CN109749939B - 一种含有丹参内生真菌的菌剂及其应用 - Google Patents
一种含有丹参内生真菌的菌剂及其应用 Download PDFInfo
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Landscapes
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，公开了一种含有丹参内生真菌的菌剂及其应用。本发明的丹参内生真菌为草茎点霉(Phomaherbarum)D603，保藏编号为CGMCCNo.16884，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明的菌剂由草茎点霉(P.herbarum)D603的发酵液和吸附载体按一定配比混合而成，吸附载体还包括缓释载体。本发明还提供了含草茎点霉(P.herbarum)D603的菌剂在促进丹参生长和/或有效成分合成中的应用。本发明的草茎点霉(P.herbarum)D603是首次发现的对丹参具有明显促生效果的内生真菌，采用缓释载体不仅提高了吸附载体的单位容积内微生物的数量，而且使得丹参内生真菌菌剂具有缓慢持续释放的效果。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种含有丹参内生真菌的菌剂及其应用。
背景技术
草茎点霉(Phomaherbarum)不仅是某些动植物的病原菌，而且也是一种可用于杂草防治的生防菌。据报道，吴庆禹等发现草茎点霉(P.herbarum)是某些动植物的病原菌，如由草茎点霉引起的动植物病害有植物黑胫病和鲑鳟鱼类的鳔真菌病(吴庆禹等，东北林业大学学报，2005，33(2)：43-45；Mohamed Faisal et al，2007，Mycopathologia(2007)163：41-48)，还会导致荞麦轮纹病、睡莲黑斑病等，而谷祖敏等发现草茎点霉也是一种可用于杂草防治的生防菌，如草茎点霉对鸭跖草和藜有很好的抑制作用(谷祖敏，草茎点霉粗毒素的除草活性和杀草谱研究，沈阳农业大学学报，2009，4：431-434)，且RC Orlandelli的研究突出了草茎点霉具有的蛋白水解活性，其分泌的酶可以促进它们对植物组织的定殖以及对病原微生物的直接作用(RC Orlandelli et al，Antifungal and proteolytic activitiesof endophytic fungi isolated from Piper hispidum，Brazilian Journal ofMicrobiology，2015，46(2)：359-366)。此外有报道，从黄海海域内海底50m深处的淤泥分离出了草茎点霉，其能产生抗肿瘤多糖(陈菁蓉，1株能产生抗肿瘤多糖的海洋真菌YS4108的鉴定，中国生化药物杂志，2007，1：8-10)。Sanae等从纤维素材料中分离得到一株产生洋红色素的草茎点霉，可以用于对织物进行染色(Sanae Chiba et al，Magenta pigmentproduced by fungus，Journal of General&Applied Microbiology，2006，52(4)：201-207)。
中药丹参(学名：Salvia miltiorrhizaBge.)为唇形科植物丹参的根。具有活血化瘀，凉血消痈、止痛、清心除烦等多种功效。根据其传统功效，丹参在现代广泛用于心脑血管疾病的治疗，并取得显著疗效。丹参的药用成分包括水溶性的丹酚酸类和脂溶性的丹参酮类成分。水溶性的酚酸类化合物，主要有丹酚酸A、B、C、咖啡酸、丹参素等，具有抗血栓形成、抗氧化、保护细胞、抗凝血及调节血脂等作用。丹参酮类成分主要包括丹参酮I、二氢丹参酮I、丹参酮II A、丹参酮IIB、隐丹参酮、羟基丹参酮等，具有抗炎、抗菌及改善血液循环等功效。
据统计我国每年仅复方丹参滴丸的销售额就已超过10亿元，每年丹参原材料需求量达到近5万吨，且逐年呈上升趋势。然丹参的栽培和生长周期长且有效成分含量低，使得批量生产和临床使用非常困难；而且野生情况下的丹参的资源有限，采挖野生丹参会破坏自然界的生态平稳。因此，利用植物组织培养或器官培养，直接获得植物有效成分，必将成为发展的一种趋势。毛状根因其激素自养、生长迅速、周期短，且具有宿主植物完整代谢通路等特点，而被公认为较好的生产植物次生代谢产物的原材料。但是毛状根也具有次生代谢产物产量低等与植物细胞培养一样的问题，这些都影响着毛状根的扩大培养乃至工业化生产。
近年来，利用诱导子刺激毛状根，研究植物次生代谢调控、促进药用植物次级代谢产物合成一直是国内外研究的热点。能够诱导植物产生次生代谢物的物质叫做诱导子(Elicitor)，如酵母提取物等生物诱导因子和金属离子等非生物诱导因子。在生物或者非生物因子的诱导下，植物的抗逆性会增强，同时促进植物次生代谢物质的积累。将微生物诱导子接入毛状根，是提高并获得丹参毛状根有效成分含量的崭新途径，必将从根本上解决当前丹参的质量控制问题和丹参栽培中面临的问题。
目前，国内外关于丹参生物诱导子的研究主要集中于内生真菌如木霉、拟青霉、球毛壳菌，但未见报道从丹参中分离得到草茎点霉(P.herbarum)，以及采用草茎点霉制成菌剂用于促进丹参根系发育和/或有效成分合成。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题提供一种含所述丹参内生真菌的菌剂，及其在促进丹参根系发育和/或有效成分合成中的应用。
一种含丹参内生真菌的菌剂，所述菌剂的活性成分为丹参内生真菌，其保藏名称为草茎点霉(P.herbarum)D603，已于2018年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16884，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
作为优选的，所述菌剂中含草茎点霉(P.barum)D603的活菌数为2×106-5×108个/g。
作为优选的，所述菌剂由草茎点霉(P.herbarum)D603的发酵液和吸附载体按照1∶2-1∶4L/kg的配比混合而成。
更为优选的，所述发酵液的制备方法如下：将所述草茎点霉(P.herbarum)D603的种子液接种到发酵培养基上培养，所述种子液的接种量为0.5～5％v/v，培养温度为28～32℃，培养时间为20～28h；所述发酵培养基为PDA液体培养基。
作为优选的，所述吸附载体包括硅藻土、草炭、蛭石、珍珠岩和碳酸钙中的一种或几种。
更为优选的，所述吸附载体还包括缓释载体，所述缓释载体由丝胶蛋白、适量纳米纤维素和含多醛基的氧化葡聚糖经混合、絮凝、沉降、脱水制得。
含多醛基的氧化葡聚糖是天然葡聚糖经高碘酸钠氧化后得到的一种高分子葡萄糖聚合物，活化后的醛基分别与纤维素中高反应活性的羟基和丝胶蛋白中的氨基进行半缩醛和席夫碱反应，将丝胶蛋白接枝导纤维素大分子上，形成具有三维网状结构的吸附载体。由于具有由交联反应形成的高分子纤维“细丝”构成的表层与网状体，“细丝”直径小，数量多，所以提高了吸附载体的单位容积内微生物的数量，还使得丹参内生真菌菌剂具有缓慢持续释放效果。丝胶蛋白是一种天然大分子蛋白，能够降解为18种氨基酸组成。氧化葡聚糖也能够降解，降解产物为氨基酸和多糖。因此，在本发明中丝胶蛋白和氧化葡聚糖还可为草茎点霉提供一定发酵底物，有利于真菌的增殖。
更为优选的，所述缓释载体的制备方法如下：丝胶蛋白和纳米纤维素加入水后溶胀，加入含多醛基的氧化葡聚糖，然后搅拌均匀，沉降8-12h，收集底部固形物，经脱水获得缓释载体；所述丝胶蛋白、纳米纤维素、含多醛基的氧化葡聚糖的质量比为(0.8～1.6)∶(0.5～2)∶(0.2～0.8)。
含多醛基的氧化葡聚糖可由下法制得：称取葡聚糖(优选T-40)10.0g，高碘酸钠13.5g，分别溶于200ml和150mlpH4.4磷酸盐缓冲液中，将高碘酸钠溶液加入葡聚糖溶液中，室温下1500r/min避光搅拌4.5h，立即加入丙三醇4.5ml，室温1500r/min继续搅拌15min，将反应混合液置于截流分子量3500的透析袋中，以蒸馏水为介质4℃透析48h，透析液冷冻干燥，得含多醛基的氧化葡聚糖。
更为优选的，所述缓释载体占吸附载体总质量比的20-30％。
一种所述含草茎点霉(P.herbarum)D603的菌剂在促进丹参生长和/或有效成分合成中的应用。
作为优选的，所述应用方法为：将丹参根系置于菌剂中浸泡，浸泡后栽种；或向丹参种子中加入菌剂，进行拌种后播种。
本发明的有益效果是：
1)本发明涉及的草茎点霉(P.herbarum)D603是首次发现的对丹参具有明显促生效果的内生真菌，填补了目前相关领域研究的空白；
2)本发明采用丝胶蛋白、纳米纤维素和含多醛基的氧化葡聚糖作为吸附载体，活化后的醛基分别与纤维素中高反应活性的羟基和丝胶蛋白中的氨基进行半缩醛和席夫碱反应，将丝胶蛋白接枝导纤维素大分子上，形成具有三维网状结构的吸附载体，提高了吸附载体的单位容积内微生物的数量，还使得丹参内生真菌菌剂具有缓慢持续释放效果；
3)本发明中丝胶蛋白和氧化葡聚糖还可为草茎点霉提供一定发酵底物，有利于真菌的增殖。
具体实施例
下列实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、丹参内生真菌的分离
1)75％乙醇浸没丹参种子1min，5％NaClO处理1min，使用无菌水洗涤3次，每次1min，2.5％PBS-Tween20溶液灭菌后，加泡种子过夜；
2)在无菌环境中，继续将步骤1所得供试材料用无菌水冲洗3次，取100μl最后1次冲洗的无菌水冲洗液涂布接种于PDA平板上，30℃培养24h后，进行无菌验证；
3)如无菌落产生，则继续后续的步骤4；如有菌落产生，则返回步骤1继续表面消毒处理；
4)在超净台将之前表面灭菌处理过的种子置于无菌研钵中，加入经过灭菌处理的石英砂，研磨成粉末，并加入5mL无菌水混匀，静置15min，取100μl上清稀释涂布于改良马丁氏培养基中，置于28-32℃培养1-3天；
5)挑取步骤4中的单菌种于改良马丁氏培养基进行划线纯化分离，置于28-32℃培养1-3天，最终得到本发明的丹参内生真菌菌株，其保藏名称为草茎点霉(P.herbarum)D603，保藏编号为CGMCC No.16884。
本发明所述的丹参内生真菌的ITS碱基序列如SEQ ID No.1所示。将测序结果于NCBI网站进行序列比对(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，同草茎点霉(P.herbarum)的相似性为98％。
TTTTCGCCTA GAGTGTAGGC TTTGCCTGCT ATCTCTTACC CATGTCTTTT GAGTACCTTACGTTTCCTCG GTGGGTTCGC CCACCGATTG GACAAATTTAAACCCTTTGC AGTTGAAATCAGCGTCTGAAAAAACTTAAT AGTTACAACT TTCAACAACG GATCTCTTGG TTCTGGCATC GATGAAGAACGCAGCGAAAT GCGATAAGTA GTGTGAATTG CAGAATTCAG TGAATCATCG AATCTTTGAA CGCACATTGCGCCCCTTGGT ATTCCATGGG GCATGCCTGTTCGAGCGTCA TTTGTACCTT CAAGCTCTGC TTGGTGTTGGGTGTTTGTCT CCTGTAGACT CGCCTTAAAA CAATTGGCAG CCGGCGTATT GATTTCGGAG CGCAGTACATCTCGCGCTTT GCACTCATAA CGACGACATC CAAAAGTACA TTTTTACACT CTTGACCTCG GATCAGGTAGGGATACCCGC TGAACTTAAGCATATCAATAAGCCGGAGGA
实施例2、含丹参内生真菌的菌剂
1、将实施例1获得的草茎点霉(P.herbarum)D603在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的PDA培养基，28-30℃摇床震荡培养22h得到种子液；
2、按1.0％体积比将步骤1获得的种子液接种到PDA液体培养基中，培养温度28℃，培养时间24h。发酵完成后得到发酵液，发酵液中草茎点霉(P.herbarum)D603的活菌数可达5×107CFU/ml；所述PDA液体培养基的配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，去离子水1000mL，pH7.2。
3、将步骤2获得草茎点霉(P.herbarum)D603与吸附载体按照体积质量比为1∶2L/kg的比例混合均匀，即得菌剂；所述吸附载体由蛭石和缓释载体组成，缓释载体占吸附载体总质量比的20％。经检测所述菌剂中草茎点霉(P.herbarum)D603的活菌数可达2×107个/g，含水量为1.22％。
所述的缓释载体的制备方法如下：所述丝胶蛋白和纳米纤维素加入水后溶胀，加入含多醛基的氧化葡聚糖，然后搅拌均匀，沉降8h，收集底部固形物，经脱水获得吸附载体；所述丝胶蛋白、纳米纤维素、含多醛基的氧化葡聚糖的质量比为1.0∶2.0∶0.8。
含多醛基的氧化葡聚糖可由下法制得：称取葡聚糖(优选T-40)10.0g，高碘酸钠13.5g，分别溶于200ml和150mlpH4.4磷酸盐缓冲液中，将高碘酸钠溶液加入葡聚糖溶液中，室温下1500r/min避光搅拌4.5h，立即加入丙三醇4.5ml，室温1500r/min继续搅拌15min，将反应混合液置于截流分子量3500的透析袋中，以蒸馏水为介质4℃透析48h，透析液冷冻干燥，得含多醛基的氧化葡聚糖。
实施例3、含丹参内生真菌的菌剂
1、将实施例1获得的草茎点霉(P.herbarum)D603的在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的PDA培养基，28-30℃摇床震荡培养22h得到种子液；
2、按2.0％体积比将步骤1获得的种子液接种到PDA液体培养基中，培养温度30℃，培养时间28h。发酵完成后得到发酵液，发酵液中草茎点霉(P.herbarum)D603的活菌数可达7×108CFU/ml；所述PDA培养基的配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，去离子水1000mL，pH7.2。
3、将步骤2获得草茎点霉(P.herbarum)D603与吸附载体按照体积质量比为1∶3L/kg的比例混合均匀，即得菌剂；所述吸附载体由珍珠岩和缓释载体组成，缓释载体占吸附载体总质量比的25％。经检测所述所述菌剂中草茎点霉(P.herbarum)D603的活菌数可达4×108个/g，含水量为1.48％。
所述的吸附载体的制备方法如下：所述丝胶蛋白和纳米纤维素加入水后溶胀，加入含多醛基的氧化葡聚糖，然后搅拌均匀，沉降10h，收集底部固形物，经脱水获得吸附载体；所述丝胶蛋白、纳米纤维素、含多醛基的氧化葡聚糖的质量比为1.5∶1.5∶0.5。
含多醛基的氧化葡聚糖可由下法制得：称取葡聚糖(优选T-40)10.0g，高碘酸钠13.5g，分别溶于200ml和150mlpH4.4磷酸盐缓冲液中，将高碘酸钠溶液加入葡聚糖溶液中，室温下1500r/min避光搅拌4.5h，立即加入丙三醇4.5ml，室温1500r/min继续搅拌15min，将反应混合液置于截流分子量3500的透析袋中，以蒸馏水为介质4℃透析48h，透析液冷冻干燥，得含多醛基的氧化葡聚糖。
实施例4、含丹参内生真菌的菌剂
1、将实施例1获得的草茎点霉(P.herbarum)D603在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的PDA培养基，28-30℃摇床震荡培养22h得到种子液；
2、按5.0％体积比将步骤1获得的种子液接种到PDA液体培养基中，培养温度32℃，培养时间20h。发酵完成后得到发酵液，发酵液中草茎点霉(P.herbarum)D603的活菌数可达10×108cfu/ml；所述PDA培养基的配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，去离子水1000mL，pH7.2。
3、将步骤2获得草茎点霉(P.herbarum)D603与吸附载体按照体积质量比为1∶4L/kg的比例混合均匀，即得菌剂；所述吸附载体由硅藻土和缓释载体组成，缓释载体占吸附载体总质量比的30％。经检测所述菌剂中草茎点霉(P.herbarum)D603的活菌数可达10×108cfu/g，含水量为2.08％。
所述的吸附载体的制备方法如下：所述丝胶蛋白和纳米纤维素加入水后溶胀，加入含多醛基的氧化葡聚糖，然后搅拌均匀，沉降8-12h，收集底部固形物，经脱水获得吸附载体；所述丝胶蛋白、纳米纤维素、含多醛基的氧化葡聚糖的质量比为0.8∶0.8∶0.2。
含多醛基的氧化葡聚糖可由下法制得：称取葡聚糖(优选T-40)10.0g，高碘酸钠13.5g，分别溶于200ml和150mlpH4.4磷酸盐缓冲液中，将高碘酸钠溶液加入葡聚糖溶液中，室温下1500r/min避光搅拌4.5h，立即加入丙三醇4.5ml，室温1500r/min继续搅拌15min，将反应混合液置于截流分子量3500的透析袋中，以蒸馏水为介质4℃透析48h，透析液冷冻干燥，得含多醛基的氧化葡聚糖。
实施例5、含丹参内生真菌的菌剂用于丹参生产的应用
采用实施例3所述菌剂，将丹参根系置于菌剂中浸泡，浸泡后栽种，同时设置对照组。每组10株丹参根系，共3个重复，放置于28℃的培养室内，7天后观察植株的生长情况。
表1
结果所示：浸泡过本发明所述菌剂的丹参苗株高、鲜重、干重和根长均比对照组CK高，说明本发明所述菌剂对丹参苗的生长具有明显的促进作用。
实施例6、含丹参内生真菌的菌剂用于丹参生产的应用
采用实施例3所述菌剂，向丹参种子中加入菌剂，进行拌种后播种，同时设置对照组。每组10颗丹参种子，共3个重复，实验组种子与菌剂拌种后播种，放置于28℃的培养室内，实验组4天就能促进丹参种子生根，而对照组需要8天左右。说明本发明所述菌剂能促进丹参种子生根。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
序列表
<110> 浙江理工大学
<120> 一种含有丹参内生真菌的菌剂及其应用
<130> 2018.12.13
<141> 2018-12-13
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 510
<212> DNA
<213> 草茎点霉(PhomaherbarumD603)
<400> 1
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tgaacttaag catatcaata agccggagga 510
Claims (10)
1.一种含有丹参内生真菌的菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分为丹参内生真菌，其保藏名称为草茎点霉(Phoma herbarum)D603，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2018年11月26日，保藏编号为CGMCC No.16884。
2.根据权利要求1所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中含草茎点霉(P.herbarum)D603的活菌数为2×106-5×108个/g。
3.根据权利要求1或2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂由草茎点霉(P.herbarum)D603的发酵液和吸附载体按照1∶2～1∶4L/kg的配比混合而成。
4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述发酵液的制备方法如下：将所述草茎点霉(P.herbarum)D603的种子液接种到发酵培养基上培养, 所述种子液的接种量为0.5～5％v/v，培养温度为28～32℃，培养时间为20～28h；所述发酵培养基为PDA液体培养基。
5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述吸附载体包括硅藻土、草炭、蛭石、珍珠岩和碳酸钙中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于，所述吸附载体还包括缓释载体，所述缓释载体由丝胶蛋白、适量纳米纤维素和含多醛基的氧化葡聚糖经混合、絮凝、沉降、脱水制得。
7.根据权利要求6所述的菌剂，其特征在于，所述缓释载体的制备方法如下：所述丝胶蛋白和纳米纤维素加入水后溶胀，加入含多醛基的氧化葡聚糖，然后搅拌均匀，沉降8-12h，收集底部固形物，经脱水获得缓释载体；所述丝胶蛋白、纳米纤维素、含多醛基的氧化葡聚糖的质量比为(0.8～1.6)∶(0.5～2)∶(0.2～0.8)。
8.根据权利要求7所述的菌剂，其特征在于，所述缓释载体占吸附载体总质量比的20-30％。
9.一种权利要求1-8任一所述的菌剂在促进丹参生长中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用方法为：将丹参根系置于菌剂中浸泡，浸泡后栽种；或向丹参种子中加入菌剂，进行拌种后播种。
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| GR01 | Patent grant | ||
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