BR122020002414B1 - Uso de anticorpos anti-cd27 humanos - Google Patents

Abstract

os anticorpos humanos imunoespecíficos para cd27 humana são capazes de bloquear a ligação de cd27 a seu ligante cd70 e neutralizar a bioatividade de cd27 incluindo, mas não se limitando a, a sinalização intracelular de cd27, a ativação e a proliferação de células t, a diferenciação e proliferação de células b, a formação de plasmablasto e alívio de respostas de anticorpos, a estimulação de células de tumor por cd70 e a produção de mediadores solúveis a partir de células t e b. os anticorpos são úteis no diagnóstico ou tratamento de doenças e condições associadas à atividade de cd27.

Description

Dividido do BR112014022812-4, depositado em 14.03.2013 ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da invenção

[0001] A presente invenção refere-se a anticorpos humanos para a proteína CD27 e seus usos e, mais particularmente, anticorpos humanos para a proteína CD27 humana e seu uso no tratamento de distúrbios inflamatórios.

Técnica relacionada

[0002] A CD27 é uma proteína transmembranar do tipo I e membro da superfamília de receptor de TNF (TNFSF27) expresso como um antígeno de superfície na maioria das células T, a células "natural killer" e plasma que secreta anticorpo e células B de memória. CD70 é uma citocina, também chamada de membro da superfamília de ligante de Fator de Necrose Tumoral 7 (TNFSF7) e o ligante cognato para CD27. As interações de receptor-ligante de TNFSF podem regular a diferenciação de célula B dependente de T (Jacquot S. 2000 Immunol Res. 21(1):23 a 30) e induzir a morte celular apoptótica em diferentes células.

[0003] A ligação de CD27:CD70 resulta na ativação de vias de sinalização de NF-kβ canônicas e não canônicas que, por sua vez, estimula a proliferação de célula B e T, diferenciação celular de plasma e secreção de anticorpo subsequente (Yamamoto, H. 1998 J Immunol. 161(9): 4753 a 4759). A coestimulação de CD27 com OX40, 4-1BB também promove a sobrevivência de células T ativadas (Croft, M. 2003 Cytokine Growth Factor Rev. 14(3-4): 265 a 273), regulando, assim, uma série de células T de memória e efetoras e controla a função de célula T diretamente pela promoção da produção de citocinas, tais como, IL-4 e IFNgama, ou modulação de respostas de célula T às ações de outras citocinas, tais como IL2 e IL-12.

[0004] Os estudos tanto em seres humanos como em animais sugerem um papel importante da via CD27:CD70 em diversas doenças relacionadas ao sistema imunológico, que incluem lúpus eritematoso sistêmico (SLE) (Doerner T Lupus 2004 13(5):283 a 289), artrite reu- matoide (Tak, PP et al. 1996 clin Immunol Immunopathol 80(2): 129 a 138) e esclerose múltipla (Hintzen RQ et al. 1991 J Neuroimmunol 35(1-3):211 a 217). Por outro lado, CD70 tem sido relatado como expresso em graus variados nas células B malignas e o complexo CD70:CD27 pode mediar uma resposta antitumor pela ativação da imunidade antitumor e redução do crescimento do tumor (Borst J, Hendriks J e Xiao Y. 2005. Curr Opin Immunol. 17(3):275 a 281). CD27 também pode controlar o acúmulo de células T CD4+ e CD8+ em sítios de infecção (Hendricks et al. 2000 Nature Immunol 1,433 a 440).

[0005] CD70 não é expresso em células não hematopoiéticas normais. A expressão de CD70 parece ser temporariamente restrita às células T e B ativadas por antígeno e sua expressão é regulada descendentemente quando a estimulação antigênica cessa. A evidência a partir de modelos de animal sugere que CD70 pode contribuir para os distúrbios imunológicos, tais como, por exemplo, artrite reumatoide (Brugnoni et al., 1997 Immunol. Lett. 55:99 a 104), artrite psoriática (Brugnoni et al., 1997, Immunol. Lett. 55:99 a 104) e lúpus (Oelke et al., 2004, Arthritis Rheum. 50:1850 a 1860). Em adição a seu papel potencial em respostas inflamatórias, CD70 também é expresso em uma variedade de células transformadas, que incluem células B de linfoma, células de Hodgkin e Reed-Sternberg, células malignas de origem neural e uma série de carcinomas.

[0006] Os anticorpos de CD27 agonistas descritos no documento n° W02008/051424 (Univ. South Hampton) são observados como úteis para promover a imunidade de célula T e tais anticorpos têm um epito- po de ligação que faz com que os mesmos não sejam afetados (não inibidos) por CD70.

[0007] Embora os estudos em roedores que envolvem a alteração de CD27 e/ou CD70 tenham demonstrado papéis potencialmente importantes dessa interação de ligante e receptor, existe uma necessidade para fornecer anticorpos humanos específicos para CD27 humana e outros agentes de bloqueio de interação de CD27:CD70 que podem exercer um efeito imunomodulatório, citostático ou citotóxico clinicamente útil sobre as células que expressam CD27, particularmente sem exercer efeitos agonistas indesejáveis sobre as células que expressam CD27 na ausência de CD70. Tais compostos podem ser agentes terapêuticos úteis na modulação do desenvolvimento de células neoplásticas ou distúrbios imunes que são mediados por células que expressam CD27.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0008] A presente invenção fornece anticorpos monoclonais de ligação de CD27 humana capazes de bloquear as atividades associadas à interação de CD27-CD70 em células, tecidos ou órgãos em um indivíduo hospedeiro. As sequências de aminoácidos de anticorpos monoclonais de ligação de CD27 exemplificadores são fornecidas, as quais são codificadas por ácidos nucleicos para a expressão em uma célula hospedeira. Além disso, os anticorpos monoclonais de CD27 da invenção definem pelo menos três epitopos não sobrepostos no domínio extracelular de CD27 que, quando engatados por um anticorpo da invenção, são impedidos da sinalização conduzida por ligação de li- gante do tipo CD70 e atividade biológica a jusante.

[0009] Um outro aspecto da invenção é um anticorpo anti-CD27 isolado reativo com um epitopo de proteína CD27 definido por resíduos entre as posições 21 a 191 da proteína CD27.

[0010] Um outro aspecto da invenção é um anticorpo isolado que tem uma sequência da região variável de cadeia pesada selecionada a partir das sequências mostradas em SEQ ID NOs: 76, 78, 80, 102 a 126, 128 a 136 e 145 a 147, e uma sequência da região variável de cadeia leve selecionada a partir das sequências mostradas em SEQ ID NOs: 77, 79, 81 a 101, 127, 137 a 144 e 148, que incluem as variantes dessas sequências, por exemplo, substituições conservativas.

[0011] Um aspecto adicional da invenção é um anticorpo isolado que tem sequências de CDR de cadeia leve e pesada selecionadas a partir das sequências mostradas em SEQ ID NOs: 1 a 75 e 151 a 158, que incluem as variantes dessas sequências, por exemplo, substituições conservativas.

[0012] Um outro aspecto da invenção é um polinucleotídeo isolado que codifica um anticorpo da invenção.

[0013] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo que se liga a um epitopo comum definido pela região na proteína à qual os anticorpos C2177 e/ou C2186 ou anticorpos humanos gerados a partir dos mesmos, descritos nas Tabelas 30 a 39, se ligam ou que competem pela ligação à proteína CD27 com os anticorpos C2177 e/ou C2186 ou anticorpos humanos gerados a partir dos mesmos, descritos nas Tabelas 30 a 39. Em outra modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo que se liga a um epitopo da domínio extracelular de CD27 definido pela região na proteína à qual o anticorpo C2191 se liga ou anticorpos humanos gerados a partir dos mesmos, descritos nas Tabelas 30 a 39, e compete pela ligação à proteína CD27 com o anticorpo C2191 ou anticorpos humanos gerados a partir dos mesmos, descritos nas Tabelas 30 a 39. Em outra modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo que se liga a um epitopo do domínio extracelular de CD27 definido pela região na proteína à qual o anticorpo C2192 se liga ou anticorpos humanos gerados a partir dos mesmos, descritos nas Tabelas 30 a 39 e compete pela ligação à proteína CD27 com o anticorpo C2192 ou anticorpos humanos gerados a partir dos mesmos, descritos nas Tabelas 30 a 39. Em outro aspecto, a invenção compreende um anticorpo ou fragmento do mesmo derivado a partir de um ou mais dentre os anticorpos C2177, C2186, C2191 e C2192 ou anticorpos humanos gerados a partir dos mesmos, descritos nas Tabelas 30 a 39 que têm outras características de ligação funcional exibidas por um ou mais dentre os anticorpos C2177, C2186, C2191 e C2192, ou anticorpos humanos gerados a partir dos mesmos, descritos nas Tabelas 30 a 39, tal como a inibição de células positivas CD27 a CD70.

[0014] Dessa forma, um aspecto da invenção refere-se a um anticorpo projetado que compreende uma cadeia pesada e cadeia leve projetada (por exemplo, humanizada ou adaptada a humano), sendo que: a região variável de cadeia pesada projetada compreende ou é derivada a partir de uma ou mais regiões determinantes da complementaridade (CDRS) a partir de cadeia pesada de anticorpos C2177, C2191, C2192 e C2186 de camundongoe uma estrutura a partir de uma cadeia pesada de anticorpo aceitador humano, que tem opcionalmente uma ou mais substituições de resíduo de estrutura humana, e a região variável de cadeia leve projetada compreende uma ou mais regiões determinantes da complementaridade a partir da cadeia leve de anticorpos C2177, C2191, C2192 e C2186 de camundongo e uma estrutura a partir de uma cadeia leve de anticorpo aceitador humano que tem opcionalmente uma ou mais substituições de resíduo de estrutura humana; e o anticorpo projetado se liga especificamente a CD27 humana e interfere com sua interação com CD70.

[0015] Em uma outra modalidade, o anticorpo projetado pode ser composto de uma ou mais CDRs que são adicionalmente projetadas com uma ou mais substituições ou deleções, por exemplo, aquelas que têm 90%, 95%, 98% ou 99,5% de identidade com uma ou mais CDRs de anticorpos C2177, C2191, C2192 e/ou C2186.

[0016] Outra modalidade refere-se ao tratamento ou prevenção de condições patológicas associadas à bioatividade de CD27 administrando-se uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um anticorpo da presente invenção, parte do mesmo ou uma mistura de anticorpos da presente invenção ou partes do mesmo a um indivíduo que necessite de tal tratamento.

[0017] Em uma outra modalidade, a invenção compreende epitopos de antígeno como um componente de uma vacina. Os polipeptí- deos ou polinucleotídeos que codificam os epitopos de polipeptídeo descritos acima, que compreende subfragmentos ou análogos tridimensionais de alguns ou todos os resíduos 21 a 191 de SEQ ID NO: 1, ou mudanças conservativas dos mesmos, são reconhecidos pelos anticorpos da invenção. Os polipeptídeos e polinucleotídeos são úteis para imunizar ativamente um hospedeiro para provocar a produção de anticorpos contra CD27 que tem capacidade para combater ou prevenir condições patológicas associadas à bioatividade de CD27.

[0018] A invenção também se refere a métodos para gerar, purificar, formular e embalar um anticorpo da invenção para o uso no tratamento ou prevenção de condições patológicas associadas à bioativi- dade de CD27, administrando-se uma quantidade terapêutica ou profi- laticamente eficaz de um anticorpo ou parte do mesmo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0019] A Figura 1 é um gráfico que mostra os efeitos do anticorpo C2177 sobre a proliferação de célula T.

[0020] A Figura 2 mostra a estrutura de cristal do complexo ternário CD27:C2177:C2191. As terminações N e C do fragmento CD27 são identificadas. As cadeias pesadas de Fabs são mais escuras do que suas cadeias leves.

[0021] A Figura 3 é um diagrama de contatos de proteína CD27 - anticorpo C2177 com os resíduos de proteína CD27 (epitopo) em círculos e resíduos de anticorpo C2177 (parátopo) em caixas.

[0022] A Figura 4 é um diagrama de contatos de proteína CD27 - anticorpo C2191 com resíduos de proteína CD27 (epitopo) são em círculos e resíduos de anticorpo C2191 (parátopo) em caixas.

DESCRIÇÃO DETALHADA Abreviações

[0023] CDR - região determinante de complementaridade; CFSE - diacetato de carboxifluoresceina, éster de succinimidila; ECD - domínio extracelular; FR - estrutura; H - cadeia pesada; GvHD doença do enxerto contra hospedeiro; L - cadeia leve; IFN - interferon (g, gama); Ig - imunoglobulina; Mab - anticorpo monoclonal; MMP - metaloprotei- nase de matriz; PBMC - células mononucleares de sangue periférico; VL - variável de cadeia leve; VH - variável de cadeia pesada Definições

[0024] Como usado aqui, um "anticorpo" inclui anticorpos inteiros e qualquer fragmento de ligação ao antígeno ou uma cadeia única dos mesmos. O anticorpo inclui qualquer proteína ou peptídeo que contém a molécula que compreende pelo menos uma porção de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, mas não se limitando a, pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) de uma cadeia pesada ou leve, ou uma porção de ligação do ligante da mesma, uma região variável de cadeia pesada ou leve, uma região constante de cadeia pesada ou de cadeia leve, uma região estrutural (FR) ou qualquer porção da mesma, que podem ser incorporadas em um anticorpo da presente invenção. O termo "anticorpo" se destina, adicionalmente, a abranger anticorpos, fragmentos de digestão, porções especificadas e suas variantes, incluindo miméticos de anticorpo ou compreendendo porções de anticorpos que imitam a estrutura e/ou a função de um anticorpo ou fragmento especificado ou porção do mesmo, incluindo anticorpos de cadeia única, anticorpos de domínio único e fragmentos dos mesmos. Os fragmentos funcionais incluem fragmentos de ligação a antígeno para um alvo selecionado previamente. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos pelo termo "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois frag-mentos Fab ligados por uma ligação de dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH; (iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste em um domínio VH; e (vi) uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada. Adicionalmente, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, podem ser unidos, com o uso de métodos re- combinantes, por um ligante sintético que possibilita que os mesmos sejam feitos como uma cadeia de proteína única, na qual as regiões de VL e VH pareiam para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); consulte, por exemplo, Bird et al. (I 988) Science 242:423 a 426, e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. EUA 85:5879 a 5883). Estes anticorpos de cadeia única também estão abrangidos pelo termo "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos com o uso de técnicas convencionais conhecidas dos versados na técnica, e os fragmentos são selecionados quanto a sua utilidade da mesma forma que os anticorpos intactos. De modo contrário, bibliotecas de constru- tos de scFv podem ser usadas para buscar uma capacidade de liga ção ao antígeno e, então, usando técnicas convencionais, podem ser unidas a outras sequências gênicas de linhagem germinativa humana que codificam DNA. Um exemplo de tal biblioteca é "HuCAL: Human Combinatorial Antibody Library" (Knappik, A. et al. J Mol Biol (2000) 296(1):57 a 86).

[0025] O termo "CDR" se refere à região determinante de complementaridade ou aos resíduos de aminoácido da região hipervariável de um anticorpo que participam ou que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A região hipervariável ou CDRs do subtipo de IgG humana de anticorpo compreendem resíduos de aminoácidos a partir dos resíduos 24 a 34 (L1), 50 a 56 (L2) e 89 a 97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31 a 35 (H1), 50 a 65 (H2) e 95 a 102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada, conforme descrito por Kabat et al. (1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edição. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) e/ou aqueles resíduos a partir de um laço hipervariável (isto é, resíduos 26 a 32 (L1), 50 a 52 (L2) e 91 a 96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26 a 32 (H1), 53 a 55 (H2) ou a definição de Chothia para H2 de 52 a 57, e 96 a 101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada, conforme descrito por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901 a 917 (1987)).

[0026] A estrutura ou resíduos de FR1-4 são aqueles resíduos de domínio variável diferentes de e que inclui as regiões hipervariáveis. Mais recentemente, um sistema de numeração universal tem sido desenvolvido e amplamente adotado, o international ImMunoGeneTics information system® (IMGT) (LaFranc, et al. 2005. Nucl Acids Res. 33:D593 a D597).

[0027] Na presente invenção, as CDRs são referidas em termos da sequência de aminoácidos e do local dentro da cadeia leve ou pesada por uma numeração sequencial. Como o "local" das CDRs dentro da estrutura do domínio variável da imunoglobulina é conservado entre as espécies e apresenta estruturas chamadas alças, pelo uso de dos sistemas de numeração que alinham as sequências do domínio variável de acordo com as características estruturais, resíduos de CDR e estruturais são facilmente identificados. Estas informações são usadas em enxertia e substituição resíduos de CDR a partir de imunoglobuli- nas de uma espécie para uma estrutura receptora tipicamente de um anticorpo humano.

[0028] O termo "CD27" refere-se à superfamília do receptor de TNF humano (TNFSF27), o produto do gene humano 939 (gene de CD27), também chamado de receptor de CD27L humano, MGC20393, S152, T14, CD27 de antígeno de ativação de células T e incluem todas as variantes, isoformas e homólogos de espécie de CD27. O CD27 humana expresso (no. de acesso de NCBI NP_001233) é um polipeptídeo de 260 aminoácidos de comprimento com um sinal de secreção de aminoácido 20 na terminação N. Consequentemente, os anticorpos da invenção podem, em determinados casos, ter reação cruzada comCD27 a partir de espécies diferentes do ser humano. Em outros casos, os anticorpos podem ser completamente específicos pa- raCD27 humana e não exibem espécies ou outros tipos de reatividade cruzada. O termo atividades biológicas de CD27 se refere a quaisquer atividades a jusante que resultam a partir da ativação e/ou ligação de receptor de CD27 como consequência da ativação de CD27 por um ou mais ligantes, especificamente polipeptídeos de CD70 (TNFSF7, NP_ 001243), ou outros ligantes, tais como SIVA. CD27 transduz sinais que conduzem à ativação de NF-K--β e MAPK8/JNK. As proteínas adaptadoras TRAF2 e TRAF5 têm sido mostradas mediar o processo de sinalização desse receptor. As atividades biológicas de CD27 podem também resultar a partir da ligação de determinadas formas truncadas de CD27 ou fragmentos deCD27 a ligantes que por si mesmos exibem atividades biológicas, por exemplo, um polipeptídeo que compreende de cerca de resíduos 21 a 191 da proteína de comprimento total pode se ligar a CD70. A cauda citoplasmática de antígeno de CD27, resíduos 213 a 260, se liga à terminação N da proteína SIVA (também conhecido como o fator de indução de apoptose: CD27BP; SIVA1, Siva- 1, NP_006418 (175 aa)); e Siva-2, SIVA2, NP_068355 (110 aa).

[0029] O termo "epitopo" significa um determinante de proteína capaz de se ligar especificamente a um anticorpo. Os epitopos normalmente consistem em agrupamentos de superfície quimicamente ativos como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e têm usualmente características estruturais tridimensionais específicas, assim como características de carga específicas. Os epitopos conformacio- nais e não conformacionais são distinguidos pelo fato de que a ligação aos primeiros, mas não aos citados por último, é perdida na presença de solventes de desnaturação.

[0030] A "humanização" (também chamada de reconformação ou enxerto de CDR) ou "engenharia" inclui técnicas estabelecidas para a redução da imunogenicidade de anticorpos monoclonais (mAbs) a partir de fontes xenogênicas (comumente roedor) e para o aperfeiçoamento da afinidade ou das funções efetoras (ADCC, ativação de complemento, ligação de C1q). O mAb projetado pode ser produzido com o uso das técnicas de biologia molecular, com o uso de sequências selecionadas aleatoriamente exibidas por fago, ou sintetizado de novo. Por exemplo, a fim de construir um anticorpo humanizado com regiões CDR incorporadas a partir de uma espécie não humana, o projeto poderia incluir variações, tais como substituições de aminoácido conser- vativas em resíduos das CDRs, e substituição reversa de resíduos a partir do mAb não humano nas regiões de estrutura humana (retromu- tações). As posições podem ser discernidas ou identificadas por métodos de comparação de sequência, análise de sequências consenso ou análise estrutural da estrutura 3D das regiões variáveis. Os programas de computador estão disponíveis, sendo que os mesmos ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção dessas visualizações permite a análise da função provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobina candidata, isto é, a análise de resíduos que influencia a habilidade da imunoglobina candidata de ligar seu antígeno. Dessa maneira ou por algoritmos de alinhamento de sequências simples (por exemplo, Clustal W), os resíduos de FR (estrutura) podem ser selecionadas a partir de sequências de anticorpos conhecidas, encontradas em tais bancos de dados publicamente acessível como VBASE ou Kabat, e as sequências con-senso otimizadas de modo que a característica de anticorpo desejada, tal como afinidade com o(s) antígeno(s) alvo, seja alcançada. À medida que os conjuntos de dados de parâmetros conhecidos para estruturas de anticorpo aumentam, a sofisticação e refinamento dessas técnicas também aumentam. Outra abordagem para a humanização consiste em modificar somente os resíduos de superfície da sequência do roedor com os resíduos mais comuns encontrados em mAbs humano e tem sido chamada de "recobrimento" ou "inativação". Um grande número tanto de sequências de lg humana como não humana é agora conhecido e livremente disponível e usado pelos versados na técnica, por exemplo, o banco de dados e ferramentas desenvolvidas por Le- Franc et al, encontrados sob o nome IMGT; sites da web em custódia pelo U.S. National Center for Biologics (NCBI); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983), agora também muito expandidos e disponíveis online, cada um incorporado ao presente documento em sua totalidade, a título de referência. A humanização ou engenharia de anticorpos da presente invenção pode ser executada com o uso de qualquer método conhecido ou aqueles desenvolvidos com o uso de informações de sequência de imunoglo- bulina humana. Tais métodos são mostrados, por exemplo, na patente no. U.S. 6982361 de Winter e documento no. W003/025019 de Bowdish et al., cujos conteúdos estão incorporados ao presente documento a título de referência.

[0031] Como usado aqui, KD se refere à constante de dissociação, especificamente, a KD do anticorpo para um antígeno predeterminado, e é uma medida da afinidade do anticorpo por um alvo específico. 0s anticorpos de alta afinidade têm uma KD de 10-8 M ou menos, com mais preferência, 10-9 M ou menos e com mais preferência ainda 10-10 M ou menos, para um antígeno predeterminado. A recíproca da KD é KA, a constante de associação. 0 termo "kdis" ou "<2" ou "kd" como usado aqui, tem por objetivo se referir à taxa de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno específica. A "KD" é a razão entre a taxa de dissociação (<2), também chamada de "taxa de dissociação (kdissocia- ção) " e a taxa da taxa de associação (<1) ou "taxa de associação (kasso- ciação)". Desta forma, KD é igual a <2/<1 ou kdissociação / kassociação e é expressa como uma concentração molar (M). Conclui-se que quanto menor a KD, mais forte é a ligação. Desta forma, uma KD de 10-6 M (ou 1 microM) indica ligação fraca em comparação a 10-9 M (ou 1 nM). Esses valores podem ser calculados com o uso de ressonância de plasmon de superfície e/ou o método Kinexa conforme conhecido na técnica.

[0032] 0s termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal", como usado aqui, referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal apresenta uma especificidade de ligação única e afinidade por um epitopo particular. 0 termo inclui também "anticorpo recombinante" e "anticorpo monoclonal recombinante" já que todos os anticorpos são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, como (a) anticorpos isolados de um animal ou um hibridoma preparado pela fusão do células do animal que secretam anticorpo e um parceiro de fusão, (b) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, por exemplo, a partir de um transfectoma, (c) anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpo recombinante, humana combinatória ou de outras espécies e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvem emenda de sequências de genes de imunoglobulina a outras sequências de DNA. Um "anticorpo isolado", como usado aqui, tem por objetivo se referir a um anticorpo que é substancialmente isento de outros anticorpos que têm diferentes especificidades antigênicas. Um anticorpo isolado que se liga especificamente a um epitopo, isoforma ou variante de CD27 humana pode ter, no entanto, reatividade cruzada a outros antígenos relacionados, por exemplo, a partir de outras espécies (por exemplo, CD27 de homólogos de espécie). Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente isento de outro material celular e/ou produto químico. Em uma modalidade da invenção, vários anticorpos mono- clonais "isolados" que têm diferentes especificidades são combinados em uma composição bem definida.

[0033] Como usado aqui, "ligação específica" ou "ligação imuno- específica" e "se liga imunoespecificamente" se referem à ligação do anticorpo a um antígeno predeterminado. Tipicamente, o anticorpo se liga com uma constante de dissociação (KD) de 10-7 M ou menos, e se liga ao antígeno pré-determinado com uma KD que é de pelo menos duas vezes menor do que sua KD para ligar a um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseína, ou qualquer outro polipeptídeo específico) além do antígeno pré-determinado. As expressões "um anticorpo que reconhece um antígeno" e "um anticorpo específico para um antígeno" são usadas de maneira intercambiável na presente invenção com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antíge- no". Como usado aqui, ligação "altamente específica" significa que a KD relativa do anticorpo para o epitopo alvo específico é pelo menos 10 vezes menor que a KD para a ligação daquele anticorpo a outros ligantes.

[0034] Como usado aqui, "isótipo" se refere à classe do anticorpo (por exemplo, IgM ou IgG) que é codificada pelos genes da região constante da cadeia pesada. Algumas classes de anticorpo abrangem adicionalmente as subclasses que também são codificadas pelas regiões constantes de cadeia pesada e adicionalmente decoradas por oli- gossacarídeos em resíduos específicos dentro dos domínios de região constante (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) que conferem, adicionalmente, funções biológicas para o anticorpo. Por exemplo, os isó- tipos de anticorpo humano IgG1, IgG3 e, em uma menor proporção, IgG2 exibem funções efetoras como as dos anticorpos IgG2a murinos.

[0035] Por funções "efetoras" ou "positivo para o efetor" entende- se que o anticorpo compreende domínios distintos dos domínios de ligação ao antígeno específicos capazes de interagir com receptores ou outros componentes do sangue como o complemento, levando, por exemplo, ao recrutamento de macrófagos e eventos que levam à destruição de células ligadas por domínios de ligação ao antígeno do anticorpo. Os anticorpos possuem várias funções efetoras mediadas pela ligação de moléculas efetoras. Por exemplo, a ligação do componente C1 do complemento aos anticorpos ativa o sistema complemento. A ativação do complemento é importante na opsonização e lise de pató- genos. A ativação do complemento estimula a resposta inflamatória e pode também estar envolvida na hipersensibilidade autoimune. Adicionalmente, os anticorpos ligam-se às células através da região Fc, com um receptor Fc sobre a região Fc do anticorpo que se liga a um receptor Fc (FcR) sobre uma célula. Há diversos receptores Fc que são específicos para diferentes classes de anticorpo, incluindo IgG (recepto- res gama), IgE (receptores eta), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu). A ligação do anticorpo aos receptores Fc sobre as superfícies celulares desencadeiam inúmeras respostas biológicas importantes e diversas incluindo o engolfamento e destruição de partículas revestidas por anticorpo, depuração de complexos imunes, lise de células- alvo revestidas por anticorpo por células exterminadoras (a chamada citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo, ou ADCC), liberação de mediadores inflamatórios, transferência placentá- ria e controle da produção de imunoglobulina.

Composição de um anticorpo da invenção

[0036] Um anticorpo neutralizante de CD27 da invenção é um anticorpo que inibe, bloqueia ou interfere com pelo menos uma atividade de CD27 ou ligação de CD70, in vitro, in situ e/ou in vivo e não promove, estimula, induz ou agoniza a atividade de CD27 ou ligação de li- gante nem a ligação de anticorpo imita os efeitos a jusante de ligação de ligante de CD27, em particular, interação de CD70 com CD27, tal como transdução de sinal em uma célula hospedeira. Um anticorpo neutralizante de CD27 adequado, parte especificada ou variante também pode, opcionalmente, afetar pelo menos uma função ou atividade de CD27, tal como, porém sem limitação, síntese de proteína, RNA ou DNA, liberação de proteína, ativação de células T, diferenciação ou proliferação de célula B, secreção de anticorpo, sinalização de receptor de CD27, clivagem de CD27, ligação de ligante de CD27, secreção, síntese ou indução de CD27 ou CD70.

[0037] Em relação à atividade de bloqueio de via de coestimulação de CD27:CD70 dos anticorpos neutralizantes de CD27 da presente invenção, a tratamento de distúrbios autoimunes com funções efetoras de célula T ou B elevadas pode ser benéfico.

[0038] A presente invenção é com base na descoberta de anticorpos monoclonais anti-CD27 humana capazes de inibir a ativação de CD27 por CD70 e incapaz de autoativação de CD27 na ausência de estímulo de CD70. Os hibridomas e transfectomas capazes de secretar tal anticorpo foram gerados. Um ensaio de receptor de NF-kβ foi usado para identificar vários anticorpos candidatos capazes de inibir a ativação de repórter de NF-kβ mediada por CD70 de células hospedeiras que expressam CD27. Em segundo lugar, os anticorpos foram caracterizados como sendo incapazes de induzir a atividade agonista dose-dependente quando incubados com células transfectadas com repórter de luciferase acoplado a CD27 na ausência de estímulo de CD70. Em terceiro lugar, foi demonstrado que os anticorpos de maneira dependente de dose inibem a proliferação de célula T CD4 virgem humana dependente de CD70. Em quarto lugar, os anticorpos neutra- lizantes de CD27 gerados são capazes de reduzir a estimulação mediada por CD70 da geração de célula de plasma a partir de células B primárias humanas de uma maneira dependente de dose. Em quinto lugar, nenhuma atividade agonista dose-dependente significante foi observada em células T ou B primárias com os anticorpos anti-CD27 testados.

[0039] Os anticorpos da invenção podem interferir com a ligação de CD27:CD70, inibir tanto as funções efetoras de célula T como a diferenciação de célula B a células de plasma em cultura celular e, dessa forma, podem ser benéficos para o tratamento de doenças mediadas pelo sistema imune que inclui, porém sem limitação, artrite reuma- toide, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose múltipla, doença inflamatória intestinal, doença de Crohn, doença pulmonar obstrutiva crônica ou outra síndrome, patologia, doença ou distúrbio relacionado às funções anormais ou ativação de populações de células que expressam CD27. Os anticorpos de ligação de CD27 descritos no presente documento reconhecem pelo menos três regiões distintas no domínio ex- tracelular de CD27 humana, que indica a descoberta adicional de múl tiplos sítios em CD27 adequados para o direcionamento de anticorpos ou outros compostos com capacidades de bloqueio de função similares. Dessa forma, a expressão e purificação dos domínios de ligação de anticorpo fornecidos no presente documento como sequências de aminoácido fornecem, adicionalmente, uma ferramenta que pode ser o meio para a seleção de moléculas inovadoras que exibem atividade neutralizante de CD27.

[0040] Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD27 humana, tem uma região de ligação que compreende uma região variável de cadeia leve (VL) ou variável de cadeia pesada (VH) que tem a sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 76 a 144 e que anticorpo ou porção de ligação do mesmo se liga de maneira imunoespe- cífica a CD27. Em outra modalidade da invenção, o anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo se liga à proteína CD27 e, além disso, os anticorpos possuem propriedades funcionais especificadas de anticorpos da invenção, tais como: ligação a CD27 humana imobilizado;inibição de ligação de CD27 solúvel humano a células que expressam CD70; inibição de sinalização de CD27 mediada por CD70 humano medida pelo ensaio de gene repórter NF-kappaB em um IC50 de menos do que 0,5 ug/ml; inibição de proliferação mediada por CD70 de células T virgens; inibição de formação de plasmoblasto mediada por CD70 a partir de células B humanas primárias; inibição de liberação de mediador solúvel mediada por CD70 humano a partir de linhas de célula ou células primárias T e B; ligação a CD27 humana com Kd menor que 100 nM (10[7 M); ativação mínima de sinalização de CD27 na ausência de estímulo de CD70; e ligação a um epitopo no domínio extracelular CD27 humana ao qual os Mabs que tem uma ou mais dentre as sequências de região variável de SEQ ID NOS: 76 a 144 se ligam e compete pela ligação com os Mabs identificados que têm uma ou mais dentre as sequências de região variável de SEQ ID NOS: 76 a 144.

[0041] Uma vez que é bem conhecido na técnica que os domínios de CDR de cadeias pesada e leve do anticorpo desempenham um papel particularmente importante na especificidade/afinidade de ligação de um anticorpo para um antígeno, os anticorpos recombinantes da invenção revelados no presente documento compreendem, de preferência, uma ou mais dentre as CDRs de cadeia pesada e leve de SEQ ID NOS: 1 a 75. Tais anticorpos podem ser preparados através da união química de várias porções (por exemplo, CDRs, estrutura) do anticorpo com o uso de técnicas convencionais, através do preparo e da expressão de uma (isto é, uma ou mais) molécula de ácido nucleico que codifica o anticorpo com o uso de técnicas convencionais de tec-nologia de DNA recombinante ou através do uso de qualquer outro método adequado.

[0042] Em uma modalidade, os anticorpos humanos da invenção têm a sequência de uma ou mais dentre as CDRs de cadeia pesada e leve de SEQ ID NOS: 1 a 75. Em adição a essas sequências de CDR, o elemento versado na técnica irá observar que algum desvio das sequências de CDR exatas pode ser possível ou desejável, enquanto que ainda mantém a capacidade do anticorpo de se ligar a CD27 (por exemplo, substituições conservativas). Consequentemente, em outra modalidade, o anticorpo humano pode ser composto de uma ou mais CDRs que têm, por exemplo, 90%, 95%, 98% ou 99,5% de identidade com as CDRs mencionados em SEQ ID NOs: 1 a 75.

[0043] Em outra modalidade, o epitopo ligado pelos anticorpos da invenção, que compreende somente cinco a todos os resíduos 21 a 191 da proteína CD27 ou uma sequência de codificação de ácido nu- cleico para a mesma, pode ser usado para imunizar um indivíduo, a fim de produzir os anticorpos da invenção diretamente no hospedeiro com o propósito de tratar, prevenir ou aliviar a doença ou sintomas da doença associada à produção de CD27.

2. Geração de anticorpos neutralizantes de CD27

[0044] Um anticorpo neutralizante de CD27que exibe espectro de bioatividade desejado, conforme exemplificado no presente documento pelos anticorpos apresentados e descritos, pode ser gerado por uma variedade de técnicas, que incluem a técnica de hibridização de célula somática padrão (método de hibridoma) de Kohler e Milstein (1975) Nature 256:495. No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro adequado, como um hamster ou macaco, é imunizado conforme descrito na presente invenção para gerar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente à proteína usada para imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos então são fundidos com células de mieloma usando um agente de fusão adequado, como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, anticorpos monoclonais: Principles e Practice, páginas 59 a 103 (Academic Press, 1986)).

[0045] Um anticorpo neutralizante de CD27 também pode ser opcionalmente gerado pela imunização de um animal transgênico (por exemplo, camundongo, rato, hamster, primata não humano, e similares) capazes de produzir um repertório de anticorpos humanos, conforme descrito na presente invenção e/ou conforme conhecido na técnica. As células que produzem um anticorpo anti-CD27 humana pode ser isolado de tais animais e imortalizados com o uso de métodos adequados, tais como os métodos descritos no presente documento. Alternativamente, as sequências codificantes do anticorpo podem ser clonadas, introduzidas em um vetor adequado, e usadas para transfec- tar uma célula hospedeira para expressão e isolamento do anticorpo pelos métodos ensinados aqui e pelos conhecidos na técnica.

[0046] O uso de camundongos transgênicos que carregam locais de imunoglobulina humana (lg) em sua configuração de linha germina- tiva fornece o isolamento de anticorpos monoclonais completamente humanos de alta afinidade direcionados contra uma variedade de alvos, que incluem autoantígenos humanos para quais o sistema imune humano normal é tolerante (Lonberg, N. et al., US5569825, US6300129 e 1994, Nature 368:856 a 859; Green, L. et al., 1994, Nature Genet. 7:13 a 21; Green, L. & Jakobovits, 1998, Exp. Med. 188:483 a 495; Lonberg, N e Huszar, D., 1995, Int. Rev. Immunol. 13:65 a 93; Kucherlapati, et al. US6713610; Bruggemann, M. et al., 1991, Eur. J. Immunol. 21:1323 a 1326; Fishwild, D. et al., 1996, Nat. Biotechnol. 14:845 a 851; Mendez, M. et al., 1997, Nat. Genet. 15:146 a 156; Green, L., 1999, J. Immunol. Methods 231:11 a 23; Yang, X. et al., 1999, Cancer Res. 59:1236 a 1243; Brüggemann, M. e Taussig, M J., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455 a 458, 1997; Tomizuka et al. WO02043478). Os locais de imunoglobulina endógena em tais camundongos podem ser interrompidos ou removidos para eliminar a capacidade do animal de produzir anticorpos codificados pelos genes endógenos. Além disso, empresas como Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.) e Medarex (San Jose, Calif.) podem ser contratadas para fornecer anticorpos humanos direcionados contra um antígeno selecionado com o uso da tecnologia descrita acima.

[0047] Em outra modalidade, o anticorpo humano é selecionadas a partir de uma biblioteca de fago, em que o fago compreende genes de imunoglobulina humana e a biblioteca expressa domínios de ligação de anticorpo humano como, por exemplo, anticorpos de cadeia única (scFv), como Fabs, ou alguma outra construção que exibe regiões variáveis de anticorpo pareadas ou não pareadas (Vaughan et lo al. Nature Biotechnology 14:309 a 314 (1996): Sheets et al. PITAS (USA) 95:6157 a 6162 (1998)); Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al. J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Os anticorpos mo- noclonais humanos da invenção também podem ser preparados com o uso de métodos de apresentação em fago para seleção de bibliotecas de genes de imunoglobulina humana. Tais métodos de apresentação em fago para isolar anticorpos humanos são estabelecidos na técnica. Consulte, por exemplo: patentes U.S. n°s 5.223.409; 5.403.484; e 5.571.698 por Ladner et al.; patentes U.S. n°s 5.427.908 e 5.580.717 por Dower et al.; patentes U.S. n°s 5.969.108 e 6.172.197 por McCafferty et al.; e patentes U.S. n°s 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 e 6.593.081 por Griffiths et al.

[0048] A preparação de antígenos imunogênicos e a produção de anticorpo monoclonal pode ser executada com o uso de qualquer técnica adequada, tal como produção de proteína recombinante. Os antí- genos imunogênicos podem ser administrados a um animal sob a forma de proteína purificada, ou misturas de proteína que incluem células completas ou extratos de tecido ou célula, ou o antígeno pode ser formado de novo no corpo do animal a partir de ácidos nucleicos que codificam o dito antígeno ou uma parte do mesmo.

[0049] Os ácidos nucleicos isolados da presente invenção podem ser feitos com o uso de (a) métodos recombinantes, (b) técnicas sintéticas, (c) técnicas de purificação, ou combinações dos mesmos, conforme bem conhecido na técnica. O DNA que codifica os anticorpos monoclonais é prontamente isolado e sequenciado com o uso de métodos conhecidos na técnica (por exemplo, com o uso de sondas de oligonucleotídeo que são capazes de ligar-se especificamente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos murinos). Quando um hibridoma é produzido, estas células podem servir como uma fonte deste DNA. Alternativamente, com o uso de técnicas de apresentação nas quais a sequência codificante e o produto de tradução são ligados, como bibliotecas de apresentação em fagos ou ribos- somais, a seleção do ligante e do ácido nucleico é simplificada. Após a seleção em fago, as regiões codificantes do anticorpo do fago podem ser isoladas e usadas para gerar anticorpos inteiros, incluindo anticorpos humanos, ou qualquer outro fragmento de ligação ao antígeno desejado, e expressas em qualquer hospedeiro desejado, incluindo células de mamífero, células de inseto, células de planta, levedura, e bac-térias.

Anticorpos humanizados

[0050] A invenção fornece adicionalmente imunoglobulinas (ou anticorpos) humanizadas (projetadas ou adaptadas ao ser humano) que ligam CD27 humana. As formas humanizadas de imunoglobulinas têm região(ões) de estrutura variável(is) substancialmente a partir de uma imunoglobulina humana (chamada de uma imunoglobulina aceitadora) e CDRs substancialmente a partir de um Mab não humano que liga especificamente CD27. As regiões constantes, se presentes, também são substancialmente de uma imunoglobulina humana. Os anticorpos humanizados exibem KD para CD27 de pelo menos cerca de 10-6 M (1 microM), cerca de 10-7 M (100 nM), ou menos. A afinidade de ligação dos anticorpos humanizados pode ser maior ou menor do que a do anticorpo de camundongo a partir do qual os mesmos foram deriva-dos. Para efetuar uma mudança em afinidade, por exemplo, aperfeiçoar a afinidade, do anticorpo humanizado para CD27, podem ser feitas substituições nos resíduos de CDR ou nos resíduos humanos.

[0051] A substituição de CDRs de camundongo em uma estrutura de domínio variável humano mais provavelmente resultará na retenção de sua orientação espacial correta se a estrutura do domínio variável humano adotar uma conformação igual ou similar à estrutura variável de camundongo a partir da qual as CDRs se originaram. Isso é alcançado obtendo-se os domínios variáveis humanos a partir de anticorpos humanos, cujas sequências de estrutura exibem um alto grau de identidade de sequência com os domínios de estrutura variáveis murinos a partir dos quais as CDRs foram derivadas. As regiões de estrutura variáveis de cadeia pesada e leve podem ser derivadas de sequências de anticorpos humanos iguais ou diferentes. As sequências de anticorpos humanos podem ser as sequências de anticorpos humanos de ocorrência natural, podem ser derivadas de sequências de imunoglo- bulina de linhagem germinativa humana, ou podem ser sequências consenso de várias sequências de anticorpos humanos e/ou linhagem germinativa.

[0052] As sequências de anticorpos humanos adequadas são identificadas por comparações feitas em computador das sequências de aminoácidos das regiões variáveis de camundongo com as sequências de anticorpos humanos conhecidos. A comparação é feita separadamente para as cadeias pesada e leve, mas os princípios são similares para cada.

[0053] Em um exemplo, a sequência de aminoácidos de um mAb neutralizante de CD27 é usado para consultar um banco de dados de anticorpo humano compilado a partir de bancos de dados de sequência de anticorpos público. As regiões variáveis de cadeia pesada reveladas ou descritas no presente documento podem ser usadas para encontrar a região variável humana com a maior identidade de sequência. A região variável da cadeia leve revelada ou descrita no presente documento pode ser, de modo similar, usada para encontrar a região variável humana com a maior identidade de sequência. Uma construção de DNA na qual as regiões que codificam as CDRs de uma dentre as regiões variáveis de cadeia pesada a partir do doador de Mab muri- no são transferidas para a sequência variável de cadeia pesada humana selecionada, substituindo-se as CDRs da região variável humana, é preparada para cada região variável murídea.

[0054] A justaposição não natural de regiões CDR murídeas com região de estrutura variável humana pode resultar em restrições con- formacionais não naturais, as quais, exceto quando corrigidas pela substituição de determinados resíduos de aminoácidos, conduzem a perda de afinidade de ligação. Conforme observado acima, os anticorpos humanizados da invenção compreendem região(ões) de estrutura variável(is) substancialmente a partir de uma imunoglobulina humana e CDRs substancialmente a partir de uma imunoglobulina de camundongo (por exemplo, anticorpos de camundongo C2177, C2186, C2191 ou C2192). Com as CDRs identificadas de anticorpos de camundongo e sequências de imunoglobulina aceitadora humana adequadas, a etapa seguinte consiste em determinar quais, se houver, resíduos a partir desses componentes deveriam ser substituídos para otimizar as propriedades do anticorpo humanizado resultante. Em geral, a substituição de resíduos de aminoácidos humanos por murino deveria ser minimizada, devido ao fato de que a introdução de resíduos murinos aumenta o risco de o anticorpo gerar uma resposta de HAMA em seres humanos. Os aminoácidos são selecionados para a substituição com base em sua possível influência sobre a conformação de CDR e/ou ligação ao antígeno. A investigação de tais possíveis influências pode ser feita por modelagem, exame das características dos aminoácidos em locais particulares ou observação empírica dos efeitos da substituição ou mutagênese de aminoácidos particulares. Com relação ao método empírico, descobriu-se ser particularmente conveniente criar uma biblioteca de sequências variantes que podem ser triadas para a atividade, afinidade de ligação ou especificidade deseja- da. Um formato para a criação de tal biblioteca de variantes é um vetor de apresentação em fago. Alternativamente, as variantes podem ser geradas com o uso de outros métodos para a variegação de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica os resíduos alvo dentro do domínio variável.

[0055] Outro método para determinar substituições adicionais são necessárias, e a seleção de resíduos de aminoácido para substituição, pode ser feito usando modelagem computadorizada. Hardware e software de computador para produzir imagens tridimensionais de moléculas de imunoglobulina são amplamente disponíveis. Em geral, os modelos moleculares são produzidos começando com estruturas solucionadas para as cadeias de imunoglobulina ou seus domínios. As cadeias a serem modeladas são comparadas para similaridade da sequência de aminoácidos com cadeias ou domínios de estruturas tridimensionais solucionadas e as cadeias ou domínios que mostram a maior similaridade de sequência são selecionadas como pontos de partida para a construção do modelo molecular. As estruturas iniciais solucionadas são modificadas para permitir diferenças entre os amino- ácidos reais nas cadeias ou domínios de imunoglobulina que estão sendo modelados, e aqueles na estrutura inicial. As estruturas modificadas são, então, montadas em uma imunoglobulina composta. Finalmente, o modelo é refinado por minimização de energia e pela verificação de que todos os átomos estão dentro de distâncias adequadas uns dos outros e que os comprimentos e ângulos da ligação estão dentro de limites quimicamente aceitáveis.

[0056] Usualmente, as regiões CDR em anticorpos humanizados são substancialmente idênticas, e de forma mais comum, idênticas às regiões CDR correspondentes no anticorpo de camundongo a partir do qual foram derivadas. Embora não desejável usualmente, às vezes é possível fazer uma ou mais substituições de aminoácido conservativas de resíduos de CDR sem afetar de maneira considerável a afinidade de ligação da imunoglobulina humanizada resultante. Ocasionalmente, as substituições de regiões CDR pode otimizar a afinidade de ligação.

[0057] Além das substituições de aminoácido específicas discutidas acima, as regiões de estrutura de imunoglobulinas humanizadas são, em geral, substancialmente idênticas, e, de forma mais comum, idênticas às regiões de estrutura dos anticorpos humanos a partir dos quais as mesmas foram derivadas. Certamente, muitos dos aminoáci- dos na região de estrutura têm pouca ou nenhuma contribuição direta para a especificidade ou afinidade de um anticorpo. Desta forma, muitas substituições conservativas individuais de resíduos de estrutura podem ser toleradas sem alteração considerável da especificidade ou afinidade da imunoglobulina humanizada resultante.

[0058] Devido à degeneração do código, uma variedade de sequências de ácidos nucleicos codificará cada sequência de aminoáci- dos de imunoglobulina. As sequências de ácidos nucleicos desejadas podem ser produzidas por síntese de DNA em fase sólida de novo ou por mutagênese de PCR de uma variante preparada anteriormente do polinucleotídeo desejado. Todos os ácidos nucleicos que codificam os anticorpos descritos neste pedido são expressamente incluídos na invenção.

[0059] Os segmentos variáveis dos anticorpos humanizados produzidos conforme descrito supra são tipicamente ligados a pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina humana. O anticorpo conterá ambas, a região constante da cadeia leve e a região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada inclui geralmente os domínios CH1, dobradiça, CH2, CH3 e, algumas vezes, CH4.

[0060] Os anticorpos humanizados podem compreender qualquer tipo de domínio constante a partir de qualquer classe de anticorpo, que inclui IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, e qualquer subclasse (isotipo), que inclui IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Quando se deseja que o anticorpo humanizado tenha atividade citotóxica, o domínio constante é geralmente um domínio constante de fixação de complemento e a classe é tipicamente IgGi. Quando esta atividade citotóxica não é desejável, o domínio constante pode ser da classe IgG2. O anticorpo humanizado pode compreender sequências de mais de uma classe ou isotipo.

[0061] Os ácidos nucleicos que codificam as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves humanizadas, opcionalmente ligadas a regiões constantes, são inseridos em vetores de expressão. As cadeias pesadas e leves podem ser clonadas no mesmo vetor de expressão ou em vetores de expressão diferentes. Os segmentos de DNA que codificam as cadeias de imunoglobulina são ligados de maneira funcional às sequências de controle no(s) vetor(es) de expressão que ga- rante(m) a expressão de polipeptídeos de imunoglobulina. Estas sequências de controle incluem uma sequência de sinal, um promotor, um intensificador, e uma sequência de terminação de transcrição (consulte Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86, 10029 (1989); WO 90/07861; Co et al., J. Immunol. 148, 1149 (1992), os quais estão aqui incorporados a título de referência em suas totalidades para múltiplas finalidades).

[0062] A eficácia de uma proteína terapêutica pode ser limitada por reações imunológicas indesejadas. Os anticorpos monoclonais não humano podem ter segmentos substanciais de sequências de aminoá- cidos lineares e conformações estruturais locais que podem produzir resposta imunológica em humanos. A primeira tentativa para reduzir a imunogenicidade de anticorpos não humanos foi a construção de anticorpos quimera humano-murino, a qual foi, então, seguida de métodos para a humanização desses quimeras no final dos anos 1980(análise em Almagro e Fransson, Front Biosci 13: 1619 a 1633, 2008).

[0063] Uma das abordagens de humanização usadas com mais frequência é o chamado "enxerto de regiões determinantes de complementaridade (CDR)", em que as CDRs murídeas são enxertadas em regiões de estrutura (FRs) de anticorpo humano. Entretanto, a aplicação desse método na maioria das vezes resulta em uma perda substancial de ligação a antígeno e, dessa forma, uma redução em potência do fármaco à base de anticorpo. Por conseguinte, é altamente valioso usar princípios do projeto de som para a criação de molécu-las de anticorpo que produzem mínimas reações imunogênicas enquanto retêm a ligação e os perfis biofísicos da molécula não humana original quando injetadas em seres humanos.

[0064] A humanização de 2177 e 2191, dois anticorpos monoclo- nais de camundongo (mAb) com especificidade de ligação a CD27 é descrita. As estruturas (FR) desses anticorpos foram substituídas por FRs de gene de linha germinativa humana com o uso da primeira etapa da tecnologia de humanização de propriedade de Janssen chamada de adaptação de estrutura humana (HFA - Human Framework Adaption) revelada no pedido de patente de Raghunathan, G., US20090118127 A1 e adicionalmente exemplificada em Fransson et al (J Mol Biol 398:214 a 231, 2010). Essa tecnologia possibilita um conjunto de mAbs específicos para CD27 com propriedades de inibição e ligação superiores àquelas medidas para os anticorpos de camundongo parentais 2177 e 2191.

3. Métodos de uso de um anticorpo anti-CD27

[0065] Conforme descrito em detalhes abaixo, a presente invenção demonstra que quatro anticorpos monoclonais isolados (C2177, C2186, C2191 e C2192) ligam três epitopos não sobrepostos em CD27 e exibem atividades de inibição de CD27 in vitro e/ou in vivo. Significativamente, a reatividade dos MAbs inclui a capacidade de bloquear de maneira dependente de dose a interação de CD27 com CD70, reduzir a sinalização de CD27 na presença de CD70, reduzir a produção de IL-4 e IFNg por células T e inibir a proliferação de célula T CD4+ virgem humana dependente de CD70, proliferação de célula B dependente de CD70 e geração de célula de plasma. Além disso, os anticorpos isolados não induzem significativamente a ativação de CD27 na ausência de estímulo de CD70.

[0066] Dadas as propriedades dos anticorpos monoclonais, conforme descrito na presente invenção, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos são adequados tanto como agentes terapêuticos como profiláticos para tratar ou prevenir condições associadas a CD27 em seres humanos e animais.

[0067] Em geral, o uso compreenderá administrar uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um ou mais anticorpos mono- clonais ou fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção ou um anticorpo ou molécula selecionada para ter espectros de ligação e atividades biológicas similares, a um indivíduo suscetível ou a um indivíduo que exibe uma condição na qual a atividade de CD27 é conhecida por ter sequelas patológicas, como distúrbios imunológicos ou crescimento tumoral e metástase. Uma forma ativa do anticorpo pode ser administrada, incluindo fragmentos Fab e F(ab')2.

[0068] De preferência, os anticorpos usados são compatíveis com as espécies receptoras, de modo que a resposta imune aos MAbs não resulte em uma meia-vida circulante inaceitavelmente curta ou induza uma resposta imune aos MAbs no indivíduo. Os MAbs administrados podem ter algumas funções secundárias como ligação aos receptores Fc do indivíduo e ativação dos mecanismos de ADCC de modo a de- pletar a população de células-alvo usando mecanismos citolíticos ou citotóxicos ou eles podem ser manipulados para serem limitados ou desprovidos destas funções efetoras secundárias de modo a preservar a população de células-alvo.

[0069] O tratamento dos indivíduos pode compreender a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos anticorpos da presente invenção. Os anticorpos podem ser fornecidos em um kit conforme descrito abaixo. Os anticorpos podem ser usados ou administrados como uma mistura, por exemplo, em quantidades iguais, ou individualmente, fornecidos em sequência, ou administrados de uma só vez. Fornecendo-se a um paciente os anticorpos, ou fragmentos dos mesmos, capazes de se ligar a CD27, ou um anticorpo capaz de proteger contra CD27 em um paciente receptor, a dosagem do agente administrado irá variar dependendo de fatores como a idade, peso, altura, sexo, condição médica geral, histórico médico anterior do paciente, etc.

[0070] Em uma abordagem similar, outro uso terapêutico dos anticorpos monoclonais da presente invenção é a imunização ativa de um paciente com o uso de um anticorpo anti-idiotípico gerado contra um dos presentes anticorpos monoclonais. A imunização com um anti- idiotipo que imita a estrutura do epitopo poderia gerar uma resposta anti-CD27 ativa (Linthicum, D. S. e Farid, N. R., Anti-idiotypes, Receptors, and Molecular Mimicry (1988), páginas 1 a 5 e 285 a 300).

[0071] De modo semelhante, a imunização ativa pode ser induzida pela administração de um ou mais epitopos antigênicos e/ou imunogê- nicos como um componente de uma vacina. A vacinação poderia ser realizada oralmente ou parenteralmente em quantidades suficientes para permitir que o receptor gere anticorpos protetores contra esta região biologicamente funcional, profilaticamente ou terapeuticamente. O hospedeiro pode ser imunizado ativamente com o peptídeo antigêni- co/imunogênico na forma pura, um fragmento do peptídeo, ou uma forma modificada do peptídeo. Um ou mais aminoácidos, que não correspondem à sequência de proteína original, podem ser adicionados à terminação amino ou carboxila do peptídeo original, ou forma truncado do peptídeo. Estes aminoácidos adicionais são úteis para acoplar o peptídeo a outro peptídeo, a uma proteína carreadora maior, ou a um suporte. Os aminoácidos que são úteis para estes propósitos incluem: tirosina, lisina, ácido glutâmico, ácido aspártico, cisteína e derivados dos mesmos. Técnicas de modificação de proteína alternativas podem ser usadas, por exemplo, acetilação de NH2 ou amidação COOH- terminal, para fornecer meios adicionais para acoplar ou fundir o pep- tídeo a outra proteína ou molécula de peptídeo ou a um suporte.

[0072] Os anticorpos capazes de proteger contra a bioatividade de CD27 indesejada se destinam a ser fornecidos aos indivíduos receptores em uma quantidade suficiente para efetuar uma redução, resolução ou melhora no sintoma ou patologia relacionada a CD27. Uma quantidade é dita suficiente ou uma "quantidade terapeuticamente eficaz" para "efetuar" a redução dos sintomas se a dosagem, via de administração e etc., do agente forem suficientes para influenciar tal resposta. As respostas à administração do anticorpo podem ser medidas pela análise dos tecidos, órgãos, ou células afetadas do indivíduo, como por exemplo, por técnicas de formação de imagens ou por análise ex vivo de amostras de tecido. Um agente é fisiologicamente significativo, caso sua presença resulte em uma alteração detectável na fisiologia de um paciente receptor.

Aplicações terapêuticas

[0073] Os anticorpos neutralizantes de CD27 da presente invenção, fragmentos de ligação ao antígeno, ou variantes especificadas dos mesmos, podem ser usados para medir ou causar efeitos em uma célula, tecido, órgão ou animal (que inclui mamíferos e seres humanos), para diagnosticar, monitorar, modular, tratar, aliviar, ajudar a evitar a incidência de ou reduzir os sintomas de, uma condição mediada, afetada ou modulada por CD27 ou células que expressam CD27. Desta forma, a presente invenção fornece um método para modular ou tra- tar pelo menos uma doença relacionada a CD27 em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente, conforme conhecido na técnica ou conforme descrito no presente documento, com o uso de pelo menos um anticorpo de CD27da presente invenção. As indicações específicas são discutidas abaixo.

Doença relacionada ao sistema imune

[0074] A presente invenção fornece, adicionalmente, um método para modular ou tratar uma doença inflamatória relacionada ao sistema imune, em uma célula, tecido, órgão, animal, ou paciente, que inclui, porém sem limitação, artrite reumatoide, artrite reumatoide juvenil, artrite reumatoide juvenil de início sistêmico, artrite psoriática, espondilite anquilosante, úlcera gástrica, artropatias soronegativas, osteoartrite, doença inflamatória intestinal, colite ulcerativa, lúpus eri- tematoso sistêmico, síndrome antifosfolipídio, iridociclite/uveíte/neurite ótica; fibrose pulmonar idiopática, vasculite sistêmica/granulomatose de Wegener, sarcoidose, orqueite/procedimentos reversos de vasec- tomia, doenças alérgicas/atópicas, asma, rinite alérgica, dermatite de contato alérgica, conjuntivite alérgica, pneumonia por hipersensibilida- de, transplantes, rejeição de transplante de órgãos, doença enxerto- versus-hospedeiro, síndrome de resposta inflamatória sistêmica, sín- drome séptica; sepse gram-positiva, sepse gram-negativa, sepse com cultura negativa, sepse fúngica, febre neutropênica, urosepse, menin- gococcemia, trauma/hemorragia, queimaduras, exposição à radiação ionizante, pancreatite aguda, síndrome do desconforto respiratório em adultos, artrite reumatoide, hepatite induzida por álcool, patologias inflamatórias crônicas, sarcoidose, doença de Crohn, anemia falciforme, diabetes, nefrose, doenças atópicas, reações de hipersensibilidade, rinite alérgica, febre do feno, rinite perene, conjuntivite, endometriose, asma, urticária, anafilaxia sistêmica, dermatite, anemia perniciosa, doença hemolítica, trombocitopenia, rejeição de enxerto de qualquer ór gão ou tecido, rejeição ao transplante renal, rejeição ao transplante cardíaco, rejeição ao transplante de fígado, rejeição ao transplante de pâncreas, rejeição ao transplante de pulmão, rejeição ao transplante de medula óssea (BMT), rejeição a aloenxerto de pele, rejeição ao transplante de cartilagem, rejeição a enxerto ósseo, rejeição ao transplante de intestino delgado, rejeição ao implante de timo fetal, rejeição ao transplante de paratireoide, rejeição a xenoenxerto de qualquer órgão ou tecidos, rejeição a aloenxerto, reações de hipersensibilidade antirreceptor, doença de Graves, doença de Raynoud, diabetes resistente à insulina tipo B, asma, miastenia grave, citotoxicidade mediada por anticorpo, reações de hipersensibilidade do tipo III, lúpus eritema- toso sistêmico, síndrome de POEMS (síndrome de polineuropatia, or- ganomegalia, endocrinopatia, gamopatia monoclonal e síndrome de mudanças de pele), síndrome antifosfolipídio, pênfigo, esclerodermia, doença de tecido conjuntivo mista, doença de Addison idiopática, diabetes mellitus, hepatite crônica ativa, cirrose biliar primária, vitiligo, vasculite, síndrome de cardiotomia pós-IM, hipersensibilidade do tipo IV, dermatite de contato, pneumonia por hipersensibilidade, rejeição de aloenxerto, granulomas causados por organismos intracelulares, sensibilidade metabólica ou idiopática a fármacos, doença de Wilson, he- mocromatose, deficiência de alfa-1-antitripsina, retinopatia diabética, tiroidite de Hashimoto, osteoporose, avaliação do eixo hipotalâmico- hipófise-adrenal, cirrose biliar primária, tiroidite, encefalomielite, caquexia, fibrose cística, doença pulmonar crônica neonatal, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), linfo-histiocitose hematofagocíti- ca familiar, condições dermatológicas, psoríase, alopécia, síndrome nefrótica, nefrite, nefrite glomerular, insuficiência renal aguda, hemodiálise, uremia, toxicidade, pré-eclâmpsia, terapia de OKT3, inflamação causada por terapia anti-CD3, terapia com citocinas, quimioterapia, terapia com radiação (por exemplo, que inclui, porém se limitação, as- tenia, anemia, caquexia, e similares), intoxicação por salicilato crônica, e similares.

Doença pulmonar

[0075] A presente invenção também fornece um método para modular ou tratar uma doença pulmonar ou pleural em uma célula, tecido, órgão ou paciente, que inclui, porém sem limitação, modular a resposta imune a processos celulares secundários ou associados que envolvem CD27 em, por exemplo, pneumonia; abscesso nos pulmões; doenças pulmonares ocupacionais causadas por agentes na forma de poeiras, gases ou névoas; asma, bronquiolite fibrosa obliterante, insuficiência respiratória, doenças de hipersensibilidade dos pulmões que incluem pneumonite por hipersensibilidade (alveolite alérgica extrínseca), aspergiliose broncopulmonar alérgica e reações a fármacos; sín- drome do desconforto respiratório em adultos (ARDS), síndrome de Goodpasture, doenças obstrutivas crônicas das vias respiratórias (COPD), doenças pulmonares intersticiais idiopáticas, tais como fibrose pulmonar idiopática, sarcoidose, pneumonia intersticial descaman- te, pneumonia intersticial aguda, doença pulmonar intersticial associada à bronquiolite respiratória, bronquiolite idiopática obliterante com pneumonia organizante, pneumonite intersticial linfocítica, granuloma- tose de célula de Langerhans, hemosiderose pulmonar idiopática; bronquite aguda, proteinose alveolar pulmonar, bronquiectasia, distúrbios pleurais, atelectasia, fibrose cística, e tumores dos pulmões, e embolia pulmonar.

Doença maligna

[0076] A presente invenção também fornece um método para modular ou tratar uma doença maligna em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente, que inclui, porém sem limitação, modular a resposta imune a processos celulares secundários ou associados que envolvem CD27 em, por exemplo, pelo menos um dentre: leucemia, leuce- mia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL), célula B, célula T ou FAB ALL, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mielocítica crônica (CML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia das células pilo- sas, síndrome mielodisplásica (MDS), um linfoma, doença de Hodgkin, um linfoma maligno, linfoma não Hodgkin, linfoma de Burkitt, mieloma múltiplo, tumores sólidos como doença primária ou como doença me- tastática, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorrectal, carcinoma pan- creático, carcinoma de célula renal, câncer dos pulmões que incluem mesotelioma, câncer de mama, carcinoma nasofaríngeo, histiocitose maligna, síndrome paraneoplástica/hipercalcemia por malignidade, adenocarcinomas, carcinomas de células escamosas, sarcomas, melanoma maligna, particularmente melanoma metastática, hemangioma, doença metastática, reabsorção óssea relacionada ao câncer, dor óssea relacionada ao câncer, e similares.

Doença cardiovascular

[0077] A presente invenção fornece, também, um método para modular ou tratar uma doença cardiovascular em uma célula, um tecido, um órgão, um animal ou um paciente que inclui, porém sem limitação, modular a resposta imune a processos celulares secundários ou associados que envolvem CD27 em pelo menos um dentre infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca congestiva, acidente vascular cerebral, acidente vascular cerebral isquêmico, hemorragia, arterioesclero- se, ateroesclerose, reestenose, doença ateriosclerótica diabética, hipertensão, hipertensão arterial, hipertensão renovascular, síncope, choque, sífilis do sistema cardiovascular, insuficiência cardíaca, cor pulmonale, hipertensão pulmonar primária, arritmias cardíacas, batidas ectópicas atriais, flutter atrial, fibrilação atrial (prolongado ou paroxís- mico), síndrome de pós-perfusão, resposta inflamatória à revasculari- zação cardiopulmonar, taquicardia atrial caótica ou multifocal, taqui- cardia com QRS estreita regular, arritmias específicas, fibrilação ven- tricular, arritmias do feixe His, bloqueio atrioventricular, bloqueio da ramificação do feixe, distúrbios isquêmicos do miocárdio, doença das artérias coronárias, angina pectoris, infarto do miocárdio, cardiomiopa- tia, cardiomiopatia congestiva dilatada, cardiomiopatia restritiva, doenças cardíacas valvulares, endocardite, doença do pericárdio, tumores cardíacos, aneurismas aórticos e periféricos, dissecção aórtica, inflamação da aorta, oclusão da aorta abdominal e suas ramificações, distúrbios vasculares periféricos, distúrbios arteriais oclusivos, doença aterosclerótica periférica, tromboangeíte obliterante, distúrbios arteriais periféricos funcionais, fenômeno e doença de Raynaud, acrocianose, eritromelalgia, doenças venosas, trombose venosa, veias varicosas, fístula arteriovenosa, linfedema, lipedema, angina instável, lesão por reperfusão, síndrome pós-bombeamento, lesão por isquemia-reperfusão, e similares.

Doença neurológica

[0078] A presente invenção também fornece um método para modular ou tratar uma doença maligna em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente, que inclui, porém sem limitação, modular a resposta imune a processos celulares secundários ou associados que envolvem CD27 em:. doenças neurodegenerativas, esclerose múltipla, mi- grânia, complexo de demência associada à AIDS, doenças desmielini- zantes, tais como esclerose múltipla e mielite transversal aguda; distúrbios cerebelares e extrapiramidais, tais como lesões do sistema cor- ticoespinhal; distúrbios dos gânglios basais ou distúrbios cerebelares; distúrbios hipercinéticos do movimento, tais como coreia de Huntington e coreia senil; distúrbios do movimento induzidos por fármaco, tais como aqueles induzidos por fármacos que bloqueiam receptores de dopamina do SNC; distúrbios hipocinéticos do movimento, tais como doença de Parkinson; paralisa supranuclear progressiva; lesões estruturais do cerebelo; degenerações espinocerebelares, tais como ataxia espinhal, ataxia de Friedreich, degenerações corticais cerebelares, degenerações de múltiplos sistemas (Mencel, Dejerine-Thomas, Shi- Drager e Machado-Joseph); distúrbios sistêmicos (doença de Refsum, abetalipoproteinemia, ataxia, telangiectasia e distúrbio mitocondrial de múltiplos sistemas); distúrbios de núcleo desmielinizante, tais como esclerose múltipla, mielite transversal aguda; e distúrbios da unidade motora, tais como atrofias musculares neurogênicas (degeneração de célula do corno anterior, tal como esclerose lateral amiotrófica, atrofia muscular espinhal infantil e atrofia muscular espinhal juvenil); doença de Alzheimer; síndrome de Down; doença do corpo de Lewy difuso; demência senil relacionada ao desenvolvimento do corpo de Lewy; síndrome de Wernicke-Korsakoff; alcoolismo crônico; doença de Creutzfeldt-Jakob; panencefalite esclerosante subaguda, doença de Haller- rorden-Spatz; e demência pugilística, e similares. Tal método pode opcionalmente compreender a administração de uma quantidade eficaz de uma composição ou composição farmacêutica que compreende pelo menos um anticorpo TNF variante ou porção especificada de uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente precisando de tal modulação, tratamento ou terapia.

Outros usos terapêuticos de anticorpos neutralizantes de CD27

[0079] Em adição às condições e doenças descritas, a presente invenção também fornece um método para modular ou tratar condições fibróticas de diversas etiologias modulando-se a resposta imune a processos celulares secundários ou associados que envolvem CD27 em, por exemplo: fibrose do fígado (que inclui, porém sem limitação, cirrose induzida por álcool, cirrose induzida por vírus, hepatite induzida por doença autoimune); fibrose pulmonar (que inclui, porém sem limitação, escleroderma, fibrose pulmonar idiopática); fibrose dos rins (que inclui, porém sem limitação, escleroderma, nefrite diabética, glomeru- lonefrite, nefrite lúpica); fibrose dérmica (que inclui, porém sem limita ção, escleroderma, cicatrizes de queloide e hipertrófica, queimaduras); mielofibrose; neurofibromatose; fibroma; fibrose intestinal; e adesões fibróticas que resultam de procedimentos cirúrgicos.

[0080] A presente invenção também fornece um método para modular, tratar ou aliviar os sintomas de uma doença infecciosa em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente, modulando-se a resposta imune a processos celulares secundários ou associados que envolvem CD27 em, por exemplo: infecção bacteriana aguda ou crônica, processos infecciosos ou parasíticos agudos e crônicos, que incluem infecções bacterianas, virais e fúngicas, infecção por HlV/neuropatia por HIV, meningite, hepatite (A, B ou C, ou similares), artrite séptica, peri- tonite, pneumonia, epiglotite, %. coli, síndrome urêmica hemolítica, malária, febre por dengue hemorrágica, leishmaniose, lepra, síndrome do choque tóxico, miosite por streptococcus, gangrena gasosa, tuberculose micobacteriana, infecção intracelular por Mycobacterium avium, pneumonia por Pneumocystis carinii, doença inflamatória pélvica, or- quite ou epididimite, legionella, doença de Lyme, influenza A, vírus Epstein-Barr, síndrome hemofagocítica associada a vírus, encefalite viral/meningite asséptica, e similares.

[0081] Os conteúdos de todas as referências citadas (que incluem referências da literatura, patentes concedidas, pedidos de patente publicados e pedidos de patente copendentes) neste relatório descritivo estão aqui expressamente incorporadas, por referência.

[0082] Outras características da invenção se tornarão aparentes durante o curso das seguintes descrições de modalidades exemplifi- cadoras que são dadas para ilustração da invenção e não se destinam a limitar a mesma.

4. Formulações farmacêuticas

[0083] A invenção fornece formulações estáveis de um anticorpo neutralizante de CD27, o qual é, de preferência, uma solução salina aquosa tamponada com fosfato ou solução de sal mista, assim como soluções e formulações preservadas, assim como formulações preservadas multiuso, adequadas para uso farmacêutico ou veterinário, que compreendem pelo menos um anticorpo neutralizante de CD27 em uma formulação farmaceuticamente aceitável. Veículos adequados e sua formulação, inclusive de outras proteínas humanas, por exemplo, albumina sérica humana, são descritos, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edição, Troy, D.B. ed., Li- pincott Williams e Wilkins, Philadelphia, PA, 2006, Parte 5.

[0084] Com a finalidade de formar uma composição farmaceuti- camente aceitável adequada para a administração eficaz, tais composições irão conter uma quantidade eficaz dos compostos descritos acima em conjunto com uma quantidade adequada de veículo carrea- dor. Métodos farmacêuticos adicionais podem ser empregados para controlar a duração de ação. Preparações de liberação controlada podem ser obtidas através do uso de polímeros para complexar ou absorver os compostos. Outro método possível para controlar a duração de ação pelas preparações de liberação controlada é incorporar os compostos da presente invenção em partículas de um material polimé- rico, como poliésteres, poliaminoácidos, hidrogéis, poli(ácido láctico) ou copolímeros de etileno / acetato de vinila. Alternativamente, ao invés de incorporar estes agentes em partículas poliméricas, é possível aprisionar estes materiais em microcápsulas preparadas, por exemplo, por polimerização interfacial, por exemplo, hidróxi metil celulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli(metacrilato de meti- la), respectivamente, ou em sistemas de liberação de medicamentos coloidais, por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, mi- croemulsões, nanopartículas, e nanocápsulas ou em macroemulsões. Tais técnicas são reveladas em Remington supra (2006).

5. Administração de um anticorpo neutralizante de CD27

[0085] Pelo menos umanticorpo neutralizante de CD27 nas soluções e formulações preservadas ou estáveis descritas no presente documento, pode ser administrado a um paciente, de acordo com a presente invenção, através de uma variedade de métodos de liberação que incluem intravenoso (I.V.), intramuscular (I.M.); subcutâneo (S.C.); transdérmico, pulmonar, transmucosa, com o uso de uma formulação em um implante, bomba osmótica, cartucho, microbomba ou outros meios observados pelo versado na técnica, assim como bem conhecidos na técnica.

[0086] Em um método para administração de um anticorpo neutralizante de CD27, a substância farmacêutica é dada de maneira intravenosa a partir de um cateter instalado anteriormente equipado com uma bolsa de infusão. O anticorpo neutralizante de CD27 é fornecido em frascos de uso único de 20 ml, tais como aqueles fornecidos por ImmunoGen, Inc. (Cambridge, MA, EUA). Cada frasco contém proteína a uma concentração de 0,05 a cerca de 2,0 mg/ml em uma solução tamponada (pH 6,5 ± 0,5) que compreende essencialmente fosfato de potássio monobásico (0,57 mg/ml), monoidrato de fosfato de sódio monobásico (0,20 mg/ml), fosfato de sódio dibásico (0,555 mg/ml) e cloreto de sódio (8,16 mg/ml) em água purificada, USP. O produto farmacêutico é pré-filtrado duas vezes sob instilação do volume da dose na bolsa de infusão passando-se o mesmo através de um filtro de 5 μ de baixa ligação proteica e é administrada aos pacientes através de um filtro de 0,22 μm em linha dentro de 8 h de preparação. Após a infusão, a linha de i.v. deveria ser lavada com fluido para assegurar a liberação da dose de fármaco completa.

[0087] Em geral, se é feita uma administração de uma dose sistêmica do anticorpo, é desejável fornecer ao receptor uma dosagem de anticorpo na faixa de cerca de 1 ng/kg a 100 ng/kg, 100 ng/kg a 500 ng/kg, 500 ng/kg a 1 ug/kg, 1 ug/kg a 100 ug/kg, 100 ug/kg a 500 ug/kg, 500 ug/kg a 1 mg/kg, 1 mg/kg a 50 mg/kg, 50 mg/kg a 100 mg/kg, 100 mg/kg a 500 mg/kg (peso corporal do receptor), embora uma dosagem menor ou maior possa ser administrada. Pode-se esperar que dosagens tão baixas quanto cerca de 1,0 mg/kg mostrem alguma eficácia. De preferência, cerca de 5 mg/kg é uma dosagem aceitável, embora níveis de dosagem de até cerca de 50 mg/kg sejam, também, preferenciais, especialmente para uso terapêutico. Alternativamente, a administração de uma quantidade específica do anticorpo pode ser feita, a qual não se baseia no peso do paciente, tal como uma quantidade na faixa de 1 ug a 100 ug, 1 mg a 100 mg, ou 1 gm a 100 gm. Por exemplo, a administração sítio-específica pode ser a um compartimento ou cavidade do corpo, tal como um meio intra-articular, intrabrônquico, intra-abdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intra- cavitário, intracelial, intracelebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intra-hepático, intramiocárdico, intraósseo, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostáti- co, intrapulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinhal, in- trassinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, intralesional, vaginal, retal, bucal sublingual, intranasal ou transdérmico.

[0088] O tratamento pode ser dado em um cronograma de dose única ou, de preferência, em um cronograma de múltiplas doses no qual um curso primário de tratamento pode ser com 1 a 10 doses separadas, seguido de outras doses dadas em intervalos de tempo subsequentes necessários para manter e/ou reforçar a resposta, por exemplo, 1 a 4 meses para uma segunda dose e, se necessário, uma dose(s) subsequente(s) após vários meses. Os exemplos de crono- gramas de tratamento adequados incluem: (i) 0, 1 mês e 6 meses, (ii) 0, 7 dias e 1 mês, (iii) 0 e 1 mês, (iv) 0 e 6 meses, ou outros cronogra- mas suficientes para gerar as respostas desejadas que se destinam a reduzir os sintomas da doença, ou reduzir a severidade da doença.

6. Artigos de fabricação que compreendem um anticorpo neutralizante de CD27

[0089] A invenção inclui um artigo de fabricação contendo materiais úteis para o tratamento dos distúrbios descritos acima que compreendem um anticorpo neutralizante de CD27, um recipiente e um rótulo ou folheto informativo dentro ou associado ao recipiente. O artigo de fabricação contém, de preferência, ao menos um frasco que compreende uma solução de ao menos um anticorpo neutralizante de CD27 com os tampões e/ou conservantes prescritos, opcionalmente em um diluente aquoso, em que o dito material para embalagem compreende um rótulo que indica que tal solução pode ser mantido ao longo de um período de tempo. A invenção pode compreender um artigo de fabricação, que compreende um material para embalagem, um pri-meiro frasco que compreende anticorpo neutralizante de CD27 liofili- zado e um segundo frasco que compreende um diluente aquoso do tampão ou conservante prescrito, sendo que o dito material para embalagem compreende um rótulo que instrui como um médico ou um paciente reconstitui o anticorpo neutralizante de CD27 no diluente aquoso para formar uma solução.

[0090] Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que tem uma tampa, opcionalmente, que pode ser perfurada por uma agulha de injeção hipodérmica).

[0091] Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo neutralizante de CD27. O rótulo ou folheto informativo indica que a composição é usada para tratar a indicação de escolha, tal como SLE. O folheto informativo no presente documento pode indicar que o anticorpo ou composição é usada para tratar uma condição que não responde, ou responde de maneira insatisfatória, ao tratamento com o padrão de cuidado, conforme descrito no presente documento, para diagnósticos e doenças específicas. Em outras modalidades, o folheto informativo pode indicar que o anticorpo, conjugado de anticorpo ou composição pode ser usado também para tratar uma doença caracterizada pela necessidade de modular a resposta imune de processos celulares que envolvem CD27.

[0092] Ainda um outro aspecto da presente invenção é um kit para detectar CD27 em uma amostra biológica. O kit inclui um recipiente que contém um ou mais anticorpos que se ligam a um epitopo de CD27 e instruções para usar o anticorpo com o propósito de ligação a CD27 para formar um complexo imunológico e detectar a formação do complexo imunológico de modo que a presença ou ausência do complexo imunológico esteja correlacionada com a presença ou ausência de CD27 na amostra. Os exemplos de recipientes incluem placas mul- ti-poços que permitem a detecção simultânea de CD27 em várias amostras.

[0093] Embora a invenção tenha sido descrita em termos gerais, as modalidades da invenção serão apresentadas adicionalmente nos exemplos a seguir.

Exemplo 1: Métodos e reagentes de CD27

[0094] Com a finalidade de gerar e testar os anticorpos monoclo- nais de ligação a CD27, foram geradas construções de proteína que representam o comprimento total de CD70 humano e CD27 humana e o domínio extracelular (ECD) de CD27 humana.

[0095] CD27 humana (SEQ ID NO: 149) é uma proteína trans- membranar tipo 1 que compreende um. domínio de peptídeo de sinalização (a partir dos resíduos 1 a 20), extracelular (ECD, a partir dos resíduos 21 a 191), transmembranar (TM, a partir de resíduos 191 a 212) e intracelular (ICD, a partir dos resíduos 213 a 260). CD70 humano (SEQ ID NO: 2) é um polipeptídeo transmembranar tipo 2 de 193 aminoácidos de comprimento que compreende, a partir da terminação N, um domínio intracelular (ICD, a partir dos resíduos 1 a 17), transmembranar (TM, a partir dos resíduos 18 a 38) e domínio extracelular (ECD, a partir dos resíduos 39 a 193). A sequência de codificação de CD70 completa foi expressa de maneira clonal sobre uma superfície de células HEK 293.

[0096] Para ensaios de ligação direta à base de mAb ELISA e Pro- teon, os aminoácidos 1 a 121 do ECD de CD27 foram expressos de forma transiente em células HEK293 com um peptídeo de His6-tag C- terminal e purificados por cromatografia de íon metálico. Para ensaios de ELISA e panning de bacteriófago, os aminoácidos 1 a 173 do ECD com um His6-tag C-terminal. foram expressos por HEK e purificados por cromatografia de íon metálico, seguido de cromatografia de exclusão de tamanho em Superdex 75. Ambas as proteínas CD27 foram biotiniladas com o uso de resíduos de amina de direcionamento químico de éster de NHS na proteína. Para cristalização, os aminoácidos 1 a 101 com um His6-tag C-terminal foram expressos em um sistema de baculovírus e purificados por cromatografia de íon metálico por Proteose, Inc. Para a imunização de camundongo, a proteína CD27-Fc foi adquirida junto a R&D systems. Para alguns estudos, a sequência de codificação de CD27 completa foi expressa de maneira clonal sobre uma superfície de células HEK 293.

[0097] Os clones de cDNA de CD27 humana e CD70 humano foram ordenados junto a Open Biosystems. Técnicas de biologia molecular padrão foram usadas para gerar construções de expressão. Em suma, os quadros de leitura aberta dos genes de CD27 e CD70 foram amplificados por PCR e clonados nos vetores de expressão mamíferos através da digestão por endonuclease de restrição e ligação, ou através de clonagem independente de ligase (LIC). Os genes de CD27 e CD70 de comprimento total foram clonados no vetor de expressão e foram expressos de forma clonal sobre a superfície de células mamíferas. O domínio extracelular de CD27 foi clonado em vetores de expressão mamíferos e expressos de forma transiente em células HEK293 com uma cauda hexa-his.

Exemplo 2: Geração de anticorpos neutralizantes de CD27

[0098] Os anticorpos murinos anti-CD27 humana foram gerados pelo método de hibridoma de Kohler e Milstein (1975). Dez camundongos C3H/HeJ com 12 a 14 semanas de idade foram obtidos junto à Charles River Laboratories. Os camundongos foram imunizados de modo subcutâneo (SQ) na base da cauda (BOT) com 50 micrograma de Hu CD27 Fc (R&D Systems) em combinação com 0,33x105 unidades cada de interferon-alfa e beta murino (Biosource) em um volume final de 100 microlitro no dia 1. Nos dias 2 e 3, os camundongos foram injetados SQ na BOT com os interferons (as mesmas doses que no dia 1). Os camundongos foram reforçados com 50 microgramas de Hu CD27-Fc em combinação com 50 microgramas de Mab de agonista de anti-CD40 murino (R&D Systems, MAB440) administrados SQ na BOT em PBS no dia 14; quatro dias antes da coleta esplénica para fusão.

[0099] Para avaliação de título, uma fase de captura EIA foi executada. Em suma, as placas (Nunc-Maxisorp) foram revestidas com 0,1 micrograma de anti-ms Fc de cabra (Jackson Immunotech) em tampão de bicarbonato de um dia para o outro a 4°C. Após a etapa de bloqueio e lavagem, as diluições de soros foram adicionadas e as placas foram incubadas por 30 minutos em RT. Após as etapas de lavagem, as placas foram incubadas por 30 minutos em RT com 0,25 microgra- ma/ml de Hu CD27-ECD biotinilado em tampão bloqueador e examinadas com estreptavidina marcada com HRP (Jackson Immunotech) diluída 1:40.000 em BSA/PBS a 0,4% por 30 minutos em RT. As placas foram lavadas conforme descrito acima; então, a solução de substrato de OPD (Sigma fast tabs) foi adicionada, com incubação por 10 minutos à temperatura ambiente, o desenvolvimento de substrato colorido parou mediante a adição de 4N de ácido sulfúrico em 25 microli- tros/poço, e a absorbância medida em 490 nm.

[00100] Um banco de células do parceiro de fusão do mieloma de camundongo BALB/c não secretor, FO foi adquirido junto a ATCC (no. CRL-1646). Um frasco congelado de células FO foi descongelado e ressuspenso em DMEM com meio de Glutamax™ (modificado) (Invi- trogen) suplementado com FBS a 10% (em volume)(Hyclone). As células foram expandidas, criopreservadas e consideradas estéreis e livres de micoplasma pelo Charles River Laboratories. A linhagem de células C1833A (Centocor) também foi usada nessa fusão. Essa linhagem de células foi derivada internamente pela redução da expressão do gene CHOP na linhagem de células FO, assim, a mesma exigem crescimento sob a seleção com geneticina. As células foram tratadas como FOs acima, com a exceção do crescimento em DMEM com meio de Glutamax™ (modificado) suplementado com FBS a 10% (em volume)(Hyclone) e 500 ug/ml de geneticina (Gibco). Tanto a linhagem de células FO como C1833A foram submetidas à sincronização celular antes da fusão. Em suma, 1,5 a 2 x108 células foram semeadas em 180 ml de DMEM com meio de Glutamax™ (modificado) suplementado com FBS a 0,25% (em volume) (Hyclone) e incubadas a 37°C por 13 horas. 20 ml adicionais de FBS foram adicionados para uma concentração final de FBS de 10% e incubados por 13 horas adicionais a 37°C antes do uso. As células C1833A ficaram constantemente sob seleção de geneticina por todo o processo de sincronização de célula. As células de mieloma foram lavadas em PBS, contadas e a viabilidade determinada (>78%) através do software Guava Viacount antes da fusão.

[00101] No dia da fusão, os animais foram submetidos à eutanásia por asfixia com CO2. Os baços foram removidos de maneira asséptica e imersos em 10 ml de solução salina tamponada com fosfato fria (PBS) contendo antibióticos (PSA) (Sigma).

[00102] Uma suspensão de célula única de esplenócitos foi preparada e submetida à lise por RBC com o uso tampão de lise por RBC (Sigma). As células lavadas foram marcadas para triagem magnética conforme as instruções do fabricante, com o uso de microesferas magnéticas de anti-Thy1.2 murino, anti-CD11b murino/humano e anti- IgM murino (Miltenyi Biotec nos 130-049-101, 130-149-601 e 130-047301, respectivamente) e, então, classificadas com o uso do instrumento AutoMacs Pro executando-se o programa Deplete. Tanto as frações de célula não marcadas (enriquecidas com célula B plasmablástica) como marcadas foram coletadas, então, contadas através do Guava PCA. As células marcadas de forma positiva foram descartadas. As células não marcadas foram divididas ao meio para fusão tanto aos parceiros de fusão FO como C1833A. As fusões foram realizadas em uma razão de 1:1 de células de mieloma de murino a células do baço viáveis de acordo com o método de De St. Groth (J Immunological Me-thods. 35:1 a 21. 1980). Em suma, as células do baço e mieloma foram misturadas em conjunto, peletizadas e lavadas uma vez em 50 ml de PBS. O pélete foi ressuspenso com 1 ml de solução de polietileno glicol (PEG) (2 g de PEG com peso molecular de 4000, 2 ml de DMEM e 0,4 ml de DMSO) a 370C durante 30 segundos. A mistura de célu- la/fusão foi, então, imersa em um banho de água a 370C por aproximadamente 60 segundos com agitação branda. A reação de fusão foi interrompida adicionando-se lentamente DMEM a 370C durante 1 minuto. As células fundidas foram deixadas descansar por 5 minutos à temperatura ambiente e, então, centrifugadas em 150 x g por 5 minutos. As células foram, então, ressuspensas em meio HAT [DMEM com Glutamax™ (modificado), suplementado com FBS a 20%, Origen a 5%, 25 microgramas/ml de gentamicina (Sigma) e HAT (100 microM de hipoxantina, 0,4 microM de aminopterina e 16 microM de timidina (Sigma), e semeadas em placas de cultura de tecido de poliestireno de fundo plano com 96 poços (Corning n° 3997) ou meio de metilcelulose (StemCell Technologies, MediumD cat n° 03804) contendo ~2,25 μg/ml de CD27 humana de AF488 (Janssen Research & Development, LLC). As placas foram incubadas em um incubador a 37°C umidificado com 7% de CO2 por 7 a 10 dias. As únicas colunas foram selecionadas a partir de placas de metilcelulose por seleção utilizando-se o instrumento ClonepixFL ou sobre um microscópio de luz branca.

Exemplo 3: Bioatividade de Mab recombinante

[00103] A capacidade de os domínios de ligação dos anticorpos de murino se ligarem à CD27 e bloquear determinadas bioatividades de CD27 foi analisada usando diversos ensaios in vitro, conforme descrito abaixo.

[00104] Um EIA de fase sólida foi usado para examinar os sobrena- dantes de hibridoma para anticorpos capazes de ligação à CD27 humana. As placas (Nunc-Maxisorp #446612) foram revestidas de um dia para o outro com 4 μg/ml de anti-huFc de cabra Fab (Jackson #109- 006-098) em tampão de bicarbonato O/N a 4°C. Sem lavagem, os poços foram bloqueados com 200 microl de 0,4% (peso por volume) de albumina sérica bovina (BSA) em PBS por 1 h à TA. Após a lavagem com 0,15 M de solução salina contendo 0,02% (peso por volume) de Tween 20, 50 microl de huCD27-Fc em 0,4% de BSA/PBS foram adicionados às placas por 1 h à TA. Após a lavagem, novamente 50 mi- crol de sobrenadantes de hibridoma não diluídos foram incubados em placas revestidas por 30 minutos à TA. As placas foram lavadas três vezes e, então, incubadas com 50 microl de Fc HRP anti-murino de cabra (Jackson # 115-036-071) diluído 1:10.000 por 30 minutos à TA. As placas foram novamente lavadas e desenvolvidas, conforme descrito acima para avaliação de título. Para avaliação em relação à capacidade de ligação de hibridoma o ensaio similar ao Mabs foi realizado com o uso de placas de 384 poços Maxisorp (NUNC 464718) com sobrenadantes de hibridoma diluídos em série (normalizados a uma concentração inicial de 5 microg/ml. Esse ensaio identificou 386 hibri- domas positivos.

[00105] Todos os 386 hibridomas específicos à CD27 foram avaliados para a capacidade de inibir a ligação de huCD27 a huCD70 com o uso de ensaios de ligação bioquímica com. células IM-9, uma linhagem de células B-linfoblastóides encontrada para expressar CD70 en- dogenamente humano. As placas Maxisorp (VWR # 62409-314) foram revestidas com CD27/Fc humano recombinante (R&D Systems, Cat# 382-CD) a 250 nanogramas (ng)/ml e incubadas de um dia para o outro a 4°C. No dia seguinte as placas foram bloqueadas com tampão bloqueador (Pierce, Cat#37543) e, então, lavadas com tampão de lavagem I, que contém PBS sem Ca++ ou Mg++, 0,01% de Tween-20. Os controles (mAb de camundongo a hCD27, R&D Systems, Cat# MAB382; controle de isótopo IgG1 de camundongo, R&D Systems, Cat# MAB002; controle de isótopo IgG2a de camundongo, R&D Systems, Cat# MAB003) foram incluídos em cada placa. 50 ul/poço de amostras ou controles de hibridoma foram misturados com 50 fl/poço de células IM-9 colhidas, linhagem de células B-linfoblastóides humanas. (ATCC, CCL-159) e foram incubados por 1. hora à TA sem agitação. No final da incubação, as placas foram lavadas com tampão de lavagem II, para remover todas as células não ligadas e, então, lisadas com 50 ul/poço de reagente Cell Titer Glo Promega, Cat# G7571). Após 10 minutos de incubação com agitação, as placas foram lidas em Envision (PerkinElmer, 2102 Multilabel reader). O sinal luminescente gerado é proporcional à quantidade de ATP presente e diretamente correlacionado ao número de células vivas presente n poço capturado pela ligação CD27. Com base nos resultados do ensaio de ligação bioquímica, cerca de 50% dos clones específicos à CD27 foram neutralizados.

[00106] Para eliminar a redundância entre os clones neutralizantes, os ensaios de ligação por competição foram realizados para armazenar os anticorpos em grupos de competição. Nesse ensaio, os sobre- nadantes de hibridoma foram avaliados individualmente tanto como reagentes de captura como de detecção em cada um dos hibridomas positivos no painel. Os anticorpos que formam reagentes de captu- ra/detecção um com o outro provavelmente reconhecem epitopos espacialmente separados na proteína CD27 permitindo, dessa forma, que ambos os anticorpos se liguem à proteína-alvo ao mesmo tempo. Os grupos de clones que exibem padrões similares de atividade ao longo de todo o painel provavelmente se ligam a epitopos similares. A seleção de clones a partir de grupos diferentes proporcionou, portanto, anticorpos que reconhecem epitopos diferentes. Brevemente, placas de 384 poços Nunc Maxisorp (464718) foram. revestidas com o Fc an- ti-camundongo de cabra (JIR115-005-071) em tampão de revestimento de um dia para o outro a 4°C. As placas foram, então, bloqueadas com 0,4% BSA em PBS por 30 minutos à temperatura ambiente. Nessa etapa e em todas as etapas subsequentes, as placas são lavadas com PBS, 0,02% de Tween-20. Cada poço de uma fileira (uma fileira por sobrenadante) recebeu 20 ul de sobrenadante (o sobrenadante puro foi usado para o exame inicial, porém, para reexaminar os subclones, os sobrenadantes foram normalizados a 2 ug/ml de mAb) em conjunto com controles (anti-huCD27 de camundongo, R&D Systems, Cat# MAB382; o controle de isótopo de camundongo Cat#555439, Becton- Dickenson), então, incubado por 30 minutos à TA. Após a lavagem, 25 ul de marcador de Hu CD27-ECD-His-não marcado foram preparados em PBS mais 10% de soro de camundongo (Bioreclamation mouse serum CD-1 lot#MSEBREC.18565) a 0,3 (ou 0,8 por concentração normalizada) microg/ml foram adicionados a todos os poços, seguido de 30 minutos de incubação à temperatura ambiente, então, lavados. Cada sobrenadante foi adicionado em uma única coluna e incubado por 30 minutos à TA com 25 ul de uma mistura preparada da seguinte forma: (sobrenadantes pré-incubados com Fc HRP anti-camundongo de cabra (Jackson 115-036-008), misturando-se 150 ul de 1:1.000 de Fc HRP anti-camundongo de cabra em cada 1.000 ul de sobrenadante (para o exame primário) ou 90 ul de 1:2.000 por 600 ul de sobrenadante ajustado a 2 ug/ml: (para reexaminar subclones). Após 30 minutos de incubação à temperatura ambiente, adiciona-se 200 microL de soro de camundongo normal a 100% por ml e incuba-se por 30 minutos adicionais à TA. As placas foram lavadas, então, incubadas por 15 minutos à TA com 100 ul/poço de solução de substrato citrato-fosfato (0,1 M de ácido cítrico e 0,2 M de fosfato de sódio, 0,01% de H2O2, e 1 mg/ml de OPD). O desenvolvimento de substrato foi interrompido pela adição de 25 ul de 4N de ácido sulfúrico e a absorbância medida a 490 nm com o uso de um leitor de placa automatizado. Esse ensaio de binagem identificou três grupos que reconhecem sítios de ligação não sobrepostos no antígeno huCD27. Os anticorpos selecionados a partir de todos os três grupos foram ampliados para produção de anticorpos, purificação e teste adicionais em ensaios funcionais.

Inibição de sinalização celular

[00107] A. ligação de CD70 à CD27 induz a sinalização que leva à ativação a jusante do fator de transcrição, NF-kβ. Um ensaio repórter NF-kβ foi estabelecido para a caracterização de anticorpo adicional. O ensaio foi executado em dois modos: (1) avaliar o antagonismo de anticorpo através da neutralização de CD70 induzida pela ativação de CD27 e (2) avaliar o agonismo de anticorpo através da ativação de si nalização de CD27 sem ligação de CD70. As células HEK-293F foram transfectadas com um total de 36 ng de DNA contendo tanto construções de CD27 humana como de luciferase, sob o controle do promotor NF-kβ. Os transfectantes HEK-293F foram colocados em placas de 5x104 células por poço em 40 ul de Freestyle media (Gibco) em placas de 96 poços. As diluições de mAbs de hibridoma neutralizante CD27 foram adicionadas à placa de ensaio em Freestyle media (Gibco) para uma concentração final de 50 ug/ml com 1:3 diluições e as placas foram incubadas a 37°C (95% de +2/5% de CO2) por uma hora. Para testar a capacidade do mAbs de hibridoma neutralizar a sinalização CD70:CD27, células epissomais terminalmente irradiadas (4000 rads) HEK-293E CD70 foram adicionadas em 20% do número de células transfectantes CD27 à placa de ensaio. Para testar a atividade agonis- ta do mAbs de hibridoma, a adição de células epissomais foi omitida. As placas de ensaio foram incubadas de um dia para o outro a 37°C (95% de +2/5% de CO2) e desenvolvidas usando o Steady-Glo® Luciferase Assay System (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. Quatro mAbs de hibridoma neutralizante CD27, C2177, C2186, C2191 e C2192, cuja dose bloqueou de forma dependente a sinalização CD27 mediada por CD70 sem causar a ativação agonística dose- dependente significativa do receptor CD27 na ausência de estímulos de CD70 foram selecionados para caracterização adicional. Os IC50 para bloquear a ligação celular IM-9 para a sinalização mediada por CD27 e CD70 no ensaio de gene-repórter NF-kβ são resumidos para esses quatro anticorpos na Tabela 1. A atividade de agonismo no ensaio de gene-repórter NF-kβ é mostrada como o aumento na sinalização de CD27 em relação a um anticorpo de controle de isotipo irrelevante (IgG1 de camundongo a proteína EMP de rato) na ausência de estímulo de CD70 na concentração testada máxima de anticorpo.

Afinidade para CD27

[00108] Os KDS de anticorpos C2177, C2186, C2191 e C2192 para CD27 solúvel monomérico a 25°C foram medidos por Biacore e são relatados na Tabela 1. Os ensaios foram realizados em um instrumento de ressonância de plasma de superfície (SPR) BIACORE 3000 (Bl- Acore, Inc.). As amostras foram preparadas em solução salina tampo- nada com fosfato, disponível junto à Dulbecco, pH 7,4 contendo 0,005% de tensoativo (polissorbato 20). O anticorpo específico Fc anti- camundongo de cabra (Jackson Immunoresearch laboratories Prod # 115-005-071) foi covalentemente ligado às superfícies de ouro revestidas com carbóxi metil dextrano (CM-5 Chip, Biacore). Antes da imobilização, o circuito integrado foi preaquecido com 50 mM de NaOH, 100 mM de HCl e 0,1% de dodecil sulfato de sódio com injeção de água deionizada entre os pré-tratamentos. Os anticorpos foram diluídos com 10 mM de tampão de acetato de sódio, pH 4,5 e acoplados à superfície de dextrano carboximetilado do circuito integrado usando as instruções do fabricante para química de acoplamento de aminas. Os grupos reativos restantes sobre a superfície foram desativados com o uso de etanolamina-HCl. Os mAb foram capturados na superfície de sensor através do domínio Fc. As associações de CD27 ECD humano injetado em concentrações crescentes (0,6 a 150 nM, série de diluição de 4 vezes) foram monitoradas por três minutos e as dissociações por dez minutos. A regeneração das superfícies de captura na linha de base foi otimizada com o uso de dois pulsos de 3 segundos de 100 mM de ácido fosfórico. Os dados foram processados com o uso do software Scrubber, versão 1.1 g (BioLogic Software). A subtração de referência dupla dos dados foi realizada para corrigir a contribuição de tampão para o ruído de sinal e instrumento. A análise cinética dos dados processados foi realizada com o uso do software Biaevaluation 4.0.1. (GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Suécia). Os perfis de ligação foram descritos por um modelo de ligação 1:1 que indica uma ligação monovalente de CD27.Tabela 1.

IC50 para inibição de mAb de ligação de células IM-9 à CD27 imobilizado IC50 para inibição de mAb no ensaio de gene-repórter

[00109] Atividade agonista de mAbs a 50 ug/ml na ausência de CD70, medida como aumento no sinal de gene-repórter em relação aos anticorpos de controle de isotipo.

Inibição de proliferação celular

[00110] A proliferação de células T subotimamente ativadas na cultura com anticorpos anti-CD3 mais anti-CD28 é aprimorada pela ligação CD70 do CD27 expressado nas células T. Os quatro anticorpos neutralizantes de murino foram avaliados para sua capacidade de inibir a proliferação de célula T na presença de CD70 e induzir a proliferação na ausência de CD70. As células T CD4+ congeladas foram adquiridas junto à AllCells, LLC. As células foram descongeladas e colocadas em meio IMDM contendo 10% de SFB, 1% de L-glutamina e 1% de Penicilina-Estreptomicina. Antes do plaqueamento de células, o anticorpo anti-CD3 (OKT3) foi aplicado como revestimento sobre uma placa de fundo em U a 1 ug/ml em STF (salina tamponada com fosfato) de um dia para o outro a 4°C. As células foram contadas, trazidas a uma concentração de 1x106 células/ml e colocadas em placas a 1x105 células/poço. O anti-CD28 solúvel foi adicionado como um sinal de ativação secundário a 1 ug/ml por poço. As células HEK irradiadas (6000 rads) transfectadas com CD70 humano ou vetor sozinho (mock) foram adicionadas em poços adequados em 2x104 células/poço (20%). As células foram estimuladas por 3 dias, 0,9 uCi de timidina [metil-3H] foram adicionados em todos os poços de amostra e as células foram incubadas por 18 a 24 horas. No quarto dia de estimulação, as células foram colhidas sobre uma placa de filtro com o uso do PE Filtermate Harvester. A placa foi deixada para secar e 30 ul de MicroScintTM-20 foram adicionados a todos os poços de amostra. A placa foi lida em um PE TopCount NXT, e os dados foram coletados como CPM. O anticorpo C2177 mostra a inibição dose-dependente de proliferação de célula T mediada por CD70 e atividade agonística intrínseca muito fraca na ausência de CD70 (Figura 1). Resultados similares foram observados para os anticorpos C2186, C2191 e C2192. O IC50 e a % máxima de inibição para esses anticorpos são relatados na Tabela 2. Nenhum dos anticorpos mostrou estimulação consistente de proliferação na ausência de ligação de CD70, que indica uma ausência de atividade agonista intrínseca.

[00111] Além disso, os anticorpos C2177, C2186, C2191 e C2192 mostraram inibição dose-dependente de proliferação de célula T mediada por CD70 medida em um ensaio CSFE sem efeito na proliferação na ausência de estímulo de CD70. As células T CD3+ congeladas foram adquiridas junto à AllCells, LLC. As células foram descongelada e colocadas em meio IMDM contendo 10% de SFB, 1% L-glutamina e 1% de Penicilina-Estreptomicina. As células foram pré-marcadas com 2,5 mM. de CFSE (Invitrogen), bruscamente arrefecidas com SFB e lavadas em meio de célula T. CFSE é um corante que se difunde passivamente nas células e se torna altamente fluorescente mediante a ligação com aminas intracelulares. Mediante a divisão celular, cada célula-filha irá conter metade do marcador CFSE da célula parenta, dessa forma, a proliferação celular pode ser monitorada rastreando-se os números de células com intensidade CFSE diferente. As células foram trazidas a uma concentração de 1 x 106 células/ml e colocadas em placas em 1x105 células/poço. Antes do plaqueamento de células, o anticorpo anti-CD3 (OKT3) foi aplicado como revestimento sobre uma placa de fundo em U a 0,5 ug/ml em STF (salina tamponada com fosfato) de um dia para o outro a 4°C. O anti-CD28 solúvel foi adicionado como um sinal de ativação secundário a 0,1 ug/ml por poço. As células HEK irradiadas (6.000 rads) transfectadas com CD70 humano ou vetor sozinho (mock) foram adicionadas em poços adequados em 2x104 células/poço (20%). As células foram estimuladas por 4 dias e analisadas através de análise de separador de células ativadas por fluorescência (FACS) para contar as células divididas contendo níveis de intensidade diferentes do marcador CFSE.

Inibição de diferenciação de explosão de plasma

[00112] Os mAbs de hibridoma neutralizante CD27 também foram testados em um ensaio de diferenciação de explosão de plasma com células B humanas primárias. Os linfócitos B humanos CD19+ que foram negativamente selecionados a partir do sangue periférico de doadores normais (obtidos junto à AllCells) foram cultivados por 6 dias na presença de 1 ug/ml de anticorpo anti-CD40 (clone MAB89, Abcam) e 100 ng/ml de interleucina 21 (Invitrogen) ou 1 ug/ml de ligante CD40 recombinante humano solúvel e 2 ug/ml de intensificador para ligantes’ (ambos disponíveis junto à Alexis Biochemicals) e 100 ng/ml de inter- leucina 21 em placas de 96 poços em 105 célula B por poço. O hibri- doma neutralizante de CD27 ou anticorpos de controle de isotipo foram adicionados na presença ou ausência de 2x104 células HEK 293 de expressão de CD70 ou células HEK 293 transfectadas MOCK irradiadas (6000 rads). mAbs de hibridoma neutralizante CD27 e controles de isotipo correspondentes foram usados em 25, 2,5 e 0,25 ug/ml. No dia 6, as amostras de célula foram analisadas por citometria de fluxo e frações de explosões de plasma foram identificadas como dispersão anterior/alta, IgDminus, CD38bright, CD20low. O efeito do mab neutralizante de CD27 foi calculado como frequência de explosão de plasma em culturas de célula B contendo células de expressão de CD70 e mAbs de hibridoma normalizados na frequência de explosão de plasma em culturas de célula B correspondentes contendo células trans- fectadas mock. A porcentagem de inibição através de mAbs C2177, C2186, C2191 ou C2192 a 2,5 ug/ml é mostrada na Tabela 2. A atividade agonística na ausência de estímulo de CD70 não foi observada em nenhum desses mAbs.Tabela 2.

Exemplo 4: Mapeamento e agrupamento de epitopo

[00113] Para avaliar mais cuidadosamente a binagem inicial, os ensaios de competição foram realizados com alguns dos mAbs neutrali- zante purificados e com o anticorpo neutralizante CD27, MAB 382 (R&D Systems). Brevemente, 5 μl (10 μg/ml) de proteína quimérica Fc CD27 (R&D Sysytems, Cat# 382-CD) foram aplicados como revestimento sobre uma placa MSD HighBind (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) por poço por 2 h à TA. 5% de tampão MSD Blocker A (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) foram adicionados em cada poço e incubados por 2 h à TA. As placas foram lavadas três vezes com 0,1 M de tampão HEPES, pH 7,4, seguido de adição de uma mistura de 10 nM de anticorpo CD27 marcado com diferentes concentrações de um anticorpo (competidor de 1 nM a 2 uM). Os anticorpos foram marcados com NHS-éster MSD Sulfo-Tag™, um éster de N- hidroxissuccinimida de amina reativa que se acopla aos grupos amina primária de proteínas para formar uma ligação de amida estável. Após uma incubação de 2 horas com agitação suave à TA, as placas foram lavadas 3 vezes com 0,1M de tampão HEPES (pH 7,4). O tampão MSD Read Buffer T foi diluído com. água destilada (4 vezes) e dispensado em um volume de 150 fl/poço. As placas foram analisadas usando um SECTOR Imager 6000 que detecta a eletroquimiolumines- cência através de marcadores Sulfo-Tag que emitem luz mediante estimulação eletroquímica iniciada nas superfícies de eletrodo de micro- placas MSD.

[00114] Os estudos de competição definiram três grupos de competição para os anticorpos resumidos na Tabela 3, que confirmam os ensaios de binagem iniciais. C2179, C2192 e MAB382 constituem um grupo; C2177, C2182, C2186 e C2193 são um segundo grupo; e C2191 constitui um grupo separado.Tabela 3

Exemplo 5: Identificação de epitopo e parátopo por cristalografia de raios X

[00115] Os epitopos e parátopos detalhados de anticorpos C2177 e C2191 foram determinados por co-cristalização de seus Fabs correspondentes ao fragmento CD27 ECD (resíduos 1 a 101) como um complexo trimérico e determinação de estrutura por cristalografia de raios X. As versões quiméricas marcadas com His (domínio variável de camundongo, domínio constante humano) de C2177 Fab e C2191 Fab foram expressadas em células HEK293 e purificadas com o uso de cromatografia de exclusão de afinidade e tamanho. O fragmento ECD marcado com His (resíduos 1 a 101) de CD27 humana foi adicionalmente purificado por cromatografia de troca aniônica. O complexo ter-nário CD27:C2177 Fab:C2191 Fab foi preparado misturando-se CD27 com o excesso de Fabs em uma razão molar de 1:1,25:1,25. O complexo foi incubado por 2 h a 4°C, separado da espécie não complexa- da com o uso de cromatografia de exclusão de tamanho, e concentrado a 12 mg/ml em. 20 mM de Tris, pH 8,5, 250 mM de NaCl. A cristalização do complexo foi realizada pelo método de difusão de vapor em gotas sentadas a 20°C. Os cristais do complexo foram obtidos a partir de 24% de PEG 3350, 0,2 M de cloreto de amônio, 0,1 M de tampão Tris, pH 8,5. Para a coleta de dados de raios X, um cristal foi embebido por alguns segundos em uma solução crioprotetora contendo solução de cristalização suplementada com 20% de glicerol, e congelado rapidamente no fluxo de nitrogênio a 100 K. Os dados de difração foram coletados no gerador de raios X Rigaku MicroMaxTM-007HF equipado com um detector de CCD Saturn 944 e um sistema de crio resfriamento X-stream 2000 (Rigaku) em relação a uma rotação de cristal de 240° com exposições de 2 min. por imagem de 0,25° e foram processados com o programa XDS (Kabsch W. 2010. Acta Crystallogr. D66:125-132). Os cristais pertencem ao grupo de espaço monoclínico P21 com parâmetros de célula de unidade: a = 141,1 A, b = 53,0 A, c = 143,4 A, α = 90°, β = 112,2°, y = 90°.

[00116] A estrutura de cristal do complexo ternário foi determinada em resolução de 3,5 A e refinada para o fator R cristalográfico de 26%. Os Fabs de C2177 e C2191 se ligam à CD27 em epitopos não sobrepostos espacialmente distintos (Figura 2). O Fab C2177 se liga à porção N-terminal (distal da superfície celular) do CD27. O epitopo cobre 700 A2 e inclui 9 resíduos: K5, S6, P8, H11, W13, G16, K17, H36, R37 (Figura 3). O parátopo é definido como resíduos de anticorpo em contato (dentro de 4 A) com o. antígeno. O parátopo C2177 inclui 5 resíduos de VL (Y31, Y36, Y53, N57, N96) e 9 resíduos de VH (S31, W33, Y52, D55, D57, Y101, Y102, D104, Y105) (Figura 3). Todos os 6 CDRs são envolvidos no reconhecimento de antígeno. H36 e R37 são os resíduos centrais do epitopo. Os mesmos se empilham contra Y31 de VL e Y102 de VH; H36 também forma uma ponte de sal para D104 de VH.

[00117] O Fab C2191 se liga à CD27 na superfície "lateral" (Figura 2) e cobre 800 A2 da superfície. O epitopo inclui 10 resíduos: F28, D43, P44, 146, P47, G48, V49, H60, S63, H66. O parátopo C2191 inclui 7 resíduos de VL (Y34, F36, Y53, L54, R96, L98, W100) e 8 resíduos de VH (S31, Y32, Y50, N57, Y59, R100, G101, N102) (Figura 4). As interações de anticorpo-antígeno são dominadas pelas interações hidrofóbicas entre os resíduos 44 a 49 do CD27 e um aplique hidrofó- bico nas VL CDRs.

[00118] A localização diferente dos epitopos C2177 e C2191 sugere mecanismos diferentes de ação desses anticorpos. C2191 provavelmente compete de maneira direta com CD70 ECD para a sobreposição de epitopos na superfície 'lateral' do CD27. O anticorpo C2177, pelo contrário, não compete com o mesmo epitopo, porém, ao invés disso, impede a aproximação das células contendo CD27 e CD70. Essa observação é sustentada pelo fato de que o C2191 impede a ligação de CD70 ECD a CD27 solúvel, considerando que o C2177 não impeça.

Exemplo 6: Modulação de anticorpo de resposta de linfócitos humanos

[00119] Um modelo de camundongo imunodeficiente, camundongos nulos NOD/SCID-IL2RY (NSG), foi desenvolvido para estudar os aspectos do controle de sistema imunitário humano por respostas de célula T (Markus G Manz & James P Di Santo Renaissance for mouse models of human hematopoiesis e immunobiology Nature Immunology 10, 1039 - 1042 (2009)). A transferência adotiva de PBMCs humanas em camundongos imuno-comprometidos (NSG) foi empregada para avaliar os efeitos de um anticorpo anti-CD27 no enxerto e/ou proliferação de células humanas. O modelo permite a avaliação dos efeitos de marcação de CD27 humana na produção de anticorpos e respostas mediadas por células T.

[00120] Os anticorpos C2177 e C2191 foram administrados no momento da transferência celular e, então, duas vezes por semana por 3 semanas. No dia 21, os camundongos foram sacrificados, as células foram purificadas a partir do sangue e do baço e subsequentemente caracterizadas por citometria de fluxo. CTLA4-lg (Orencia, BMS) foi incluído como um controle positivo para a imunossupressão. O enxer- to/expansão de células humanas foi medido através da avaliação da presença de células humanas CD45+ nas amostras de sangue e de baço.

[00121] Os camundongos foram estritamente monitorados e o momento do sacrifício foi determinado com base nos sintomas de XGVH de acordo com as diretrizes de bem-estar animal. As leituras experimentais usadas para avaliar os efeitos de tratamento de anti-CD27 incluíram: peso corporal (duas vezes por semana), sinais observáveis de XGVH (duas vezes por semana),. como postura, nível de atividade, arranjo, lesões na pele (em particular, ao redor dos olhos e orelhas) com o uso do sistema de pontuação 1 a 5, contagem absoluta de subconjuntos de células humanas e estado de ativação com o uso da aná-lise por citometria de fluxo de (1) PBMC humana injetada, (2) PB de camundongo (uma vez/semana), e (3) baço e medula óssea; determinação de lg, IgM e IgG humana total em soro, baço e BM com o uso de um ELISA e, mediante o sacrifício, histologia ou imunohistoquímica para determinar os níveis de infiltração humana em órgãos alvo, como fígado, rins, pulmões e baço.

[00122] Os grupos de tratamento foram da seguinte forma: PBMC (20 a 40 milhões de células por camundongo, intraperitoneal (i.p.)) PBMC + CTLA4-Ig (10 mg/kg) PBMC + anticorpo de controle de isotipo, 2x/semana por 3 semanas PBMC + anticorpo anti-CD27 2x/semana por 3 semanas

[00123] Os camundongos dosados com 10 mg/kg de mAbs anti- CD27, C2177 e C2191, (anticorpos de hibridoma quimerizados em uma estrutura de IgG4 humana (Ala/Ala, Ser->pro)) tinham de maneira estatística significativamente menos células CD45+ humanas em comparação a uma PMBC sozinha ou controle de isotipo em PMBCs isoladas das amostras de sangue e baço.

Exemplo 7: Adaptação de estrutura humana dos MABs C2177 e C2191

[00124] O sítio de ligação de antígeno e as regiões usadas para transferir a especificidade de antígeno a partir dos anticorpos C2177 e C2191 para a FR humana foram reclassificados como descrito em Ra- ghunathan G. US20090118127 A1, 2009. Em resumo, as regiões de ligação de antígeno foram definidas com o uso de diversos termos (análise em Almagro e Fransson, Front Biosci 13: 1619 a 1633, 2008). O termo "Regiões Determinantes de Complementaridade (CDRs)" tem por base a variabilidade de sequência (Wu e Kabat, J. Exp. Med. 132:211-250, 1970). Existem seis CDRs; três para VH (H-CDR1, H- CDR2, H-CDR3), e três para VL (L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). "Regiões hipervariáveis", "HVR’s" ou "HVL’s" referem-se às regiões de um domínio variável de anticorpo que são variáveis na estrutura, como definido por Chothia e Lesk (Chothia e Lesk, Mol. Biol. 196:901-917, 1987). Existem seis HVR’s, três para VH (H1, H2 e H3) e três para VL (L1, L2 e L3).

[00125] No método HFA, as regiões marcadas para transferir a especificidade do anticorpo. não humano para as FRs humanas (HFRs) são as CDRs como definido por Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991) exceto na região que corresponde à CDR-1 de VH. Para essa região, uma combinação de CDR e HVL (CDR-1 estendida de VH) é transferida a partir do anticorpo não humano para as FRs humanas (como fornecido nas Tabelas 30, 31, 34, 35). Além disso, variantes com uma CDR-H2 transferida mais curta (chamada Kabat-7 [Raghunathan G. US20090118127 A1, 2009]) são geradas e testadas. Seleção de FR Humana.

[00126] As FRs humanas definidas como as regiões nas regiões V não compreendidas no sítio de ligação de antígeno foram selecionadas dentre o repertório de genes IGHV, IGKV, IGKJ e IGHJ da linha germinativa humana funcional. O repertório de sequências de gene da linha germinativa humana foi obtido pesquisando-se a base de dados IMGT (Kaas, et al., Nucl. Acids. Res. 32, D208-D210, 2004; Lefranc M.-P et al., Nucl. Acids Res., 33, D593-D597, 2005) e compilando todos os alelos "01" como de 01 de outubro de 2007. A partir dessa compilação, os genes redundantes (100% idênticos em nível de ami- noácido) e aqueles com resíduos de cisteína não pareados foram re-movidos da compilação.

[00127] A seleção inicial de sequências humanas para HFR se baseou na similaridade entre sequências dos genes da linha germinativa IGHV humana de todo o comprimento da região VH de camundongo incluindo FR-1 a 3, assim como, H-CDR-1 e H-CDR-2. No próximo estágio, as sequências humanas foram classificadas de maneira ordenada com o uso de uma pontuação que leva em consideração tanto o comprimento das CDRs como as similaridade entre sequências entre as CDRs de camundongo e sequências humanas. Uma matriz de mutação padrão, como a matriz de substituição BLOSUM 62 (Henikoff e Henikoff, Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 10915-9, 1992) foi usada para alinhamentos de pontuação das CDRs de camundongo e as sequências humanas e uma grande penalidade foi aplicada se houvesse uma inserção e/ou deleção nos laços de CDR. A FR-4 foi selecionada com base na similaridade entre sequências dos genes IGHJ da linha germinativa (Kaas, et al., Nucl. Acids. Res. 32, D208-D210, 2004; Lefranc M.-P et al., Nucl. Acids Res., 33, D593-D597, 2005) com sequências C2177 e C2191 de anticorpos de camundongo. Um procedimento similar foi usado para escolher as FRs humanas para VL. IGVK, os genes da linha germinativa foram usados para selecionar FRs 1-3 e L-CDR 13. Os genes IGJK da linha germinativa foram usados para selecionar FR-4.

[00128] Além dos critérios de sequência, um modelo de homologia 3D para os fragmentos Fv foi construído com o uso de Modeler (Sali e Blundell. J. Mol. Biol. 234: 779, 1993) no pacote de programas disponível junto à Accelrys, Inc. Os modelos foram utilizados para análise das variantes de HFR, incluindo a caracterização de CDR e a avaliação de responsabilidades de capacidade de desenvolvimento. As considerações adicionais para seleção de variantes de HFR servem para minimizar o número de resíduos de metionina e triptofano expostos, eliminar os sítios de N-glicosilação potenciais e favorecer as linhas germinativas humanas com o perfil de expressão mais alto in silico (de Wildt, J. Mol. Biol. 185: 895, 1999).

[00129] Para a adaptação de estrutura de trajetória 1 e a otimização de C2177, seis variantes de VH e quatro VL HFR foram incluídas na biblioteca. As variantes de VH e VL HFR foram emparelhadas de uma maneira combinatória para produzir 24 pares de variantes de HFR mais 10 controles que emparelham todas as variantes de HFR. com a região V duplicada de C2177 mais o próprio C2177 parental para render um total de 35 combinações. De modo similar ao C2191, cinco variantes de VH e quatro de VL HFR foram emparelhadas de uma maneira combinatória para produzir 20 HFR mais 9 controles que combinam todas as variantes de HFR V emparelhadas com a região V duplicada de C2191 mais o próprio C2191 parental para um total de 30 variantes. O DNA que codifica os domínios variáveis selecionados foi recombi- nado com o uso de métodos-padrão para reunir os MAbs completos com IgG1 humana e regiões constantes kappa. O anticorpo quimérico de referência resultante de C2177, designado como M40, é compreendido de regiões variáveis H7 e L18. O anticorpo quimérico corres- pondente de C2191, designado como M41, é compreendido de regiões variáveis H10 e L20. Os mAbs foram transientemente expressados em placas de 48 poços em células HEK 293E. O fluido sobrenadante a partir das culturas foi testado para atividade de expressão e ligação 96 horas após a transfecção. O nível de expressão do mAb secretado foi avaliado com o uso da tecnologia Octet para medir a taxa de ligação de anticorpo aos biossensores de proteína A. O nível de expressão foi quantificado em comparação às amostras padrão de concentração de anticorpo conhecidas. Uma curva padrão de 8 pontos que consiste em uma diluição em série de 1:2 do anticorpo do isotipo idêntico. foi montada iniciando em 100 ug/ml. Os biossensores foram hidratados por 10 minutos em meio gasto, e a taxa de ligação das normas e amostras desconhecidas foi medida por 2 minutos. Os dados foram analisados usando a equação dose-resposta ponderada por 5 parâmetros e o algoritmo de taxa de ligação de coeficiente angular inicial. As amostras com expressão >1 ug/ml foram diluídas em 1 ug/ml com meio gasto e examinado com o uso de um ELISA de único ponto. Para esse ELISA, placas maxisorp pretas de 96 poços foram revestidas com 50 ul de 3 ug/ml de IgG FC anti humana de cabra diluída em tampão de carbonato-bicarbonato, pH 9,4 a 4C de um dia para o outro e, então, lavadas três vezes. com tampão de lavagem (PBS contendo Tween-20 a 0,05%), bloqueadas com solução de 300 μl de StartingBlock (Thermo Scientific) por 1 hora, então, lavadas como antes. As amostras ou normas foram diluídas em 100 ng/ml em meio gasto, e 50 ul foram adicionados à placa de ensaio à temperatura ambiente durante 1 hora com agitação. As placas foram lavadas três vezes e 50 ul por poço de CD27 ECD humana com marcador His foram adicionados em 60 ng/ml diluídos em tampão para testes (STF (salina tamponada com fosfato) com 1% SFB e 0,05% de Tween-20) e incubadas por 1 hora à temperatura ambiente. Após a lavagem, 50 ul por poço de penta-his conju- gada com peroxidase Qiagen a 1:2.000 diluições em tampão para testes foram adicionados e incubados 1 hora à temperatura ambiente com agitação. O Substrato BM ChemiLum. (BM Chemilum, POD, Roche) foi misturado através das instruções do fabricante, e 50 ul foram adicionados às placas após uma lavagem final. Após 10 minutos as placas foram lidas em leitor Perkin Elmer Envision.

[00130] Os resultados de triagem da biblioteca combinatória C2177 mostraram que todas as regiões V se ligam à CD27 com intensidades variáveis. Diversas variantes de HFR forneceram um sinal de ligação mais alto que a C2177 parental enquanto outras mostraram que a ligação era comparável ou inferior à parental. Todas as VLs se ligam ao antígeno em níveis detectáveis e não influenciam a ligação de variantes de HFR expressadas em níveis aceitáveis, porém, inferiores ao parental. Vinte e quatro dos anticorpos C2177 HFR. (combinações VH, VL) mostraram ligação e expressão de CD27 >1 ug/ml.

[00131] Os resultados da triagem da biblioteca combinatória C2191 mostraram que todas, exceto uma VH, se ligaram à CD27 com sinais variados. Com a exceção do emparelhamento com essa VH, todas as VLs mostraram ligação à CD27. Diversas variantes de HFR forneceram um sinal de ligação mais alto que a C2177 parental, enquanto outras mostraram que a ligação era comparável ou inferior à parental. Dezessete anticorpos C2191 HFR (combinações VH, VL) demonstraram ligação e expressão de CD27 >1 ug/ml.

[00132] Com base na afinidade de ligação relativa para a CD27 medida por ELISA, quinze variantes de C2177 e onze de C2191 foram escolhidas para expressão e purificação em escala piloto. A expressão em escala piloto foi transitoriamente realizada em células CHO-S a um volume de 750 ml. Os sobrenadantes coletados foram purificados através de cromatografia de Proteína A e as proteínas purificadas foram avaliadas para afinidade e atividade funcional.

[00133] As afinidades das variantes de MAb humano. HFR C2177 foram medidas por ressonância de plasma de superfície (SPR) com o uso de um sistema de matriz de interação de proteína ProteOn XPR36 (BioRad). As taxas de associação e dissociação de CD27 foram medidas para cada variante. A superfície de biossensor foi preparada acoplando-se de maneira covalente os anticorpos de IgG (Fc) antiHumana de cabra à superfície de um circuito integrado GLC (BioRad) com o uso das instruções do fabricante para química de acoplamento de amina. Aproximadamente 5.000 RU (unidades de resposta) do anticorpo foram imobilizadas. Os experimentos cinéticos foram realizados a 25 °C em tampão de corrida (STF (salina tamponada com fosfato), 0,01% de P20, 0,01% de BSA). 1:3 diluições em série de CD27 ECD humana, iniciando em 300 nM foram preparadas em tampão de corrida. Cerca de 350 RU de mAb foram capturadas em cada canal do circuito integrado de sensor. Um controle de anticorpo combinado com isotipo foi imobilizado no canal 6 e usado como uma superfície de referência. A captura do mAb foi seguida por uma injeção de três minutos (fase de associação) de antígeno a 30 ul/min, seguida por 10 minutos de fluxo de tampão (fase de dissociação). A superfície do circuito inte-grado foi regenerada através da injeção de 0,85% de ácido fosfórico a 100 ul/min. Os dados foram processados no software do instrumento. A subtração de referência dupla dos dados foi realizada subtraindo-se as curvas geradas pela injeção de tampão a partir das curvas de referência subtraídas para injeções de analito. A análise cinética dos dados foi realizada com o uso do modelo de ligação Langmuir 1:1 com ajuste global. O resultado para cada mAb foi relatado no formato de Ka (taxa de associação), Kd (taxa de dissociação), KD (Constante de dissociação de equilíbrio), e porcentagem de atividade. As afinidades das variantes de C2177 HFR eram similares ao mAb M40 parental, mostrando menos que uma alteração tripla em KD para todas as variantes. De modo similar, as afinidades das variantes de mAb humano HFR C2191 mostraram menos que uma diferença de duas vezes do mAb M41 parental.

[00134] A bioatividade das variantes de HFR foi medida através de sua inibição de indução mediada por CD70 de NFkB em um ensaio repórter luciferase. As células HEK foram transfectadas com um vetor de expressão de luciferase induzível por NFkB pGL4-32-NFkB-Luc2 (Promega), e plasmídio de expressão CD27 ou vetor vazio e incubado de um dia para o outro em meio de expressão Freestyle (Gibco, #12338). No dia seguinte, as células foram folheado em placas de cultura de 96 poços em 40 ul, e 50.000 células por poço. Então, 40 ul de anticorpos ou controles foram adicionados às células com o uso de uma diluição em série de 1:3, iniciando em 30 ug/ml de concentração em poço final, e incubados por 1 a 2 horas. Durante essa incubação, as células epissomais são preparadas para estimulação. Brevemente, as células aderentes foram ressuspensas com o uso de técnicas de cultura celular. padrão e incubadas por 1 hora com Mitomicina C a 25 ug/ml para interromper a expansão celular. Após a incubação, as células CD70+ foram lavadas em meio, diluídas, e 40 ul foram adicionados em 10.000 células por poço. As placas foram incubadas de um dia para o outro. No dia seguinte, o reagente Steady Glo (Promega) foi pre-parado através das instruções do fabricante e 120 ul foram adicionados por poço. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 20 minutos com agitação. A luminescência foi medida em um leitor Perkin Elmer Envision. Os IC50 das variantes C2177 HFR eram similares uns aos outros e ao MAb parental M40, na faixa de 0,11 nM a 0,21 nM. Os IC50 das variantes C2191 HFR também eram similares uns aos outros e ao M41 parental, variando de 0,13 nM a 1,39 nM.

[00135] A consideração das propriedades de afinidade, bioatividade e biofísicas levou à seleção da variante C2177 M69, compreendida das regiões variáveis H28 (SEQ ID NO: 111) e L35 (SEQ ID NO: 82), e a variante C2191 M91, compreendida das regiões variáveis H31 (SEQ ID NO: 131) e L42 (SEQ ID NO: 140), para maturação por afinidade. Um resumo de KDS, rendimento de purificação, ligação à CD27 ECD para os sobrenadantes de cultura celular ("ELISA"), e inibição (IC50) de resposta de NFKβ mediada por CD27 através da CD70 para o M40 parental e sua variante M69 HFR e para o M41 parental e sua variante M91 é mostrado na Tabela 4.Tabela 4.

Exemplo 8: Otimização de C2177 HFR MAB M69

[00136] O M69 tem uma afinidade ao redor de 1 nM para CD27 ECD humana e contém as mesmas CDRs que as C2177, e a CD27M40 parental HFA. A otimização de M69 envolveu múltiplas bibliotecas para aumentar a afinidade e remover sítios de PTM introduzidos ou identificados no processo.

[00137] Conforme descrito no Exemplo 9, uma abordagem de biblioteca de apresentação em bacteriófago paralela para HFR e otimização de C2177 identificou a diversidade na prolina na posição 52a de CDR-H2. Essa posição não foi selecionada aleatoriamente no design de biblioteca. A coestrutura dos Fabs C2177 e C2191 com CD27 (Exemplo 5) indica que P52a não é diretamente envolvido na ligação de antígeno. Todavia, a mutação nessa posição pode alterar a con formação de laço CDR-H2 e permitir interações mais otimizadas com CD27 através dos resíduos circundantes D27. Dessa forma, uma biblioteca foi projetada para diversificar aleatoriamente P52a e seus resíduos vizinhos Y52, G53 e D54 com o uso de mutagênese de NNK (biblioteca C27H28L2). Também, na otimização de trajetória 2, uma mutação Y32 para F em CDR-L1 mostrou ligação aprimorada. Dessa forma, uma. segunda biblioteca foi projetada com diversidade aleatória em Y32 em conjunto com a diversidade nos resíduos Y30a, D30d, A50, que se situam no mesmo plano estrutural que Y32 (biblioteca C27L35L2).

[00138] Além disso, os laços CDR-H3 e CDR-L1 completos foram avaliados com o uso de bibliotecas de diversidade limitada. As Tabelas 5 e 6 mostram o design dessas bibliotecas.Tabela 5. Design de maturação por afinidade de diversidade limitada para CDR-H3 (C27H28L3)

Tabela 6. Design de maturação por afinidade de diversidade limitada para CDR-L1 (C27L35L3)

[00139] As bibliotecas Fab foram construídas em um sistema de exibição Fab de bacteriófago pIX conforme descrito no documento n° W02009/085462, Shi et al, J Mol Biol 397: 385-396 (2010), e Tornetta et al. J Immunol Methods 360: 39-46 (2010) com modificações menores nos sítios de enzima de restrição. Essas bibliotecas foram submetidas a panning contra a CD27-ECD biotinilada de acordo com os esquemas de panning conhecidos na técnica, como descrito no documento n° W02009/085462 e em Shi et al, J Mol Biol 397: 385-396 (2010), direcionados ao. aumento de afinidade selecionando-se uma taxa de dissociação mais lenta ou taxa de associação mais rápida. O bacteriófago foi produzido por infecção de bacteriófago auxiliar. 0s li- gantes foram recuperados pela adição de microesferas para formar um complexo de microesfera/antígeno/bacteriófago. Após a lavagem final, o bacteriófago foi resgatado por infecção de células de Escherichia coli TG-1 de crescimento exponencial. O bacteriófago foi novamente produzido e submetido a ciclos adicionais de equilíbrio.

[00140] Para triagem de acompanhamento, o DNA foi preparado a partir de estoques de glicerol de rodadas submetidas a panning de bacteriófago e o gene pIX foi excisado por digestão Nhel/Spel. Após a ligação, o DNA foi transformado em células TG-1 e cultivado em placas de ágar LB de um dia para o outro. No dia seguinte, as colônias foram selecionadas, cultivadas de um dia para o outro e as culturas usadas para (i) PCR de colônia e sequenciamento das regiões V e (ii) indução de produção de Fab. Para a produção de Fab, a cultura de um dia para o outro foi diluída 10 a 100 vezes em novo meio e cultivada por 5 a 6 horas a 37 °C. A produção de Fab foi induzida mediante a adição de meio fresco contendo IPTG e as culturas foram cultivadas de um dia para o outro a 30 °C. No dia seguinte, as culturas foram rapidamente centrifugadas e os sobrenadantes, contendo as proteínas de Fab solúveis, foram usadas para ELISA de Fab. Para o ELISA, as proteínas Fab solúveis foram capturadas sobre placas através de um anticorpo anti-Fd(CH1) policlonal. Após a lavagem e o bloqueio, a CD27 ECD humana biotinilada foi adicionada a 0,2 nM de concentração. Essa concentração permite a classificação de variantes de Fab, definida como ligação percentual do original, na qual o Fab original, presente como um controle em todas as placas, é definido como ligação a 100%. A CD27 ECD biotinilada foi detectada por estreptavidina conjugada por HRP e leitura por quimioluminescência em um leitor de placa. Nessa concentração de CD27, a classificação das variantes de Fab normalizadas para o Fab parental é possível. Através desse critério, 10 cadeias pesadas e 6 cadeias leves que ligam CD27 humana a 100% ou superior em relação ao M69 Fab foram selecionadas.

[00141] A partir da biblioteca CDR-H2 (C27H28L2), o Y parental foi predominantemente selecionado na posição 52 que indica a preferência por esse resíduo. Na posição 52a, P foi substituído pelos resíduos A, S, V, e G entre os Fabs com a melhor atividade de ligação. Na posição 53, o G parental foi selecionado em conjunto com R e N. Na posição 54, apenas o D parental foi recuperado. Nove clones a partir dessa biblioteca (Tabela 7) foram subclonados em vetores de IgG para expressão e caracterização como mAbs.Tabela 7. Nove clones VH selecionados a partir da biblioteca de diversidade completa C27H28L2

[00142] Para a biblioteca CDR-H3 (C27H28L3), as únicas diversidades recuperadas foram S95A e A101G. Um clone a partir dessa biblioteca contendo ambas as mutações (Tabela 8) foi subclonado nos vetores de IgG para expressão e caracterização como um mAb.Tabela 8. Clone VH único selecionado dentre C27H28L3

[00143] Para a biblioteca L-CDR1 (C27L35L2) de quatro posições, a posição 30a mostrou enriquecimento dos Y e W parentais. Na posição 30d, os resíduos S, H, e E foram enriquecidos em conjunto com o D parental. Na posição 32, o Y parental foi substituído por F e W. Na posição 50, T foi preferencial em relação ao A parental. Em geral, os melhores clones tinham mais cadeias laterais hidrofóbicas em comparação ao parental. Cinco clones a partir dessa biblioteca (Tabela 9) foram subclonados nos vetores de IgG para expressão e caracterização como mAbs.

[00144] Para a biblioteca CDR-L1 completa com diversidade limitada. (C27L35L3), apenas uma sequência foi recuperada, com a única diferença que o Y32 parental é alterado para F, similar à biblioteca VL. de quatro posições acima. Essa biblioteca CDR-L1 completa não inclui um F na posição 32 e, dessa forma, o clone recuperado era provavelmente um contaminante a partir da biblioteca VL de quatro posições. Esse clone (L255) foi subclonado nos vetores de IgG para expressão e caracterização como um mAb (Tabela 9).Tabela 9. Seis clones VL selecionados dentre C27L35L1 e C27L35L2

[00145] As 6 cadeias leves variantes foram emparelhada com as 10 cadeias pesadas variantes para render 60 combinações que eram células HEK293E expressadas. Os sobrenadantes foram examinados para o nível de expressão, ligação à CD27 ECD humana conforme medida por ELISA e afinidade conforme medida em um instrumento ProteOn. O nível de expressão de todas as variantes foi suficiente pa ra propósitos de triagem. A afinidade foi aumentada até 40 vezes para algumas variantes. Dois mAbs M596 e M600 foram selecionados para mutagênese adicional para remover sítios potenciais de modificação pós-traducional. As combinações de cadeia VH e VL para esses mAbs são fornecidas na Tabela 10. Os anticorpos diferem em apenas dois resíduos em suas cadeias leves.Tabela 10. Emparelhamento de cadeia pesada e leve de condutores maturados por afinidade de C2177 selecionada

[00146] M596 difere da molécula parental M69 em três posições:P52aA em CDR-H2, Y32W em CDR-L1 e A50T em CDR-L2. M600 difere da M69 em duas posições: Mutação P52aA em CDR-H2 e Y32F em CDR-L1.

[00147] Três sítios de modificação pós-traducional potencial compartilhados foram identificados em M596 e M600. Há um sítio de glico- silação n-ligado potencial na posição N58 em CDR-H2 e dois sítios de isomerização potencial em CDR-H2 e CDR-L1 codificada por "DG" e "DS", respectivamente. Além disso, M596 contém um resíduo de. trip- tofano de linha não germinativa em CDR-L1 que pode ser suscetível à oxidação.

[00148] Para eliminar o risco de glicosilação, três substituições únicas individuais foram criadas em N58 e uma em S60 (Tabela 11). As construções foram expressadas em células HEK293E e os sobrena- dantes foram avaliados para afinidade com CD27 com o uso do ins- trumento ProteOn. Todas as variantes tinham afinidades próximas àquelas dos parentais que eram 25 pM e 49 pM para. M596 e M600, respectivamente. As variantes M680 e M678, ambas derivadas de M600, foram selecionadas para avaliação de substituições adicionais para eliminar os sítios de isomerização. As variantes M680 e M678 têm A nas posições 60 e 58, respectivamente, e têm a vantagem adicional de ausência do triptofano em CDR-L1 que era presente no M596 parental.Tabela 11.

[00149] Para avaliar o impacto da mutação dos sítios de isomerização potenciais em M678 e M680, uma biblioteca pequena foi projetada para remover ambos os sítios paralelamente. Cada mutação foi individualmente substituída por CDR-H2 das cadeias pesadas ou CDR-L1 da cadeia leve comum e, então, emparelhada em uma biblioteca combinatória. A diversidade dessa biblioteca é mostrada na Tabela 12.Tabela 12

[00150] Esses mAbs foram expressados e a afinidade foi avaliada quanto às variantes de sítio de glicosilação. A mutação D34E no sítio de isomerização potencial CDR-L1 levou a um aumento de duas vezes consistente em afinidade e, portanto, esse sítio foi corretamente removido. A mutação D54E no sítio de isomerização potencial CDR-H2 reduziu a afinidade mais de dez vezes. Entretanto, a mutação G55A não afetou significativamente a afinidade. As variantes M703 e M706 mantêm a afinidade do M600 parental e têm um risco reduzido de impacto na função de PTM. A Tabela 13 mostra as variantes selecionadas a partir de cada estágio da avaliação de risco PTM, seu emparelhamen- to de cadeia pesada e leve, afinidade e modificações de sequência nas CDRs. A mutação selecionada para remover o sítio de glicosilação potencial é sublinhada. As mutações para remover os dois sítios de isomerização potenciais são em negrito e duplamente sublinhadas.Tabela 13.

Exemplo 9: HFR Combindada e otimização de C2177 MAB

[00151] Nessa abordagem, um conjunto limitado de variantes HFR foi avaliado em um formato Fab para expressão, exibição e ligação pIX e os melhores candidatos foram, então, avançados para a otimização. As CDRs de C2177 eram estruturas humanas adaptadas a duas cadeias pesadas VH5-51 (SEQ ID NO: 102 H24). e VH1-46 (SEQ ID NO: 106 H25) e duas cadeias leves Vk4-1 e Vk012 (SEQ ID NO: 90 L36). Esses domínios variáveis de HFA foram emparelhados em conjunto em uma matriz 2x2 como Fabs com regiões constantes CH1 e Ck humanas no vetor de exibição de bacteriófago Fab pIX. A variante VH1- 46/Vk012 (M55, H25/L36) mostrou ligação à CD27 e boas características de exibição e foi selecionada para construção de bibliotecas de maturação por afinidade.

[00152] As bibliotecas Fab para exibição de bacteriófago pIX foram construídas, conforme descrito acima para o Exemplo 8. Com base na coestrutura experimental de CD27 com C2191 e C2177 (Exemplo 5), as bibliotecas de diversidade foram projetadas em resíduos CDR e ao redor do parátopo de anticorpo. A ênfase na variação foi nas CDRs L1, L3, e H2. Um total de 4 a 6 resíduos dentro de uma CDR individual foi diversificado com um códon NNK, que codifica todos os 20 aminoácidos. O tamanho de cada biblioteca foi estimado em <6 x 107 variantes, que pode ser coberto com o uso de técnicas de clonagem de endonuclease de restrição de biblioteca padrão. A Tabela 14 mostra os resíduos que foram submetidos à diversificação completa nas bibliotecas CDR diferentes.Tabela 14: Projeto de biblioteca de maturação por afinidade para C2177

[00153] As bibliotecas Fab exibidas na proteína de revestimento do bacteriófago IX foram tomadas em panorâmica contra hCD27ECD/Fc biotinilada. O bacteriófago foi produzido através da infecção de bacteriófago auxiliar de uma biblioteca de plasmídeo das variantes. Os li- gantes foram recuperados pela adição de microesferas magnéticas revestidas com estreptavidina para formar um complexo de microesfe- ra/antígeno/bacteriófago. Após a lavagem final, o bacteriófago foi resgatado por infecção de células de Escherichia coli exponencialmente desenvolvidas MC1061F’. O bacteriófago foi novamente produzido e submetido a ciclos adicionais de equilíbrio. Fab solúvel a partir de clones selecionados foi produzido e avaliado para atividade de ligação conforme descrito para a trajetória 1. Acessos foram obtidos apenas a partir das bibliotecas CDR-L1 e CDR-L2. Vinte e um clones a partir dessas duas bibliotecas demonstraram ligação maior que aquela do HFR Fab parental. Os clones contendo C ou M nas sequências diversificadas foram descartados. Dez Fabs foram convertidos para expressão em um plano de fundo IgG4SPAAa/kappa para caracterização adicional. A cadeia pesada IgG4PAA é a IgG4 humana contendo uma substituição de. serina por prolina na região de dobradiça (Angal et al., Mol Immunol 30: 105 (1993) e substituições de alanina em duas posições em CH2 (ML Alegre et al, Transplantation; 57: 1537-43 (1994)). Os mAbs foram produzidos em células HEK293E como réplicas dos Fabs e como uma matriz de combinações de cadeia pesada e leve. A afinidade foi medida em um instrumento ProteOn usando os sobrena- dantes de cultura (Tabela 15). A mutação de P52a para Q (M158) ou S (M157) em CDR-H2 diminuiu a KD 6 vezes em comparação com aquela do mAb parental (M159). A mutação Y36F em CDR-L1 (M149) diminuiu a KD 4 vezes e a adição de mutações G33H e D34E (M155) levou a uma redução de 6 vezes na KD. A combinação da mutação P52S com Y36F (M160) ou Y36F mais G33H e D34E diminuiu a KD 20 vezes a 100 pM. As combinações de substituições em M158, M160 e M166 foram selecionadas para caracterização adicional.Tabela 15: Painel inicial de mAbs derivados das bibliotecas de maturação Fab

[00154] As proteínas M158, M160 e M166 foram produzidas em culturas de 750 ml de células HEK293, purificadas e analisadas para cinética de ligação à CD27-His em Biacore. Os valores KD foram cerca de 1 log mais alto que aqueles medidos pelo ProteOn com sobrena- dantes brutos, porém, mostraram os mesmos valores em relação uns aos outros (Tabela 16).Tabela 16

[00155] Ao reavaliar as combinações HFA originais, a VH adaptada à VH5-51 mostrou uma KD duas vezes mais baixa que a estrutura VH1-46. A mutação P52aS em H-CDR2 foi introduzida na VH VH5-51 que cria H221. H221 foi expressada com as cadeias leves L220, L219 e L217 a partir do mAb parental HFA (M159) e as variantes aprimoradas por afinidade M160 e M166, respectivamente, para gerar mAbs M171, M169 e M170. As medições cinéticas BIAcore nos mAbs purificados mostrou um aprimoramento de duas vezes na KD em comparação às variantes VH1-46 correspondentes (compare as Tabelas 16 e 17).Tabela 17

[00156] A análise de sequências de M160, M169 e M170 identificou um sítio de isomerização potencial em D54-G55 e um sítio de desami- dação potencial em N61-G62 em CDR-H2 de H196 e H221. Adicionalmente, um sítio de isomerização potencial foi identificado em D34 dentro de CDR-L1 de L219. As mutações foram introduzidas para remover esses sítios e avaliadas para seu impacto na atividade (Tabela 18). Os mAbs purificados foram analisados para afinidade com CD27- His em ProteOn. As mutações não tiveram nenhum efeito ou um efeito positivo na KD. Por exemplo, tanto M668 como M671 teve quase 2 vezes menos KDS que seus mAbs parentais, M160 e CM169, respectivamente.Tabela 18:. variantes de mAb com sequências PTM mutadas

Exemplo 10: Otimização de C2191 HFR MAB M91

[00157] Os métodos aplicados para a otimização do M91 (H31/L42) foram conforme descrito no Exemplo 8 exceto conforme observado. Uma varredura de alanina/linha germinativa das CDRs de C2191 foi executada em um formato Fab para avaliar as posições importantes para interação com CD27, com o uso das regiões VH e VL parentais C2191 em um formato Fab com regiões constantes Chi e Ck humanas. As bibliotecas substituíram os resíduos nas CDRs com alanina ou o resíduo presente na sequência de linha germinativa correspondente. Algumas posições nas CDRs foram excluídas à medida que as mesmas têm baixa ou nenhuma exposição a solvente com base na modelagem e, subsequentemente, na estrutura determinada (Exemplo 5). As mutações somáticas putativas mutadas de volta aos aminoácidos de linha germinativa de camundongo para avaliar sua contribuição com a afinidade de anticorpo. Brevemente, as regiões V de camundongo foram clonadas no vetor de exibição Fab pIX e a ligação da pro-teína CD27-ECD humana biotinilada foi verificada por ELISA. As mutações únicas (de acordo com o design de biblioteca) foram introduzidas por mutagênese sítio-dirigida, realizadas essencialmente conforme descrito por Stratagene (La Jolla, CA, USA). Os mutantes confirmados por sequência foram cuidadosamente selecionados em novas placas e cultivados em conjunto com o Fab parental e Fabs de controle negativo. Os variantes de substituição de único aminoácido finais foram gerados em E. coli e então, examinados para expressão e ligação de CD27 por ELISA. Os sinais de expressão e ligação para os clones parentais foram medidos e ajustados em 1,0 e os sinais dos mutantes foram normalizados em relação ao parental. Duas formas de antígeno foram usadas nos ELISAs: CD27 ECD(1 a 173 resíduos) e quimera de CD27 ECD-Fc (R&D Systems).

[00158] Os resultados dessa varredura acoplados à estrutura co- cristalina proporcionaram a base para o design de bibliotecas de maturação por afinidade. Para a cadeia pesada; as posições selecionadas para a variação foram T33 em H-CDR1 e Y50, S52, S52a, N56 e Y58 em CDR-H2 (Tabela 23). T33 não é um resíduo de contato, porém, uma ligação aprimorada por mutação de T33A. As posições S52 e S52a não são resíduos de contato, porém, as substituições na varredura mostraram alguma ligação aumentada. As tirosinas nas posições 50 e 58 são ambas sítios de contato e as substituições nesses sítios foram selecionadas na trajetória de otimização paralela descrita no Exemplo 11. A posição N56 não foi avaliada na varredura de alani- na/linha germinativa, porém, é um sítio de contato e adjacente à T33, S52, e S52a na estrutura de cristal. Para a cadeia leve, as posições selecionadas para variação foram T30a, S30b, G30c e Y30d em. CDR- L1 e L50 e N53 em CDR-L2 (Tabela 23). Nenhum desses resíduos entra em contato diretamente com o antígeno, porém, são adjacentes aos re-síduos que ficam em contato, cuja varredura mostrou ter um impacto negativo substancial na ligação. Uma mutação L50A teve um efeito moderado na ligação e, na estrutura de cristal, é o único resíduo em CDR-L2 provavelmente em contato com o antígeno. Além disso, N53 foi selecionado para diversificação limitada. Duas bibliotecas paralelas foram construídas, uma com Y30d mutado para W, e outra com Y30d mantido como Y, uma vez W pode tornar o parátopo mais hidrofóbico e dessa forma menos desenvolvível. As Tabelas 19 e 20 abaixo mostram os designs de biblioteca de maturação por afinidade VH e VL para M91.Tabela 19.

Tabela 20.

Duas bibliotecas separadas contendo Y ou W nessa posição foram criadas

[00159] As bibliotecas Fab exibidas na proteína de revestimento de bacteriófago IX foram submetidas a panning contra a CD27-ECD bioti- nilada. Um total de 12 variantes de cadeia pesada e 12 de cadeia leve foi selecionado que se liga à CD27 igualmente ou melhor que o Fab quimérico parental de C2191. As variantes foram convertidas em anticorpos IgG1/kappa, produzidas em células HEK293E como 144 combinações, e os sobrenadantes de cultura foram avaliados para ligação por ProteOn. Aumentos significativos (>100 vezes) em afinidade foram observados para algumas variantes. Dos 144. emparelhamentos VH e VL, 8 foram selecionados para caracterização adicional (Tabela 21). Esses mAbs foram classificados em três subgrupos: As variantes do grupo 1 têm a mesma cadeia pesada (H227, SEQ ID NO: 133) emparelhada com quatro cadeias leves diferentes, enquanto cada grupo 2 e grupo 3 tem uma cadeia leve emparelhada com duas cadeias pesadas diferentes. As quatro cadeias leves selecionadas variaram em todas as quatro posições diversificadas em CDR-L1 (RASKSVSX1X2X3X4SFMH) (SEQ ID NO: 158); onde X1 é A, E, H ou L; X2 é D, G, V ou W; X3 é G ou R; e X4 é W ou Y). Elas também variaram em ambas as posições diversificadas em CDR-L2 (X1ASX2LES) (SEQ ID NO:171); onde X1 é L ou V; e onde X2 5 K, N ou R). CDR-L3 foi inalterada a partir da sequência L42 (SEQ ID NO: 140) e é QHSRELPWT.Tabela 21. Emparelhamento de sequências de cadeia pesada e leve de condutores maturados por afinidade 2191 selecionada

[00160] Essas oito variantes foram produzidas por expressão temporária em células HEK293E em um volume de 750 ml. Os sobrenadantes colhidos foram purificados através de cromatografia de proteína A, e cada variante foi analisada por SDS-PAGE e SE-HPLC para determinar a pureza da amostra e a porcentagem de monômero na amostra purificada. Todas as variantes foram superiores a 90% puras e superiores a 90% monoméricas. Para avaliar as propriedades de associação dos anticorpos, os fatores de retenção(k’) foram determinados realizando-se a cromatografia de interação cruzada para cada variante purificada (Jacobs SA, Wu SJ, Feng Y, Bethea D & cromatografia de interação cruzada O'Neil KT (2010): um método rápido para identificar candidatos de anticorpo monoclonal altamente solúveis. Pharm Res 27, 65-71). Nesse método, os anticorpos de amostra foram passados através de uma coluna acoplada à IgG humana e avaliados para retenção em relação aos anticorpos de controle. Brevemente, 50 mg de IgG humana (Sigma Aldrich) foram acoplados a uma coluna de 1 ml de NHS-Sefarose (GE Healthcare) seguindo as instruções do fabricante. A IgG desacoplada foi removida por lavagem com 0,1 M de Tris, pH 8, 0,5 M de NaCl e grupos de NHS não reagido foram bloqueados com o mesmo tampão. A eficiência de acoplamento foi determinada mediante a medição da concen-tração de proteína permanecendo no tampão de acoplamento não reagido e lavagens com o uso do Kit de Ensaio Coomassie Plus da Pierce (Thermo Pierce) e subtraindo da quantidade de proteína antes da imobilização. Uma coluna de controle também foi preparada com o uso do mesmo protocolo, porém, sem conjugação de IgG para a resina. A coluna de controle foi testada primeiro em um HPLC Dionex UltiMate 3000 após ser equilibrada com PBS, pH 7 a uma taxa de fluxo de 0,1 ml/min. 20 μl da solução estoque de proteína foi injetada primeiro para assegurar que os sítios de ligação não específica sejam bloqueados seguido de 20 μl a de acetona a 10% para verificar a integridade da coluna. As amostras a serem analisadas foram diluídas a 0,1 mg/ml em PBS, pH 7. 20 ul de cada amostra foram injetados em cada coluna e foi permitido o teste a 0,1 ml/min por 30 min. Os tempos de permanência foram anotados e o fator de retenção (k’) foi calculado para cada variante. O valor de k foi calculado como a diferença nos tempos de permanência na IgG e colunas em branco. Todas as variantes foram purificadas até mais do que 90% de pureza com base no SDS-PAGE e SE-HPLC. Todos os valores de k foram calculados para serem menores do que 0,3, indicati- vos de boas propriedades de solução (Tabela 22).Tabela 22. Análise por batelada de variantes maduras purificadas por afinidade

[00161] Os oitos mAbs variantes e a HFR parental foram avaliados acerca de sua afinidade ao CD27 ECD por BIAcore e seu IC50 no ensaio de Kβ-reporter. As constantes cinéticas e a afinidade foram medidas por BIAcore. A Tabela 23 resume os dados coletados sobre essas variantes. A expressão e sinal de ELISA para ligação com CD27, conforme medido a partir dos sobrenadantes de cultura pequena inicial também estão incluídos nessa tabela.Tabela 23: Resumo de dados de subconjunto de biblioteca C2191 AM

Exemplo 11: Otimização e HFR combinada de mAb C2191

[00162] Nessa abordagem, um conjunto limitado de variantes de HFR foi avaliado em um formato de Fab acerca da expressão, ligação e exibição de pIX e os melhores candidatos foram, então, avançados na otimização. CDRs de C2191 foram adaptadas por estrutura humana em duas cadeias pesadas (VH3-23 e VH3-11) e duas cadeias leves (Vk4-1 e Vk012). Esses domínios variáveis de HFA foram pareados em conjunto em uma matriz de 2x2 como Fabs com regiões constantes de CH1 e Ck humano no vetor de exibição de bacteriófago de Fab pIX. A variante VH3-23/Vk012 (H39 (SEQ ID NO: 145)) e L40 (SEQ ID NO: 137) mostrou ligação a CD27 e boas características de exibição e foi selecionada para a construção de bibliotecas de maturação por afinidade. Esse Fab é mencionados como "parental".

[00163] Para a seleção de anticorpos com afinidade aperfeiçoada, múltiplos resíduos em todas as CDRs, exceto CDR-H3 de H39, foram completamente diversificados com o uso de códons degenerados NNK (Tabela 24). Cada biblioteca de CDR foi construída separadamente e submetida ao panning de bacteriófago para seleção de variantes matu- radas por afinidade. Tabela 24: design de biblioteca de maturação por afinidade para variantes C2191

[00164] As bibliotecas de C2191 com diversidade em CDR-H2, CDR-L1 ou CDR-L2 rendeu 50 Fabs únicos com ligação aperfeiçoada a CD27 humano em relação ao Fab de HFR parental, conforme medido no ELISA de ponto único. Esses clones foram adicionalmente classificados em um ELISA de múltiplo ponto e dezessete clones foram selecionados para conversão para IgG4alaala/kappa humana para caracterização adicional (Tabela 25). Tabela 25: Fabs maturados por afinidade selecionados para conversão em IgG

[00165] Os mAbs de IgG1/k mAbs foram construídos como réplicas dos Fabs e como uma matriz de regiões variáveis de cadeia leve e pesada (Tabela 26) e testados acerca da afinidade de propriedades de solução. A forma mAb do Fab parental é denominada M131. M141 e M408 foram selecionados para caracterização adicional.Tabela 26: mAbs derivados de maturação por afinidade de Fab

Exemplo 12: Caracterização de mAbs maturados por afinidade

[00166] Os mAbs amadurecidos por afinidade selecionados a partir dos anticorpos de hibridoma C2177 e C2191 parentais foram otimizados por códon, introduzidos em um vetor diferente para a expressão dupla de cadeias leve e pesada, expressos em cultura de célula CHO- GS e purificados para caracterização adicional. As IDs desses anticorpos em relação às variantes maturadas descritas nos exemplos acima são mostradas na Tabela 27.Tabela 27.

[00167] Os dados resumidos para esses mAbs é mostrado abaixo para a análise KD por Biacore e o IC50 medido em um ensaio de gene- repórter NF-Kβ (Tabelas 28 e 29). Para esse ensaio repórter NF- Kβ, as células HEK-293F foram transfectadas com um total de 36 ng de DNA contendo tanto construções de CD27 humana como de luciferase, sob controle do NF-Kβ promoter. Os transfectantes HEK-293F foram colocados em placas de 5x104 células por poço em 40 μL Freestyle media (Gibco). placas de 96 poços. As diluições de mAbs de hibridomas anti- CD27 foram adicionadas à placa de ensaio em meio Freestyle para uma concentração final de 50 μg/ml com 1:3 diluições e as placas foram incubadas a 37 °C (5% de CO2) por uma hora. Para testar a capacidade mAbs para neutralizar a sinalização de CD70:CD27, células epissomais HEK-293E terminalmente irradiadas (4000 rads) foram adicionadas em 20% do número de células transfectantes CD27 à placa de ensaio. Para testar a atividade agonista do mAbs de hibridoma, a adição de células epissomais foi omitida. As placas de ensaio foram incubadas de um dia para o outro a 37°C (5% de CO2) e desenvolvidas com o uso do sistema de ensaio de Luciferase Steady-Glo® (Prome- ga) de acordo com as instruções do fabricante.Tabela 28. Caracterização de variantes maturadas derivadas de C2191

Claims (12)

1. Uso de um anticorpo CD27 humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, em que a dita região variável de cadeia leve compreende: uma sequência de aminoácidos de CDRL1 da SEQ ID NO: 62; uma sequência de aminoácidos de CDRL2 da SEQ ID NO: 68; e uma sequência de aminoácidos de CDRL3 da SEQ ID NO: 75, e em que a dita região variável de cadeia pesada compreende: uma sequência de aminoácidos de CDRH1 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 44 e 161; uma sequência de aminoácidos de CDRH2 da SEQ ID NO: 47; e uma sequência de aminoácidos de CDRH3 da SEQ ID NO: 58 caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medi-camento para uso em um método de inibição da produção de anticorpos de células B mediada por células T, compreendendo o contato de uma porção das células T de um sujeito com uma quantidade eficaz de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno; e a sua porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno inibe a ativação do CD27 nas referidas células T humanas na presença da proteína CD70 humana ou de uma porção da proteína CD70 humana.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos variável de cadeia leve e uma sequência de aminoácidos variável de cadeia pesada, em que a sequência de aminoácidos variável de cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 143 e a sequência de aminoácidos variável de cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 133.:

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, uma região constante de cadeia pesada de IgG4 e uma região constante de cadeia leve de IgG4.

4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:159 e a região constante de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:160.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o sujeito está sofrendo de um distúrbio inflamatório.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o distúrbio inflamatório é o lúpus eritematoso sistêmico.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o sujeito exibe uma resposta imune humoral específica de antígeno associada a um distúrbio selecionado do grupo que consiste em uma doença do sistema pulmonar ou pleural, uma doença do sistema nervoso central ou periférico, uma doença do olho ou sistema visual, uma doença do sistema gastrointestinal e digestivo, uma doença do sistema cardiovascular, uma doença infecciosa e uma infecção parasitária.

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno é administrada sistemicamente ao sujeito.

9. Uso de um anticorpo CD27 humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, em que a dita região variável de cadeia leve compreende: uma sequência de aminoácidos de CDRL1 da SEQ ID NO: 62; uma sequência de aminoácidos de CDRL2 da SEQ ID NO: 68; e uma sequência de aminoácidos de CDRL3 da SEQ ID NO: 75, e em que a dita região variável de cadeia pesada compreende: uma sequência de aminoácidos de CDRH1 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 44 e 161; uma sequência de aminoácidos de CDRH2 da SEQ ID NO: 47; e uma sequência de aminoácidos de CDRH3 da SEQ ID NO: 58 caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medi-camento para uso em um método de inibição da proliferação de células T naive, compreendendo o contato de um tecido com uma quantidade eficaz de uma ligação de anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno; e o anticorpo da porção de ligação ao antígeno inibe a ativação do CD27 nas referidas células T humanas na presença da proteína CD70 humana ou de uma porção da proteína CD70 humana.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos variável de cadeia leve e uma sequência de aminoácidos variável de cadeia pesada, em que a sequência de aminoácidos variável de cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 143 e a sequência de aminoácidos variável de cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 133.:

11. Uso de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, uma região constante de cadeia pesada de IgG4 e uma região constante de cadeia leve de IgG4.

12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:159 e a região constante de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:160.

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