CN111280183A - 一种苹果炭疽叶枯病生防菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种苹果炭疽叶枯病生防菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种苹果炭疽叶枯病生防菌剂，所述苹果炭疽叶枯病生防菌剂是丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)菌株B‑1菌悬液。本发明丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)B‑1对苹果炭疽叶枯病有显著的防治效果，实施例的研究表明，菌株B‑1可显著抑制苹果炭疽叶枯病菌菌丝的生长，菌株B‑1的菌悬液对苹果炭疽叶枯病的防治效果均在60％以上；本发明苹果炭疽叶枯病生防菌剂，对环境友好，大规模生产的发酵工艺简单、生产成本低廉。

Description

一种苹果炭疽叶枯病生防菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种苹果炭疽叶枯病生防菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
苹果含有丰富的碳水化合物、维生素和无机盐等物质，是人们重要的营养来源和物质基础。在我国苹果作为重要的经济作物和出口水果，栽培面积和产量均居世界首位，苹果是我国北方农民增收的重要支柱产业之一，但是病害严重制约了我国苹果产业的健康发展。
由炭疽病菌(Glomerella cingulata)引起的苹果炭疽叶枯病(Glomerella leafspot,GLS)，是近年我国苹果上新发现的一种病害，其主要危害苹果叶片和果实，导致叶片焦枯，提前大量脱落。苹果果实受侵染后在果面上形成直径 1-2mm的黑色病斑，不仅直接降低果品产量和品质，造成严重的经济损失，而且严重消弱树势，降低树体抗病力，诱发枝干病害及根部病害的危害。苹果炭疽叶枯病2012年在我国首次报道，2014年已扩散蔓延至大部分苹果主产区。其中，如：嘎啦、金冠、秦冠等品种高度感病，富士、红星等品种抗性强。
利用抗病基因育种是克服苹果炭疽叶枯病的理想策略，但相关研究尚未取得突破性进展，离应用于生产还有很远的距离。目前，苹果炭疽叶枯病的防控主要依靠化学杀菌剂，频繁使用化学杀菌剂不仅使果园生态环境恶化，给食品安全带来极大隐患；而且苹果炭疽叶枯病发病迅速，潜育期只有2-4d，病原菌一旦侵入寄主组织，几乎没有用药防治时间。如该病无法得到有效控制，嘎啦、金冠、秦冠等感病优良品种在我国将面临被淘汰的风险。化学杀菌剂的广泛使用，给人类健康及环境安全带来严重威胁，进而带来的抗药性问题也逐渐显露。因此，寻求可替代化学杀菌剂的安全有效防治措施已成为苹果生产和病害防治中亟待解决的问题。
采用生防菌剂防治苹果炭疽叶枯病对环境友好，可以避免化学防治带来的一系列问题。生防菌剂可减少或替代化学药剂的使用，从而达到防治苹果炭疽叶枯病的目的。现有技术中还没有采用丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae) 制备苹果炭疽叶枯病生防菌剂，用于苹果炭疽叶枯病防治的报道。如何解决上述技术问题，是目前微生物技术领域需要解决的技术问题。
发明内容
本发明所提供的丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)B-1，于2015年12 月31日保藏于：中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO:M2015813，保藏地址为：湖北省武汉市，洪山区八一路。
本发明所提供的苹果炭疽叶枯病生防菌剂是丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)菌株B-1菌悬液。
本发明所提供的苹果炭疽叶枯病生防菌剂是浓度为103-107cfu·mL-1的丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)菌株B-1菌悬液。
本发明所提供的是浓度为107cfu·mL-1的丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)菌株B-1菌悬液。
本发明所提供的苹果炭疽叶枯病生防菌剂用于苹果炭疽叶枯病的防治。
本发明所提供的苹果炭疽叶枯病生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将菌株B-1划线接种在NA培养基中，于30℃恒温活化培养24h，得到活化的菌株B-1单菌落A；
(2)将所述活化的菌株B-1单菌落A，接种于装瓶量80mL/250mL的NB培养基中，180r·min-1，30℃恒温震荡培养12h，得到菌株B-1发酵种子液B；
(3)将所述发酵种子液B按1:100的接种量接种到NB培养基中扩大培养， 30℃恒温震荡培养12h，得到107cfu·mL-1B-1菌株的细胞培养液C；
(4)将107cfu·mL-1B-1菌株的细胞培养液C，在4℃条件下，12000r·min-1离心15min，收集菌体沉淀用无菌水重新悬浮，得到107cfu·mL-1的菌悬液，即为苹果炭疽叶枯病生防菌剂。
本发明所提供的NA培养基由以下方法制备：取蛋白胨10g，牛肉膏3g， NaCl 5g，琼脂粉20g，加水定容至1 000mL，调节pH值为7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
本发明所提供的NB培养基由以下方法制备：取蛋白胨10g，牛肉膏3g， NaCl 5g，加水定容至1 000mL，调节pH值为7.0，分装于250mL三角瓶中，装瓶量为80mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。
本发明所提供的用于防治苹果炭疽叶枯病的农药复配剂，有效成分为2,6- 二叔丁基对甲酚(BHT)和丁香假单胞菌B-1菌悬液。
本发明所提供的用于防治苹果炭疽叶枯病的农药复配剂，由以下体积份数的有效成分制成：0.1mmol·L-1的2,6-二叔丁基对甲酚溶液1份和105cfu·mL-1的丁香假单胞菌B-1菌悬液1份。
本发明所提供的用于防治苹果炭疽叶枯病的农药复配剂，用于苹果炭疽叶枯病防治。
本发明的有益效果是：本发明丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)B-1 对苹果炭疽叶枯病有显著的防治效果，实施例的研究表明，菌株B-1可显著抑制苹果炭疽叶枯病菌菌丝的生长，菌株B-1的菌悬液对苹果炭疽叶枯病的防治效果均在60％以上；本发明苹果炭疽叶枯病生防菌剂，对环境友好，大规模生产的发酵工艺简单、生产成本低廉。
附图说明
图1为菌株B-1提取DNA的16S rDNA序列PCR扩增示意图；
其中，图中M为核酸Marker DL2000；图中1为菌株B-1基因组DNA的16S rDNA序列扩增结果；
图2为不同浓度菌株B-1对苹果炭疽叶枯病菌菌丝生长的抑制作用；
图3为不同浓度菌株B-1对苹果炭疽叶枯病的防治效果；
其中，A为不同浓度菌株B-1对苹果炭疽叶枯病病情指数的影响，B为不同浓度菌株B-1对苹果炭疽叶枯病病情指数病斑数的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所提供的生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将菌株B-1划线接种在NA培养基中，于30℃恒温活化培养24h，得到活化的菌株B-1单菌落A；
(2)将所述活化的菌株B-1单菌落A，接种于装瓶量80mL/250mL的NB培养基中，180r·min-1，30℃恒温震荡培养12h，得到菌株B-1发酵种子液B；
(3)将所述发酵种子液B按1:100的接种量接种到NB培养基中扩大培养， 30℃恒温震荡培养12h，得到107cfu·mL-1B-1菌株的细胞培养液C；
(4)将107cfu·mL-1B-1菌株的细胞培养液C，在4℃条件下，12000r·min-1离心15min，收集菌体沉淀用无菌水重新悬浮，得到107cfu·mL-1的菌悬液，即为苹果炭疽叶枯病生防菌剂。
需要说明的是，所述107cfu·mL-1的菌悬液在使用的时候，一般要稀释 0-10000倍。
本发明所提供的NA培养基由以下方法制备：取蛋白胨10g，牛肉膏3g， NaCl 5g，琼脂粉20g，加水定容至1 000mL，调节pH值为7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
本发明所提供的NB培养基由以下方法制备：取蛋白胨10g，牛肉膏3g， NaCl 5g，加水定容至1000mL，调节pH值为7.0，分装于250mL三角瓶中，装瓶量为80mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。
实施例1
丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)B-1的分离筛选与菌株鉴定
1.菌株的分离与筛选
从山东烟台商品化富士苹果园采集成熟健康果实，表面消毒后取果实组织研磨，加入无菌水，采用常规梯度稀释涂布分离法，用NA培养基分别在28℃条件下培养，挑取菌落形态差异明显的菌落，在NA培养基上纯化保存，并以苹果轮纹病菌为靶标病原菌进行拮抗菌的初筛和多次复筛，最终得到一株抑菌活性强的细菌菌株，命名为B-1。
2.菌株的鉴定
(1)形态特征：菌株B-1在NA培养基上培养24h后，菌落呈乳白色，圆形或近圆形，表面光滑中间凸起，菌落质地均匀，生长较快，菌体镜检呈杆状，为革兰氏阴性菌。
(2)生理生化特性：菌株B-1可利用葡萄糖、果糖、D-木糖作为碳源，不能利用蔗糖、麦芽糖、乳糖等作为碳源；氧化酶反应阴性，多聚物颗粒阴性，不水解淀粉，不产生H2S，不产生吲哚，精氨酸，接触酶反应阳性；能液化明教， VP反应呈阳性，上述特性符合《常见细菌鉴定手册》中假单胞属丁香假单胞菌 (Pseudomonas syringae)的描述。
(3)16S rDNA序列分析：采用CTAB法提取细菌基因组DNA，采用通用引物Primer F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，Primer R： 5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’对DNA模板进行PCR扩增；PCR扩增反应体系 (25μL)：2.5μL 10×Taq酶缓冲液，0.2μmol/L引物，2μL200mmol/L dNTPs， 20ng DNA模板，1U Taq酶(TaKaRa)，17μL ddH2O。PCR扩增程序：94℃预变性4min,94℃变性45s,54℃退火60s,72℃延伸2min，进行35个循环， 72℃延伸5min。扩增产物(8μL)经1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测(PCR扩增结果如图1所示)。
PCR扩增产物经切胶回收后，直接送交上海生物工程有限公司进行序列测定。测定序列的分析结果表明ITS序列扩增片段长度为1402bp，其序列如序列表SEQ ID NO:1所示。将所得序列采用NCBI数据库(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov)中的BLAST软件与GenBank中的核酸序列进行比对，与丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)IPPBC-R30菌株(Accession No: HQ840766.1)的16S rDNA序列同源性为100％。
结合以上3点，形态学特征、生理生化特性及基因组的16S rDNA序列分析，将菌株B-1鉴定为丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)。
实施例3
丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)B-1对苹果炭疽叶枯病菌菌丝生长的影响
将丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)B-1的种子发酵液接种于NB培养基中，30℃恒温震荡培养12h，得到菌株B-1的细胞培养液，离心后收集菌株 B-1菌体。
配置PDA培养基，在其中添加菌株B-1的菌体，使其终浓度为104、105、106和107cfu·mL-1，以不添加菌株B-1的PDA培养基作为对照，在上述PDA培养基中接种活化好的苹果炭疽叶枯病菌。于25℃恒温暗培养3d，测量菌落直径。
上述所用PDA培养基，其组分及配方如下：马铃薯削皮后称取200g，切成小块在水中煮沸15-20min，四层纱布过滤后加入葡萄糖20g，琼脂粉15g，定容至1000mL，pH值天然，在121℃高压蒸汽灭菌20min。
结果表明，添加不同浓度菌株B-1菌体对苹果炭疽叶枯病菌均有显著的抑制作用，菌株B-1菌悬液浓度为104cfu·mL-1时，抑菌率为45.25％；B-1菌体浓度为105cfu·mL-1时，抑菌率为68.98％；B-1菌体浓度为106cfu·mL-1-107 cfu·mL-1时，抑菌率均达85％以上(图2)。
实施例4
丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)B-1菌悬液对苹果炭疽叶枯病的防治效果
制备苹果炭疽叶枯病菌的孢子悬浮液，将病原菌在PDA上恒温暗培养，待菌丝长至2/3平皿时，用接种环刮除气生菌丝，2-3d后可见橘黄色的分生孢子角产生，配置分生孢子悬浮液调节浓度至5×104个·mL-1。
制备菌株B-1不同浓度的菌悬液，103cfu·mL-1，105cfu·mL-1和107 cfu·mL-1。选取长势一致的一至二年生完全展开叶的嘎啦苹果枝条，分别均匀喷雾上述不同浓度菌株B-1菌悬液，直到叶片有水滴滴下，以无菌水作对照。上述不同浓度B-1菌悬液处理后3d，喷雾接种上述制备的苹果炭疽叶枯病菌孢子悬浮液，田间接种后用塑料袋进行保湿24h，定期观察记录叶片发病情况。
按GB/T17980.124-2004《农药田间药效试验准则(二)》分级，并计算病情指数。
0级：无病斑；1级：病斑面积占整个叶面积的10％以下；3级：病斑面积占叶面积的11％-30％；5级：病斑面积占叶面积的30％-50％；7级：病斑面积占叶面积的51％；9级：落叶。
按以下公式计算:病情指数＝100×∑(各级病叶数×该病级值)/(调查总叶片数×最高级值)；防治效果＝(对照病情指数-菌株B-1菌悬液处理病情指数)/ 对照病情指数×100％
所述不同浓度菌株B-1菌悬液对苹果炭疽叶枯病的防治效果见图3，不同浓度菌株B-1菌悬液处理后，苹果炭疽叶枯病病斑数和病情指数均显著降低，B-1 菌体浓度为103cfu·mL-1时，防治效果为60.95％，B-1菌体浓度为105cfu·mL-1和107cfu·mL-1时，防治效果分别达到78.05％和80.73％。
实施例5
丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)B-1对多种植物病原真菌的抑制作用
丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)B-1对果蔬灰霉病菌、果蔬青霉病菌、苹果树腐烂病菌、苹果轮纹病菌、苹果霉心病菌、桃褐腐病菌等主要果蔬病原真菌具有显著的抑制作用，表现出良好的广谱抗菌特性，培养5d时抑菌率见表1。抑菌率＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100％。
表1丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)B-1对果蔬主要病原真菌的抑制作用
Figure BDA0002386189780000091
实施例6
农药复配剂对苹果炭疽叶枯病的防治效果
配置0.1mmol·L-1的2,6-二叔丁基对甲酚溶液，制备丁香假单胞菌B-1菌悬液105cfu·mL-1，进行等体积混合，制备用于防治苹果炭疽叶枯病的农药复配剂。
制备苹果炭疽叶枯病菌的孢子悬浮液，将病原菌在PDA上恒温暗培养，待菌丝长至2/3平皿时，用接种环刮除气生菌丝，2-3d后可见橘黄色的分生孢子角产生，配置分生孢子悬浮液调节浓度至5×104个·mL-1。
选取长势一致的一至二年生完全展开叶的嘎啦苹果枝条，均匀喷雾上述农药复配剂，直到叶片有水滴滴下，以单独接种0.1mmol·L-1的2,6-二叔丁基对甲酚溶液、105cfu·mL-1的丁香假单胞菌B-1菌悬液、无菌水作对照。
上述不同处理喷雾后3d，接种苹果炭疽叶枯病菌孢子悬浮液，田间接种后用塑料袋进行保湿24h，定期观察记录叶片发病情况。根据病害分级标准，计算病情指数和防治效果:病情指数＝100×∑(各级病叶数×该病级值)/(调查总叶片数×最高级值)；防治效果＝(对照病情指数-菌株B-1菌悬液处理病情指数)/ 对照病情指数×100％。
表2可见，农药复配剂可显著提高丁香假单胞菌B-1单独对苹果炭疽叶枯病的防治效果，防效由78.11％提高至92.89％。
表2 2,6-二叔丁基对甲酚提高丁香假单胞菌B-1对炭疽叶枯病的防治效果
Figure BDA0002386189780000101
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一种苹果炭疽叶枯病生防菌剂及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1402
<212> DNA
<213> 丁香假单胞菌 B-1 的16S rDNA(16S rDNA of Pseudomonas syringae B-1)
<400> 1
gtccccccga aggttagact agctacttct ggtgcaaccc actcccatgg tgtgacgggc 60
ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcgacattc tgattcgcga ttactagcga 120
ttccgacttc acgcagtcga gttgcagact gcgatccgga ctacgatcgg ttttgtgaga 180
ttagctccac ctcgcggctt ggcaaccctc tgtaccgacc attgtagcac gtgtgtagcc 240
caggccgtaa gggccatgat gacttgacgt catccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg 300
cagtctcctt agagtgccca ccataatgtg ctggtaacta aggacaaggg ttgcgctcgt 360
tacgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga cagccatgca gcacctgtct 420
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aggttcttcg cgttgcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc 540
aattcatttg agttttaacc ttgcggccgt actccccagg cggtcaactt aatgcgttag 600
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accagggtat ctaatcctgt ttgctcccca cgctttcgca cctcagtgtc agtatcagtc 720
caggtggtcg ccttcgccac tggtgttcct tcctatatct acgcatttca ccgctacaca 780
ggaaattcca ccaccctcta ccatactcta gcttgccagt tttggatgca gttcccaggt 840
tgagcccggg gatttcacat ccaacttaac aaaccaccta cgcgcgcttt acgcccagta 900
attccgatta acgcttgcac cctctgtatt accgcggctg ctggcacaga gttagccggt 960
gcttattctg tcggtaacgt caaaacaatc acgtattagg taactgccct tcctcccaac 1020
ttaaagtgct ttacaatccg aagaccttct tcacacacgc ggcatggctg gatcaggctt 1080
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ttccagtgtg actgatcatc ctctcagacc agttacggat cgtcgccttg gtgagccatt 1200
acctcaccaa ctagctaatc cgacctaggc tcatctgata gcgcaaggcc cgaaggtccc 1260
ctgctttctc ccgtaggacg tatgcggtat tagcgtccgt ttccgagcgt tatcccccac 1320
taccaggcag attcctaggc attactcacc cgtccgccgc tcgccaccag gtacaagtac 1380
ccgtgctgcc gctcgactgc at 1402

Claims (8)

1.一种苹果炭疽叶枯病生防菌剂，其特征是：所述苹果炭疽叶枯病生防菌剂是丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)菌株B-1菌悬液。
2.根据权利要求1所述的苹果炭疽叶枯病生防菌剂，其特征是：所述苹果炭疽叶枯病生防菌剂是浓度为103-107cfu·mL-1的丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)菌株B-1菌悬液。
3.根据权利要求1所述的苹果炭疽叶枯病生防菌剂，其特征是：所述苹果炭疽叶枯病生防菌剂是浓度为107cfu·mL-1的丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)菌株B-1菌悬液。
4.一种权利要求1-3任一项所述的苹果炭疽叶枯病生防菌剂的应用，其特征是：所述苹果炭疽叶枯病生防菌剂用于苹果炭疽叶枯病的防治。
5.一种权利要求1所述的苹果炭疽叶枯病生防菌剂制备方法，其特征是：包括以下步骤：
(1)将菌株B-1划线接种在NA培养基中，于30℃恒温活化培养24h，得到活化的菌株B-1单菌落A；
(2)将所述活化的菌株B-1单菌落A，接种于装瓶量80mL/250mL的NB培养基中，180r·min-1，30℃恒温震荡培养12h，得到菌株B-1发酵种子液B；
(3)将所述发酵种子液B按1:100的接种量接种到NB培养基中扩大培养，30℃恒温震荡培养12h，得到107cfu·mL-1B-1菌株的细胞培养液C；
(4)将107cfu·mL-1B-1菌株的细胞培养液C，在4℃条件下，12000r·min-1离心15min，收集菌体沉淀用无菌水重新悬浮，得到107cfu·mL-1的菌悬液，即为苹果炭疽叶枯病生防菌剂。
6.一种用于防治苹果炭疽叶枯病的农药复配剂，其特征是：所述农药复配剂中的有效成分为2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)和丁香假单胞菌B-1菌悬液。
7.根据权利要求6所述的农药复配剂，其特征是：所述农药复配剂由以下体积份数的有效成分制成：0.1mmol·L-1的2,6-二叔丁基对甲酚溶液1份和105cfu·mL-1的丁香假单胞菌B-1菌悬液1份。
8.一种权利要求6或7所述的农药复配剂的应用，其特征是：所述农药复配剂用于苹果炭疽叶枯病防治。
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