CN110079478B - 解淀粉芽孢杆菌的抑菌物及其制备方法和在防治串珠镰孢菌花生根腐病中的应用 - Google Patents

解淀粉芽孢杆菌的抑菌物及其制备方法和在防治串珠镰孢菌花生根腐病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属微生物应用技术领域，提供解淀粉芽孢杆菌的抑菌物及其制备方法和在防治串珠镰孢菌花生根腐病中的应用。从山西老陈醋醋醅中分离、筛选出对串珠镰孢菌有强抑菌活性的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为：CGMCC 15732。将该菌种的发酵上清液经硫酸铵沉淀、透析、冷冻干燥后制成1.0mg/mL的抑菌物，应用在防治花生根腐病中，可以降低串珠镰孢菌对花生种子发芽生长的抑制效果；并且抑菌物对花生无不良影响，可以防治花生的根腐病，防治效果可达71.79%，能更好满足农业生产中花生根腐病防治的要求。

Description

解淀粉芽孢杆菌的抑菌物及其制备方法和在防治串珠镰孢菌 花生根腐病中的应用
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及解淀粉芽孢杆菌的抑菌物及其制备方法和在防治串珠镰孢菌花生根腐病中的应用。
背景技术
花生根腐病在花生各生育期皆可发生，花生播种后出苗前染病，可引起烂种、烂芽。苗期受害引致根腐、苗枯；成株期受害引致根腐、茎基腐和荚腐，病株地上部表现矮小、生长不良、叶片变黄，终致全株枯萎。由于本病发病部位主要在根部及维管束，使病株根变褐腐烂，维管束变褐，主根皱缩干腐，形似老鼠尾状，患部表面有黄白色至淡红色霉层。
花生根腐病由半知菌亚门的镰刀菌侵染所引起，其中包括串珠镰孢菌，它可产生无性态的小孢子、大孢子和厚垣孢子。病菌习居土壤中，在土中能存活数年，属维管束寄生菌，可堵塞导管和分泌毒素而使植株枯萎，所以导致花生产量损失极大。
目前花生根腐病防治可以采用合理轮作的栽培管理，也可使用化学药物防治，如***酮、多菌灵等，然而由于串珠镰孢菌的抗药性以及化学防治对环境污染严重等问题，开展根腐病的生物防治研究具有重大意义。生防菌具有安全、作用范围广、无毒的特点，因此从生防菌中提取活性物质应用到生产中，减少了菌体保存的环节，提高了利用率。本发明从山西老陈醋醋醅中分离出对串珠镰孢菌具有抑菌活性的芽孢菌，并提取其抑菌物质后应用在防治花生根腐病中。
发明内容
本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌的抑菌物及其制备方法和在防治串珠镰孢菌花生根腐病中的应用。
本发明提供了一种分离自山西老陈醋醋醅的解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732制备的抑菌物，并将其应用在防治串珠镰孢菌花生根腐病中。本发明的技术方案如下：
筛选对串珠镰孢菌具有高抑菌活性的芽孢菌：采集山西老陈醋醋酸发酵阶段的醋醅样品，采用MRS培养基进行稀释涂布，最终共分离出38株芽孢菌，采用牛津杯抑菌圈法从中筛选出对串珠镰孢菌CGMCC 39030有高抑菌活性的芽孢菌2014。
所述的MRS培养基的制备方法为：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，K2HPO4 2g，乙酸钠2g，柠檬酸三铵2g，吐温80 1g，MgSO4 0.2g，MnSO4 0.05g，蒸馏水1000mL。调pH至6.2‒6.6，121℃灭菌20min备用。
对芽孢菌2014进行16Sr DNA测序，引物为：上游：5′-CAGATGGGAGCTTGCTCCCT
G-3′，下游：5′-CGACTTCACCCAATCATCTG-3′，经鉴定芽孢菌2014为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），并将其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 15732。
解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732抑菌物的制备：将活化的解淀粉芽孢杆菌CGMCC15732按5%的接种量，分别接种于MRS液体培养基中，37℃，160rpm/min分别培养24h后，4℃，10000 r/min离心10 min，取上清液；用6mol/L的HCl溶液将上清液调成中性，边搅拌边加入固体硫酸铵，饱和度达到80%时，4℃冰箱放置过夜；4000r/min离心20 min后收集沉淀，用pH=7.2的磷酸盐缓冲液溶解，透析除盐，真空冷冻干燥后即得抑菌物。
上述所述的磷酸盐缓冲液的配制方法为：磷酸二氢钾0.24g、磷酸氢二钠1.42g、氯化钠8.0g、氯化钾0.2g，1000mL，pH=7.2。
上述所述的真空冷冻干燥是在-40℃、真空度为100 Pa条件下干燥40 h。
解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732抑菌物对串珠镰孢菌的抑菌机理：解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732抑菌物作用的串珠镰孢菌的生长延滞期较长，对数生长期时间较短，所以对串珠镰孢菌的菌丝生长量和孢子萌发率有明显的抑制作用；并且对串珠镰孢菌细胞膜的通透性造成了很大的影响，破坏了细胞壁的完整性；扫描电镜观察发现串珠镰孢菌菌丝萎缩畸形并且塌陷破裂；透射电镜观察发现串珠镰孢菌的细胞形态发生了明显变化，细胞壁塌陷、变薄，出现了质壁分离现象，质膜从细胞壁完全分离，原生质凝集，细胞质密度增加。
解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732的抑菌物在降低串珠镰孢菌对花生种子发芽生长产生抑制中的应用：将串珠镰孢菌接至PDA液体培养基中，30℃，160rpm/min培养5天后，过滤得串珠镰孢菌培养液。选饱满的花生种子，30℃下清水浸泡12 h后，冲洗3次，置30℃下催芽24 h；将花生种子放在装有滤纸的培养皿上，每皿10粒，倒入5mL串珠镰孢菌培养液，再加入10mL浓度为1.0mg/mL解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732抑菌物，对照组加入10 mL无菌水，置于恒温25℃下培养，48h后测量发芽长度。结果发现串珠镰孢菌对花生种子的发芽生长起到了抑制作用，与对照组相比，用解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732制备的抑菌物浸泡的花生发芽生长的抑制率较低，说明抑菌物可以降低串珠镰孢菌对花生种子发芽生长的抑制效果。
解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732的抑菌物在防治串珠镰孢菌花生根腐病中的应用：将串珠镰孢接至PDA液体培养基中30℃，160rpm/min培养5天后，取20mL串珠镰孢菌菌液灌溉100株盆栽花生的根部，用50mL浓度为1.0mg/mL解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732抑菌物和50mL无菌水分别灌溉50株花生的根部。结果发现用无菌水灌溉的有39株花生有根腐病，用解淀粉芽孢杆菌制备的抑菌物灌溉的有11株花生有根腐病，所以解淀粉芽孢杆菌CGMCC15732制备的抑菌物对花生无不良影响，并且可以很好地防治花生的根腐病，防治效果可达71.79%。
用解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732制备的抑菌物灌溉花生的根部，可以很好地防治花生的根腐病，能高效稳定的防治花生根腐病，更好地满足农业生产中花生根腐病防治的要求。
附图说明
图1为解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732的菌落形态和细胞形态，图中：A为解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732的菌落形态；B为解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732的1000×下细胞形态；
图2为解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732的16SrDNA***发育树；
图3为解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732发酵上清液对串珠镰孢菌菌丝生长量的影响；
图4为解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732发酵上清液对串珠镰孢菌孢子萌发率的影响；
图5为解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732发酵上清液对串珠镰孢菌理化指标的影响，图中：A为对串珠镰孢菌胞外钾离子浓度的影响；B为对串珠镰孢菌胞外AKP含量的影响；C为对串珠镰孢菌菌液电导率的影响；
图6为解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732发酵上清液对串珠镰孢菌菌丝及细胞形态的影响，图中：A为扫描电镜下对照组的串珠镰孢菌菌丝形态；B为扫描电镜下实验组的串珠镰孢菌菌丝形态；C为扫描电镜下对照组的串珠镰孢菌细胞形态；D为透射电镜下实验组的串珠镰孢菌细胞形态。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1：筛选对串珠镰孢菌具有高抑菌活性的芽孢菌
（1）筛选对串珠镰孢菌具有高抑菌活性的芽孢菌：采集山西老陈醋醋酸发酵阶段的醋醅样品，采用MRS培养基进行稀释涂布，最终共分离出38株芽孢菌。采用牛津杯抑菌圈法从中筛选出对串珠镰孢菌CGMCC 39030（购买于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心）有高抑菌活性的芽孢菌2014。
上述MRS固体培养基的制备方法为：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，K2HPO4 2g，乙酸钠2g，柠檬酸三铵2g，葡萄糖20g，吐温80 1g，MgSO4 0.2g，MnSO4 0.05g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，调pH至6.2‒6.6，121℃灭菌20min备用。
上述筛选对串珠镰孢菌具有高抑菌活性芽孢菌的具体方法为：将分离纯化的38株芽孢菌接至MRS液体培养基，37℃，160 r/min培养24 h，10000 r/min离心10 min收集芽孢菌发酵上清液，分别用6.0 mol/L的NaOH将其调至中性后备用；将串珠镰孢菌点接至放置有牛津杯的PDA培养基平板，将芽孢菌发酵上清液移取200 µL至牛津杯中，并放30℃培养箱培养。
（2）对串珠镰孢菌具有高抑菌活性芽孢菌2014的鉴定及保藏
形态学鉴定：用接种环挑取芽孢菌2014少许后在MRS平板培养基上进行划线，分离出单菌落，将培养基上生长的菌落拍照，进行记录，然后通过革兰氏染色镜检，观察其细胞形态特征。芽孢菌2014在MRS平板培养基上形成菌落直径4.58 mm，菌落呈圆形、较黏稠、表面粗糙凸起、边缘整齐、乳白色、不透明；其细胞形态：革兰氏染色呈G+，杆状，中间有芽孢，如图1所示。
16Sr DNA测序：用试剂盒提取芽孢菌2014的基因组，进行16Sr DNA测序及菌种鉴定，引物为：上游：5′-CAGATGGGAGCTTGCTCCCTG-3′，下游：5′-CGACTTCACCCAA
TCATCTG-3′，采用BLAST软件经同源性比较，结果表明芽孢菌2014为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），并构建***进化树，见图2。将其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 15732，保藏时间为2018年5月7日。
实施例2：解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732抑菌物的制备
将活化的解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732按5%的接种量，分别接种于MRS液体培养基中，37℃，160rpm/min分别培养24h后，4℃，10000 r/min离心10 min，取上清液；用6mol/L的HCl溶液将上清液调成中性，边搅拌边加入固体硫酸铵，饱和度达到80%时，4℃冰箱放置过夜；4000r/min离心20 min后收集沉淀，用pH=7.2的磷酸盐缓冲液溶解，透析除盐，真空冷冻干燥后即得抑菌物。
上述所述的磷酸盐缓冲液的配制方法为：磷酸二氢钾0.24g、磷酸氢二钠1.42g、氯化钠8.0g、氯化钾0.2g，1000mL，pH=7.2。
上述所述的真空冷冻干燥是在-40℃、真空度为100 Pa条件下干燥40 h。
实施例3：解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732抑菌物对串珠镰孢菌的抑菌机理
解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732抑菌物对串珠镰孢菌的抑菌机理主要从菌丝生长量、孢子萌发率、胞外钾离子浓度、胞外AKP含量、菌液电导率以及菌丝形态和细胞形态等方面来研究。由图3可知，解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732抑菌物作用的串珠镰孢菌的生长延滞期较长，对数生长期时间较短，所以对串珠镰孢菌的菌丝生长量有抑制作用；图4中明显可以看出，解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732抑菌物对串珠镰孢菌的孢子萌发率有明显的抑制作用；并且对串珠镰孢菌细胞膜的通透性造成了很大的影响，破坏了细胞壁的完整性（见图5），扫描电镜观察发现串珠镰孢菌菌丝萎缩畸形并且塌陷破裂；透射电镜观察发现串珠镰孢菌的细胞形态发生了明显变化，细胞壁塌陷、变薄，出现了质壁分离现象，质膜从细胞壁完全分离，原生质凝集，细胞质密度增加（见图6）。
上述解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732抑菌物对串珠镰孢菌菌丝生长量影响的具体方法为：将串珠镰孢菌点接在PDA培养基斜面，30℃培养5d后用生理盐水冲洗孢子，并将孢子悬浮液浓度调至106 cfu/mL，然后按5%的接菌量接入100 mL PDA液体培养基中，实验组加入5 mL的1.0mg/mL解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732抑菌物溶液（无菌水配制），其余空白对照组加5 mL的MRS培养基，继续在30℃，140 r/min条件下培养，实验组和空白对照组分别在1d、2d、4d、6d、8d每天取1瓶串珠镰孢菌菌液过滤弃去培养液，65℃烘干至恒重后称菌丝体重量。以时间为横标，菌丝体重量为纵坐标绘制生长曲线，观察解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732发酵上清液对串珠镰孢菌菌丝生长量的影响。
上述解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732抑菌物对串珠镰孢菌孢子萌发率影响的具体方法为：将串珠镰孢菌点接在PDA培养基斜面，30℃培养5 d后用生理盐水冲洗孢子，并将孢子悬浮液浓度调至106 cfu/mL，移取10 μL孢子悬浮液与50 μL的1.0mg/mL解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732抑菌物溶液混匀，以10 μL孢子悬浮液与50μL PDA液体混合为空白对照。悬滴法置于无菌载玻片中央，30℃恒温培养。分别在6 h、8 h、12 h、16 h、20 h镜检，观察孢子萌发情况，低倍镜（400ｘ）下观察孢子，计算孢子萌发率。孢子萌发率=（萌发孢子数/孢子总数）×100%。
上述解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732抑菌物对串珠镰孢菌胞外钾离子浓度影响的具体方法为：将上述串珠镰孢菌培养的实验组和空白对照组分别在0 h、3 h、8 h、13 h、23 h定时取菌悬液5 mL，4℃离心（10000 r/min，15 min）取上清，按照钾离子剂盒中提供的方法，采用分光光度计对串珠镰孢菌的胞外钾离子浓度进行测定。
上述解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732抑菌物对串珠镰孢菌胞外AKP含量影响的具体方法为：将上述串珠镰孢菌培养的实验组和空白对照组分别在0 h、3 h、8 h、13 h、23 h时取菌悬液5 mL，4℃离心（10000 r/min，15 min）取上清，按照碱性磷酸酶（AKP）剂盒中提供的方法，采用分光光度计对串珠镰孢菌的胞外AKP含量进行测定。
上述解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732抑菌物对串珠镰孢菌菌液电导率影响的具体方法为：将上述串珠镰孢菌培养的实验组和空白对照组分别在0 h、3 h、8 h、13 h、23 h时取菌悬液5 mL，4℃离心（10000 r/min，15 min）取上清，采用电导仪测定串珠镰孢菌的电导率。
采用扫描电镜观察对串珠镰孢菌菌丝形态影响的方法为：配制串珠镰孢菌106 cfu/mL的孢子悬浮液，按5%的接菌量接至100mL PDA液体培养基中，30℃，140r/min培养2天后，再加入5mL的1.0mg/mL解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732抑菌物溶液（无菌水配制），对照组加5mL的MRS培养基，30℃，140r/min条件下培养72h后，离心收集菌丝；分别用0.1 moL/L pH为7.2的PBS缓冲液漂洗菌丝3次，并用2.5%的戊二醛固定，4℃冰箱过夜；离心倒掉固定液，菌丝用接菌针均匀涂布在盖玻片上，并用0.1 moL/L的PBS缓冲液中漂洗3次，每次15 min。将上述处理后的盖玻片分别在浓度梯度50%、70%、80%、90%和95%的乙醇溶液中进行脱水处理，每种浓度处理10 min，再用100%的乙醇处理两次，每次15 min，最后将脱水处理后的盖玻片放置平皿中，将平皿放置干燥器中干燥4 h，喷金并在扫描电镜下观察。
采用透射电镜观察对串珠镰孢菌细胞形态影响的具体方法为配制串珠镰孢菌106 cfu/mL的孢子悬浮液，按5%的接菌量接至100mL PDA液体培养基中，30℃，140r/min培养2天后，再加入5mL的1.0mg/mL解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732抑菌物溶液（无菌水配制），对照组加5mL的MRS培养基，30℃，140r/min条件下培养72h后，离心收集菌丝；用0.1 moL/L pH为7.2的PBS缓冲液漂洗菌体3次，并以20倍菌体体积的2.5%的戊二醛固定，4℃冰箱过夜，倒掉固定液，用0.1 moL/L的PBS缓冲液中漂洗3次；每次15 min；再用1%的锇酸溶液固定菌体2h，倒掉固定液，用0.1 moL/L的PBS缓冲液中漂洗3次，每次15 min；并用浓度梯度50%、70%、80%、90%和95%的乙醇溶液中进行脱水处理，每种浓度处理10 min，再用100%的乙醇处理两次，每次15 min。用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=1/1）处理样品1h，将经过处理的样品分装到0.5mL的Eppendorf管中包埋起来，37℃烘箱内24 h，45℃烘箱内24 h，60℃烘箱内48 h；最后样品在超薄切片机中切片，获得70-90nm的切片，并在透射电镜中观察。
上述的PDA培养基的制备方法为：取马铃薯20g，葡萄糖2g，蛋白胨0.2g，KH2PO40.2g，MgSO4·2H2O 0.1g，加蒸馏水100mL，121℃ 灭菌20min。
实施例4：解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732的抑菌物在降低串珠镰孢菌对花生种子发芽生长抑制中的应用
将串珠镰孢菌接至PDA液体培养基中，30℃，160rpm/min培养5天后，过滤得串珠镰孢菌培养液。选饱满的花生种子，30℃下清水浸泡12 h后，冲洗3次，置30℃下催芽24 h；将花生种子放在装有滤纸的培养皿上，每皿10粒，倒入5mL串珠镰孢菌培养液，再加入10mL浓度为1.0mg/mL解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732抑菌物（无菌水配制），对照组加入10 mL无菌水，置于恒温25℃下培养，48h后测量发芽长度，按照公式计算串珠镰孢菌对种子发芽生长的抑制率，并按照抑制率的大小确定解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732的抑菌物在降低串珠镰孢菌对花生种子发芽生长产生的抑制效果。发芽生长抑制率(%)=(对照组发芽长度-处理组发芽长度)/对照组发芽长度。
结果显示串珠镰孢菌对花生种子的发芽生长起到了抑制作用，与对照组相比，用解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732制备的抑菌物浸泡的花生发芽生长的抑制率较低，说明抑菌物可以降低串珠镰孢菌对花生种子发芽生长的抑制效果。
实施例5：解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732的抑菌物在防治串珠镰孢菌花生根腐病中的应用
将串珠镰孢菌接至PDA液体培养基中30℃，160rpm/min培养5天后，取20mL串珠镰孢菌菌液灌溉100株盆栽花生的根部，用50mL浓度为1.0mg/mL解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732抑菌物和50mL无菌水分别灌溉50株花生的根部。结果发现用无菌水灌溉的有39株花生有根腐病，用解淀粉芽孢杆菌制备的抑菌物灌溉的有11株花生有根腐病，所以解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732制备的抑菌物对花生无不良影响，并且可以很好地防治花生的根腐病，防治效果可达71.79%。

Claims (7)

1.一株解淀粉芽孢杆菌( Bacillus amyloliquefaciens ) ，其特征在于：该菌株从山西老陈醋醋醅中分离、筛选所得，保藏号为CGMCC 15732，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年5月7日。
2.利用权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌制备的抑菌物，其特征在于：具体制备方法如下：将活化的解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732按5%的接种量，接种于MRS液体培养基中，37℃，160rpm/min分别培养24h后，4℃，10000 r/min离心10 min，取上清液；用6mol/L的HCl溶液将上清液调成中性，边搅拌边加入固体硫酸铵，饱和度达到80%时，4℃冰箱放置过夜；4000r/min离心20 min后收集沉淀，用pH=7.2的磷酸盐缓冲液溶解，透析除盐，真空冷冻干燥后即得抑菌物。
3.根据权利要求2所述的利用解淀粉芽孢杆菌制备的抑菌物，其特征在于：所述的磷酸盐缓冲液的配制方法为：磷酸二氢钾0.24g、磷酸氢二钠1.42g、氯化钠8.0g、氯化钾0.2g，1000mL，pH=7.2。
4.根据权利要求2所述的利用解淀粉芽孢杆菌制备的抑菌物，其特征在于：所述的真空冷冻干燥是在-40℃、真空度为100 Pa条件下干燥40 h。
5.权利要求2所述的利用解淀粉芽孢杆菌制备的抑菌物在防治串珠镰孢菌( Fusarium moniliforme ) 花生根腐病中的应用，其特征在于：所述的抑菌物在降低串珠镰孢菌对花生种子发芽生长抑制作用中的方法为：将串珠镰孢菌接至PDA液体培养基中，30℃，160rpm/min培养5天后，过滤得串珠镰孢菌培养液；选饱满的花生种子，30℃下清水浸泡12 h后，冲洗3次，置30℃下催芽24 h；将花生种子放在装有滤纸的培养皿上，每皿10粒，倒入5mL串珠镰孢菌培养液，再加入10mL浓度为1.0mg/mL解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732抑菌物，对照组加入10 mL无菌水，置于恒温25℃下培养，48h后测量发芽长度，并计算串珠镰孢菌对花生种子发芽生长的抑制率，并按照抑制率的大小确定抑菌物在降低串珠镰孢菌对花生种子发芽生长产生的抑制效果。
6.权利要求2所述的利用解淀粉芽孢杆菌制备的抑菌物在防治串珠镰孢菌花生根腐病中的应用，其特征在于：所述的抑菌物在防治串珠镰孢菌花生根腐病中应用的方法为：将串珠镰孢接至PDA液体培养基中30℃，160rpm/min培养5天后，取20mL串珠镰孢菌菌液灌溉100株盆栽花生的根部，用50mL浓度为1.0mg/mL解淀粉芽孢杆菌CGMCC 15732抑菌物和50mL无菌水分别灌溉50株花生的根部。
7.根据权利要求5或6所述的利用解淀粉芽孢杆菌制备的抑菌物在防治串珠镰孢菌花生根腐病中的应用，其特征在于：所述浓度为1.0mg/mL的抑菌物溶液用无菌水配制而成。
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