27株菌株最低耐盐度为9％ NaCl。因无法确认在较高盐浓度下生存的细菌是否还有促进植物生长的能力，故筛选耐盐菌株的培养基NaCl浓度最高为15％，在这27株菌中有一半以上的菌株能够在15％ NaCl浓度下生存。
对上述复筛得到的27株菌株进行促生特性定性试验，即测定菌株是否具有产IAA、ACC脱氨酶、氮、磷和铁载体的特性，来验证菌株是否具有促生的能力(检测方法为本领域常规实验方法)。根据检测结果筛选出3株结果较好的菌株(表1和表2)做下一步发芽实验。
表1复筛的菌株各项促生指标定性测定的结果
注：各项指标中“+”表示显色，即该菌株具有此项能力；“-”表示无反应，即该菌株不具有此项能力；“++”表示颜色显著，即该菌株在此项指标中较其他菌株更为凸显。
表2菌株产IAA和无机磷能力的结果
发芽试验方法为：设置不加盐和加浓度为200mM NaCl溶液的两种处理，选用上述筛选的3株菌株进行发芽试验。选取差异较小的玉米种子先用无菌水冲洗干净，然后放到10％的过氧化氢溶液中浸泡30min，将浸泡后的种子冲洗干净。浸菌处理为将清洗干净的种子用无菌纸吸干水分后，分别浸泡在含有2％(w/w)甘油的10mM MgSO4·7H2O的菌悬液中，OD600为1.5，反复搅拌制备2h；对照组种子浸泡在无菌水中。将浸菌处理后的种子放在灭菌后的培养皿中，每个培养皿中放置2层灭菌的并用200mM NaCl溶液润湿的滤纸，无菌水为对照。每个培养皿中放置15粒大小一致的玉米种子，每个处理3个重复，置于28℃的培养箱中避光培养。保持萌芽所需的足够水分，随时关注滤纸的湿度。为保证培养皿中NaCl浓度保持不变，每天用无菌水定量(4mL)补充水分。从第二天开始记录发芽数，之后每隔24h记录一次种子发芽数，第6天结束发芽试验，测量种子的芽长、根长、鲜物质量和烘干后的干物质量等各项指标。其中，发芽指数＝ΣGt/Dt，其中，Gt为在第t天的新增发芽数，Dt为总天数；活力指数＝(芽长+根长)×发芽指数。
结果如表3所示，无论是在正常条件下还是盐胁迫条件下，由3种菌株处理的发芽状况都优于对照CK组。从数据可知，在正常条件上，3种菌株处理的玉米种子的结果存在显著性差异，可以看出菌株ZH3-2表现最为突出。而在200mM NaCl浓度的盐胁迫下，由3种菌株处理的几组在芽长、根长、发芽指数和活力指数四个指标对比CK组表现出显著性差异，同样ZH3-2菌株表现更优异。由此选取ZH3-2的菌株进行后续的鉴定、包衣及盆栽试验。
表3发芽试验结果
注：数值表示平均值±标准偏差，不同字母表示不同的显著性差异(Duncan-test，P＜0.05)。
对ZH3-2菌株进行了16S rRNA鉴定，并利用BLAST软件和GenBank中已知的16SrRNA基因序列与获得的测序结果进行同源性比对。根据与目标功能菌株序列重复性较高的菌株鉴定菌株种属。根据附图1的***发育树，鉴定ZH3-2菌株为沙雷氏菌属(Serratiasp.)嗜线虫沙雷氏菌(Serratia nematodiphila)，筛选自湖南省冷水江市黄光村(锡矿山)花生根际土。
实验例2ZH3-2菌株及微生物包衣制剂对玉米生长的影响
玉米种子：试验用玉米种子选自重庆本地农户种植较为广泛的玉米品种“京科糯928”，渝审玉2014012。
供试菌株：ZH3-2菌株。
微生物包衣制剂相关材料：载体：为粉末状的玉米秸秆生物炭，其水分系数为10.26％，有机碳含量为510.90g/kg，全氮含量为8.51g/kg，全磷含量为2.34g/kg，P2O5含量为5.35g/kg，全钾含量为15.76g/kg，K2O含量为19.15g/kg。粘合剂：粉末状的***胶，主要成分为高分子多糖类及其钙、镁和钾盐性质是一种安全无害的增稠粘合剂。
2.1材料的处理准备和包衣操作、种子发芽操作
载体：将玉米秸秆生物炭过200目筛，使能更好地包覆在玉米种子表面。将过筛后的生物炭在121℃下高压灭菌20min，以防止生物炭自身所带的微生物造成干扰。备用。
粘合剂：用于粘合的***胶需在使用前放置于超净工作台内紫外杀菌30min以上，临用前用无菌水配置成质量分数为40％的溶液使用。
玉米种子：选取大小一致的玉米种子先用无菌水冲洗干净，然后放到10％的过氧化氢溶液中浸泡30min，将浸泡后的种子冲洗干净。将冲洗干净的种子在无菌水中浸泡2h，期间进行反复搅拌，备用。
菌株：将菌株活化，并在LB液体培养基扩大培养，以7000r/min离心10min后重新将菌株悬浮在含有2％(w/w)甘油的10mM MgSO4·7H2O的溶液中，制成OD600＝1的菌液。将甘油作为保护剂加入细胞悬液中以使包衣过程中细胞生存力的损失最小化。
包衣操作：将浸泡后的玉米种子用干净的厨房用纸擦干表面水分称重后，放入提前用酒精杀菌清洗干净的旋转滚筒机(种子包衣机)中，按照设定的比例加入相应重量和体积的包衣相关材料(如：生物炭、40％浓度的***胶溶液、OD600为1的菌液)，选择适当的转速(500-800r/min)进行旋转包衣。期间要根据实际情况调转转速大小，时刻观察包衣情况，如果有粘黏到一起的要及时分开，保证制成粒粒分明、大小圆润度一致的玉米包衣种子。
玉米包衣种子发芽操作：将制好的玉米包衣种子摆放入无菌的放有两层滤纸的培养皿中，提前用无菌水润湿滤纸，每个培养皿中放置10粒玉米种子，每个处理设置5个重复。然后放入28℃的恒温培养箱中避光培养，保持萌芽所需的足够水分，随时关注滤纸的湿度，每天用无菌水定量(4mL)补充水分。从第二天开始记录发芽数，之后每隔24h记录一次种子发芽数，第6天结束发芽试验，测定各项指标。
2.2玉米种子与生物炭不同比例对种子萌芽和生长发育的影响
生物炭与浓度为40％的***胶溶液按质量(g)：体积(mL)＝2:1的比例使用(此比例生物炭黏着包覆在玉米种子上的效果最好)，同时生物炭重量与玉米重量的比例按如下6种比例进行包衣操作后检测种子的萌芽和生长发育：
种子重量：生物炭重量＝1:0.08(8％)
种子重量：生物炭重量＝1:0.12(12％)
种子重量：生物炭重量＝1:0.16(16％)
种子重量：生物炭重量＝1:0.20(20％)
种子重量：生物炭重量＝1:0.24(24％)
6种比例进行包衣的状态可以看出(附图2)，当生物炭与种子重量的比例为16％时，玉米种子没有被完全包覆，还有较多空白，且种子外的生物炭较薄；随着生物炭的比例的提高，种子没有被包覆到的空白地方越来越小，外层的生物炭也越来越厚。从表4的数据可以看出，测定包衣处理的几组玉米种子的发芽势、根长、芽长鲜重和干鲜物质量存在显著性差异。在不同的配比之间，各项促生指标有显著性差异的，也即表明促生效果不是完全一致的。可以看出在生物炭的比例是16％时，各项指标的数据相较于未作任何处理的CK组是最好的，其发芽势、根长、芽长和鲜重的值都是最高的，分别为5.75％、14.3cm、6.34cm和4.64g，较CK组分别提高15％、58％、73％和31％。生物炭比例为8％和12％的两组发芽势是显著低于CK组的，而增加比例到20％和24％时，各项指标的数据虽然相较于CK组还是较好的，但低于比例16％的。经相关性分析后，可知16％组与其他处理也存在显著性差异，所以最终选定生物炭的最优比例为16％。即种子重量(g)和生物炭重量(g)和***树胶体积(mL)的比例为1：0.16：0.08(w/w/v)作为后续试验的包衣配比。
表4不同配比发芽试验结果
注：数值表示平均值±标准偏差，不同字母(a、b、c、d)表示不同的显著性差异(p＜0.05)。发芽势＝发芽4天时正常发芽的种子数/供试种子数×100％。
2.3微生物包衣制剂和对种子萌芽和生长发育的影响
微生物包衣制剂为将OD600＝1的ZH3-2菌液与载体、粘合剂混合，比例为菌液体积(mL)：生物炭重量(g)：***胶溶液体积(mL)＝2：2：1(v/w/v)。然后进行包衣操作和种子发芽操作，其中包衣操作时种子重量：生物炭重量＝1：0.16(16％)。
从表5数据可以看出，相较于未作任何处理的对照CK组，菌株在进行包衣后的玉米种子的芽长、根长、活力指数(活力指数＝(芽长+根长)×发芽指数)和干鲜物质量都有显著性的差异，都远高于CK组的数据，可见生物炭并未对菌株的促生效果造成影响。
表5包衣发芽试验结果
注：数值表示平均值±标准偏差，不同字母(a、b)表示不同的显著性差异(p＜0.05)。
实验例3ZH3-2菌株对盐胁迫下玉米的作用
玉米种子：试验用玉米种子选自重庆本地农户种植较为广泛的玉米品种“京科糯928”，渝审玉2014012。
供试菌株：ZH3-2菌株。
盆栽土壤：选用紫色土，采自重庆市北碚区歇马(N 29°46’，E 106°21’)，坐落于川东平行岭。土壤pH为6.5、有机质为9.11g/kg、碱解氮为60mg/kg、有效磷为17.51mg/kg、速效钾为43.92mg/kg。
3.1玉米生长胁迫临界盐浓度确定
选取大小形状相比差异较小的玉米种子，先冲洗干净，用10％的过氧化氢浸泡20min后用无菌水冲洗至干净后进行后续试验。对种子进行浸菌处理(方法见实验例1)和微生物包衣制剂进行包衣处理(方法见实验例2)后播入装有盆栽试验供试土壤的育苗盘中，每个处理设置12个重复。育苗盘中土壤放置大致70％含水量时进行播种。
用浓度为0、150、200、250和300mM的NaCl溶液每隔1d浇灌一次，每次每个孔浇5mL(为避免盐激效应，在浇灌NaCl溶液时，第一次应先用低浓度的NaCl溶液浇灌再递增至既定浓度)，期间在保证不会造成水土流失的前提保持水分充足，若缺水，则补浇自来水，保证每个孔浇灌相同量的自来水，对照处理浇灌自来水。在温室大棚中正常培养，根据玉米发芽和生长状态确定玉米生长的临界NaCl浓度。
玉米是盐敏感作物，当盐浓度较高时，会导致玉米各种代谢活动减弱。这种现象会在玉米的发芽势、株高、根长和干鲜物质量等方面表现出来。根据表6，进行盐分处理的各组与不加盐分处理的对照相比，无论是根长还是株高均显著降低。当盐分处理的浓度达到250mM NaCl时，与0mM NaCl处理的对照相比，玉米的发芽势显著降低。在300mM NaCl处理时，发芽势最低。但是，在功能菌株的作用下，玉米的发芽势、根长和株高相较于对照组都有显著性的帮助。后续选择300mM NaCl处理作为盆栽试验的盐浓度来进行后续试验。
表6不同盐分浓度对玉米的生长影响
注：植株在14d后结束试验，测量各项指标。数值表示平均值±标准偏差，不同字母(a、b、c、d、e)表示不同的显著性差异(p＜0.05)
3.2菌株对玉米生长的影响
试验设置盐浓度为300mM NaCl，以正常土壤为对照。设置四个处理：①对照组(CK；不施加任何处理)；②载体包衣种子(BCK；只用载体包衣不加菌株的种子)；③常规接种在土壤中的ZH3-2菌株(ZH3-2；用ZH3-2菌株浸菌处理的种子)；④ZH3-2包衣种子(BZH3-2；用ZH3-2微生物包衣制剂包衣处理的种子)。每个处理设置六个重复。30d后结束试验。因供试土壤的有机质含量较低，故在实验开始前施加等量的有机肥。
盆栽试验前期育苗：选取形状、大小一致的玉米种子进行杀菌消毒处理，先用无菌水冲洗3次，再用10％的过氧化氢浸泡20min后用无菌水冲洗至干净后进行后续试验。浸菌处理和包衣处理与前面实验例相同，将种子播种在装有基质的育苗盘中进行发芽。每个处理预备足够多的重复，待长至两叶一心的时候挑选长势一致的苗转移至盆中进行盆栽试验。
盆栽试验盐胁迫处理：盆栽实验选用的盆大致为高40cm，口径28cm，底径25cm；托盘直径35cm，高4cm。每盆大致装10kg盆栽试验用土，浇灌后放置大致70％含水量时进行栽苗。根据玉米生长胁迫临界盐浓度试验确定的NaCl浓度配置成盐溶液，栽种之后，每隔1d浇灌一次，每次200mL(为避免盐激效应，在浇灌NaCl溶液时，第一次应先用低浓度的NaCl溶液浇灌再递增至既定浓度)，期间保持水分充足，若缺水，则补浇自来水，保证每盆浇灌相同量的自来水，对照处理浇灌自来水，其他保持一致。
在光合指标和叶片叶绿素含量的相对值(SPAD值)测定后进行收样。将整株玉米植株从盆中取出，轻抖根部收集植株根际土，保存至-80℃冰箱留作进行后续试验，以及根际土边的非根际土，风干过筛后留作后续做后续的土壤理化性质分析。用自来水清洗根部数次，直至无残留土壤。将一部分植株(分为地上部和地下部)立即用锡纸包好标好编号后放在液氮中速冻，储存在-80℃冰箱进行后续酶活等测定分析。将剩余部分进行称量，记录株高、根长、鲜重等数据，测定叶绿素和根系活力并进行扫根，之后对植株进行烘干，磨碎过晒后进行植株的生理生化分及养分含量。
玉米幼苗生长指标的测定：待试验周期结束收获前，用直尺测量各处理玉米株高并记录；收获后用植物园艺剪刀将玉米植株分为地上部和地下部，测量玉米茎和根的鲜重后放入115℃恒温烘箱中杀青、烘干至恒重，分别测量干重并记录。
由附图3所示的玉米植株地上地下部分的干鲜重数据知，接菌处理对玉米植株的生长均较对照好，其中包衣接菌处理对植株生长促进最好。在盐胁迫条件下，菌株直接接菌处理的ZH3-2组的地上部干鲜物质量分别为1.80g和12.82g，地下部干鲜物质量分别为0.21g和1.64g，都高于CK组，而包衣接菌处理的BZH3-2组的地上部干鲜物质量为2.63g和16.94g，地下部干鲜物质量分别为0.32g和2.64g，都显著高于其他处理。表明在盐胁迫下，包衣接菌处理对玉米植株的生长具有明显的帮助。
由附图4的玉米植株株高数据也表明，接菌处理促进玉米植株的生长，其中包衣接菌处理效果更好。在没有盐胁迫的条件下，包衣接菌处理的BZH3-2组的株高为74.94cm，显著高于其他处理组；在盐胁迫条件下，BZH3-2组的株高为75.07cm，也显著高于其他处理组。
3.3根系扫描、根系活力系数测定
利用根系扫描仪仪器对植株根系进行扫描成像，并用WinRHIZO根系分析软件进行分析。
取样后，尽快将玉米的根系清洗干净后，剪成很碎的小块茎以便充分浸提。称取0.2g根充分浸入0.4％ TTC溶液和磷酸钾缓冲液各5mL中，在37℃下避光保温反应2h后加入1mol/L的硫酸2mL停止反应。与此同时做空白对照实验，将样品放入硫酸中失活后同上操作。充分反应后将擦干的根用乙酸乙酯磨碎后定容至10mL，测定在OD485值，代入标准曲线，求出四氮唑还原量。四氮唑还原强度(mg/g根鲜重/h)＝四氮唑还原量(mg)/[根重(g)×时间(h)]。
由附图5可知，正常或盐胁迫下接种ZH3-2后，玉米根的生长如根长、根密度等均有所提高，其中包衣处理组根生长更好。
由附图6所示，在没有盐胁迫的条件下，玉米根的四氮唑还原强度存在显著性差异，BZH3-2组的还原强度显著高于其他处理，ZH3-2组略高于对照组。而在盐胁迫条件下，接菌处理组的还原强度都高于对照组。表明接菌处理促进根系活力。
3.4光合作用相关指标测定
①光合参数测定。在收获前使用便携式光合作用仪在上午10：00-11：00中间测定叶片的净光合作用速率、蒸腾作用、气孔导度和水分利用率。选择每个植株上中部正常生长的第三片健康、完全展开的叶片进行测定，每片叶片记录六个数据点。
如附图7所示，在施加300mM NaCl浓度盐胁迫后对玉米叶片的光合速率、蒸腾速率、气孔导度、水分利用率都有不同程度的影响。从光合速率的数值来看，在未施加盐胁迫条件下不同处理组的光合速率存在显著性差异，BZH3-2组为32.31μmol m-2s-1显著高于其他处理；在施加300mM NaCl浓度盐胁迫的条件下，由菌株ZH3-2作用的2组处相较于CK组均提高了玉米叶片的光合速率。从蒸腾速率的数值来看，施加盐胁迫使玉米的蒸腾速率都有所下降，但在接菌处理后都有所增高。从气孔导度的数值来看，盐胁迫显著影响了玉米的气孔导度，但无论是否有盐胁迫，由包衣接菌处理的BZH3-2组提高了气孔导度。在没有盐胁迫的条件下，相较于其他处理，BZH3-2组的气孔导度与其他处理组在p＜0.05存在显著性差异。在盐胁迫条件下，BZH3-2的气孔导度为0.12mol m-2s-1，提高了33％。从水分利用率的数值来看，盐胁迫条件下，不同处理的水分利用率存在显著差异，由菌株ZH3-2直接接菌处理的一组其对水分的利用率显著高于其他处理组，包衣接菌处理BZH3-2组水分利用率略高于CK组。综上表明接菌处理促进玉米植株光合作用，促进生长。
②叶绿素含量测定。在植株收获前，用便携式叶绿素测定仪测定每个植株上中部正常生长的第三片健康、完全展开的叶片，每个叶片测定5次，取一个平均值。在植株收获后取这片叶子测定叶绿素含量。将叶子用剪刀或者小刀碎成小块以便充分浸提，称取0.1g叶片用5mL 95％的乙醇浸提24-36h。测定浸提液的OD665、OD649和OD470的值，按照下式即按照李合生的方法计算浓度后再算出含量。
Ca＝13.95D665-6.88D649
Cb＝24.96D649-7.32D665
Cx·c＝(1000D470-2.05Ca-114.8Cb)/245
色素在叶片中的含量(mg/g)＝色素浓度(mg/L)×提取液总体积(mL)×稀释倍数/样品质量(g)。
如附图8所示，接菌处理相比对照，SPAD显著提高，由菌株ZH3-2包衣接菌处理组的SPAD值相比于CK组增加了23％。
3.5SOD活性值测定
超氧化物歧化酶(SOD)的含量按照试剂盒说明书中的方法进行测定。如附图9所示，无论是否施加盐胁迫，不同处理间存在显著性差异，由菌株ZH3-2包衣接菌的一组其SOD活性值是所有处理中最高的，在盐胁迫下SOD活性也是显著高于对照组。在盐胁迫下，相较于CK组BZH3-2组提高了66％。

Claims (10)

1. 一种嗜线虫沙雷氏菌（Serratia nematodiphila），其特征在于，菌株编号为ZH3-2，保藏编号为CGMCC NO.26963。
2.一种微生物包衣制剂，其特征在于，所述制剂包含微生物菌液、载体和粘合剂，所述微生物菌液为OD600=1的权利要求1的ZH3-2菌液，所述载体为过200目筛的生物炭，所述粘合剂为质量百分数为40%的***胶溶液，微生物菌液、载体和粘合剂的比例为微生物菌液体积/mL：载体重量/g：粘合剂体积/mL=2：2：1。
3.如权利要求2所述的微生物包衣制剂在制备玉米包衣种子中的应用，其特征在于，所述制剂通过与玉米种子混合使制剂包裹玉米种子成为玉米包衣种子，混合时所述制剂中生物炭的重量与玉米种子的重量比为1：0.16。
4.如权利要求1所述的ZH3-2菌株在促进玉米发芽和/或促进玉米生长中的应用，其特征在于，所述ZH3-2菌株制备为菌液直接接菌使用或制备为微生物包衣制剂使用，所述玉米生长在正常环境或高盐环境中。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述促进玉米生长为促进玉米植株株高的增加或促进玉米植株地上地下部分植株重量的增加或促进玉米植株根的生长。
6.如权利要求1所述的ZH3-2菌株在增强玉米植株根系活力中的应用，其特征在于，所述ZH3-2菌株制备为菌液直接接菌使用或制备为微生物包衣制剂，所述玉米生长在正常环境或高盐环境中。
7.如权利要求1所述的ZH3-2菌株在促进玉米植株光合作用中的应用，其特征在于，所述ZH3-2菌株制备为菌液直接接菌使用或制备为微生物包衣制剂使用，所述玉米生长在正常环境或高盐环境中。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述促进光合作用为通过提高光合速率、蒸腾速率、气孔导度和水分利用率促进光合作用或通过提高叶绿素含量促进光合作用。
9.如权利要求1所述的ZH3-2菌株在提高玉米植株超氧化物歧化酶活性中的应用，其特征在于，所述ZH3-2菌株制备为菌液直接接菌使用或制备为微生物包衣制剂使用，所述玉米生长在正常环境或高盐环境中。
10.如权利要求1所述的ZH3-2菌株在提高玉米耐盐特性中的应用。
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