CN116064249B - 一株球孢白僵菌pr3及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体公开了一株球孢白僵菌PR3及其应用，所述球孢白僵菌PR3于2020年12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.21031；所述提取物为将发酵获得的菌丝体使用冷冻研磨仪研磨后以乙醇为提取溶剂，通过超声提取获得；所述提取物可用于防治小麦赤霉病，解决了使用活菌效果不稳定且效果较差的问题；且所述提取物仅需很少的有效用量即可对小麦赤霉病有很好地防治效果。
Description
【技术领域】
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株球孢白僵菌PR3及其应用。
【背景技术】
小麦赤霉病又名红头瘴、烂麦头、麦穗枯、红麦头，是全球性的小麦的主要病害之一，主要发生在温暖湿润地区。
使用以菌治菌，以菌防菌的方法来对小麦赤霉病进行防治成为一种新的途径。国内外研究表明，土传病害的生防真菌有很种，而白僵菌是目前研究最多的真菌之一。球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一种虫生真菌，其寄主昆虫分布较广，因而已被广泛应用于害虫的防治中。然而，球孢白僵菌(Beauveria bassiana)虽然是有较长开发历史的生防菌，但其研究和应用主要集中于对农林害虫的生物防治，而白僵菌用于防治植物病的研究则相对较少。
【发明内容】
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于，提供一株球孢白僵菌PR3及其应用。
为了实现上述技术效果，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面在于，提供一株球孢白僵菌(Beauveria bassiana)PR3，所述菌株已于2020年12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.21031。
所述球孢白僵菌PR3从感染球孢白僵菌的家蚕体内分离获得，所述菌株在改良PDA培养基上于25℃条件下培养15天直径6.6cm，生长缓慢，菌落圆形，边缘白色，中间米黄色，绒状，四周质地平坦，中间有凸起，无渗出液，反面深黄色；该菌具有球孢白僵菌的特征，初步判定为球孢白僵菌。
本发明的第二方面在于，提供所述球孢白僵菌PR3的提取物，所述提取物具体为发酵后菌丝体的乙醇提取物。
本发明的第三方面在于，提供所述球孢白僵菌PR3提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化：用接种环挑取少许所述球孢白僵菌PR3，接种到已灭菌的改良PDA培养基平板中，恒温培养6～7天，培养温度25℃，得到活化后的球孢白僵菌PR3；
(2)发酵培养：将步骤(1)中活化后的球孢白僵菌PR3的孢子接种到已灭菌的改良PDB培养基中，在恒温摇床上恒温培养，培养液经滤纸过滤得菌丝体；
(3)将步骤(2)过滤后的菌丝体用冷冻研磨仪研磨后加入乙醇进行超声提取，过滤得球孢白僵菌PR3菌丝体的乙醇提取物。
优选地，步骤(1)中所述改良PDA培养基的成分为：马铃薯200g，葡萄糖20g，酵母粉1g，蛋白胨3g，ZnSO4 0.1g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH值自然。
优选地，步骤(2)中所述改良PDB培养基的成分为：马铃薯200g，葡萄糖20g，酵母粉1g，蛋白胨3g，ZnSO4 0.1g，蒸馏水1000mL，pH值自然。
优选地，步骤(2)中恒温摇床的温度为25℃，转速为180r/min培养8天。
优选地，步骤(3)中所述冷冻研磨仪的温度为4℃，研磨时间为2min，提取功率为300～600W，提取时间为40min～1h20min。
优选地，步骤(3)中加入乙醇的浓度为15％～30％，加入乙醇后，菌丝体的体积百分含量为10％～20％。
本发明的第四方面在于，提供所述球孢白僵菌PR3或其提取物在防治小麦赤霉病中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述球孢白僵菌PR3，已于2020年12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.21031；
本发明利用所述球孢白僵菌PR3提取物防治小麦赤霉病，解决了活菌由于受温度、湿度、风及传代等影响而导致的效果不稳定且效果较差的问题；
本发明所述球孢白僵菌PR3提取物仅需很少的有效用量即可对小麦赤霉病有很好地防治效果，对小麦赤霉病病原菌的抑制率最高可达78％。
【附图说明】
图1为所述球孢白僵菌PR3菌落形态；
图2为所述球孢白僵菌PR3于显微镜下观察的菌丝形态(40×0.65)；
图3为所述球孢白僵菌PR3通过ITS序列分析建立的***发育进化树；
图4为所述球孢白僵菌PR3提取物对小麦赤霉病病原菌的抑制效果；
【具体实施方式】
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，本发明用以下具体实施例进行说明，但绝非仅限于此。以下所述为本发明较好的实施例，仅仅用于描述本发明，不能理解为对本发明的限制，应当指出的是在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
以下实施例用到的各培养基的成分如下：
萨式培养基SDAY：葡萄糖40g，蛋白胨10g，酵母膏10g，琼脂15-20g，蒸馏水1L；
改良PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，酵母粉1g，蛋白胨3g，ZnSO4 0.1g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH值自然；
改良PDB培养基的成分为：马铃薯200g，葡萄糖20g，酵母粉1g，蛋白胨3g，ZnSO40.1g，蒸馏水1000mL，pH值自然。
实施例1菌株的分离与鉴定
1、本发明所述球孢白僵菌PR3从感染球孢白僵菌的家蚕体内分离得到，具体分离过程如下：
(1)收集因感染球孢白僵菌而死的家蚕后，将带菌虫体置于灭菌培养皿(d＝9cm)中，在超净工作台中用接种针轻轻挑取少量孢子，采用划线法接种于萨式培养基SDAY中，于25±1℃，全黑暗，相对湿度70％的恒温培养箱中培养；
(2)培养6d后，挑取少量孢子至新的萨式培养基SDAY纯化培养15d，直至平板上长出的菌落形态特征一致。
2、菌株的鉴定
(1)菌株的形态特征
菌株在改良PDA培养基上于25℃条件下培养15天直径6.6cm，生长缓慢，菌落圆形，边缘白色，中间米黄色，绒状，四周质地平坦，中间有凸起，无渗出液，反面深黄色(如图1所示)；在显微镜下观察，菌丝具隔膜，直径1.15～2.00μm，透明无色，分生孢子梗的分梗或小枝可多次直角分叉，聚集成团，分生孢子梗与主枝或侧枝着生部位多成直角。分生孢子近球形，直径2.00～2.15μm，着生在产孢细胞延伸而成的“之”字形结构上，产孢细胞为瓶状多变化，由腹端向上逐渐变细(如图2所示)；该菌具有球孢白僵菌的特征，初步判定为球孢白僵菌。
(2)菌株的分子生物学鉴定
以ITS1和ITS4为引物，对所述菌株PR3进行扩增，并对扩增产物进行测序分析，具体见序列表；
基于blast搜索，选取与研究菌株序列最接近的种或最靠近的进化分支代表菌株的序列进行比对，利用Mega6.0软件通过ML算法，利用bootstrap 1000次建树结果建立进化树如图3所示；NCBI数据库对比分析，发现其与球孢白僵菌的同源相似性达97％，确定该菌株为球孢白僵菌。
实施例2球孢白僵菌PR3提取物的制备
所述球孢白僵菌PR3提取物具体为其发酵后菌丝体的乙醇提取液，具体提取过程如下：
(1)菌种活化：用接种环挑取少许保藏的球孢白僵菌PR3菌种，接种到已灭菌的改良PDA培养基平板中，恒温培养6-7天，培养温度25℃，得到活化后的球孢白僵菌PR3；
(2)发酵培养：将步骤(1)活化后的球孢白僵菌PR3的孢子接种到装有已灭菌的改良PDB培养基中，装液量300ml/500ml三角瓶，在恒温摇床上以温度25℃转速180r/min恒温培养8天后，培养液滤纸过滤得到菌丝体；
(3)提取液的制备：将步骤(2)过滤后的菌丝体用冷冻研磨仪研磨后(4℃，2min)，利用五倍体积的乙醇进行超声提取，得所述菌丝体提取液。
对步骤(3)所述的提取过程进行优化，主要研究提取功率、提取时间及乙醇浓度等对提取液的影响，具体过程如下：
将步骤(2)制得的菌丝体分为8组，分别限定不同的提取功率、提取时间及乙醇浓度制备提取液，将获得的球孢白僵菌菌株PR3菌丝提取液，按体积1:4的比例将其与冷却至60～70℃的灭菌改良PDA培养基(此时为液体状态)混匀，制备供试菌株无菌提取液平皿，待平皿冷凝后将直径7mm的病原真菌菌饼置于平板中央；并以普通改良PDA平板作为对照组，在恒温培养箱中25℃进行培养，用十字交叉法分别于第3天测量菌落直径，每组试验设置三个重复取平均值，三天后测量赤霉菌直径，具体试验设计及结果见表1。
表1不同提取条件对小麦赤霉病病原菌生长直径的影响
由上表可知，在提取功率600w、提取时间1h、乙醇浓度为25％的条件下，经过冷冻研磨(4℃，2min)的菌株PR3的菌丝提取产物(试验组2)对小麦赤霉病病原菌的抗菌效果比未研磨的(试验组1)效果提高近1倍；在冷冻研磨后，提取时间1h、乙醇浓度为25％的条件下，提取功率为600w时，防效效果最好；在冷冻研磨后，提取功率600w、乙醇浓度为25％的条件下，提取时间增加或缩短20min，菌丝提取产物的防效效果未见明显提高；在冷冻研磨后，提取功率600w、提取时间1h的条件下，乙醇浓度为30％时菌丝提取产物的防效效果最佳。
综上所述，确定球孢白僵菌PR3提取物的最佳条件为冷冻研磨、提取功率为600w、提取时间为1h、乙醇浓度为30％，此时，球孢白僵菌PR3提取物对小麦赤霉病病原菌的抑菌效果最佳。
实施例3改良培养基的效果试验
培养基配方：
普通PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH值自然；
改良PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，酵母粉1g，蛋白胨3g，ZnSO4 0.1g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH值自然；
普通PDA培养基和改良PDA培养基的比较：
将培养7d的球孢白僵菌PR3使用打孔器获得大小相同的菌饼，将获得的菌饼分别转移到普通PDA培养基和改良PDA培养基，恒温培养6～7天，培养温度为25℃，然后使用十字交叉法对球孢白僵菌的直径进行测量。
结果显示，普通PDA培养基中球孢白僵菌PR3的平均直径为4.83cm，改良PDA培养基中球孢白僵菌PR3的平均直径为7.72cm，使用改良PDA培养基比使用普通PDA培养基菌丝获得量多150％以上。
实施例4不同浓度提取物对小麦赤霉病的抑菌试验
将最佳提取条件获得的球孢白僵菌菌株PR3菌丝提取液，根据不同浓度按对应体积(提取液与培养基浓度为1:4时浓度为1.4506mg/g)的比例将其与冷却至60～70℃的灭菌改良PDA培养基(此时为液体状态)混匀制备供试菌株无菌提取液平皿，待平皿冷凝后将直径7mm的小麦赤霉病病原真菌菌饼置于平板中央；并以普通改良PDA平板作为对照组，在恒温培养箱中25℃进行培养，用十字交叉法分别于第3天测量菌落直径，每组试验设置三个重复取平均值，三天后测量赤霉菌直径，采用生长速率法测定所述球孢白僵菌PR3提取物的抑菌活性，按下式计算相对抑菌率：
本发明所述的球孢白僵菌PR3提取物在不同浓度下对小麦赤霉病病原菌的抑制率如表2所示：
表2不同浓度提取物对小麦赤霉病病原菌的抑制率
| 处理组 | 提取液浓度(mg/g) | 抑制率(％) |
| 试验组1 | 1.4506 | 77.8 |
| 试验组2 | 0.7253 | 77.7 |
| 试验组3 | 0.3626 | 78.0 |
| 试验组4 | 0.2418 | 67.2 |
| 试验组5 | 0.1813 | 52.3 |
| 试验组6 | 0.1451 | 41.6 |
由上表可知，在球孢白僵菌PR3提取物浓度为0.2418～1.4506mg/g时，其对小麦赤霉病病原菌的抑制率均可达到67％以上，当浓度为0.3626mg/g时，对小麦赤霉病病原菌的抑制效果如图4所示，此时其抑菌效果最佳，可达78％。
综上所示，可以将其选作内生真菌资源，通过发酵提取制备，获得抗植物病原真菌病害的新型农用活性的天然成分。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
Claims (5)
1.一株球孢白僵菌PR3，其特征在于，所述球孢白僵菌PR3于2020年12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.21031。
2.权利要求1所述的球孢白僵菌PR3的提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）菌种活化：用接种环挑取少许所述球孢白僵菌PR3，并将其接种到已灭菌的改良PDA培养基平板中，恒温培养6~7天，培养温度25℃，得到活化后的球孢白僵菌PR3；
（2）发酵培养：将步骤（1）活化后的球孢白僵菌PR3的孢子接种到已灭菌的改良PDB培养基中，在恒温摇床上恒温培养，培养液经滤纸过滤得菌丝体；
（3）将步骤（2）过滤后的菌丝体用冷冻研磨仪研磨后加入乙醇进行超声提取，过滤得球孢白僵菌PR3菌丝体的乙醇提取物；
步骤（1）中所述的改良PDA培养基的成分为：马铃薯200g，葡萄糖20g，酵母粉1g，蛋白胨3g，ZnSO4 0.1g，琼脂15~20g，蒸馏水1000mL，pH值自然；
步骤（2）中所述的改良PDB培养基的成分为：马铃薯200g，葡萄糖20g，酵母粉1g，蛋白胨3g，ZnSO4 0.1g，蒸馏水1000mL，pH值自然；
步骤（2）中恒温摇床的温度为25℃，转速为180r/min，培养8天。
3.根据权利要求2所述的球孢白僵菌PR3的提取物的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述冷冻研磨仪的温度为4℃，研磨时间为2min，提取功率为300~600W，提取时间为40min~1h20min。
4.根据权利要求2所述的球孢白僵菌PR3的提取物的制备方法，其特征在于，步骤（3）中加入乙醇的浓度为15%~30%，加入乙醇后，菌丝体的体积百分含量为10%~20%。
5.权利要求1所述球孢白僵菌PR3在防治小麦赤霉病中的应用。
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2022
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