CN116115542B - 一种发酵乳液、含其皮肤外用剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种发酵乳液、含其皮肤外用剂及其制备方法和应用。发酵乳液的制备方法包括如下步骤：步骤(1)：将酿酒酵母接种到包括大米、植物油和水的发酵底物中，经发酵培养，灭菌，制得物料A；其中，大米和植物油的质量比为(1～10)：1；步骤(2)：将植物乳杆菌接种到步骤(1)制得的物料A中，经发酵培养，灭菌，制得发酵乳液。本申请制得的发酵乳液与传统的乳液相比，在无需添加乳化剂、增稠剂、表面活性剂等成分的情况下，依然可表现出良好的保湿、抗炎和抗衰老功效，稳定性佳，感官评价良好，制备工艺简单，节约生产成本，使用安全性高，不易导致肌肤过敏。
Description
技术领域
本申请属于化妆品技术领域，尤其涉及一种发酵乳液、含其皮肤外用剂及其制备方法和应用。
背景技术
随着科技的飞速发展，人类物质生活条件改善，人口老龄化不断加剧，积极探索和开发美容护肤产品对减缓社会人口老龄化具有重要意义。使用具有保湿功效的乳液，使消费者保持皮肤水嫩，适当润肤的重要途径。目前市面上保湿类的乳液种类众多，保湿效果差异较大，常用乳液普遍由多元醇、基础油脂、乳化剂、表面活性剂等物质经乳化制得，但该些物质的缺点是被肌肤吸收的速度慢，不利于活性物质的渗透和吸收，现有乳化剂还会导致肌肤出现过敏等现象。
如何开发出一种具有良好保湿功效，且活性物质易被肌肤吸收，使用安全性高的乳液护肤产品，以满足市场多方面的需求，是本领域技术人员亟需解决的技术难题。
发明内容
本申请所要解决的技术问题是克服现有技术中，保湿类的乳液常由多元醇、基础油脂、乳化剂、表面活性剂等物质经乳化制得，但这些物质被肌肤吸收的速度慢，不利于活性物质的渗透和吸收，还会导致肌肤出现过敏等缺陷，而提供一种发酵乳液、含其皮肤外用剂及其制备方法和应用。本申请制得的发酵乳液与传统的乳液相比，在无需添加乳化剂、增稠剂、表面活性剂等成分的情况下，依然可表现出良好的保湿、抗炎和抗衰老功效，稳定性佳，感官评价良好，制备工艺简单，节约生产成本，使用安全性高，不易导致肌肤过敏。
本申请采用以下技术方案解决上述技术问题：
本申请提供一种发酵乳液的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤(1)：将酿酒酵母接种到包括大米、植物油和水的发酵底物中，经发酵培养，灭菌，制得物料A；其中，所述大米和所述植物油的质量比为(1～10)：1；
步骤(2)：将植物乳杆菌接种到步骤(1)制得的所述物料A中，经发酵培养，灭菌，制得所述发酵乳液。
步骤(1)中，所述大米可为市售的常规大米，例如东北大米。
步骤(1)中，所述大米在使用前还可进一步包括粉碎的操作，所述粉碎后的粒径可为50～100目。
步骤(1)中，所述植物油可包括澳洲坚果籽油、牡丹籽油、白池花籽油和青刺果油中至少一种。
步骤(1)中，所述水和所述大米的质量比可为(10～200)：1，较佳地为(20～100)：1，更佳地为(20～60)：1，例如25：1。
步骤(1)中，所述大米和所述植物油的质量比较佳地为(3～8)：1，更佳地为(3～5)：1。
步骤(1)中，所述发酵底物在使用前还可按照本领域常规包括灭菌的操作。
其中，所述发酵底物的所述灭菌的条件和方法可为本领域该类操作常规的条件和方法，一般可为高温灭菌法。
当采用所述高温灭菌法对所述发酵底物进行所述灭菌时，所述灭菌的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为110～125℃，更佳地为115～121℃。
当采用所述高温灭菌法对所述发酵底物进行所述灭菌时，所述灭菌的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为20～60min，更佳地为20～40min，例如30min。
其中，所述发酵底物经所述灭菌的操作后还可进一步包括冷却的操作，一般可为冷却至室温。
步骤(1)中，所述酿酒酵母可包括保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.17452的酿酒酵母。
步骤(1)中，所述酿酒酵母可按照本领域常规以酿酒酵母菌液的形式添加，所述酿酒酵母菌液中活菌数为105～109CFU/mL，较佳地为106～108CFU/mL。
步骤(1)中，单位体积的所述发酵底物中接种的所述酿酒酵母的数量可为本领域常规，较佳地为5×103～5×107CFU/mL，更佳地为5×104～5×106CFU/mL。
步骤(1)中，所述发酵培养可按照本领域常规在震荡培养箱中进行，所述震荡培养箱中摇床的转速可为150～300r/min，较佳地为150～250r/min，例如200r/min。
步骤(1)中，所述发酵培养的时间可为24～120h，较佳地为48～100h，例如96h。
步骤(1)中，所述发酵培养的温度可为25～38℃，较佳地为25～32℃，例如30℃。
步骤(1)中，所述灭菌的条件和方法可为本领域常规，一般可为高温灭菌法。
步骤(1)中，当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为90～125℃，更佳地为90～110℃，例如100℃。
步骤(1)中，当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为20～60min，更佳地为20～40min，例如30min。
步骤(1)中，所述灭菌的操作后还可进一步包括冷却至室温的操作。
步骤(2)中，所述植物乳杆菌可包括购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 20261的植物乳杆菌。
步骤(2)中，所述植物乳杆菌可按照本领域常规以植物乳杆菌菌液的形式添加，所述植物乳杆菌菌液中所述植物乳杆菌的浓度可为106～1010CFU/mL，较佳地为107～109CFU/mL，例如108CFU/mL。
步骤(2)中，单位体积的所述物料A中接种的所述植物乳杆菌的数量可为本领域常规，较佳地为104～108CFU/mL，更佳地为105～107CFU/mL，例如106CFU/mL。
步骤(2)中，所述发酵培养可为本领域常规使用的静置发酵。
步骤(2)中，所述发酵培养的时间可为12～24h，较佳地为12～18h。
步骤(2)中，所述发酵培养的温度可为30～45℃，较佳地为35～45℃，例如40℃。
步骤(2)中，所述灭菌的条件和方法可为本领域常规，一般可为高温灭菌法。
步骤(2)中，当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为90～125℃，更佳地为90～110℃，例如100℃。
步骤(2)中，当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为20～50min，更佳地为25～35min，例如30min。
步骤(2)中，所述灭菌的操作后还可进一步包括冷却和/或离心，收集上清液的操作。
其中，按照本领域常规，所述冷却可为冷却至室温。
其中，所述离心的转速可为本领域该类操作常规的转速，较佳地为3000～9000r/min，更佳地为4000～6000r/min，例如4800r/min。
其中，所述离心的半径可为本领域该类操作常规的半径，较佳地为8～15cm。
其中，所述离心的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为10～40min，更佳地为20～40min，例如30min。
其中，所述离心的操作后还可进一步包括二次灭菌和/或与防腐剂混合的操作。
所述二次灭菌的条件和方法可为本领域该类操作常规的条件和方法，一般可为高温灭菌法。
当采用所述高温灭菌法进行所述二次灭菌时，所述二次灭菌的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为100～125℃，更佳地为115～121℃。
当采用所述高温灭菌法进行所述二次灭菌时，所述二次灭菌的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为20～40min，更佳地为25～35min，例如30min。
与所述防腐剂混合的过程中，所述混合的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为50～80℃，更佳地为70～80℃。
与所述防腐剂混合的过程中，所述防腐剂可按照本领域常规包括对羟基苯乙酮和/或1,2-己二醇。
当所述防腐剂包括所述对羟基苯乙酮和所述1,2-己二醇时，所述对羟基苯乙酮占所述离心后制得上清液的质量百分数可为0.1％～1％，所述1,2-己二醇占所述离心后制得上清液的质量百分数可为0.1％～1％；较佳地，所述对羟基苯乙酮占所述离心后制得上清液的质量百分数为0.5％，所述1,2-己二醇占所述离心后制得上清液的质量百分数为0.5％。
本申请还提供一种发酵乳液，其由如上所述的发酵乳液的制备方法制得。
本申请还提供一种如上所述的发酵乳液直接作为产品、作为添加剂或作为基底在制备皮肤外用剂中的应用。
一些实施例中，所述发酵乳液可作为所述皮肤外用剂中的保湿活性成分、抗炎活性成分和抗衰老活性成分中至少一种。
其中，所述抗炎活性成分可为具有抑制细胞产生IL-1β炎症因子的抗炎活性成分；
其中，所述抗衰老活性成分可为具有促进弹性蛋白产生的抗衰老活性成分。
本申请还提供一种皮肤外用剂，其包括如上所述的发酵乳液。
一些实施例中，所述皮肤外用剂中还可进一步包括本领域常规使用的活性成分，一般可包括保湿活性成分、抗炎活性成分、抗敏活性成分和抗氧化活性成分中至少一种。
一些实施例中，所述皮肤外用剂可按照本领域常规包括但不限于面膜、精华或爽肤水。
一些实施例中，所述发酵乳液占所述皮肤外用剂的质量百分比可为5％～99％，较佳地为60％～99％。
一些实施例中，所述室温、常温一般指15～40℃。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本申请各较佳实例。
本申请所用试剂和原料均市售可得。
本申请的积极进步效果在于：本申请制得的发酵乳液与传统的乳液相比，在无需添加乳化剂、增稠剂、表面活性剂等成分的情况下，依然可表现出良好的保湿、抗炎和抗衰老功效，稳定性佳，感官评价良好，制备工艺简单，节约生产成本，使用安全性高，不易导致肌肤过敏。
附图说明
本申请可以通过参考下文中结合附图所给出的描述而得到更好的理解。所述附图连同下面的详细说明一起包含在本说明书中并且形成本说明书的一部分，而且用来进一步举例说明本申请的优选实施例和解释本申请的原理和优点。
其中：
图1为实施例1～4和对比例1～5制得产品处理受损HaCaT细胞后，细胞内炎性因子IL-1β的相对表达量对比图；
图2为实施例1～4和对比例1～5制得产品的抗衰老活性对比图；
图3为实施例1～4和对比例1～5制得产品分别在常温、-20℃和50℃条件下储存4周后的稳定性对比图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本申请，但并不因此将本申请限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例和对比例中，澳洲坚果籽油购自横关油脂工业株式会社；
下述实施例和对比例中，牡丹籽油购自菏泽市康普生物科技有限公司；
下述实施例和对比例中，青刺果油购自云南英格生物技术有限公司；
下述实施例和对比例中，白池花籽油购自江西鑫森天然植物油有限公司；
下述实施例和对比例中，使用的酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YWY-1，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101，保藏日期为2019年03月27日，保藏编号为CGMCC No.17452。
酿酒酵母菌液的制备方法包括如下步骤：将酿酒酵母(CGMCC No.17452)接种到YPD固体培养基中进行划线活化，于28℃培养箱中培养48h，获得单菌落；采用接种环挑取获得的单菌落于YPD液体培养基中，在温度为28℃，转速为180r/min的震荡培养箱中培养。
下述实施例和对比例中，植物乳杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 20261的植物乳杆菌。采用无菌水分散，配置成植物乳杆菌菌液。
下述对比例3中，嗜热链球菌为购自郑州和合生物工程技术有限公司，产品编号为HH-ST08的嗜热链球菌。采用无菌水分散，配置成嗜热链球菌菌液。
实施例1
步骤(1)：称取15g目数为100目的大米粉末、3g澳洲坚果籽油以及300mL去离子水混合，在温度为121℃的条件下灭菌30min，灭菌后冷却至室温，制得发酵底物；
在上述制得的发酵底物中接入酿酒酵母菌液(CGMCC No.17452)；其中，酿酒酵母菌液中活菌数为107CFU/mL，酿酒酵母菌液的添加量为15mL，在30℃震荡培养箱中发酵96h，震荡培养箱中摇床的转速为200r/min，发酵培养结束后，将得到的发酵乳液在温度为100℃的高温灭菌锅中灭菌30min，终止酿酒酵母发酵；灭菌后冷却至室温，制得物料A；
步骤(2)：向步骤(1)制得的物料A中接入植物乳杆菌菌液(CICC 20261)，其中，植物乳杆菌菌液中的活菌数为108CFU/mL，植物乳杆菌菌液的添加量为3mL，在40℃培养箱中静置发酵18h，发酵培养结束后，在温度为100℃的高温灭菌锅中灭菌30min，终止植物乳杆菌发酵，灭菌后冷却至室温，再进行离心，在离心半径为15cm，4800r/min条件下离心30min，得上清液，对上层液进行二次灭菌，在温度为100℃的灭菌锅中灭菌30min，避免离心过程中其它杂菌造成污染，灭菌完成后冷却至室温，即得发酵乳液。
实施例2
与实施例1相比，区别仅在于将步骤(1)中澳洲坚果籽油替换为等量的牡丹籽油，其他条件参数同实施例1，制得发酵乳液。
实施例3
与实施例1相比，区别仅在于步骤(1)中将澳洲坚果籽油替换为青刺果油和白池花籽油，其中油的总质量不变为3g，青刺果油与白池花籽油的质量比为1∶1，其他条件参数同实施例1，制得发酵乳液。
实施例4
与实施例1相比，区别仅在于步骤(1)中发酵底物的制备方法不同，其他条件参数同实施例1，制得发酵乳液；
发酵底物的制备方法具体为：称取12g目数为100目的大米粉末、4g澳洲坚果籽油以及300mL去离子水混合，在温度为121℃的条件下灭菌30min，灭菌后冷却至室温，制得发酵底物。
对比例1
与实施例1相比，区别仅在于不分步发酵，具体包括如下步骤：
称取15g目数为100目的大米粉末、3g澳洲坚果籽油以及300mL去离子水混合，在温度为121℃的条件下灭菌30min，灭菌后冷却至室温，制得发酵底物；
在上述制得的发酵底物中接入15mL酿酒酵母菌液(CGMCC No.17452)和3mL的植物乳杆菌菌液(CICC 20261)；其中，酿酒酵母菌液中活菌数为107CFU/mL，植物乳杆菌菌液中的活菌数为108CFU/mL；在30℃震荡培养箱中发酵96h，震荡培养箱中摇床的转速为200r/min，发酵培养结束后，将得到的发酵乳液在温度为100℃高温灭菌锅中灭菌30min，终止菌种发酵；灭菌后冷却至室温，即可。
对比例2
与实施例1相比，区别仅在于步骤(1)的发酵底物中不添加澳洲坚果籽油，步骤(2)结束后，将产物与3g澳洲坚果籽油混合，其他条件参数同实施例1，具体包括如下步骤：
步骤(1)：称取15g目数为100目的大米粉末和300mL去离子水混合，在温度为121℃的条件下灭菌30min，灭菌后冷却至室温，制得发酵底物；
在上述制得的发酵底物中接入酿酒酵母菌液(CGMCC No.17452)；其中，酿酒酵母菌液中活菌数为107CFU/mL，酿酒酵母菌液的添加量为15mL，在30℃震荡培养箱中发酵96h，震荡培养箱中摇床的转速为200r/min，发酵培养结束后，将得到的发酵乳液在温度为100℃的高温灭菌锅中灭菌30min，终止酿酒酵母发酵；灭菌后冷却至室温，制得物料A；
步骤(2)：向步骤(1)制得的物料A中接入植物乳杆菌菌液(CICC 20261)，其中，植物乳杆菌菌液中的活菌数为108CFU/mL，植物乳杆菌菌液的添加量为3mL，在40℃培养箱中静置发酵18h，发酵培养结束后，在温度为100℃的高温灭菌锅中灭菌30min，终止植物乳杆菌发酵，灭菌后冷却至室温，再进行离心，在离心半径为15cm，4800r/min条件下离心30min，得上清液，对上层液进行二次灭菌，在温度为100℃a的灭菌锅中灭菌30min，避免离心过程中其它杂菌造成污染，灭菌完成后冷却至室温；
步骤(3)：将步骤(2)中冷却后物料与3g澳洲坚果籽油混合均匀后采用均质机12000r/min均质10min，即可。
对比例3
与实施例1相比，区别仅在于将步骤(2)中植物乳杆菌菌液(CICC 20261)替换为3mL嗜热链球菌菌液HH-ST08(郑州和合生物工程技术有限公司)，嗜热链球菌菌液中活菌数为108CFU/mL，其他条件参数同实施例1。
对比例4
与实施例1相比，区别仅在于步骤(1)中发酵底物的制备方法不同，其他条件参数同实施例1；
发酵底物制备方法具体为：称取20g目数为100目的大米粉末、1g澳洲坚果籽油以及300mL去离子水混合，在温度为121℃的条件下灭菌30min，灭菌后冷却至室温，制得发酵底物。
对比例5
与实施例1相比，区别仅在于不进行步骤(2)的操作，其他条件参数同实施例1，即实施例1步骤(1)制得的物料A。
效果实施例1：安全性评价
人体斑贴试验主要是用于检测化妆品或原料的刺激性。根据《化妆品卫生规范》(2015)对实施例和对比例制得的产品进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其皮肤刺激性进行评估。
1、试验对象：
严格按照《化妆品接触性皮炎诊断标准及处理原则》要求，选择受试对象，皮肤的待测部位出现瘢痕、鲜红斑痣等影响结果判定的受试者、体质高度敏感者均不能参与试验。本试验选择合适的志愿者30人，年龄范围在18-60岁随机选择。
2、实验方法
分别将0.2mL上述实施例或对比例制得的产品滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。设置空白对照，即在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂蒸馏水。测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观察皮肤的反应，接着于24h后观察皮肤的反应，皮肤不良反应分级标准见表1。
表1皮肤不良反应分级标准
3、试验结果
结果参见表2，从表中可以看出；本申请实施例1～4制得的发酵乳液试敏结果都是阴性反应，说明本申请制得的发酵乳液具有良好的安全性和耐受性，不会给人体带来不良反应。而对比例1～5制得产品的使用安全性相对较差，部分受试者出现不良反应。
表2
效果实施例2：保湿性评价
根据《化妆品保湿功效评价指南》，用角质层含水量表示皮肤的水分含量，筛选出30位符合条件的志愿者参加测试，在温度为22±2℃，湿度为40％～60％的环境中，测试上述实施例和对比例制得产品对志愿者皮肤的保湿效果。
测试方法如下：
清洁皮肤15min后，测定双侧前臂本底值(未涂抹产品的皮肤)，取受试者双侧前臂内侧用记号笔画出面积为3.5×3.5cm正常皮肤，采用皮肤水分测试探头CorneometerCM825测试5min后、20min后、1小时后受试部位的皮肤含水量。将面膜布分别剪成3×3cm大小，分别贴在前臂相应标记处，把上述实施例或对比例制得的产品用胶头滴管滴在面膜布上，15min后取下面膜布，取下后分别在5min、20min、60min测试皮肤含水量，并计算与本底值相比含水量的提升值，提升值结果见表3。
表3
| 皮肤含水量提升值 | 5min(C.U.) | 20min(C.U.) | 60min(C.U.) |
| 实施例1 | 11.1 | 5.8 | 2.2 |
| 实施例2 | 12.6 | 6.5 | 3.1 |
| 实施例3 | 10.5 | 4.6 | 1.8 |
| 实施例4 | 9.7 | 3.8 | 2 |
| 对比例1 | 6.7 | 1.6 | -2.3 |
| 对比例2 | 5.8 | 1.7 | 0.3 |
| 对比例3 | 7.4 | 2.6 | 0.6 |
| 对比例4 | 7.1 | 1.9 | -0.8 |
| 对比例5 | 5.9 | 1.3 | -1.2 |
结果表明，上述实施例1～4制得的发酵乳液均具有良好的补水功效。对比例1～5制得产品的保湿功效要显著差于实施例制得的发酵乳液，并且对比例1、对比例4和对比例5制得产品在使用后60min时，不但不具有补水功效，皮肤含水量反而比本底值还低，说明使用这三组对比例制得的产品后，皮肤水分散失非常快，无法达到长期保湿的功效。
效果实施例3：炎性因子(IL-1β)的测定(修复细胞)
取对数期HaCaT细胞，以25万个/mL的密度将细胞悬浮液接种于6孔细胞培养板上，每孔加入2mL细胞悬液，培养12h；实验组和模型组采用40mJ/cm2的UVB照射细胞后，吸弃上清。空白组和模型组加入DMEM溶液2mL，实验组加入含有样品(样品体积百分数为0.1％)的DMEM溶液2mL处理细胞24h，处理结束后吸弃上清液，用PBS清洗2～3次细胞，然后细胞裂解液处理细胞，10000r/min 4℃下离心10min，取上清得到细胞裂解上清液。取20μL细胞裂解液用BCA试剂盒检测样品中的总蛋白含量；炎症因子的测定按照ELISA试剂盒说明书进行实验操作，于450nm处测定各OD值。
BCA试剂盒操作步骤：
1.样品前处理：根据使用量，按照RIPA∶PMSF为100∶1的比例配制裂解液，去培养液，用PBS清洗一边，按照6孔板每孔细胞量加入200μL裂解液的比例加入裂解液，用移液器吹打数下，使裂解液与细胞充分接触。
2.后处理：将裂解后的样品10000r离心10min，取上清，即可进行后续的蛋白浓度测定。
3.按照试剂(A)∶试剂(B)为50∶1的比例配置BCA工作液。
4.加入20μL待测蛋白样品于96孔板中。
5.各孔加入200μL配置好的BCA工作液，37℃放置60min。
6.于562nm下检测吸光度。
7.根据标准曲线与稀释倍数计算出样品的蛋白浓度。
ELISA试剂盒检测步骤：
1.试剂准备
1)试剂回温：首先在实验前30min将试剂盒回温，待测样本放置于室温下，浓缩洗涤液如出现结晶，放入37℃水浴中，直至结晶全部溶解。
2)配制洗涤液：预先计算好稀释后的洗涤液使用体积，然后用去离子水将20倍浓缩洗涤液稀释成1倍应用液，未用完浓缩洗涤液放入4℃保存。
3)样品梯度稀释：加入标准品/样本稀释液(SR1)1mL至冻干标准品中，静置15分钟，待其完全溶解后轻轻混匀(浓度1000pg/mL)。然后在其余6管中各加入500μL标准品/样本稀释液(SR1)，按照以下浓度进行倍比稀释：500、250、125、62.5、31.25、15.62、0pg/mL进行稀释，1000pg/mL为标准曲线最高点浓度，标准品/样本稀释液(SR1)作为标准曲线零点。复溶过的标准品原液(浓度为1000pg/mL)未用完的需废弃或者根据需要按照一次用量分装，并将其储存在-80℃冰箱。
4)生物素化抗体工作液：预先计算好试验所需用量，用检测稀释液(SR2)将100倍抗体浓缩液稀释成1倍应用工作液(稀释前充分混匀)，在30分钟内加入到反应孔中。
5)酶结合物工作液：按每次试验所需用量配制，用酶结合物稀释液(SR3)将40倍浓缩酶结合物稀释成1倍应用工作液(稀释前离心)，在30min内使用。
6)洗涤方法：甩尽酶标板孔中液体，在吸水纸上拍干，用洗瓶加入洗涤液300μL/孔，静止30s后甩净酶标板孔中液体，在吸水纸上拍干。
2.检测步骤
1)实验前30min，拿出试剂盒，恢复至室温，加入标准品/样本前，洗板三次并甩干。
2)加入100μL标准品/样品至反应孔中，封板后于37℃孵育90min，拍板并洗板4次。
3)加入100μL生物素化抗体工作液至反应孔中，封板后于37℃孵育60min，拍板并洗板4次。
4)加入100μL酶结合物工作液至反应孔中，封板后于37℃孵育30min，拍板并洗板5次。
5)加入50μL显色底物至反应孔中，封板后于37℃孵育箱避光显色15min。
6)加入50μL终止液，即刻用酶标仪450nm波长下测量OD值(5min内)。
根据上述测试得到的OD值，计算IL-1β的释放水平，结果见表4和图1，各炎症因子的释放量需要BCA含量校正。
根据标准曲线计算出炎症因子的表达量A，用蛋白质含量B进行校正得到C＝A/B，相对表达量＝C/C空白组；标准曲线：y＝0.0042x+0.1443。
图1中，*p＜0.05，表示与模型组相比有统计学差异；**p＜0.01，表示与模型组相比有显著性统计学差异，显著降低；***p＜0.001，表示与模型组相比有极其显著性统计学差异，极显著降低；###p＜0.001，表示与空白组相比有极其显著性统计学差异，极显著升高。
表4
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效果实施例4：弹性蛋白(ELN)测定
取对数成长期的人皮肤成纤维细胞，以50万/孔接种于6孔板中，置于培养箱37℃，5％CO2环境中培养过夜；实验组更换培养基，加入2mL用培养基稀释的样品，相当于加入体积终浓度为5％的待测液；模型组和空白组更换2mL新培养基，置于培养箱37℃，5％CO2环境中培养24h；培养后，除空白组之外的模型组和实验组均采用UVA照射，继续培养24h，培养后吸弃上清，用PBS清洗两遍，采用裂解液处理，得到细胞裂解液，于4℃，12000rpm的条件下离心10min，得到细胞裂解上清液。
1.1标准品配制：从CUSABIO公司生产的***性蛋白(ELN)酶联免疫试剂盒中取一只标准品，于6000rpm离心30s，用1mL样本稀释液溶解，并用枪头对准冻存管底部反复吸打5次助溶，充分混匀得到标准品S7，取7只1.5mL的EP管(S0-S6)依次排列，各加入350μL样本稀释液，吸取350μL标准品S7到第一个离心管(S6)，轻轻吹打均匀。从S6中吸取350μL到第二个EP管中(S5)，轻轻吹打均匀，以此类推进行标准品的倍比稀释，S0为样本稀释液。
b.洗涤工作液：浓洗涤液按1：25倍用去离子水进行稀释。
c.生物素标记抗体工作液：生物素标记抗体液按1∶100倍用生物素标记抗体稀释液进行稀释，取10μL生物素标记抗体加990μL生物素标记抗体稀释液，轻轻混匀，10min中内配好。
d.辣根过氧化物酶标记亲和素工作液：辣根过氧化酶标记亲和素按1:100倍用辣根过氧化酶标记亲和素稀释液进行稀释，取10μL辣根过氧化物酶标记亲和素加990μL辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液，轻轻混匀，10分钟内配好。
1.2具体实验操作流程
a.将各种试剂移至室温(18～25℃)平衡至少30min，按前述方法配制试剂，备用。
b.加样：分别设标准孔、待测样品孔。每孔分别加标准品或待测样品(上述配置的空白组、模型组或实验组待测液)100μL，轻轻晃动摇匀，覆上板贴，37℃温育2小时。
c.弃去孔内液体，甩干，不用洗涤。
d.每孔加生物素标记抗体工作液100μL，覆上新的板贴，37℃温育1小时。
e.弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡2min，200μL每孔，甩干。
f.每孔加辣根过氧化物酶亲和素工作液100μL，覆上新的斑贴，37℃温育1小时。
g.弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每次浸泡2分钟，200μL/每孔，甩干。
h.依次每孔加底物溶液90μL，37℃避光显色15～30min。
i.依次每孔加终止液50μL，终止反应。
j.在反应终止后5min内用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的OD值。
k.计算：根据浓度和OD值算出标准曲线和回归方程，具体为y＝3.7/[1+(x/74.26)-1.11]+0.039；并根据得到的回归方程和测得的待测样品的OD值计算待测样品中弹性蛋白的含量，结果见表5和图2(图2中，*p＜0.05，表示与模型组相比有统计学差异；**p＜0.01，表示与模型组相比有显著性统计学差异，显著升高；***p＜0.001，表示与模型组相比有极其显著性统计学差异，极显著升高；###p＜0.001，表示与空白组相比有极其显著性统计学差异，极显著降低)。
表5
根据表5结果可看出，本申请实施例1～4制得的产品具有理想的抗衰老功效，且抗衰老功效极显著高于对比例1～5制得的产品；采用本申请实施例1～4制得的产品处理的人皮肤成纤维细胞受UVA照射后，其中弹性蛋白含量与空白对照组更为接近，表现出理想的抗衰老功效。
效果实施例5：感官评价
对实施例1～4和对比例1～5制得的产品进行感官评价(保湿感、粘性、油光等)。以男女各24名，总48名经过训练的检查员为对象，对关于使用上述实施例或对比例制得产品的使用感的项目进行了评分(以5分为标准，1：非常不好、2：不好、3：普通、4：好、5：非常好)，结果见表6。
表6
根据表6结果表明，与对比例1～5制得的产品相比，实施例1～4制得产品的保湿效果更理想，且粘性小，使用后不易产生油光；从整理来看，使用者对实施例1～4制得产品的评价更高。
效果实施例5：稳定性考察
分别在常温、-20℃和50℃条件下对上述实施例和对比例制得产品的稳定性进行考察，考察周期为4周，结果见图3。
经过4周的稳定性考察发现，上述对比例1制备得到的产品在50℃和-20℃条件下不稳定，出现分层现象；对比例2制备得到的产品在不同条件下均不稳定，均出现分层现象；对比例3制备得到的产品在不同条件下均不稳定，出现分层现象；实施例1～4和对比例4～5制备得到的产品在不同条件下均稳定。
最后，还需要说明的是，在本申请中术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管上面已经通过本申请的具体实施例的描述对本申请进行了披露，但是，应该理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本申请的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本申请所要求保护的范围内。
Claims (24)
1.一种发酵乳液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)：将酿酒酵母接种到包括大米、植物油和水的发酵底物中，经发酵培养，灭菌，制得物料A；其中，所述大米和所述植物油的质量比为(1～10)：1；
步骤(2)：将植物乳杆菌接种到步骤(1)制得的所述物料A中，经发酵培养，灭菌，制得所述发酵乳液；
其中，步骤(1)中，所述酿酒酵母为保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.17452的酿酒酵母；步骤(2)中，所述植物乳杆菌为保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 20261的植物乳杆菌。
2.如权利要求1所述的发酵乳液的制备方法，其特征在于，所述发酵乳液的制备方法满足下述条件中至少一种：
步骤(1)中，所述大米在使用前还进一步包括粉碎的操作，所述粉碎后的粒径为50～100目；
步骤(1)中，所述植物油包括澳洲坚果籽油、牡丹籽油、白池花籽油和青刺果油中至少一种；
步骤(1)中，所述水和所述大米的质量比为(10～200)：1；
步骤(1)中，所述大米和所述植物油的质量比为(3～8)：1；
步骤(1)中，所述酿酒酵母以酿酒酵母菌液的形式添加，所述酿酒酵母菌液中活菌数为105～109CFU/mL；
步骤(1)中，单位体积的所述发酵底物中接种的所述酿酒酵母的数量为5×103～5×107CFU/mL；
步骤(1)中，所述发酵培养在震荡培养箱中进行，所述震荡培养箱中摇床的转速为150～300r/min；
步骤(1)中，所述发酵培养的时间为24～120h；
步骤(1)中，所述发酵培养的温度为25～38℃；
步骤(1)中，所述灭菌的方法为高温灭菌法；
步骤(1)中，所述灭菌的操作后还进一步包括冷却至室温的操作。
3.如权利要求2所述的发酵乳液的制备方法，其特征在于，所述发酵乳液的制备方法满足下述条件中至少一种：
步骤(1)中，所述水和所述大米的质量比为(20～100)：1；
步骤(1)中，所述大米和所述植物油的质量比为(3～5)：1；
步骤(1)中，所述酿酒酵母以酿酒酵母菌液的形式添加，所述酿酒酵母菌液中活菌数为106～108CFU/mL；
步骤(1)中，单位体积的所述发酵底物中接种的所述酿酒酵母的数量为5×104～5×106CFU/mL；
步骤(1)中，所述发酵培养在震荡培养箱中进行，所述震荡培养箱中摇床的转速为150～250r/min；
步骤(1)中，所述发酵培养的时间为48～100h；
步骤(1)中，所述发酵培养的温度为为25～32℃；
步骤(1)中，当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的温度为90～125℃；当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的时间为20～60min。
4.如权利要求3所述的发酵乳液的制备方法，其特征在于，所述发酵乳液的制备方法满足下述条件中至少一种：
步骤(1)中，所述水和所述大米的质量比为(20～60)：1；
步骤(1)中，当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的温度为90～110℃；
步骤(1)中，当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的时间为20～40min。
5.如权利要求1所述的发酵乳液的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述发酵底物在使用前还包括灭菌的操作。
6.如权利要求1所述的发酵乳液的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述发酵底物的所述灭菌的方法为高温灭菌法。
7.如权利要求6所述的发酵乳液的制备方法，其特征在于，所述发酵乳液的制备方法满足下述条件中至少一种：
当采用所述高温灭菌法对所述发酵底物进行所述灭菌时，所述灭菌的温度为110～125℃；
当采用所述高温灭菌法对所述发酵底物进行所述灭菌时，所述灭菌的时间为20～60min；
所述发酵底物经所述灭菌的操作后还进一步包括冷却至室温的操作。
8.如权利要求7所述的发酵乳液的制备方法，其特征在于，所述发酵乳液的制备方法满足下述条件中至少一种：
当采用所述高温灭菌法对所述发酵底物进行所述灭菌时，所述灭菌的温度为115～121℃；
当采用所述高温灭菌法对所述发酵底物进行所述灭菌时，所述灭菌的时间为20～40min。
9.如权利要求1～8中任意一项所述的发酵乳液的制备方法，其特征在于，所述发酵乳液的制备方法满足下述条件中至少一种：
步骤(2)中，所述植物乳杆菌以植物乳杆菌菌液的形式添加，所述植物乳杆菌菌液中所述植物乳杆菌的浓度为106～1010CFU/mL；
步骤(2)中，单位体积的所述物料A中接种的所述植物乳杆菌的数量为104～108CFU/mL；
步骤(2)中，所述发酵培养的方法为静置发酵；
步骤(2)中，所述发酵培养的时间为12～24h；
步骤(2)中，所述发酵培养的温度为30～45℃；
步骤(2)中，所述灭菌的方法为高温灭菌法。
10.如权利要求9所述的发酵乳液的制备方法，其特征在于，所述发酵乳液的制备方法满足下述条件中至少一种：
步骤(2)中，所述植物乳杆菌以植物乳杆菌菌液的形式添加，所述植物乳杆菌菌液中所述植物乳杆菌的浓度为107～109CFU/mL；
步骤(2)中，单位体积的所述物料A中接种的所述植物乳杆菌的数量为105～107CFU/mL；
步骤(2)中，所述发酵培养的时间为12～18h；
步骤(2)中，所述发酵培养的温度为35～45℃；
步骤(2)中，当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的温度为90～125℃；当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的时间为20～50min。
11.如权利要求9所述的发酵乳液的制备方法，其特征在于，当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的温度为90～110℃；当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的时间为25～35min。
12.如权利要求1所述的发酵乳液的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述灭菌的操作后还进一步包括冷却和/或离心，收集上清液的操作。
13.如权利要求12所述的发酵乳液的制备方法，其特征在于，步骤(2)满足下述条件中至少一种：所述冷却为冷却至室温；
所述离心的转速为3000～9000r/min；
所述离心的半径为8～15cm；
所述离心的时间为10～40min。
14.如权利要求13所述的发酵乳液的制备方法，其特征在于，步骤(2)满足下述条件中至少一种：
所述离心的转速为4000～6000r/min；
所述离心的时间为20～40min。
15.如权利要求12～14中任意一项所述的发酵乳液的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述离心的操作后还进一步包括二次灭菌和/或与防腐剂混合的操作。
16.如权利要求15所述的发酵乳液的制备方法，其特征在于，步骤(2)中满足下述条件中至少一种：
所述二次灭菌的方法为高温灭菌法；
与所述防腐剂混合的过程中，所述混合的温度为50～80℃；
与所述防腐剂混合的过程中，所述防腐剂包括对羟基苯乙酮和/或1,2-己二醇。
17.如权利要求16所述的发酵乳液的制备方法，其特征在于，步骤(2)满足下述条件中至少一种：
当采用所述高温灭菌法进行所述二次灭菌时，所述二次灭菌的温度为100～125℃；
当采用所述高温灭菌法进行所述二次灭菌时，所述二次灭菌的时间为20～40min；
与所述防腐剂混合的过程中，所述混合的温度为70～80℃；
当所述防腐剂包括所述对羟基苯乙酮和所述1,2-己二醇时，所述对羟基苯乙酮占所述离心后制得上清液的质量百分数为0.1％～1％，所述1,2-己二醇占所述离心后制得上清液的质量百分数为0.1％～1％。
18.如权利要求17所述的发酵乳液的制备方法，其特征在于，步骤(2)满足下述条件中至少一种：
当采用所述高温灭菌法进行所述二次灭菌时，所述二次灭菌的温度为115～121℃；
当采用所述高温灭菌法进行所述二次灭菌时，所述二次灭菌的时间为25～35min；
当所述防腐剂包括所述对羟基苯乙酮和所述1,2-己二醇时，所述对羟基苯乙酮占所述离心后制得上清液的质量百分数为0.5％，所述1,2-己二醇占所述离心后制得上清液的质量百分数为0.5％。
19.一种发酵乳液，其特征在于，由如权利要求1～18中任意一项所述的发酵乳液的制备方法制得。
20.一种如权利要求19所述的发酵乳液直接作为产品、作为添加剂或作为基底在制备皮肤外用剂中的应用。
21.如权利要求20所述的应用，其特征在于，所述发酵乳液作为所述皮肤外用剂中的保湿活性成分、抗炎活性成分和抗衰老活性成分中至少一种。
22.一种皮肤外用剂，其特征在于，包括如权利要求19所述的发酵乳液。
23.如权利要求22所述的皮肤外用剂，其特征在于，满足下述条件中至少一种：
所述皮肤外用剂中还进一步包括保湿活性成分、抗炎活性成分、抗敏活性成分和抗氧化活性成分中至少一种；
所述皮肤外用剂包括面膜、精华或爽肤水；
所述发酵乳液占所述皮肤外用剂的质量百分比为5％～99％。
24.如权利要求23所述的皮肤外用剂，其特征在于，所述发酵乳液占所述皮肤外用剂的质量百分比为60％～99％。
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