CN116077347A - 一种天然牙本质提取材料及其制备方法和应用 - Google Patents
一种天然牙本质提取材料及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及口腔修复材料技术领域，具体涉及一种天然牙本质提取材料及其制备方法和应用。该法包括以下依次进行的步骤：将牙本质研磨成牙本质粉末，然后经冷冻干燥，获得待消化牙本质粉；将待消化牙本质粉分散于酸性的胃蛋白酶溶液中，获得消化体系；再经消化处理、固液分离取上清和调整pH值，获得牙本质提取液；对牙本质提取液依次进行冷冻处理和冷冻干燥处理，获得牙本质提取物。本技术方案解决了现有技术的天然牙本质提取材料的治疗效果有限的技术问题，降低了材料粒径和提升了生物活性，其可以作为骨替代材料、牙根穿孔修补材料、盖髓材料、牙本质敏感症的脱敏材料和促进牙齿再矿化材料，应用到医疗实践操作中，具有理想的推广应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及口腔修复材料技术领域，具体涉及一种天然牙本质提取材料及其制备方法和应用。
背景技术
哺乳动物牙本质作为一种天然的无细胞材料，是从新鲜拔除的哺乳动物的健康牙齿中提取而获得，被认为在骨组织及牙本质修复或再生中具有良好的应用前景。目前已经报道了数种不同类型的牙本质材料。目前主要有DDM（demineralized dentin matrix）、TDM（treated dentin matrix）、CDM(Cryopreserved dentin matrix)。这些材料被认为具有成骨/成牙的作用，可用于骨组织或者牙组织修复或再生。TDM提取物含有多种细胞外基质分子（DSP、DMP-1等），可调节细胞增殖和牙源性分化。TDM被证实能促进牙髓细胞分化为成牙本质样细胞。另外，Chen等人评估了TDM糊剂作为直接盖髓剂在动物模型中的有效性，并发现TDM对牙髓组织具有良好的生物相容性，并实现了修复性牙本质的形成。脱矿牙本质基质DDM可以提高骨诱导的效率。经验证，DDM可以诱导啮齿动物离体模型中的骨形成。在一项关于人类牙齿的研究中，临床评估了DDM水凝胶作为直接盖髓材料与氢氧化钙矿物三氧化物聚合物（MTA）的再生潜力。研究发现，DDM水凝胶保存了牙髓活力并实现了牙本质再生，并认为它是一种商品化盖髓材料的天然替代品。这些天然的牙本质提取材料可以作为目前商品化骨修复材料（如人工骨粉）或者直接盖髓材料（MTA或者iRoot BP）的替代品，此外还可以应用于骨组织工程或者牙组织工程中，用于促进骨或者牙本质再生。
目前生产牙本质基质材料的一般在100-300μm大小，基本保留了天然牙本质的基本结构，包括牙本质小管、管周牙本质、管间牙本质，虽然证实其具有骨修复和牙本质修复的效果，但是颗粒太大也带来了很多缺点，例如：不能够调拌成均匀的糊剂用于直接盖髓；如果异体移植存在引起免疫反应的风险；因为研磨工艺，所获得的颗粒大小不均匀，目前报道的牙本质提取材料颗粒尺寸大小不一；感染的风险；因为颗粒太大，不能够进入一些狭小的区域（如不能进入牙本质小管，起到牙本质小管封闭的作用）。此外，因为尺寸过大，且保留牙本质的结构，意味着很难被机体吸收且被机体新生的组织所代替，很难形成真正的骨组织或受体自身的牙组织。现有的天然牙本质提取材料在某些情况下难以取得理想的治疗效果，亟需研发一种新型的具有成骨/成牙本质功效的材料，该材料可以作为骨替代材料、牙根穿孔修补材料和盖髓材料应用，还可以用于牙本质敏感症的脱敏治疗，促进牙齿再矿化。
发明内容
本发明意在提供一种天然牙本质提取材料的制备方法，以解决现有技术的天然牙本质提取材料的治疗效果有限的技术问题。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种天然牙本质提取材料的制备方法，包括以下依次进行的步骤：
S1：将牙本质研磨成牙本质粉末，然后经冷冻干燥，获得待消化牙本质粉；
S2：将待消化牙本质粉分散于酸性的胃蛋白酶溶液中，获得消化体系；再经消化处理、固液分离取上清和调整pH值，获得牙本质提取液；
S3：对牙本质提取液依次进行冷冻处理和冷冻干燥处理，获得牙本质提取物。
本技术方案还提供了一种天然牙本质提取材料的制备方法所制备的牙本质提取物。
本技术方案还提供了牙本质提取物在制备骨替代材料、牙根穿孔修补材料、盖髓材料、牙本质敏感症的脱敏材料和促进牙齿再矿化材料中的应用。
本技术方案的原理以及有益效果在于：
通过对牙本质粉末进行酸性环境下胃蛋白酶处理，获得了粒径更小的DDME（Digested dentin matrix extract），破坏了牙本质小管结构和管周管间牙本质结构，克服了现有技术的牙本质提取材料颗粒尺寸大小不一、不能够进入一些狭小的区域、很难被机体吸收且被机体新生的组织所代替、成骨促进作用有限等问题。本方案制备的DDME具有凹凸不平的表面，保证了较多活性官能团暴露和多肽结构暴露。适度的胃蛋白酶降解，进而将蛋白质切分成稳定的结构域，提升了材料促进成骨的活性。
本方案的牙本质提取物作为替代材料、牙根穿孔修补材料、盖髓材料、牙本质敏感症的脱敏材料和促进牙齿再矿化材料时，DDME层会被逐渐降解并被新生的修复性牙本质占据，DDME可以被降解并被自身组织替代，是一种理想的修复材料。在DDME的处理下，脱矿牙本质实现再矿化，且牙本质小管被封闭，且矿化封闭物不能够被超声清洗机洗脱。说明本方案制备的DDME非常适合用于牙本质小管封闭，促进脱矿牙本质再矿化，用于治疗牙本质过敏症和脱矿牙本质的再矿化。另外，对DDME的作用机制进行初步分析，发现本技术方案制备的DDME通过促进Yap信号通路促进成牙，本方案的DDME可以作为YAP1蛋白入核促进剂发挥作用。
进一步，在S2中，酸性的胃蛋白酶溶液的pH值为1-2。
进一步，胃蛋白酶在酸性的胃蛋白酶溶液中的浓度为0.001-0.01 g/mL。
进一步，待消化牙本质粉在酸性的胃蛋白酶溶液中的浓度为0.001-0.05 g/mL。
进一步，在S2中，所述消化处理的方法为：在37℃温度条件下，搅拌消化体系24-48h。
进一步，在S2中，所述固液分离取上清的方法为：在4℃温度下，1500-3000 rpm离心5-10 min，取上清液。
进一步，在S2中，所述调整pH值的方法为：将上清液的pH值先调整至10-12，然后再调整至7.2。
进一步，在S1中，牙本质粉末的粒径为80-200 μm。
综上所述，本技术方案的有益效果如下：
（1）本技术方案制备的牙本质提取物颗粒更小，更均匀，颗粒直径约为7-8μm。制备方法的可重复性好，可以批次稳定地获得粒径小且均一的牙本质提取物颗粒。由于粒径的减小，DDME和液体调拌制成糊剂，更加均匀，操作性较传统牙本质提取材料（DDM）更佳，能作为直接盖髓材料用于活髓保存治疗中。
（2）采用本技术方案破坏了牙本质小管结构和管周管间牙本质结构，将牙本质的蛋白成分酶解成了多肽，降低了牙本质提取材料的抗原性，减小了异体移植中的免疫反应。
（3）对材料的检测结果显示，本方案制备的DDME具有凹凸不平的表面，有较多活性官能团暴露，且有肽结构暴露。此外，傅里叶红外光谱和X射线光电子能谱检测显示DDME具有和传统牙本质提取材料相似的波谱。表面其在减小尺寸的同时也保留了牙本质基质的成分。对DDME的蛋白分析显示其含有牙本质的主要基质蛋白。
（4）由于粒径的减小等原因，本方法制备的牙本质提取材料DDME可部分降解，被新生的组织（骨或牙本质）替代，不同于传统的大颗粒牙本质提取材料。且本方法制备的牙本质提取材料具有良好的生物相容性，在骨组织/牙本质修复中有潜在的应用价值。
附图说明
图1为实施例1的牙本质提取物（DDME）的整体制备流程图。
图2为实施例1的牙本质提取物（DDME）的大体图。
图3为实施例1的牙本质提取物（DDME）和现有技术的牙本质提取物材料的外观对比图。
图4为实施例1的牙本质提取物（DDME）和现有技术的牙本质提取物材料的电镜图。
图5为实施例1的牙本质提取物（DDME）的粒径分布图
图6为实施例1的牙本质提取物（DDME）和现有技术的牙本质提取物材料的波普图（XPS和FITR）。
图7为实验例1的CCK-8法检测细胞增殖的实验结果（*表示与空白对照相比具有显著差异）。
图8为实验例1的WB检测结果以及统计图。
图9为实验例1的正常情况下人牙髓细胞流式细胞术检测结果。
图10为实验例1的正常情况下人牙髓细胞显微图片。
图11为实验例1的不同浓度DDME 处理下人牙髓细胞显微图片和细胞存活荧光照片。
图12为实验例2的DDME在大鼠模型中的促进成骨和成牙本质的作用效果实验研究结果（标尺：100μm）。
图13为实验例2的DDME在裸鼠模型中的促进成骨和成牙本质的作用效果实验研究结果（标尺：100μm）。
图14为实验例3的DDME的促牙本质矿化和牙本质小管封闭效果的实验研究结果。
图15为实验例4的DDME对人牙髓细胞的基因表达情况分析热图。
图16为实验例4的DDME对人牙髓细胞的基因表达影响的GO分析结果统计图。
图17为实验例4的DDME对人牙髓细胞的信号通路影响的KEGG分析结果统计图。
图18为实验例4的DDME对人牙髓细胞YAP1蛋白表达影响的免疫荧光分析图象。
图19为实验例4的DDME对人牙髓细胞YAP1和DMP-1蛋白表达影响的WB图像以及统计图。
图20为对比例2的使用盐酸处理牙本质粉末获得的牙本质提取材料的大体照片以及显微图片。
图21为对比例3的使用盐酸、胃蛋白酶和胰酶处理牙本质粉末获得的DDME的大体照片以及显微图片。
图22为对比例3的使用盐酸、胃蛋白酶和胰酶处理牙本质粉末获得的DDME对成骨相关蛋白的表达影响的WB检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
实施例1：
本技术方案大致工艺流程如下：
（1）收集新鲜的健康牙齿（人、牛、猪牙等），刮除软组织，使用高速手机和金钢砂车针磨切（过程中保证冷却水降温）磨除牙周膜、牙骨质及牙冠，仅保留牙根部牙本质。将牙本质磨成小块。上述获取牙本质的过程为现有技术常规方式，在此不做赘述。
（2）使用低温冷冻研磨仪(-50至-40℃, 60-70Hz)，将牙本质块（可加入适当的蛋白酶抑制剂，以防止样本中牙本质蛋白质降解，但非胃蛋白酶抑制剂）研磨成80-200μm的牙本质粉末，使用冻干机进行常规冻干24小时（恒温冻干，冷阱温度-50℃），待后续处理。
（3）配置酸性胃蛋白酶溶液（pH=1-2，胃蛋白酶为常规生化试剂，可通过商业途径获得，例如：sigma P6887；solarbio P8390；胃蛋白酶的浓度范围为 0.001-0.02 g/mL），将合适量的牙本质粉末放入酸性胃蛋白酶溶液，牙本质粉末的浓度为0.001-0.05g/mL，在37℃下充分搅拌（400rpm，用磁力搅拌器）处理24-48h（绝大部分牙本质粉末被溶解停止处理），获得牙本质消化液，4℃下，1500-3000rpm离心5-10min，取上清液。此步骤可将牙本质粉基本完全溶解，未溶解部分离心后成为沉淀去除。4℃下，用NaOH溶液调节至pH10以失活胃蛋白酶，再加入稀盐酸调节至pH7.2，获得牙本质提取液。
（4）提取液-80℃保存24h后，冷冻干燥48-72h（恒温冻干，冷阱温度-50℃，使用常规的实验室冷冻干燥机进行冻干，开启冷冻真空干燥，吸走样本的水分），获得牙本质提取物（DDME）。获得的牙本质提取物颗粒直径更小，且更均匀。整体制备流程参见图1。
更具体地，本实施例的操作方式如下：
选取临床中身体健康、年龄12-25岁、因正畸等原因拔除的单根前磨牙，使用PBS缓冲液清洗后备用，也可放置于-80℃保存。使用高速手机和金刚砂车针，磨除离体牙的根部牙周膜和牙骨质，去除牙冠，仅保留根部牙本质，获得牙本质块。然后使用冷冻研磨仪，将牙本质块研磨成粉末状牙本质，冻干24小时，待后续处理。称取1g牙本质粉末和0.1g胃蛋白酶，加入至100ml 0.1M 稀盐酸中。将溶液置于37℃恒温下400rpm搅拌，消化24h。待牙本质粉大部分溶解，收集牙本质消化液。使用低温高速离心机，4℃下，3000rpm离心5min，取上清液。4℃下，上清中加入1M 氢氧化钠溶液，调节至pH10以失活胃蛋白酶，此时可见有大量白色沉淀析出。再加入稀盐酸调节至pH7.2，沉淀大量减少，获得牙本质提取液。然后转移至-80℃冷冻保存24h，再冷冻干燥48h，可获得白色粉末状人牙本质提取物DDME（Digesteddentin matrix extract）。
DDME大体图片参见图2，DDME和DDM的对比图片参见图3（上DDME，下DDM）。DDME和DDM的微观结构对比图参见图4。DDM为现有技术材料（demineralized dentin matrix），参照文献制备（MehrvarzfarP, Abbott PV, Mashhadiabbas F, Vatanpour M, TourSavadkouhi S. Clinical andhistological responses of human dental pulp to MTAand combined MTA/treateddentin matrix in partial pulpotomy. Aust Endod J.2018;44:46–53.）。DDM的制备方法大致为：将人牙本质进行研磨成牙本质粉末，然后依次用EDTA溶液脱钙处理：17%EDTA 5min，10%EDTA 5min，5%EDTA 10min。可见传统的牙本质材料完全保留了牙本质小管，管周牙本质以及管间牙本质的结构，而DDME完全破坏了牙本质的基本结构，呈现表面凹凸不平且存在较多空隙的结构。现有技术中的牙本质基质材料（DDM）通过机械研磨和脱矿制备而成，其颗粒大，且保留牙本质的结构（例如，牙本质小管、管周牙本质和管间牙本质等）。本技术方案制备的DDME颗粒小，破坏了牙本质小管结构和管周管间牙本质结构，具有凹凸不平的表面，保证了较多活性官能团暴露和多肽结构暴露。
经检测，本实施例制备的DDME的平均粒径为8μm左右，粒径分布图参见图5（横坐标粒径nm，纵坐标为强度intensity）。本方案的DDME（DDME）和现有技术的牙本质基质材料（脱矿牙本质基质DDM）的波普图对比详见图6（XRD，XPS，FITR；上方曲线DDME，下方曲线DDM），二者有相似波普，说明按照本方案制备的DDME保留了在减小尺寸的同时也保留了牙本质基质的特征性成分。
实验例1：体外实验
本实验例研究了DDME在体外对人牙髓细胞的作用，发现DDME在体外具有促进成骨/成牙的作用。通过现有技术常规手段从健康人中因正畸等原因拔除的牙齿中分离获得人牙髓细胞.大致的牙髓干细胞的获取过程如下：从新鲜拔除的牙齿中取出牙髓组织，并放入一装有PBS的1.5mL离心管中，用含1%青霉素/链霉素/两性霉素B的PBS冲洗3次；用剪刀将组织剪碎, 应尽量剪碎, 使组织成为小于1mm3的小碎块，离心1000 rpm 5min, 去除上清，并吸去多余的PBS冲洗液；加入3mg/mL的I型胶原酶溶液，要求胶原酶溶液体积至少是组织块体积10倍以上，用振荡器充分震荡后置于37℃水浴40 min；加入含有10% FBS的a-MEM培养基终止消化；离心1000rpm 5min, 去除上清；加入少量FBS, 将组织块转移至T25培养瓶中，加入1mL完全培养基，等待细胞爬出，获得人牙髓细胞。将人牙髓细胞以5000个/孔的接种量接种在96孔板中，采用含10%胎牛血清的α-MEM培养基培养4-6h后，在培养基中加入DDME，使得DDME的终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1mg/mL（1×、2×、3×、4×和5×），空白对照（con）不添加DDME，培养过程中进行常规新鲜培养基的更换。使用DDME培养细胞24-72h后，使用CCK-8法检测人牙髓细胞在不同DDME浓度下以及不同培养时间下的细胞增殖情况，实验结果参见图7。使用DDME培养细胞7天后，取各组细胞进行使用WB法检测细胞中与成牙和成骨分化相关的蛋白的表达情况（DMP-1、RUNX2、COLI、YAP1），并通过软件识别和计算蛋白质条带信号强度，形成柱状统计图（图8）。图9为正常人牙髓细胞的表型流式细胞术检测结果。图10为正常人牙髓细胞的原代培养显微照片。图11为培养1天后，空白对照、1×、2×、3×、4×和5×处理的显微镜下细胞照片（上）、以及荧光图像（下，荧光染色染的为live/dead）。live/dead细胞存活染色显示0.2-1mg/mL的DDME不会影响细胞的存活，对牙髓细胞具有较好的生物相容性（其中，绿色代表活细胞，红色代表死细胞）。
CCK-8和WB实验结果说明：使用低浓度的DDME处理细胞不会影响细胞增殖，但随着DDME的浓度升高，会一定程度抑制牙髓细胞的增殖，但是会非常显著地促进细胞中与成骨分化相关的蛋白的表达。图11的细胞显微图像说明了DDME对牙髓细胞无明显毒性，不会影响细胞的存活，但处理后可见较多不透明的矿化结节样结构，即DDME处理之后，细胞形态变化，有矿化结节的形成。
实验例2：体内实验
（1）裸鼠背部皮下移植模型
模型制作流程如下：
1）将1×106/mL的人牙髓干细胞和0.2mL体积的DDME或HA-TCP（一种经典的成骨材料）混合在15mL离心管中，充分混匀，加入完全培养基至10mL在细胞培养箱中孵育6小时，将1500rpm离心10分钟，去除上清，沉淀为人牙髓细胞和材料的混合物。
2）异氟烷呼吸麻醉下，在裸鼠背部中线两侧做切口，分别植入DMME+人牙髓细胞或 HA-TCP+人牙髓细胞混合物（每个植入点约0.2mL），缝合切口，然后8周后处死裸鼠，取材，固定，脱钙，脱水，石蜡包埋，切片，行HE染色，Masson Trichrome染色和免疫组织化学染色（AQP4和CD31）。
实验结果参见图13（箭头所指为新生牙本质），HE染色可见两组植入物均能形成明显的矿化物（硬组织），DDME组形成的矿化物形态更像牙本质。Masson染色结果显示两组形成的矿化物中含有较多的胶原成分（染成蓝色），而DDME组中蓝色更加明显。DDME形成的矿化物周围存在一层表达AQP4阳性的细胞。以上结果证明了DDME能在动物体内诱导形成矿化组织，与经典的材料HA-TCP相比，其形成的矿化物更接近牙本质。
（2）大鼠原位牙髓再生模型：
模型制作流程如下：
1）异氟烷吸入麻醉下，碧蓝麻局部浸润麻醉，用自制开口器撑开大鼠上下颌，暴露上颌第一磨牙，采用FG1/2球钻从咬合面开髓，并逐步磨除髓室内的冠髓，用探针和微型刮匙清理髓室内的残留牙髓，用沾有1%次氯酸钠的小棉球放置于髓室内3分钟，生理盐水冲洗，小棉球吸掉多余的水分。
用10%PVP调拌DDME粉末，使其成为糊状，待其固化前使用。将DDME糊剂放置于髓腔内，保证DDME完全覆盖暴露的牙髓及周围的牙本质，棉球轻压吸出多余的液体，放置iRootBPplus在DDME糊剂上层，待其初步固化后，用松风流动树脂封闭窝洞，充填时避免充填体过高。用小磨头稍稍挫平对牙合牙的牙尖，避免其过大的咬合接触。
然后4周和8周后处死大鼠，取下其上颌骨，固定，一部分拍摄microCT，其余脱钙，脱水，石蜡包埋，切片，行HE染色，Masson Trichrome染色和免疫组织化学染色（AQP4、CD31和CD14）。
实验结果参见图12，两组中均有新生的牙本质形成，实验组中DDME层被降解并被新生的修复性牙本质占据，证明了DDME可以被降解并被自身组织替代。新生的牙本质中含有大量的胶原成分（蓝色）。牙髓组织中没有明显的炎症，未见炎症细胞浸润，同时有AQP4阳性的成牙本质细胞。
实验例3：DDME的牙本质过敏症效果实验
获取新鲜拔除的人健康牙齿（智齿），用硬组织切片机制备厚度约1mm的牙本质片，对其进行脱矿处理，获得脱矿牙本质。脱矿方法为采用17%EDTA脱钙两周。使用含10%PVP的PBS作为溶剂配制的DDME溶液处理脱矿牙本质14天，采用超声波清洗机荡洗30min，然后在扫描电镜下观察脱矿牙本质经处理后的再矿化以及牙本质小管的封闭情况。
实验结果参见图14，在DDME的处理下，脱矿牙本质再矿化，且牙本质小管被封闭，作用效果随着DDME的浓度的升高而提升，且矿化封闭物不能够被超声清洗机洗脱。说明本方案制备的DDME非常适合用于牙本质小管封闭，促进脱矿牙本质再矿化，用于治疗牙本质过敏症和脱矿牙本质的再矿化。
实验例4：作用机制初步分析
对DDME的作用机制进行初步分析，使用终浓度为0.2mg/mL的DDME处理人牙髓细胞7天，并同时设置不添加DDME的空白对照（con），然后比较基因表达情况以及进行信号通路分析。实验结果参见图15（热图）、图16（GO分析）和图17（KEGG分析）。图18为免疫荧光图像（红色YAP1，蓝色DAPI染细胞核），图19为WB图像和量化分析结果。DMP-1为牙本质基质蛋白1，YAP1是Yes相关蛋白1(Yes-associated protein 1,YAP1)，是Hippo信号通路(Hippopathway)中的一个分子。YAP1（激活状态）可以促进细胞增殖、转移、生存以及维持干细胞活性，Verteporfin为YAP1抑制剂。DDME的使用可以促进YAP1和DMP-1的表达，而YAP1抑制剂Verteporfin可以一定程度上抵消DDME的促表达效果。由实验结果可知，本技术方案制备的DDME通过促进Yap信号通路促进成牙，初步阐明了DDME作用的机制。
对比例1
现有的牙本质基质材料不易被机体吸收，植入形成矿化组织是材料本身，并非是机体自身形成的矿化组织，限制了牙本质基质材料的应用，发明人分析了可能造成上述现象的原因：目前的牙本质基质材料主要是通过机械研磨制备，尺寸过大，且保留了牙本质的结构，很难被机体所吸收以及被自身的新生骨组织替代。经分析，发明人思考从以下几个方面来实现牙本质基质材料的可被机体吸收的性能：去除牙本质粉末的基本结构、破坏蛋白的四级结构、降低牙本质材料的免疫原性、减少材料的尺寸，让其能够被机体吸收降解，并被自身的新生组织所代替。
以上仅仅是发明人的理论分析，如何才能制备可被机体降解，被自身新生的组织代替，且具有成牙/成骨功能的材料呢？需要找出具体的可行的操作手段。发明人通过了大量的实验分析，探寻可以实现去除牙本质粉末的基本结构、破坏蛋白的四级结构、降低牙本质材料的免疫原性、减少材料的尺寸等效果的方法。
本对比例展示了发明人尝试加强研磨的手段，来实现减少材料尺寸以及破坏牙本质粉末的基本结构的过程。发明人使用更高性能的冷冻研磨机，尝试将牙本质块研磨成更细的颗粒，但是，经过粒径分析发现，仅仅经过研磨处理牙本质粉的最小粒径只能达到70-80μm的范围，且颗粒的粒径分布较广，颗粒的尺寸不是完全均匀一致。同时，通过显微观察，牙本质的小管及管间结构仍然保留。由这种方式获得的牙本质基质材料不能被PBS或者培养基溶解，导致其生物利用度不高且给药方式受到了局限。这样的也牙本质基质材料在植入后，较长时间不能被机体组织吸收降解，难以被机体自身组织所代替形成真正的自身组织。虽然通过加强研磨的方式可以将牙本质基质材料的粒径从100-300μm降至70-80μm，但是依然不能满足应用需求。
对比例2
牙本质基质里面有很多蛋白质成分，从保留牙本质蛋白的功能学的角度出发，首先想到的是脱矿/脱钙溶解羟磷灰石（去除无机成分）使其活性蛋白成分暴露，本对比例尝试了如下的方式除去无机成分、降低产品尺寸和免疫原性：
在本对比例中，发明人使用17%EDTA对牙本质粉末（制备方法参见实施例1）进行脱钙处理。具体的方式为：将牙本质粉末以1g：100mL的比例浸泡在17%EDTA溶液中一周（每两天更换一次EDTA溶液）。上述处理的目的在于EDTA这类螯合剂对牙本质粉末起到脱钙的作用，经过上述处理之后，虽然脱钙后能够牙本质表面的结构暴露出来，但是，牙本质的内部结构没有受到影响，牙本质原始结构没有得到破坏，即牙本质的小管及管间结构仍然保留，且EDTA对牙本质的作用缓慢，即使处理一年也不能降低牙本质粉末的尺寸，不能满足应用需求。
在本对比例中，发明人还尝试了强酸（盐酸）以及弱酸（甲酸）来实现对牙本质粉末的脱矿化以及调整产品粒径。将牙本质粉末以1g：100mL的比例浸泡在0.1M盐酸中24h（参照实施例1中的操作方式，不同点仅在于步骤（3）的酶处理变成了酸处理）。实验结果发现，短时间的盐酸处理不能够完全溶解牙本质粉末，且尺寸大小并没有明显降低，盐酸明显使得牙本质粉末完全脱矿，且牙本质原始结构被破坏（牙本质的小管及管间结构等）。但是，增加盐酸的体积和延长处理时间，盐酸处理可以将牙本质中的羟基磷灰石溶解，暴露出脱矿的胶原纤维，但不能将牙本质基质蛋白进一步水解成多肽。因此，盐酸处理虽然可以破坏牙本质原始结构，但是仅由盐酸处理制备的牙本质基质材料的生物活性不理想，不能满足应用需求。而甲酸这类的弱酸时间处理时间较长，对牙本质粉末的溶解效果不佳，也不能满足应用需求。
将牙本质粉末以1g：100mL的比例浸泡在0.1M盐酸中24h，其他制备流程参见实施例1，获得牙本质提取材料。该牙本质提取材料的大体照片以及显微图片参见图20。将图20的左侧的大体图片和图2、3（实施例1获得的DDME）的大体图片对比，本对比例获得的牙本质提取材料分散度明显比实施例1差，聚集成块，且粒径分布非常不均一，粒径较大的颗粒和粒径较小的颗粒之间差距大，本对比例的牙本质提取材料平均粒径较实施例1更大。对本对比例获得的牙本质提取材料进行电镜观察，为了便于观察，特别选取了DDME中较为松散和分散的小颗粒部分，参见图20中图和右图。本对比例与实施例1不同，未展现出如图4所示的较多的凹凸不平的表面，不能保证较多活性官能团暴露和多肽结构暴露，降低了其生物活性。
对比例3
本对比例尝试了使用不同酶来对牙本质粉末进行处理，以期达到消化牙本质粉末且破坏牙本质原始结构，并重组牙本质的成分。现有技术的牙本质基质材料的制备方法主要是研磨和脱矿（部分或完全），对牙本质材料的酶解尚无现有技术报道，发明人首次将酶解处理引入了牙本质基质材料的制备过程中，并获得了性能理想的DDME。按照本领域的惯常认知，牙本质基质里面有很多蛋白质成分，从保留牙本质蛋白的功能学的角度出发，不会想到使用蛋白酶来破坏牙本质蛋白的结构。而在本技术方案中，使用到了酶解处理牙本质粉的技术方案，提升了DDME材料的作用效果，克服了现有技术的偏见。
结合牙本质的特点，牙本质基质蛋白主要是胶原蛋白、非胶原蛋白、蛋白多糖（如硫酸软骨素和少量硫酸角质素），因此，发明人尝试了用多种蛋白酶处理牙本质粉末。蛋白酶是催化蛋白质水解的酶类，种类繁多，例如：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶，组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。蛋白酶能将蛋白质水解成多肽链和一些氨基酸并破坏其空间结构，但是不至于将蛋白质完全水解丧失功能。蛋白酶对所作用的反应底物有严格的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键，如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。
针对牙本质的特点，发明人纳入并比较了了几种消化方案：1）I型胶原酶（3mg/mL,pH7，37℃，处理48小时），2）胃蛋白酶（可参见实施例1），3）胰酶（0.25%，pH8，37℃，处理48小时），4）糜蛋白酶（2mg/mL,pH7，37℃，处理48小时），5）肠肽酶（5000U/mL，pH8，37℃，处理48小时），6）先胃蛋白酶（2mg/mL,pH1-2，37℃，处理48小时），后胰酶（调整pH值后，0.25%，pH8，37℃，处理48小时），7）胶原酶（3mg/mL,pH7，37℃，处理48小时）+胰酶（调整pH值后，0.25%，pH8，37℃，处理48小时）。具体操作流程参见实施例1，不同实验组和组2）的区别在于步骤（3）中使用的酶的类型。结果发现方案1）、3）、4）、5）、7）作用缓慢，在上述处理时间内都不能有效将绝大部分牙本质粉末溶解，发明人也尝试了延长作用时间，还是不能将绝大部分牙本质粉末溶解。所以，1）、3）、4）、5）、7）不能用于DDME的制备。针对剩下的方案2）、6），发明人进一步研究分析了这两种方案消化制备的牙本质基质材料。通过SEM，XRD，XPS，FITR以及粒径分析，蛋白组学分析等研究所制备的材料效果。其中，第2）组在破坏了牙本质基质的原始结构的同时基本保留了牙本质基质成分的特性，粒径基本控制在7-8μm的范围，颗粒均匀，粒径分布范围窄。XPS，FITR显示所制备的材料和天然牙本质基质的波谱相似。第2）组的处理方式破坏了牙本质胶原蛋白的四级结构，有更多的官能团暴露出来。初步研究结果表明方案2）处理后获得的材料颗粒7-8μm。方案6）处理后的DDME大体以及显微图像参见图21。图21左的大体图显示由方案6）获得的DDME的粉末聚集成块，粉末的分散度不理想。图21中和右的显微图选择了DDME粉末中较为松散和分散的小颗粒部分，与实施例1不同，未展现出如图4所示的较多的凹凸不平的表面，不能保证较多活性官能团暴露和多肽结构暴露，降低了DDME的活性。
随后发明人又进行了进一步的研究和评估制备的牙本质材料，评估了对材料对细胞存活和增殖的作用以及评估对人牙髓细胞成牙成骨的作用（实验方法参见实验例1）。单使用方案2）的胃蛋白酶所提取的牙本质基质材料的效果，比方案6）的联合胃蛋白酶+胰蛋白酶提取的牙本质基质材料的效果要更好。同时在动物实验中也得到了印证，无论是大鼠原位直接盖髓模型或者是小鼠背部皮下移植模型，采用方案2）提取的牙本质基质材料形成新生牙本质的能力更佳，形成矿化组织的能力更强。例如，参照实施例1的方法，检测DDME在体外对人牙髓细胞的作用，使用WB法检测细胞中与成牙和成骨分化相关的蛋白的表达情况，实验结果参照图22。实验结果显示方案6）采用两种蛋白酶水解所制备的牙本质基质材料不具备成骨成牙的功效。图22显示，方案6）制备的DDME不具备提升成牙相关蛋白（牙本质涎磷蛋白(DSPP)、牙本质基质蛋白1（DMP-1））的表达的能力。对比实施例1的DDME说明，酶的类型的选取对DDME的活性的维持非常关键，在胃蛋白酶的基础上进行胰酶处理，会导致蛋白过度酶解成为不具有成牙活性的多肽。而采用本技术方案的胃蛋白酶处理，将部分肽键水解，适度的酶解，适度提升了DDME的活性，进而提升DDME的促牙齿矿化以及成骨效果，获得了预料不到的技术效果。
发明人进而分析了通过酶解处理的方式增加DDME作用效果的原理，适当的蛋白酶的使用破坏牙本质基质的基本结构，攻击暴露在外面的肽链，进而将蛋白质切分成稳定的结构域，并且降解暴露在外面的loop和蛋白质的非结构域，提升了作用效果。使用胃蛋白酶酸性溶液酶解牙本质粉末，虽然会降低颗粒尺寸及降低免疫原性，但是也会破坏牙本质的基本结构，会降解或者失活部分蛋白质。不能够检出牙本质中存在的一些蛋白或其肽链（如DSP，DPP，TGF-beta等）。但是，采用本技术方案可以在获取到合适大小且具有生物功能的牙本质基质材料的同时，尽量减少对牙本质中蛋白成分的破坏。本方案会破坏牙本质中的胶原纤维以及其蛋白四级结构，但是不会破坏胶原的三螺旋结构，而这些在生物再矿化中扮演着重要的作用。因此本方案制备的DDME非常适合用于牙本质小管封闭，用于治疗牙本质过敏症；也有助于脱矿牙本质的再矿化。产生上述的作用效果，胃蛋白酶的选择在本技术方案中起到了至关重要的作用，获得了预料不到的技术效果。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一种天然牙本质提取材料的制备方法，其特征在于：包括以下依次进行的步骤：
S1：将牙本质研磨成牙本质粉末，然后经冷冻干燥，获得待消化牙本质粉；
S2：将待消化牙本质粉分散于酸性的胃蛋白酶溶液中，获得消化体系；再经消化处理、固液分离取上清和调整pH值，获得牙本质提取液；
S3：对牙本质提取液依次进行冷冻处理和冷冻干燥处理，获得牙本质提取物。
2.根据权利要求1所述的一种天然牙本质提取材料的制备方法，其特征在于：在S2中，酸性的胃蛋白酶溶液的pH值为1-2。
3. 根据权利要求2所述的一种天然牙本质提取材料的制备方法，其特征在于：在S2中，胃蛋白酶在酸性的胃蛋白酶溶液中的浓度为0.001-0.02 g/mL。
4. 根据权利要求3所述的一种天然牙本质提取材料的制备方法，其特征在于：在S2中，待消化牙本质粉在酸性的胃蛋白酶溶液中的浓度为0.001-0.05 g/mL。
5. 根据权利要求4所述的一种天然牙本质提取材料的制备方法，其特征在于：在S2中，所述消化处理的方法为：在37℃温度条件下，搅拌消化体系24-48 h。
6. 根据权利要求5所述的一种天然牙本质提取材料的制备方法，其特征在于：在S2中，所述固液分离取上清的方法为：在4℃温度下，1500-3000 rpm离心5-10 min，取上清液。
7.根据权利要求6所述的一种天然牙本质提取材料的制备方法，其特征在于：在S2中，所述调整pH值的方法为：将上清液的pH值先调整至10-12，然后再调整至7.2。
8. 根据权利要求1所述的一种天然牙本质提取材料的制备方法，其特征在于：在S1中，牙本质粉末的粒径为80-200 μm。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的一种天然牙本质提取材料的制备方法所制备的牙本质提取物。
10.根据权利要求9所述的牙本质提取物在制备骨替代材料、牙根穿孔修补材料、盖髓材料、牙本质敏感症的脱敏材料和促进牙齿再矿化材料中的应用。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117482239A (zh) * | 2023-12-29 | 2024-02-02 | 北京大学口腔医学院 | Yap通路干预剂在制备抑制牙根吸收的药物中的应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102138865A (zh) * | 2011-03-31 | 2011-08-03 | 四川大学 | 一种具有生物活性的盖髓剂及其制备方法 |
| AU2013202303A1 (en) * | 2005-04-12 | 2013-05-02 | Mesoblast, Inc. | Isolation of adult multipotential cells by tissue non-specific alkaline phosphatase |
| WO2017073785A1 (ja) * | 2015-10-30 | 2017-05-04 | 学校法人近畿大学 | 分化誘導剤、分化誘導方法、および、これらに用いられる骨組織分解物の製造方法 |
| CN108517312A (zh) * | 2018-04-20 | 2018-09-11 | 重庆医科大学附属口腔医院 | 一种盖髓材料体外评估模型的制备方法 |
| CN115006428A (zh) * | 2022-07-05 | 2022-09-06 | 中山大学附属口腔医院 | 一种可注射生物水凝胶及其制备方法与应用 |
-
2023
- 2023-01-17 CN CN202310062123.7A patent/CN116077347A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2013202303A1 (en) * | 2005-04-12 | 2013-05-02 | Mesoblast, Inc. | Isolation of adult multipotential cells by tissue non-specific alkaline phosphatase |
| CN102138865A (zh) * | 2011-03-31 | 2011-08-03 | 四川大学 | 一种具有生物活性的盖髓剂及其制备方法 |
| WO2017073785A1 (ja) * | 2015-10-30 | 2017-05-04 | 学校法人近畿大学 | 分化誘導剤、分化誘導方法、および、これらに用いられる骨組織分解物の製造方法 |
| CN108517312A (zh) * | 2018-04-20 | 2018-09-11 | 重庆医科大学附属口腔医院 | 一种盖髓材料体外评估模型的制备方法 |
| CN115006428A (zh) * | 2022-07-05 | 2022-09-06 | 中山大学附属口腔医院 | 一种可注射生物水凝胶及其制备方法与应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 熊航;谢志刚;鲍济波;: "脱矿牙本质基质的基本性能及制备", 国际口腔医学杂志, no. 01, 1 January 2016 (2016-01-01), pages 90 - 94 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117482239A (zh) * | 2023-12-29 | 2024-02-02 | 北京大学口腔医学院 | Yap通路干预剂在制备抑制牙根吸收的药物中的应用 |
| CN117482239B (zh) * | 2023-12-29 | 2024-04-16 | 北京大学口腔医学院 | Yap通路干预剂在制备抑制牙根吸收的药物中的应用 |
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| PB01 | Publication | ||
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