CN116411041A - 基于亚油酸诱导人皮脂腺细胞检测皮脂融合和释放的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于亚油酸诱导人皮脂腺细胞检测皮脂融合和释放的方法，以TG作为生物标志物可定量检测皮肤皮脂释放，以TG、细胞脂滴、PLIN2和CIDEA可检测评估皮肤皮脂融合和释放。本发明采用亚油酸诱导人皮脂腺细胞SZ95的方法，模拟了皮脂腺细胞从皮脂合成、皮脂融合到皮脂释放的全过程，并创新性的构建了皮脂释放阶段的检测方法，通过LA诱导皮脂腺细胞特定时间后，作为皮脂释放阶段的起始，并在皮脂释放的起始阶段采用待测样品处理，并在释放阶段的结束时间通过对细胞分泌到培养上清中的皮脂特定成分TG含量作为分泌指标进行定量检测，进而评估待测样品对皮脂释放的抑制率，且该检测结果与人体试验的即时控油效果较为一致。
Description
技术领域
本发明涉及组织学检测技术领域，具体涉及到一种基于亚油酸诱导人皮脂腺细胞检测皮肤皮脂融合和释放的方法。
背景技术
皮脂腺是附属于皮肤的一个重要腺体，是产生皮脂的重要部位，皮脂腺细胞是皮脂腺结构的主要细胞，通过调控皮脂腺细胞，减少皮脂的合成及分泌，可改善皮肤出油状态，维持皮肤健康。
通过转染含有Simian virus-40编码区的PBR-322质粒使人皮脂腺细胞突变，获得的人永生化皮脂腺细胞系(SZ95细胞)，具备正常皮脂腺细胞的基本功能，为研究痤疮等皮脂腺相关疾病提供了良好的材料。亚油酸是可被人体细胞吸收利用一种必需的非饱和脂肪酸，与过氧化物酶体增殖物激活受体结合后通过调节过氧化物酶体、微粒体、线粒体内与脂质代谢有关的基因,促进皮脂腺的分化、增殖及皮脂合成。睾酮或二氢睾酮、促黑激素、***1、乙酰胆碱等物质，作用于皮脂腺细胞，也可与其关联的受体结合，诱导皮脂合成。
皮脂腺细胞皮脂合成的测试方法通常采用尼罗红染色或者油红O染色，其主要针对细胞内总脂质进行染色，一是不具有特异性，无法区分皮脂和细胞脂质，二是染料无法清洗干净，容易残留在细胞板上，导致背景加深，从而不易于定量检测，大部分仅用图片进行定性展示。且皮脂腺细胞皮脂合成的测试，适用于皮脂合成的早期调控，与皮肤长效控油(抑制皮脂合成，约14～28天)的人体试验结果较为吻合，但却不适用于即时控油效果(抑制皮脂释放，6h以内)、短效控油(减少皮脂融合，7天以内)的评价。而现有的控油功效人体试验，选择至少30例以上受试者进行皮脂含量的测试，存在测试周期长、测试数据差异大、成本高的特点，所测得的皮脂含量均为皮肤表面分泌出来的皮脂，且不能评定毛囊皮脂腺单位内部合成及储存的皮脂。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于亚油酸诱导人皮脂腺细胞检测皮脂融合和释放的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供了一种甘油三酯(TG)作为生物标志物在定量检测抑制皮肤皮脂释放功效中的应用。
第二方面，本发明提供了一种TG作为生物标志物在筛选或评估具有抑制皮肤皮脂释放功效的物质中的应用。
第三方面，本发明提供了一种生物标志物群组在检测评估皮脂融合和释放中的应用，所述生物标志物群组包括TG、细胞脂滴、PLIN2(脂滴包被蛋白)和Cidea蛋白家族(celldeath-inducing Dff45 like effector)中的CIDEA。
第四方面，本发明提供了一种生物标志物群组在筛选或评估具有抑制皮脂融合和释放作用的物质中的应用，所述生物标志物群组包括甘油三酯、PLIN2和CIDEA。
第五方面，本发明提供了一种基于亚油酸诱导人皮脂腺细胞的抑制皮脂释放的定量检测方法，包括以下步骤：
A1、将人皮脂腺细胞培养后，采用含亚油酸的培养基对人皮脂腺细胞进行处理；
A2、将亚油酸处理后的细胞采用含待测样品和亚油酸的培养基进行处理作为实验组；并以仅采用亚油酸的培养基进行相同处理作为对照组；
A3、收集步骤A2处理后实验组和对照组的培养基上清液进行TG含量检测，并计算得到皮脂释放的抑制率。
优选地，步骤A1中，所述人皮脂腺细胞培养依次包括细胞复苏、细胞传代和细胞铺板的步骤；
所述细胞复苏的步骤为：将冻存的人皮脂腺细胞取出后融化，然后加入到细胞培养基中，离心去上清后，所得细胞再加入细胞培养基进行重悬；
所述细胞传代的步骤为：将第一次接种培养后的细胞再接种进行传代培养，培养至细胞生长密度为70-80％时，将细胞清洗后进行消化，收集所得消化的细胞并离心、重悬；
细胞铺板的步骤为：将重悬后的细胞接种至孔板中，进行孵育。
优选地，步骤A1中，所述人皮脂腺细胞为SZ95细胞。
优选地，所述细胞复苏的步骤中，进行第一次接种培养的接种量为每10cm细胞培养皿接种2×106个细胞；
所述细胞传代的步骤中，进行传代培养的接种量为2×106个细胞/皿(10cm细胞培养皿)。
所述细胞铺板的步骤，将细胞调整密度为1×105/ml，并以每孔200μL接种至48孔板中；所述孵育的时间为16～24h。
优选地，步骤A1中，步骤A1中，所述含亚油酸的培养基中，亚油酸的质量浓度为0.002～0.004％；所述亚油酸处理的时间为4～12天。在发明人前期的实验中发现，所述亚油酸的质量浓度太低时，油脂分泌会变慢从而需要培养较长的时间，使差异性弱；所述亚油酸的质量浓度太高则会导致细胞容易死亡。处理的时间太短时，培养基中观察不到有漂浮的油脂，说明还没有到皮脂释放的阶段，检测指标的差异性会减少；而处理的时间太长时，皮脂释放很多，样品效果可能体现不出来。因此处理的时间太长或太短均会影响试验的灵敏度。
步骤A2中，所述含待测样品和亚油酸的培养基中，亚油酸的质量浓度为0.002～0.004％；为所述处理时间为2～4天。
更优选地，所述含亚油酸的培养基中，亚油酸的质量浓度为0.003％；所述亚油酸处理的时间为6天，每3天换液1次；
步骤A2中，所述含待测样品和亚油酸的培养基中，亚油酸的质量浓度为0.003％；为所述处理时间为3天。
本发明改进了目前的亚油酸诱导方式，采用先诱导脂质合成，形成脂质融合后，再观察皮脂腺细胞皮脂分泌、释放至培养基的整个过程。皮脂为油状半流态混合物，含有多种脂类，主要成分是TG、脂肪酸、磷脂和胆固醇等。通过测试皮脂中的主要成分TG在细胞培养上清中的含量，确定待测物质对皮脂释放的抑制效果。
第六方面，本发明提供了一种基于亚油酸诱导人皮脂腺细胞检测皮脂融合和释放的方法，包括定量检测TG含量和检测PLIN2、CIDEA基因的表达量；
所述定量检测TG含量来反应皮脂融合的方法，包括以下步骤：
B1、将人皮脂腺细胞培养后，采用含待测样品和亚油酸的培养基对人皮脂腺细胞进行处理作为实验组；并以仅采用亚油酸的培养基进行相同处理作为对照组；
B2、收集步骤B1处理后实验组和对照组的培养基上清液进行TG含量检测，并计算得到皮脂融合的抑制率。
优选地，步骤B1中，所述含亚油酸的培养基中，亚油酸的质量浓度为0.002～0.004％，更优选浓度为0.003％；所述亚油酸处理的时间为4～12天，更优选时间为3天；每3天换液1次。
优选地，所述检测PLIN2、CIDEA基因的表达量的步骤如下：
C1、将人皮脂腺细胞培养后，采用含亚油酸和待测样品的培养基对人皮脂腺细胞进行处理；
C2、在处理24～72h后进行收样，清洗后加入裂解液进行裂解，所得细胞裂解液进行RNA提取和RT-PCR，然后检测PLIN2和CIDEA基因的表达量。
优选地，步骤C1中，所述含亚油酸和待测样品的培养基中，亚油酸的质量浓度为0.002～0.004％，更优选质量浓度为0.003％。
本发明改进了目前的亚油酸诱导方式，采用先诱导脂质合成，再通过调控PLIN2和CIDEA基因表达量来促进脂质融合，观察小脂滴融合成大脂滴时TG含量的变化。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1)本发明采用亚油酸诱导人皮脂腺细胞SZ95的方法，模拟了皮脂腺细胞从皮脂合成、皮脂融合到皮脂释放的全过程，并创新性的构建了皮脂释放阶段的检测方法，通过特定浓度LA诱导皮脂腺细胞特定时间后，作为皮脂释放阶段的起始，并确定了当LA浓度为0.003％时诱导D6-D9天为皮脂的释放阶段。由此在皮脂释放的起始时间采用样品处理，并在释放阶段的结束时间通过对细胞分泌到培养上清中的皮脂特定成分TG含量作为分泌指标进行定量检测，进而评估待测样品对皮脂释放的抑制率。
2)本发明通过与现有人体试验方法(参见本发明实施例4和5)对比可见，两者的结果趋势较为一致。因此，采用本发明方法测得皮脂释放的抑制率结果可用于评估即时控油效果。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为实施例1中亚油酸组(0.003％ LA)细胞在D1、D6、D9和D12的显微镜照片(上图)和油红O染色照片(下图)；
图2为实施例1的细胞裂解液(细胞内)和培养上清液(细胞外)中阴性对照组和亚油酸组在D1、D6和D9测得的TG含量结果；其中，柱形图从左到右依次为：对照组-细胞内、0.003％LA-细胞内、对照组-细胞外、0.003％LA-细胞外；
图3为实施例1中阴性对照组和亚油酸组PLIN2基因的表达量结果；
图4为实施例1中阴性对照组和亚油酸组CIDEA基因的表达量结果；
图5为实施例2中各实验组在D9细胞外脂滴的显微镜照片结果；
图6为实施例2中各实验组在D9测得的细胞内(细胞裂解液)、细胞外(细胞上清液)TG含量结果；
图7为实施例2中各实验组在D1、D3测得的PLIN2基因表达量结果；从左到右依次为阴性对照组、亚油酸组、0.5％样品组、1％样品组；
图8为实施例2中各实验组在D1、D3测得的CIDEA基因表达量结果；从左到右依次为阴性对照组、亚油酸组、0.5％样品组、1％样品组；
图9为实施例4中各实验组在使用前、使用后皮肤皮脂含量变化的结果；
图10为实施例5中各实验组在D6的细胞显微镜照片结果；
图11为实施例6中各实验组在D6的细胞显微镜照片(上图)和油红O染色照片(下图)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明中的词语“优选的”、“优选地”、“更优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。
应当理解，除了在任何操作实例中，或者以其他方式指出的情况下，表示例如说明书和权利要求中使用的成分的量的所有数字应被理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非相反指出，否则在以下说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是根据本发明所要获得的期望性能而变化的近似值。至少并不是试图将等同原则的适用限制在权利要求的范围内，每个数值参数至少应该根据报告的有效数字的个数并通过应用普通舍入技术来解释。
尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是具体实例中列出的数值尽可能精确地报告。然而，任何数值固有地包含由其各自测试测量中发现的标准偏差必然产生的某些误差。
实施例1
本实施例提供了一种基于亚油酸诱导人皮脂腺细胞检测皮脂融合和释放的方法，具体步骤如下：
一、TG定量检测
1.细胞来源：人皮脂腺细胞。通过转染含有Simian virus-40编码区的PBR-322质粒使人皮脂腺细胞突变，获得人永生化皮脂腺细胞系(SZ95)，该细胞系为专利细胞，本公司已取得授权使用。
2.细胞培养基的组成：DMEM/F12(1:1)培养基+10％胎牛血清(FBS)+9ng/ml hEGF+3ng/ml hKGF+1％双抗(P/S)。
3.细胞复苏：将冻存的SZ95细胞从液氮取出后快速放在37℃水浴锅中，融化后加入到提前准备好的预热过的细胞培养基中，室温下1000转/分离心5分钟，弃去上清，将细胞重新用培养基进行重悬计数，按照每10cm细胞培养皿接种2M(million，百万)SZ95细胞的量进行接种，接种后摇匀放置到37℃、5％ CO2细胞培养箱中进行培养。
4.细胞传代：按照每两天进行一次换液处理来传代培养(每10cm细胞培养皿接种2M(million，百万)细胞)，当细胞生长到70％～80％密度时，进行如下处理：
a)首先用10ml PBS清洗，弃掉PBS；
b)用37℃预热好的0.25％胰酶3～5mL进行消化，37℃下消化6～10分钟，观察到细胞掉落后加5ml细胞培养基终止消化过程；
c)将消化的细胞收集到离心管中，1000转/分离心5min，重悬细胞后进行计数。
5.细胞铺板：将重悬后的细胞，调整细胞密度为1*105/ml，按照每孔200μL接种到48孔板中，放置在37℃、5％ CO2培养箱中进行孵育24h。
6.亚油酸处理：将孵育24h后得到的贴壁的SZ95细胞板先在显微镜下观察，然后开始进行亚油酸处理，具体为用细胞培养基将亚油酸稀释到0.003％浓度，将含亚油酸的细胞培养基以每孔400μL换液加样至孔板中亚油酸组(LA组)对应的孔中，每组至少6复孔，并以每孔400μL细胞培养基换液作为阴性对照组。然后将48孔板放置在37℃、5％CO2培养箱中孵育。添加LA刺激的时间点为D0，每72h进行一次换液，即在D3、D6、D9、D12进行前述同样的亚油酸处理。
7.收样处理和检测：分别在LA处理后的D1、D6、D9、D12，将细胞在显微镜下进行拍照，观察细胞培养液中是否存在油滴。同时，收集细胞板里的培养上清液。之后一部分细胞加入0.5％的油红O染色液，室温染色10min，PBS清洗后于显微镜下观察细胞内皮脂合成及融合情况。
另一部分细胞采用Nonidet P40 20倍稀释后进行裂解，每孔200μL裂解液室温裂解10～20min，将收集到的细胞裂解液转移到EP管中，80℃水浴孵育2～5min，冷却至室温，反复2次，充分溶解TG。将收集的培养上清液(细胞外)和细胞裂解液(细胞内)采用MAK266试剂盒进行TG含量的检测，具体检测方法参考MAK266试剂盒的说明书。
8.检测结果：LA组在不同处理时间(D1、D6、D9、D12)下的显微镜照片如图1所示。由图1可见，LA刺激下，D1时细胞内可观察到小脂滴(红色)的形成，D6细胞内仍有大量小脂滴的合成，同时部分脂滴融合变大，并在细胞培养上清中也观察到少量的脂滴释放。而在D9时，可以观察到培养上清有大量脂滴的存在，同时细胞死亡增多，说明细胞已经进入崩坏释放阶段，油红O染色结果不准确。D12时细胞大量死亡，无法观察到比较完整的细胞轮廓，不适宜进行染色检测。
图2为LA组在不同处理时间(D1、D6、D9)下细胞内和细胞外的TG含量检测结果，由图2可见，LA刺激下，D1时，TG在细胞内大量合成，细胞外几乎观察不到脂滴的形成和检测不到TG的含量。D6时，TG开始分泌至细胞培养上清中，可在细胞外检测到TG的含量和观察到脂滴的形成，细胞内的TG含量由于脂滴的融合和脂滴的释放而呈现减少。D9时，TG大量分泌至细胞培养上清，说明脂滴大量释放，细胞坏死。
从上述实验结果最终确定：当采用0.003％浓度的LA处理时，D6-D9天为皮脂释放阶段，因此选择该阶段作为后续定量检测皮脂释放的处理时间。
二、PLIN2和CIDEA定量检测
1.细胞来源：人皮脂腺细胞。通过转染含有Simian virus-40编码区的PBR-322质粒使人皮脂腺细胞突变，获得人永生化皮脂腺细胞系(SZ95)，该细胞系为专利细胞，本公司已取得授权使用。
2.细胞培养基的组成：DMEM/F12(1:1)培养基+10％胎牛血清(FBS)+9ng/ml hEGF+3ng/ml hKGF+1％双抗(P/S)
3.细胞复苏：将冻存的SZ95细胞从液氮取出后快速放在37℃水浴锅中，融化后加入到提前准备好的预热过的细胞培养基中，室温下1000转/分离心5分钟，弃去上清，将细胞重新用培养基进行重悬计数，按照每10cm细胞培养皿接种2M(million，百万)SZ95细胞的量进行接种，接种后摇匀放置到37℃、5％CO2细胞培养箱中进行培养。
4.细胞传代：按照每两天进行一次换液处理进行传代培养，当细胞生长到70％～80％密度时，进行如下处理：
a)首先用10ml PBS清洗，弃掉PBS；
b)用37℃预热好的0.25％胰酶3～5ml进行消化，37℃下消化6～10分钟，观察到细胞掉落后加5ml细胞培养基终止消化过程；
c)将消化的细胞收集到离心管中，1000转/分离心5min，重悬细胞后进行计数。
5.细胞铺板：将重悬后的细胞，调整细胞密度为1*105/ml，按照每孔1ml接种到6孔板中，放置在37℃、5％ CO2培养箱中进行孵育16～24h。
6.亚油酸处理：将孵育24h后得到的贴壁的SZ95细胞板先在显微镜下观察，然后开始进行亚油酸处理，具体为用细胞培养基将亚油酸稀释到0.003％浓度，将含亚油酸的细胞培养基以每孔2mL换液加样至孔板中亚油酸组(0.003％LA组)对应的孔中，每组至少3复孔，并以每孔2mL细胞培养基换液作为阴性对照组。然后将6孔板放置在37℃、5％ CO2培养箱中孵育。
7.收样处理和检测：分别将孵育6h、24h(D1)、48h(D2)和72h(D3)、96h(D4)后的细胞进行收样，PBS清洗一遍，每孔加150μL裂解液RL(含DTT)，静置1min，轻轻吹打确保裂解充分；所得细胞裂解液-80℃冻存，后续采用现有常规方法进行RNA提取和RT-PCR；然后采用试剂盒进行PLIN2和CIDEA基因表达检测，采用2-ΔΔCT法计算相对表达倍数，来分析基因表达的上升幅度。
8.检测结果：如图3和图4所示，经过LA刺激后，PLIN2基因的相对表达倍数在处理后6h即可显著上升，在D1～D4维持较高的表达量，且在D3时上升幅度达到最大。CIDEA基因的相对表达倍数在D3时呈现明显上调，说明LA刺激下可通过上调这两个基因的表达量，从而加速脂质融合、脂质释放过程。
从上述实验结果最终确定：D3时的差异最大，以孵育72h检测PLIN2和CIDEA基因的相对表达来评估皮脂融合和释放的效果更显著。
实施例2
本实施例提供了一种基于亚油酸诱导人皮脂腺细胞检测皮脂融合和释放的方法，来筛选或评估具有抑制皮肤皮脂释放功效的物质中的应用，具体步骤如下：
1.细胞来源：同实施例1中TG定量检测的步骤1。
2.细胞培养基的组成：同实施例1中TG定量检测的步骤2。
3.细胞复苏：同实施例1中TG定量检测的步骤3。
4.细胞传代：同实施例1中TG定量检测的步骤4。
5.细胞铺板：同实施例1中TG定量检测的步骤5。
6.亚油酸处理：将孵育24h后得到的贴壁的SZ95细胞板先在显微镜下观察，然后开始进行亚油酸处理，具体为用细胞培养基将亚油酸稀释到0.003％浓度，将含亚油酸的细胞培养基以每孔400μL换液加样至孔板中亚油酸组(LA组)对应的孔中，每组至少6复孔，并以每孔400μL细胞培养基换液作为阴性对照组。然后将48孔板放置在37℃、5％CO2培养箱中孵育。添加LA刺激的时间点为D0，每72h进行一次换液，孵育至D6天。
7.样品处理：用细胞培养基将亚油酸稀释到0.006％浓度作为含0.006％ LA的培养基，用细胞培养基将样品1(珈妍净，为上海珈凯生物股份有限公司研发的原料产品，功效成分为百脉根籽提取物)稀释到1％浓度作为含样品1的培养基，用细胞培养基将样品2(槲皮苷，百脉根籽提取物的主要成分1)、样品3(5’-O-鼠李糖基尿苷，百脉根籽提取物的主要成分2)各稀释到200μg/mL浓度分别作为含样品2的培养基和含样品3的培养基。在亚油酸处理孵育至D6天，按表1所示的培养基对各实验组进行换液，然后将48孔板放置在37℃、5％CO2培养箱中，继续孵育3天(D9)。
表1
8.细胞显微镜拍照和TG含量检测：参照实施例1的方法收集细胞裂解液和培养上清液。于显微镜下对各细胞培养上清液中的脂滴进行拍照。并对阴性对照组、亚油酸组和样品1组的细胞裂解液和培养上清液、以及样品组2和样品组3的培养上清液进行TG含量检测。
各实验组在D9显微镜拍照下的细胞培养上清液中脂滴的含量如图5所示。LA刺激后，分泌到上清液中的脂滴明显增多，且细胞轮廓不清晰，出现坏死(亚油酸组)。样品1同步处理时，可明显减少上清液中的脂滴，细胞形态更为完整(样品1组)。样品2对于细胞形态和上清液中的脂滴没有明显改善(样品2组)，样品3对细胞形态呈现一定的改善效果(样品3组)。综合这些测试结果，样品1可通过调控PLIN2和CIDEA基因的表达量来减少皮脂融合、皮脂释放，样品3可以一定程度减少皮脂释放，样品2对于皮脂释放的作用不强。此方法可以区分对于皮脂释放具有不同作用的样品，也可用于皮脂融合和皮脂释放的机理验证。
阴性对照组、亚油酸组和样品1组在D9天测得的OD值结果和TG含量(平均值)如表2和图6所示。样品2组和样品3组测得的TG含量(平均值)和抑制率结果如表3所示。抑制率的计算方式为：(亚油酸组含量值-样品组含量值)/亚油酸组含量值*100％。在细胞裂解液中，亚油酸组的TG含量均明显高于阴性对照组，说明采用亚油酸处理D9后，细胞皮脂大量合成，并使得过量合成的皮脂从细胞中释放出来，从而在细胞的上清液中也检测到了TG含量明显高于阴性对照组。
在上清液中，样品1组的TG含量明显低于亚油酸组，说明浓度0.5％的样品1对细胞的皮脂释放具有明显的抑制作用，且抑制率达到了40.80％。而样品2组的结果显示其没有抑制作用；样品3组有一定抑制作用，但抑制率仅为13.85％。
表2
表3
9.PLIN2和CIDEA检测：用细胞培养基将亚油酸稀释到0.006％浓度作为含0.006％LA的培养基，用细胞培养基将样品(珈妍净，为上海珈凯生物股份有限公司研发的原料产品，功效成分为百脉根籽提取物)稀释到1％、2％浓度作为含样品的培养基。将采用与实施例1中PLIN2和CIDEA定量检测的步骤1-步骤5相同方法孵育24h后得到的贴壁的SZ95细胞按表4所示的培养基对各实验组细胞孔板进行换液(D0)，然后将6孔板放置在37℃、5％ CO2培养箱中孵育至D1、D3。参照实施例1中相同的方法收集细胞，检测PLIN2和CIDEA的基因表达量。
表4
各实验组在D1、D3测得的PLIN2和CIDEA相对表达倍数如图7、图8所示。LA刺激后，PLIN2和CIDEA基因的相对表达倍数均呈现上升，且在D3时上升幅度较大(亚油酸组)。而0.5％、1％的样品处理下(0.5％样品组和1％样品组)，可显著降低这两个基因的表达量。
实施例3
本实施例提供了一种人体临床即时控油功效的检测方法，通过对比样品1(珈妍净)、样品2(槲皮苷)、样品3(5’-O-鼠李糖基尿苷)使用前、使用不同时间后面部皮肤皮脂含量的变化，阐明待测产品的即时控油功效与细胞测试结果的一致性。
采用德国CK公司的多功能皮肤测试***MPA6中的Sebumeter皮肤皮脂测试探头对皮肤皮脂含量进行测试。Sebumeter法基于光度计原理，使用一种0.1mm厚的特殊消光胶带，其吸收人体皮肤上的皮脂后就会变成一种半透明的胶带，透光量会发生变化，吸收的皮脂越多，透光量就会越大，可以测量出皮肤皮脂的含量。
测试配方组成和测试分组信息如下表5所示：
表5
具体步骤如下：
1、筛选年龄在18岁～55岁之间，面部皮肤皮脂分泌比较旺盛，在清洁后8h内超过120μg/cm2的受试者参与测试；
2、测试当天采用碱性肥皂清洁面部，并用干面纸巾擦干水分，于测试环境中(恒温恒湿区域，温湿度范围为20～22℃，40％～60％)静坐平衡20～30min，平衡期间不能喝水和饮料；
3、将20名受试者额头区域根据中心位置平分为左、中、右三边，组别之间至少间隔0.5cm，左、右两边随机分成样品1组、样品2组、样品3组，中间为基质对照组。采用Sebumeter探头测量初始皮脂含量，按各区域100μl的用量使用乳胶指套进行样品的单次涂抹，待涂抹试样完全干燥后开始计时，3h后分别再次测量皮脂含量；
4、对皮脂含量，采用以下公式计算样品的变化率。用配对TTest的方法计算显著性差异，其中*代表P<0.05，**代表P<0.01。变化率越大，代表即时控油效果越强。
a)检测变化值Δ＝检测值使用后-检测值使用前
b)变化率(％)＝(1-检测变化值样品组/检测变化值对照组)×100％
5、测试结果：如表6所列，基质对照组在3h后的皮脂含量检测变化值维持较高的水平，说明皮肤皮脂含量在清洁后持续升高。而样品1组在使用后3h，与基质对照组相比，皮脂含量显著减少了26.4％，样品3处理下也显著减少了13.5％，但样品2处理时对皮脂含量基本无影响。通过检测清洁后3h的皮肤表面分泌的皮脂含量变化，可反应释放并储存在毛囊皮脂腺单位导管中的皮脂含量变化，此结果与采用亚油酸诱导的皮脂腺细胞皮脂释放结果呈现较为一致的趋势。
表6
实施例4
本实施例提供了一种人体临床长效控油功效的检测方法，通过对比使用含5％样品1(珈妍净)的精华液28天，对比使用前、使用28天后面部皮肤皮脂含量的变化，阐明待测产品的长效控油功效，以及复核验证细胞上皮脂融合的测试结果。
含5％样品1的测试精华液S、不含有测试样品的测试精华液C(基质对照)的配方组成信息如下表7：
表7
具体步骤如下：
1、受试者筛选：筛选年龄在18岁～55岁之间，面部皮肤皮脂分泌比较旺盛，在清洁后8h内超过120μg/cm2的受试者参与测试；
2、使用半脸对照进行测试，试验设计为对照、随机试验。试验周期为28天，受试者早晚各使用一次样品，测试时间分别为使用样品的第0、14、28天；
3、测试方案：左、右脸分别涂抹基质(精华液C)或样品(精华液S)，使用前、后，左、右脸同时进行对比分析。先检测受试者使用样品前左、右脸的基础值，以及不同时间点的皮脂含量。
4、测试当天采用清水清洁面部，并用干面纸巾擦干水分，于测试环境中静坐平衡20～30min，平衡期间不能喝水和饮料。将额头区域根据中心位置平分为左、右两边，组别之间至少间隔0.5cm。采用Sebumeter探头测量左、右两边各三个点初始皮脂含量，待所有测试完成后开始计时，3h后分别再次测量皮脂含量；
5、分别在14天和28天按照步骤4进行测试；
6、对皮脂含量，采用以下公式计算样品的变化率。用配对TTest的方法计算显著性差异，其中*代表P<0.05，**代表P<0.01。变化率越大，代表长效控油效果越强。
变化率(％)＝(1-检测变化值样品组/检测变化值对照组)×100％
7、测试结果：由图9可知，使用前(D0 T0h)，测试精华液C与精华液S组的皮肤皮脂含量值并无明显差距，而使用含5％珈妍净的精华液S14、28天(D14、D28)后，与测试精华液C(对照组)相比，在清洁后0h、3h，皮肤皮脂含量均呈现显著下降，0h的下降率分别达到14.2％、19.0％，3h的下降率分别达到9.4％、10.9％。通过检测清洁后0h、3h的皮肤表面分泌的皮脂含量变化，可分别反应皮脂合成、皮脂释放后导致的皮脂含量变化，此结果与采用亚油酸诱导的皮脂腺细胞结果趋势一致。
实施例5
本实施例提供了不同刺激物作用于人皮脂腺细胞上检测皮脂融合和释放的方法，来验证亚油酸的刺激效果，具体步骤如下：
1.细胞来源：同实施例1中TG定量检测的步骤1。
2.细胞培养基的组成：同实施例1中TG定量检测的步骤2。
3.细胞复苏：同实施例1中TG定量检测的步骤3。
4.细胞传代：同实施例1中TG定量检测的步骤4。
5.细胞显微镜拍照和油红O染色检测：将重悬好的细胞，调整细胞密度为1*105/ml，按照每孔200μL接种到48孔板中，放置在37℃、5％ CO2培养箱中进行孵育24h。用细胞培养基将亚油酸、二氢睾酮、促黑激素、***1、乙酰胆碱分别稀释到0.003％、20μg/mL、100μg/mL、1mg/mL、1mg/mL浓度作为含不同刺激物的培养基。每孔400μL加入细胞板，于37℃、5％ CO2培养箱中，继续孵育，每3天换液1次。每次换液时于显微镜下对细胞培养上清液中的脂滴进行拍照，在处理至第6天时，弃培养基，加入0.5％的油红O染色液，室温染色10min后，40％异丙醇清洗2遍后，于显微镜下拍照。
6.检测结果：在处理至D6时，除亚油酸组外，各个处理组的培养上清液中均未发现脂滴的形成。采用油红O染色对细胞内脂质进行染色，如图10所示，亚油酸处理下，可诱导细胞大量产生脂质(红色油滴)，而其他几种刺激物作用下，除二氢睾酮能少量促进细胞产生脂质外，其他刺激物(促黑激素、***1、乙酰胆碱)基本对细胞脂质的产生无影响。
实施例6
本实施例提供了一种不同浓度的亚油酸作用于人皮脂腺细胞上检测皮脂融合和释放的方法，来验证亚油酸的浓度对细胞的影响，具体步骤如下：
1.细胞来源：同实施例1中TG定量检测的步骤1。
2.细胞培养基的组成：同实施例1中TG定量检测的步骤2。
3.细胞复苏：同实施例1中TG定量检测的步骤3。
4.细胞传代：同实施例1中TG定量检测的步骤4。
5.细胞显微镜拍照和油红O染色检测：将消化好的细胞，调整细胞密度为1*105/ml，按照每孔200μL接种到48孔板中，放置在37℃、5％ CO2培养箱中进行孵育24h。用细胞培养基将亚油酸分别稀释到0.001％、0.003％、0.006％浓度作为含不同浓度刺激物的培养基。每孔400μL加入细胞板，于37℃、5％ CO2培养箱中，继续孵育，每3天换液1次。每次换液时于显微镜下对细胞培养上清液中的脂滴进行拍照，在处理至第6天时，弃培养基，加入0.5％的油红O染色液，室温染色10min后，40％异丙醇清洗2遍后，于显微镜下拍照。
6.检测结果：如图11所示，在处理至D6时，0.003％、0.006％亚油酸组的培养上清液中均可发现脂滴的形成，但0.006％浓度下细胞大量死亡，不利于后续的继续处理和检测。采用油红O染色对细胞内脂质进行染色，0.001％浓度的亚油酸处理下，可诱导细胞大量合成脂质(红色油滴)，但脂滴形状较为均一，直径较小；0.006％浓度的亚油酸处理下，脂滴直径偏大，但因细胞大量死亡，定量分析不准确。因此，0.003％浓度的亚油酸，不仅可维持细胞形态，有利于后续的继续处理及各种检测，还可促进脂质的合成、脂滴的融合和脂滴的释放，适用于皮脂腺细胞不同生长阶段和脂质合成不同阶段的评价，也适用于对不同种类的样品进行评价。
本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种甘油三酯作为生物标志物在定量检测皮肤皮脂释放中的应用。
2.一种甘油三酯作为生物标志物在筛选或评估具有抑制皮肤皮脂释放作用的物质中的应用。
3.一种生物标志物群组在检测评估皮肤皮脂融合和释放中的应用，其特征在于，所述生物标志物群组包括甘油三酯、细胞脂滴、PLIN2和CIDEA。
4.一种生物标志物群组在筛选或评估具有抑制皮肤皮脂融合和释放作用的物质中的应用，其特征在于，所述生物标志物群组包括甘油三酯、细胞脂滴、PLIN2和CIDEA。
5.一种基于亚油酸诱导人皮脂腺细胞的抑制皮脂释放的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
A1、将人皮脂腺细胞培养后，采用含亚油酸的培养基对人皮脂腺细胞进行处理；
A2、将亚油酸处理后的细胞采用含待测样品和亚油酸的培养基进行处理作为实验组；并以仅采用亚油酸的培养基进行相同处理作为对照组；
A3、收集步骤A2处理后实验组和对照组的培养基上清液进行甘油三酯含量检测，并计算得到皮脂释放的抑制率。
6.根据权利要求5所述的抑制皮肤皮脂释放的定量检测方法，其特征在于，步骤A1中，所述人皮脂腺细胞培养依次包括细胞复苏、细胞传代和细胞铺板的步骤；
所述细胞复苏的步骤为：将冻存的人皮脂腺细胞取出后融化，然后加入到细胞培养基中，离心去上清后，所得细胞再加入细胞培养基进行重悬，然后进行第一次接种培养；
所述细胞传代的步骤为：将第一次接种培养后的细胞再接种进行传代培养，培养至细胞生长密度为70-80％时，将细胞清洗后进行消化，收集所得消化的细胞并离心、重悬；
细胞铺板的步骤为：将重悬后的细胞接种至孔板中，进行孵育。
7.根据权利要求5所述的抑制皮肤皮脂释放作用的定量检测方法，其特征在于，步骤A1中，所述含亚油酸的培养基中，亚油酸的质量浓度为0.002～0.004％；所述亚油酸处理的时间为4～12天；
步骤A2中，所述含待测样品和亚油酸的培养基中，亚油酸的质量浓度为0.002～0.004％；为所述处理时间为2～4天。
8.一种基于亚油酸诱导人皮脂腺细胞检测皮脂融合和释放的方法，其特征在于，包括定量检测甘油三酯的含量和检测PLIN2、CIDEA基因的表达量；
所述定量检测皮脂释放的抑制率的步骤如权利要求5-7中任一项所述。
9.根据权利要求8所述的检测皮脂融合和释放的方法，其特征在于，所述检测PLIN2、CIDEA基因的表达量的步骤如下：
B1、将人皮脂腺细胞培养后，采用含亚油酸和待测样品的培养基对人皮脂腺细胞进行处理；
B2、在处理24-72h后进行收样，清洗后加入裂解液进行裂解，所得细胞裂解液进行RNA提取和RT-PCR，然后检测PLIN2和CIDEA基因的表达量。
10.根据权利要求9所述的检测皮脂融合和释放的方法，其特征在于，步骤B1中，所述含亚油酸和待测样品的培养基中，亚油酸的质量浓度为0.002～0.004％。
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