CN116559439A - 一种牛冠状病毒间接elisa抗体检测试剂盒及应用 - Google Patents

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CN116559439A CN202310445944.9A CN202310445944A CN116559439A CN 116559439 A CN116559439 A CN 116559439A CN 202310445944 A CN202310445944 A CN 202310445944A CN 116559439 A CN116559439 A CN 116559439A
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Abstract

本发明公开了一种牛冠状病毒间接ELISA抗体检测试剂盒及应用，属于生物检测技术领域。本发明是利用杆状病毒表达***表达制备BCoV重组S1蛋白，并以纯化后的BCoV‑S1蛋白作为待检抗原，建立的BCoV间接ELISA抗体检测方法。本发明制备的BCoV‑S1蛋白纯度较高，抗原性好，并首次用BCoV‑S1建立间接ELISA抗体检测方法，具有灵敏、特异、高效的特点，适合于BCoV抗体的临床检测与诊断。

Description

一种牛冠状病毒间接ELISA抗体检测试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种牛冠状病毒间接ELISA抗体检测试剂盒及应用。
背景技术
牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)属于套式病毒目冠状病毒科冠状病毒属，为有囊膜的单股正链RNA病毒，临床上能引起犊牛出血性腹泻、成年牛冬痢和呼吸道感染。该病毒在世界范围内广泛存在，除感染牛以外，也可以感染野生反刍动物。1972年美国的Mebus等曾在犊牛和成年牛的腹泻病料中首次检出BCoV病原。1985年宋广林首次报道了BCoV在我国的存在情况，随后BCoV在我国各个省份多次被成功检测出，阳性率高达70％，表明BCoV的感染率很高。1988年，研究人员从德国一名儿童腹泻样品中分离出一株与BCoV基因组关系密切的毒株，提示BCoV可能存在跨物种传播的可能。然而，目前尚无针对牛冠状病毒病的特效治疗药物，且国外研制的疫苗保护效果不佳，广谱性差。
基于以上，快速、特异、灵敏的BCoV检测对于疾病监测和控制非常重要。目前国内用于检测BCoV主要是通过RT-PCR或荧光定量检测，操作繁琐并且对于检测人员要求较高；建立的检测BCoV抗体的方法大多是原核表达N蛋白建立的ELISA检测方法，其抗原性大大减低。因此，建立特异性强、敏感性高、操作简单、成本低廉的病毒抗体检测方法有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛冠状病毒间接ELISA抗体检测试剂盒及应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过以杆状病毒表达***表达S1全长作为包被抗原，建立的特异性强、敏感性高、操作简单、成本低廉的病毒抗体检测方法，适合用于牛冠状病毒抗体的现场检测。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种牛冠状病毒间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被于酶标板上的BCoV-S1蛋白重组抗原。
优选的是，所述BCoV-S1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：MKFLVNVALVFMVVYISYIYAFLILLISLPTAFAVIGDLKCTTVSINDVDTGVPSISTDTVDVTNGLGTYYVLDRVYLNTTLLLNGYYPTSGSTYRNMALKGTLLLSTLWFKPPFLSDFTNGIFAKVKNTKVIKDGVMYSEFPAITIGSTFVNTSYSVVVQPHTTNLDNKLQGFLEISVCQYTMCEYPNTICHPNLGNQRVELWHWDTGVVSCLYKRNFTYDVNADYLYFHFYQEGGTFYAYFTDTGVVTKFLFNVYLGTVLSHYYVMPLTCNSALTLEYWVTPLTSKQYLLAFNQDGVIFNAVDCKSDFMSEIKCKTLSIAPSTGVYELNGYTVQPIADVYRRIPNLPDCNIEAWLNDKSVPSPLNWERKTFSNCNFNMSSLMSFIQADSFTCNNIDAAKIYGMCFSSITIDKFAIPNGRKVDLQLGNLGYLQSFNYRIDTTATSCQLYYNLPAANVSVSRFNPSTWNRRFGFTEQSVFKPQPAGVFTDHDVVYAQHCFKAPTNFCPCKLDGSLCVGSGSGIDAGYKHTGIGTCPAGTNYLTCHNAAQCDCLCTPDPITSKATGPYKCPQTKYLVGIGEHCSGLAIKSDHCGGNPCSCQPQAFLGWSVDSCLQGDRCNIFANFILHDVNSGTTCSTDLQKSNTDIILGVCVNYDLYGITGQGIFVEVNATYYNSWQNLLYDSNGNLYGFRDYLTNRTFMIRSCYSGRVSAAFHANSSEPALLFRNIKCNYVFNNTLLRQLQPINYFDSYLGCVVNADNSTSSVVQTCDLTVGSGYCVDYSTKRRSRRHHHHHHHH*.
优选的是，所述试剂盒还包括：封闭液、洗涤液、阳性对照、阴性对照、酶标二抗、显色液。
优选的是，所述BCoV-S1蛋白重组抗原的制备方法包括：将牛冠状病毒的S1基因序列经过密码子优化后，在3’端加入组氨酸标签，在S1基因序列两端引入BamHI和HindIII限制性酶切位点后，再转入载体中，构建重组质粒；将所述的重组质粒转染Sf9昆虫细胞，经培养，获取病毒上清液，再经分离纯化，即得BCoV-S1蛋白重组抗原。
优选的是，所述BCoV-S1蛋白重组抗原的最佳包被量为0.125μg/mL；最佳封闭条件为：37℃封闭3h；所述酶标二抗为兔抗牛IgG-HRP抗体，最佳稀释度为1:25000，孵育时间为37℃45min；最佳显色条件为37℃13min。
本发明还提供所述的检测试剂盒在非诊断目的的鉴定牛冠状病毒中的应用，利用所述的检测试剂盒，采用间接ELISA检测方法检测待测样品，以判断所述待测样品中是否含有牛冠状病毒。
优选的是，所述采用间接ELISA检测待测样品具体包括以下步骤：
(1)待检血清孵育：将待测样品进行倍比稀释，孵育；之后洗涤；
(2)酶标二抗孵育：稀释兔抗牛IgG-HRP抗体，孵育；之后洗涤；
(3)底物显色：避光加入显色液，孵育完成后，加入终止液终止反应，测定待测样品的OD450nm值和P/N值，以判断是否含有牛冠状病毒。
优选的是，步骤(1)-(2)中，洗涤液均为0.05％吐温20的PBST溶液。
优选的是，所述判断是否含有牛冠状病毒的标准为：阴阳性临界值OD450nm≥0.297为阳性，即为反之，OD450nm﹤0.297判定为阴性。
本发明公开了以下技术效果：
血清学诊断的关键是靶标抗原必要的构象折叠与修饰，牛冠状病毒(BCoV)S蛋白其中的S1亚基上有主要的中和表位，能够诱导中和抗体的产生，为牛冠状病毒检测和诊断提供依据，具体的，本发明BCoV-S1是由杆状病毒表达***表达获取，与现有检测方法的BCoV-N蛋白原核表达相比其抗原性大大提高。
本发明所建立的间接ELISA抗体检测方法，其灵敏度高达1:3200；与牛病毒性腹泻、牛轮状病毒、牛星状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛腺病毒阳性血清无交叉反应；重复性实验显示，所检测的样品在不同批次内的变异系数在1.20％-7.12％之间，均小于10％，而在同一批次不同时间段内的变异系数在0.05％-6.67％之间，均小于10％，说明该方法批内以及批间重复性良好。
综上所述，本发明以杆状病毒表达***表达S1全长制备BCoV重组S1蛋白(BCoV-S1)，并纯化后的BCoV-S1蛋白作为包被抗原，经实验显示，本发明制备的重组BCoV-S1蛋白具有良好抗原性，基于此重组BCoV-S1蛋白建立的间接ELISA抗体检测方法具有灵敏、特异、高效的特点，适合于BCoV抗体的现场检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为pFastBacTM1-S1双酶切鉴定图；1:双酶切质粒pFastBacTM1-S1；M：1kb DNALadder；
图2为重组Bacmid的M13菌液PCR鉴定结果，其中1-8：BCoV-S1的重组菌；M：DL5000DNA Marker；
图3为重组蛋白S1在SF9昆虫细胞中蛋白表达的鉴定，其中a：IFA鉴定重组蛋白S1在SF9昆虫细胞表达；b：蛋白免疫印记鉴定S1蛋白表达，1：接毒后SF9细胞；2：未接毒SF9细胞；3：接毒后SF9上清；4：未接毒SF9上清；M：预染蛋白Marker；
图4为重组蛋白S1在High5细胞中表达后蛋白纯化后SDS-PAGE分析图(a)及蛋白免疫印记分析图(b)；1：原液；2：流穿液；3-6：5mM咪唑缓冲液洗杂；7-11：500mM咪唑缓冲液洗脱；
图5为重组蛋白S1蛋白纯化后超滤管浓缩分析图；1：纯化后蛋白；2：纯化浓缩后蛋白；M：Marker；
图6为临界值的确定。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1真核BCoV-S1蛋白重组抗原的制备方法
1、BCoV-S1主要结构域的密码子优化和基因合成
参考BCoV-China/SWUN/A1/2018毒株((Gene bank:QOV05164.1)的S1基因为基础进行密码子优化，通过南京金斯瑞生物科技有限公司进行优化合成。优化后基因序列的C端带有6个组氨酸(His)标签，N端带有蜂素分泌信号肽(Honeybee melittin signalpeptide，Mels)，优化后的蛋白序列如SEQ ID No：2。使用BamHⅠ和Hind III两个酶切位点将基因克隆到pFastBacTM1载体上，构建含有优化基因序列的pFastBacTM1-S1质粒。将质粒pFastBacTM1-S1双酶切进行验证，图1为pFastBacTM1-S1双酶切结果图。
SEQ ID No：2如下所示：
MKFLVNVALVFMVVYISYIYAFLILLISLPTAFAVIGDLKCTTVSINDVDTGVPSISTDTVDVT
NGLGTYYVLDRVYLNTTLLLNGYYPTSGSTYRNMALKGTLLLSTLWFKPPFLSDFTNGIFA
KVKNTKVIKDGVMYSEFPAITIGSTFVNTSYSVVVQPHTTNLDNKLQGFLEISVCQYTMCE
YPNTICHPNLGNQRVELWHWDTGVVSCLYKRNFTYDVNADYLYFHFYQEGGTFYAYFTDT
GVVTKFLFNVYLGTVLSHYYVMPLTCNSALTLEYWVTPLTSKQYLLAFNQDGVIFNAVDC
KSDFMSEIKCKTLSIAPSTGVYELNGYTVQPIADVYRRIPNLPDCNIEAWLNDKSVPSPLNW
ERKTFSNCNFNMSSLMSFIQADSFTCNNIDAAKIYGMCFSSITIDKFAIPNGRKVDLQLGNLGYLQSFNYRIDTTATSCQLYYNLPAANVSVSRFNPSTWNRRFGFTEQSVFKPQPAGVFTDHDVVYAQHCFKAPTNFCPCKLDGSLCVGSGSGIDAGYKHTGIGTCPAGTNYLTCHNAAQCDCLCTPDPITSKATGPYKCPQTKYLVGIGEHCSGLAIKSDHCGGNPCSCQPQAFLGWSVDSCLQGDRCNIFANFILHDVNSGTTCSTDLQKSNTDIILGVCVNYDLYGITGQGIFVEVNATYYNSWQNLLYDSNGNLYGFRDYLTNRTFMIRSCYSGRVSAAFHANSSEPALLFRNIKCNYVFNNTLLRQLQPINYFDSYLGCVVNADNSTSSVVQTCDLTVGSGYCVDYSTKRRSRRHHHHHHHH*.
2、重组Bacmid的构建
将pFast Bac1-S1质粒分别转化大肠杆菌DH10Bac E coli感受态细胞(购自上海唯地生物技术有限公司)，涂于含3种抗生素的蓝白斑板(X-Gal、庆大霉素、卡那霉素、四环素、IPTG)，48h后挑取白色单克隆菌落划线于蓝白斑；经过24h蓝白斑纯化后，挑单菌于含有庆大霉素、卡那霉素、四环素的液体LB中摇菌1h后，用M13引物进行菌液鉴定重组S1-Bacmid，如图2为重组S1-Bacmid的M13菌液PCR鉴定结果。切条带正确的核酸胶送上海生物工程有限公司测序。测序成功后，摇菌16h小提质粒获得S1-Bacmid重组质粒。
3、BCoV-S1蛋白的表达及鉴定
将重组质粒S1-Bacmid通过转染试剂X-tremeGENETMHP DNA转染Sf9昆虫细胞，细胞培养72h后，收获病毒上清，4℃避光保存；将生长状态良好Sf9细胞提前一天接至24孔板中，细胞密度约1.5-2.5×106cells/mL，27℃恒温培养箱静置培养24h，使细胞贴壁；将汇合度约为70％的细胞用PBS清洗2遍，更换新鲜培养基。按照5％的接毒量接种重组杆状病毒于SF9细胞，细胞板放置在27℃恒温培养箱培养；接毒后72h，观察到细胞是否出现明显病变，收集上清4℃保存，继续接毒，直至出现明显病变。
出现明显病变后，24孔板铺6个孔，4孔接毒病毒上清，2孔不接毒作为对照，72h出现病变后收上清4℃保存，加入少量PBS覆盖细胞表面进行润洗，弃掉PBS。在24孔细胞板中2个接毒孔及一个对照孔中加入80μL含PMSF的RIPA蛋白裂解液，用移液枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，细胞板置于冰上裂解30min，充***解后，将细胞裂解液转移至1.5mL离心管中，14000g离5min，取裂解后离心上清80μl，加入20μL 5×SDS-PAGE Loading Buffer，混匀后100℃水浴10min使蛋白变性，用于后续的Western blot。剩下3孔接毒后72h，收集上清4℃保存。细胞使用PBST洗涤三次，按500μL/孔的量加入无水乙醇于4℃下固定45min。固定结束后用PBST洗涤三次，加入500μL小鼠His标签单克隆抗体，37℃恒温培养箱孵育1h。孵育结束后用PBST洗涤三次，加入500μL FITC标记山羊抗小鼠单克隆抗体，37℃恒温培养箱孵育50min，用PBST洗涤三次，使用倒置荧光显微镜观察荧光情况。
如图3所示，其为重组蛋白S1在SF9昆虫细胞中蛋白表达的鉴定图，Western blot结果表明：在100kDa偏上处出现了一条特异性的条带，对照细胞无条带，证明重组蛋白在Sf9昆虫细胞中成功表达；S1在上清和细胞均有表达，且分泌于上清的杂蛋白少。间接免疫荧光结果表明：接毒后的Sf9昆虫细胞内出现明显的绿色荧光，未接毒的Sf9昆虫细胞没有绿色荧光，证明重组蛋白在Sf9昆虫细胞中成功表达。
4、BCoV-S1蛋白的大量表达及纯化
准备2瓶1000mL的高压锥形瓶，每瓶加300mL的密度为2×106cells/mL的High 5细胞，按照2％的接毒量加重组杆状病毒于细胞中，混匀后置于27℃110rpm转速的恒温摇床中培养。培养96h，细胞活率大概为70％左右后，将细胞悬液装入50mL离心管中，2500rpm离心10min，反复离心，收取上清培养基进行蛋白纯化。
纯化前溶液的准备：所有纯化溶液要过0.22μm滤器，需纯化的培养基上清蛋白溶液过0.45μm滤器。
接下来，采用5mL Cytiva His TrapTM HP镍柱对上述得到的蛋白质进行进一步纯化，具体操作如下：
(1)分别用5倍柱体积的ddH2O和10倍柱体积的5mM咪唑缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、5mM咪唑)平衡镍柱；
(2)蛋白溶液放置于冰上，通过NGC***，A泵流经镍柱；
(3)使用5倍柱体积的5mM咪唑缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、5mM咪唑)，经B泵流经镍柱进行漂洗，洗脱掉结合不牢固的杂蛋白；
(4)使用10倍柱体积的500mM咪唑缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、500mM咪唑)洗脱目的蛋白，以1mL/min流速洗脱柱子上的目的蛋白，收集洗脱液储存在1.5mL EP管内，每管1mL分别收集。
(5)使用超滤管对蛋白进行浓缩换液。5mL 50KD超滤管中加不超过5mLddH2O，配平3000rpm离心10min使滤膜润湿，弃去离心管内ddH2O，加入经SDS-PAGE(如图3a)中有目的蛋白条带的3管溶液，3000rpm离心10min，补加5％甘油的PBS溶液至原位置，离心后继续补加，经过反复多次换液减少蛋白溶液中盐离子含量，最终延长离心时间使溶液只剩下500μL，用移液枪析出经过换液浓缩后蛋白。
(6)使用BCA法测定纯化S1蛋白浓度后，分装于-80℃。
如图4所示，纯化结果表明使用低浓度咪唑(5mmol/L)可以将大部分杂蛋白洗脱下来，使用高浓度咪唑(500mmol/L)能够洗脱目的蛋白，浓缩后蛋白纯度提高。
如图5所示，其为使用超滤管浓缩换液后重组蛋白S1蛋白超滤浓缩分析图，可见浓缩后蛋白的浓度更高。
实施例2基于真核表达BCoV-S1蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立
1、最适抗原包被浓度与血清稀释度的确定
使用矩阵法确定BCoV-S1蛋白抗原最佳包被浓度和血清稀释度，使用碳酸氢钠包被缓冲液将BCoV-S1蛋白进行倍比稀释，将其包被浓度稀释为2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625μg/mL，每孔100μL(依次横排包被)，4℃包被过夜；弃去孔中液体，每孔200μL PBST洗涤，每次5min洗3次，最后一次于吸水纸上拍干液体；配制5％的脱脂乳封闭缓冲液，每孔加入200μL封闭缓冲液，37℃封闭2h；弃去，使用PBST洗板3次，每次5min，最后一次于吸水纸上拍干液体；使用2％脱脂乳将牛阳性血清和阴性血清(阴性对照)进行倍比稀释，稀释比例为1:50、1:100、1:200、1:400，4个稀释度，每孔100μL(依次竖排加入)，37℃孵育1h；弃去，使用PBST洗板3次，每次5min，最后一次于吸水纸上拍干液体；使用PBST按照1:20000稀释兔抗牛IgG-HRP抗体，每孔100μL，37℃孵育45min；弃去，使用PBST洗板3次，每次5min，最后一次于吸水纸上拍干液体；避光每孔加入100μL TMB显色液，37℃孵育15min；每孔加入100μL1M硫酸终止液；使用酶标仪450mm处吸光值，比较BCoV阴阳性血清的OD450nm值和P/N值，从而确定最适抗原包被浓度和血清稀释度。
2、最佳封闭条件的确定
使用上一步优化的实验条件，进行封闭条件的优化。将ELISA板包被孔分组，用5％脱脂乳、2.5％脱脂乳、1％明胶、1％BSA、5％BSA分别在37℃条件下封闭30min、60min、90min、120min、180min。比较这几组的BCoV阴性和阳性血清OD450nm值和P/N值，以确定最佳的封闭条件。
3、血清的最佳作用条件的确定
使用上一步优化的实验条件，进行血清最佳作用条件的优化。将ELISA板包被分组，将血清按比例稀释好后，分别在37℃条件下孵育30min、45min、60min、75min、90min。比较这几组的BCoV阴性和阳性血清OD450nm值和P/N值，以确定血清的最佳作用条件。
4、最适酶标二抗稀释度以及孵育条件的确定
使用上一步优化的实验条件，对酶标抗体的稀释度和孵育条件进行优化。将ELISA板包被分组，兔抗牛IgG-HRP抗体分别按1：5000、1:10000、1：15000、1：20000、1：25000的稀释度行稀释，同时在每个稀释度分别在37℃条件下孵育30min、45min、60min、75min。比较酶标抗体不同稀释倍数不同孵育条件下BCoV阴性和阳性血清的OD450nm值和P/N值，确定最佳酶标抗体稀释度以及孵育条件。
5、底物作用时间的确定
使用上一步优化的实验条件，对底物作用时间进行优化。将ELISA板包被分组，TMB底物作用时间分别为37℃条件下孵育5min、8min、10min、13min、15min。比较不同底物作用时间下BCoV阴性和阳性血清的OD450nm值和P/N值，确定底物最佳作用时间。
6、阴阳临界值的确定
使用已经优化好的实验条件，以75份阴性的牛血清为样品，测定其OD450nm值，计算平均值和标准差(SD)，利用计算公式确定阴阳性临界值。
7、结果与分析
7.1包被抗原、封闭液、一抗血清、酶标二抗和底物作用条件的确定
结果显示，经试验确定间接ELISA抗原最佳包被量为0.125μg/mL，血清最佳稀释度为1:200(表1)；最佳封闭液为1％明胶(表2)，封闭条件为37℃3h(表3)；血清最佳孵育条件为37℃30min(表4)；酶标二抗的最佳稀释度为1:25000(表5)，最佳作用条件为37℃45min(表6)；底物的最佳作用条件为37℃13min(表7)。
表1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定
表2封闭液类型确定
表3封闭条件确定
表4血清最佳反应条件的选择
表5酶标二抗最佳稀释度确定
表6酶标二抗最佳作用条件确定
表7底物作用条件的确定
7.2阴阳性临界值的确定
对75份BCoV牛阴性血清的OD值进行统计学分析，阴性血清OD450nm的平均值 标准差SD＝0.047，根据公式计算：/>得出阴阳性临界值为0.297。因此，当被检血清的OD450nm值≥0.297时，判定为阳性，反之则为阴性(如图6)。
实施例3BCoV间接ELISA抗体检测方法的性能测定
1、特异性实验
以最优条件包被重组BCoV-S1蛋白后，分别将已知抗体阳性的牛病毒性腹泻(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)、牛星状病毒(BastV)、牛副流感病毒(BPIV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛腺病毒(BBAV)的标准血清1：200稀释进行检测，同时以BCoV阳性血清和阴性血清为对照，具体的实验操作步骤按优化后的试验条件进行，最后根据OD450nm值，确定该方法的交叉情况。
结果显示，用建立的ELISA方法对牛病毒性腹泻、牛轮状病毒、牛星状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛腺病毒阳性血清进行检测，结果显示，重组BCoV-S1蛋白抗原与不同病毒阳性血清反应后，OD450nm值均＜0.297，可见重组BCoV-S1蛋白抗原不与上述病原的阳性血清发生非特异性结合，表明建立的ELISA方法具有较好的特异性。结果见表8。
表8特异性试验
2、敏感性实验
将BCoV阳性血清分别进行1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6400、1∶12800和1∶25600倍稀释，然后分别对不同稀释度的阳性血清进行ELISA试验。
如表9所示，结果显示，血清的稀释比例为1∶3200时，检测结果仍为阳性(OD450nm＞0.297)，表明该方法的敏感性较高。
表9敏感性试验
3、重复性实验
选取6份血清样品，利用建立的BCoV间接ELISA抗体检测方法对同一批次包被的3个不同ELISA板进行批内重复性试验；另外随机选用3个不同批次包被的ELISA板，用该检测方法对上述6份血清样品进行批间重复性试验。计算它们的批间或批内的平均值、标准差和变异系数评估该检测方法的重复性。应用所建立的ELISA方法进行批内重复性试验和批间重复性试验，进行统计学分析。
如表10所示，结果显示，批间内重复性试验最大变异系数为7.12％，批内重复性试验最大变异系数为6.67％，均小于10％，表明所建立的ELISA方法具有较好的重复性。
表10BCoV间接ELISA抗体检测方法的重复性实验结果
4、临床应用
收集来自3个牛场共298份临床牛血清样品，用所建立的BCoV间接ELISA抗体检测方法进行样品检测。
如表11所示，结果显示，本次样品的阳性检出率为74.83％。
表11样品检测结果
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种牛冠状病毒间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被于酶标板上的BCoV-S1蛋白重组抗原。
2.根据权利要求1所述的牛冠状病毒间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述BCoV-S1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1所述的牛冠状病毒间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：封闭液、洗涤液、阳性对照、阴性对照、酶标二抗、显色液。
4.如权利要求1所述的牛冠状病毒间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述BCoV-S1蛋白重组抗原的制备方法包括：将牛冠状病毒的S1基因序列经过密码子优化后，在3’端加入组氨酸标签，在S1基因序列两端引入BamHI和HindIII限制性酶切位点后，再转入载体中，构建重组质粒；将所述的重组质粒转染Sf9昆虫细胞，经培养，获取病毒上清液，再经分离纯化，即得BCoV-S1蛋白重组抗原。
5.如权利要求1所述的牛冠状病毒间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述BCoV-S1蛋白重组抗原的最佳包被量为0.125μg/mL；最佳封闭条件为：37℃封闭3h；所述酶标二抗为兔抗牛IgG-HRP抗体，最佳稀释度为1:25000，孵育时间为37℃45min；最佳显色条件为37℃13min。
6.如权利要求1-5任一项所述的检测试剂盒在非诊断目的的鉴定牛冠状病毒中的应用，其特征在于，利用所述的检测试剂盒，采用间接ELISA检测方法检测待测样品，以判断所述待测样品中是否含有牛冠状病毒。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述采用间接ELISA检测待测样品具体包括以下步骤：
(1)待检血清孵育：将待测样品进行倍比稀释，孵育；之后洗涤；
(2)酶标二抗孵育：稀释兔抗牛IgG-HRP抗体，孵育；之后洗涤；
(3)底物显色：避光加入显色液，孵育完成后，加入终止液终止反应，测定待测样品的OD450nm值和P/N值，以判断是否含有牛冠状病毒。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(1)-(2)中，洗涤液均为0.05％吐温20的PBST溶液。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述判断是否含有牛冠状病毒的标准为：阴阳性临界值OD450nm≥0.297为阳性，即为反之，OD450nm﹤0.297判定为阴性。
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