CN116121123B

CN116121123B - 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在葡萄灰霉病和葡萄保鲜中的应用

Info

Publication number: CN116121123B
Application number: CN202211578485.3A
Authority: CN
Inventors: 杜丰玉; 肖�琳; 王进田; 张诚玮
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2022-12-09
Filing date: 2022-12-09
Publication date: 2024-04-09
Anticipated expiration: 2042-12-09
Also published as: CN116121123A

Abstract

本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌及其在葡萄灰霉病和葡萄保鲜中的应用，属于微生物技术领域。本发明的贝莱斯芽孢杆菌，于2022年8月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M 20221278。本发明的贝莱斯芽孢杆菌对pH以及UV具有较强的耐受性，对多耐药葡萄灰霉病菌具有防治效果，并能够实现食品的保鲜效果。因此，可将所述贝莱斯芽孢杆菌制备成微生物制剂，应用于病菌防治、食品保鲜等领域，应用前景广阔。同时，本发明的贝莱斯芽孢杆菌对化学杀菌剂还具有较强的耐受性，因此，可将其与化学杀菌剂共同用于多耐药葡萄灰霉病菌的防治，从而降低农药施用量。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌及其在葡萄灰霉病和葡萄保鲜中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其在葡萄灰霉病和葡萄保鲜中的应用。

背景技术

葡萄(Vitis vinifera L.)为我国主要经济作物之一，现有品种700多种，种植面积超过7.0×10⁵hm²，其鲜食及酿酒生产已成为带动我国农业与农村经济发展的重要产业之一。但与此同时，葡萄病害的发生逐年上升，再加上葡萄自身不耐贮藏的特性，已经成为制约葡萄产量及品质的核心因素。其中，葡萄灰霉病更是葡萄生产中最常见、危害也最严重的病害之一。

葡萄灰霉病的病原为灰葡萄孢(Botrytis cinerea)，其能够侵染葡萄花序、叶片及幼果，也能危及成熟果实，从而危害葡萄从种植到果实储藏的全产业链，造成重大经济损失。在葡萄种植阶段，不同结构类型的化学农药一直充当葡萄灰霉病防治的主力军，其中，具有代表性的化学农药包括早期广泛应用的多菌灵与异菌脲，以及近年推广使用的啶酰菌胺与嘧菌酯。尽管上述化学农药能够较好防控葡萄灰霉病，但是由于其作用机制相对单一且葡萄灰霉病菌遗传变异性强，导致田间抗性菌株不断出现，进而造成化学农药过量使用与农残超标的恶性循环。而在葡萄储藏阶段，由于其对农残的要求更为严苛，导致葡萄灰霉病防控与化学农药使用之间的矛盾更加突出。

与化学杀菌剂相比，从微生物中寻找防治植物病害的潜力菌株已经成为未来绿色农药发展的重要方向之一。截止目前，芽孢杆菌、链霉菌等细菌以及木霉菌、青霉菌等真菌中的部分菌株已经成功开发为商品化杀菌剂。微生物菌剂具有降解性好、安全性高、不易产生抗药性等优点，对发展环境友好型的生态农业具有重要意义。

发明内容

本发明聚焦葡萄生产及贮藏过程的若干“卡脖子”问题：(1)多耐药葡萄灰霉病频发导致的化学杀菌剂防治困难且农残风险加大的问题；(2)葡萄不耐贮藏特性与多耐药葡萄灰霉病侵染双重叠加，造成葡萄贮藏保鲜困难的问题。

基于上述问题，本发明提出如下技术方案：

本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌NH-13-5，该菌株从山东黄河三角洲国家级自然保护区采集的碱蓬根际土壤中分离获得，并于2022年8月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M 20221278。

上述贝莱斯芽孢杆菌被证明具有植物病害防治效果，尤其对于多耐药葡萄灰霉病及其引起的植物性病害，具有显著的预防和治疗效果。为此，本发明提供了上述贝莱斯芽孢杆菌在预防和/或治疗多耐药葡萄灰霉病菌和/或其引起的植物性病害中的应用；其中，在该应用中，防治目的可以是诊疗性，也可以是非诊疗性。具体地，本发明提供了上述贝莱斯芽孢杆菌在制备预防和/或治疗多耐药葡萄灰霉病菌和/或其引起的植物性病害的微生物制剂中的应用。

本发明进一步提供了上述贝莱斯芽孢杆菌在食品保鲜中的应用。所述食品包括但不限于水果、蔬菜以及粮食等食品；进一步优选为葡萄。

上述贝莱斯芽孢杆菌被证明具有较好的化学杀菌剂耐受性，基于此，本发明提供了上述贝莱斯芽孢杆菌在化学杀菌剂施用环境中的应用；所述应用包括但不限于如下情形：(1)在施用化学杀菌剂时，通过施用上述贝莱斯芽孢杆菌，以改善葡萄种植土壤的微环境，防止因化学杀菌剂过量施用造成的菌群失调及植物病原菌耐药性增强等问题；(2)与化学杀菌剂共同用于上述多耐药葡萄灰霉病菌的防治，即上述贝莱斯芽孢杆菌在与化学杀菌剂联合抑制多耐药葡萄灰霉病菌和/或其引起的植物性病害中的应用。本发明进一步提供了上述贝莱斯芽孢杆菌在制备与化学杀菌剂联合抑制多耐药葡萄灰霉病菌和/或其引起的植物性病害的杀菌剂中的应用。

上述化学杀菌剂选自啶酰菌胺及嘧菌酯中的一种或几种。

本发明提供了一种多耐药葡萄灰霉病菌联合杀菌剂，包括化学杀菌剂和上述贝莱斯芽孢杆菌；所述化学杀菌剂选自啶酰菌胺及嘧菌酯中的一种或几种。

上述贝莱斯芽孢杆菌被证明具有较强的pH及UV耐受性，基于此，本发明提供了上述贝莱斯芽孢杆菌在与UV联合抑制多耐药葡萄灰霉病菌和/或其引起的植物性病害中的应用。

本发明提供了一种微生物制剂，包含上述贝莱斯芽孢杆菌。该微生物制剂可被用于防治多耐药葡萄灰霉病菌和/或其引起的植物性病害。

上述微生物制剂包括但不限于固态制剂或液态制剂，例如粉剂或悬浮剂等。如果是悬浮剂，所述贝莱斯芽孢杆菌的菌含量≥10⁸CFU/mL。

本发明提供了上述贝莱斯芽孢杆菌的发酵培养物。

上述发酵培养物的制备方法，步骤如下：

将上述贝莱斯芽孢杆菌经LB培养基摇床发酵2～3d，获得发酵培养物；所述LB培养基选自如下成分组成：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％ NaCl，蒸馏水，pH调至7.0。

上述发酵培养物中，所述贝莱斯芽孢杆菌的菌含量≥10⁸CFU/mL。

本发明的有益效果为：

本发明的贝莱斯芽孢杆菌对pH以及UV具有较强的耐受性，对多耐药葡萄灰霉病菌具有防治效果，并能够实现食品的保鲜效果。因此，可将所述贝莱斯芽孢杆菌制备成微生物制剂，应用于病菌防治、食品保鲜等领域，应用前景广阔。同时，本发明的贝莱斯芽孢杆菌对化学杀菌剂还具有较强的耐受性，因此，可将其与化学杀菌剂共同用于多耐药葡萄灰霉病菌的防治，从而降低农药施用量。

附图说明

图1为菌株NH-13-5的菌落形态图；

图2为菌株NH-13-5基于16S rDNA基因构建的***发育树；

图3为菌株NH-13-5对化学杀菌剂的耐受性；

图4为菌株NH-13-5对pH值及UV的耐受性；

图5为菌株NH-13-5对多耐药葡萄灰霉病的预防效果；

图6为菌株NH-13-5对多耐药葡萄灰霉病的治疗效果；

图7为菌株NH-13-5对葡萄果实的保鲜效果；

图8为菌株NH-13-5的安全性评价结果。

具体实施方式

菌种分离与鉴定：

本发明所述菌株分离自山东黄河三角洲国家级自然保护区采集的碱蓬根际土壤，应用稀释平板涂布及平板稀释划线法分离纯化获得，具体步骤如下：将碱蓬根际土壤置于烘箱，45℃烘干残留水分；取10g土样至250mL三角烧瓶，加入90mL无菌水，28℃、180rpm震荡培养30min，得到土壤悬浮母液，并依次稀释10倍及100倍；分别吸取200μL上述稀释液，均匀涂布于人工海水(3％海盐水溶液)配制的LB平板表面，每个梯度设置三个平行；将平板28℃静置培养，挑取培养基表面不同形态的菌落，并在人工海水配制的LB平板上划线分离，定时观察菌落生长情况；继续采用平板稀释划线法分离纯化菌株，保存备用，菌株编号为NH-13-5。

将菌株NH-13-5划线接种至LB平板，28℃培养2d，菌落形态如图1所示。菌落表面粗糙，菌落中心存在***，边缘存在褶皱，淡黄色。

所述菌株NH-13-5的16S rDNA基因序列测定结果如下：

将该序列信息与Genbank数据库中已知菌株相应序列信息比较，并构建其***进化树，如图2所示，该菌株与菌株Bacillus velezensis CBMB205(Accession number：NR116240.1)的同源性最高(99.65％)，处于同一进化分支，从而鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。该菌株于2022年8月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M20221278。

本发明中所使用的其它术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

化学杀菌剂耐受性试验：

选取市售啶酰菌胺和嘧菌酯原药(98％)作为供试化学试剂，购自上海源叶生物科技有限公司。具体试验步骤如下：

称取一定质量的啶酰菌胺及嘧菌酯原药，将其分别与一定体积的45℃PDA培养基混匀，得到浓度分别为800mg/L、400mg/L及200mg/L的混药培养基。将不同浓度的混药培养基分别倒入四分格培养皿(直径为9cm)，以PDA培养基为对照。将菌株NH-13-5分别在平板上划线，28℃培养48h，观察菌株生长情况。

试验结果如图3所示：

即使在800mg/L的啶酰菌胺及嘧菌酯平板上，菌株NH-13-5仍能够正常生长，这表明其具有较强的化学杀菌剂耐受性。

实施例2

pH及UV耐受性试验：

挑取菌株NH-13-5的单菌落，接种至装有50mL LB培养基的250mL三角瓶，28℃、180rpm震荡培养12h，得到种子液。

pH耐受性试验：按照5％接种量，分别接种至pH＝2、3、4、5、6、8、9、10及11的LB培养基，以pH＝7为对照。28℃、180rpm震荡培养12h后，稀释涂布计算菌株存活率。

UV耐受性试验：将上述种子液置于254nm紫外光灯下分别照射20min、40min及60min，以正常光线照射为对照，稀释涂布计算菌株存活率。

试验结果如图4所示：

菌株NH-13-5在pH值5～9范围内，生存率超过90％；即使pH值低至2或者高至11，存活率依然超过55％。菌株NH-13-5在强紫外线照射20min后，生存率超过80％，40min后仍能超过40％。这表明菌株NH-13-5具有较强的环境耐受性。

实施例3

葡萄灰霉病防治试验：

(1)供试植物病原真菌

多耐药灰霉病菌分离自青岛莱西的葡萄采摘园，其对灰霉病常用化学杀菌剂：啶酰菌胺及嘧菌酯具有高耐药性，EC₅₀值>150mg/L；与之相比，非耐药灰霉病菌对两者的EC₅₀值<40mg/L。

(2)制备灰霉病菌孢子悬浮液

将多耐药灰霉病菌接种至PDA平板，25℃培养7d。挑取带有分生孢子的菌丝至0.5％葡萄糖水溶液，充分振摇，以均匀分散分生孢子，并稀释至约1×10⁵个分生孢子/mL，备用。

(3)葡萄果实预处理

供试葡萄果实选取青岛广泛种植的代表性品种“大泽山一号”。选择大小均一、无机械损伤及感染的葡萄果实，流水冲洗表面20min，以除去表面污渍。2％次氯酸钠溶液表面消毒2min，无菌水漂洗3～4次，以除去残留的次氯酸钠，自然晾干。

(4)供试菌株NH-13-5的发酵培养物

挑取菌株NH-13-5的单菌落，接种至装有50mL LB培养基的250mL三角瓶，28℃、180rpm震荡培养12h，得到种子液。取一定量种子液(5％接种量)接种至LB培养基，28℃、180rpm震荡培养48h，稀释发酵液至菌浓度为1×10⁸CFU/mL，并进一步稀释至上述菌浓度的1％、5％及10％浓度，备用。

(5)预防与治疗效果

预防效果实验：以无菌刀片在葡萄果实中部进行表面创伤(2mm×2mm)，将其在不同浓度的菌株发酵培养物中浸泡10s，以LB培养基作为阴性对照。吸取5μL孢子悬浮液接种至葡萄果实创伤处，每个处理设置3个重复，每个重复12个葡萄果实。将葡萄果实以保鲜膜密封，置于人工气候箱25℃、80％湿度孵育，每隔12h观察葡萄果实发病情况，待对照病斑直径接近葡萄直径大小时，统计病斑直径。

治疗效果试验：首先，吸取5μL孢子悬浮液接种至葡萄果实创伤处，置于人工气候箱25℃、80％湿度孵育24h；其次，将其在不同浓度的菌株发酵培养物中浸泡10s，以LB培养基作为阴性对照。

上述治疗与预防效果试验均以1000mg/L多菌灵为阳性对照。

试验结果如图5和图6所示：

由于供试植物病原真菌为多耐药葡萄灰霉病，所以阳性对照多菌灵对其防治效果一般；而菌株NH-13-5对葡萄果实侵染多耐药葡萄灰霉病具有明显的预防及治疗效果，其中，预防效果显著优于治疗。这也提示我们，在葡萄面临多耐药葡萄灰霉病侵染之前，可通过及时应用菌株NH-13-5以显著降低葡萄灰霉病的发病率及对葡萄果实品质的影响。

实施例4

葡萄果实保鲜试验：

(1)样品处理

分别按照实施例3中的方法，对葡萄果实进行预处理，并制备菌株NH-13-5的发酵培养物，调至1×10⁸CFU/mL浓度并进一步稀释至10％浓度，备用。

(2)保鲜效果

将上述10％浓度的菌株NH-13-5的发酵培养物均匀喷洒在葡萄果实表面，自然晾干。以LB培养基为阴性对照，以市售枯草芽孢杆菌保鲜剂为阳性对照。将葡萄果实置于冰箱冷藏室，4℃贮藏28d。每隔7d观察葡萄果实外观，测定其硬度、VC、可滴定酸及可溶性糖等代表性评价指标。硬度采用质构仪(博勒飞中国)测定，VC采用2,6-二氯靛酚滴定法(果树学报,2020,37(4):520-532；北方园艺,2022,4:39-44)，可滴定酸采用酸碱滴定法(果树学报,2020,37(4):520-532)，可溶性糖采用蒽酮比色法(果树学报,2020,37(4):520-532；北方园艺,2022,4:39-44)。

试验结果如图7所示：

菌株NH-13-5处理组的葡萄果实外观、硬度及VC、可滴定酸、可溶性糖等评价指标显著优于对照组。其中，经菌株NH-13-5处理的葡萄果实，在28d后，其VC及可滴定酸含量也显著优于阳性对照组。

实施例5

菌株NH-13-5的安全性评价：

应用小鼠口服毒性实验评价菌株NH-13-5的安全性(Postharvest Biology andTechnology,2021,174,111439)，具体步骤如下所示：

(1)供试菌株NH-13-5的发酵培养物

按照实施例3中的方法，制备菌株NH-13-5的发酵培养物，将浓度分别调至1×10⁸CFU/mL及1×10¹⁰CFU/mL，备用。

(2)供试小鼠

选取年龄3～4个月、体重18～22g的ICR小鼠，雌雄各半。饲养温度20～22℃，相对湿度45％～55％。

(3)试验方法

将供试小鼠随机分成3组，每组30只，雌雄各半。按照20mL/kg的剂量，向每只小鼠灌胃服用菌株NH-13-5不同浓度的发酵培养物(平均约0.4mL)，以相同剂量的生理盐水为阴性对照。供试小鼠在灌胃前，禁食16h、不禁水；在灌胃后，禁食12h、不禁水。连续观察28d，观察小鼠是否存在中毒及死亡情况，记录小鼠的日取食量并每7d称重一次。

试验结果如图8所示：

菌株NH-13-5处理组的小鼠日取食量显著高于对照组，这可能与其能够促进小鼠的胃肠道消化吸收有关，同时，处理组的小鼠平均体重也高于对照组。连续观察28d，处理组与对照组均未出现小鼠中毒及死亡情况。

综上所述，本发明所述贝莱斯芽孢杆菌对人畜的毒性低，可将其制备成微生物制剂，用于葡萄生产全过程的葡萄灰霉病防治及保鲜；并可与化学杀菌剂共用进行葡萄灰霉病防治，从而显著降低农药施用量。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，其特征在于，所述菌株于2022年8月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M 20221278。

2.权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌在预防和/或治疗多耐药葡萄灰霉病菌和/或其引起的植物性病害中的应用。

3.权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌在葡萄保鲜中的应用。

4.权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌在化学杀菌剂施用环境中的应用；所述化学杀菌剂为啶酰菌胺或嘧菌酯。

5.一种多耐药葡萄灰霉病菌联合杀菌剂，其特征在于，包括化学杀菌剂和权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌；所述化学杀菌剂为啶酰菌胺或嘧菌酯。

6.根据权利要求5所述的联合杀菌剂，其特征在于，所述化学杀菌剂选自啶酰菌胺及嘧菌酯中的一种或几种。

7.权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌在与UV联合抑制多耐药葡萄灰霉病菌和/或其引起的植物性病害中的应用。

8.一种微生物制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌。

9.一种发酵培养物的制备方法，其特征在于，步骤如下：将权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌经LB培养基摇床发酵2～3d，获得发酵培养物；所述LB培养基选自如下成分组成：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，蒸馏水，pH调至7.0。