CN116042761B - 一种超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法 - Google Patents
一种超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116042761B CN116042761B CN202211110076.0A CN202211110076A CN116042761B CN 116042761 B CN116042761 B CN 116042761B CN 202211110076 A CN202211110076 A CN 202211110076A CN 116042761 B CN116042761 B CN 116042761B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture
- concentration
- glucose
- lutein
- algae
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 235000012680 lutein Nutrition 0.000 title claims abstract description 38
- KBPHJBAIARWVSC-RGZFRNHPSA-N lutein Chemical compound C([C@H](O)CC=1C)C(C)(C)C=1\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\[C@H]1C(C)=C[C@H](O)CC1(C)C KBPHJBAIARWVSC-RGZFRNHPSA-N 0.000 title claims abstract description 38
- 229960005375 lutein Drugs 0.000 title claims abstract description 38
- ORAKUVXRZWMARG-WZLJTJAWSA-N lutein Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=CC(O)CC2(C)C)C ORAKUVXRZWMARG-WZLJTJAWSA-N 0.000 title claims abstract description 38
- 239000001656 lutein Substances 0.000 title claims abstract description 38
- KBPHJBAIARWVSC-XQIHNALSSA-N trans-lutein Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CC(O)CC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=CC(O)CC2(C)C)C KBPHJBAIARWVSC-XQIHNALSSA-N 0.000 title claims abstract description 38
- FJHBOVDFOQMZRV-XQIHNALSSA-N xanthophyll Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CC(O)CC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C=C(C)C(O)CC2(C)C FJHBOVDFOQMZRV-XQIHNALSSA-N 0.000 title claims abstract description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 claims abstract description 45
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 42
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 42
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 37
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 37
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims abstract description 16
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims abstract description 13
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 9
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 50
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 25
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 20
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 claims description 15
- LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L calcium chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 15
- 229940052299 calcium chloride dihydrate Drugs 0.000 claims description 15
- QGUAJWGNOXCYJF-UHFFFAOYSA-N cobalt dinitrate hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Co+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O QGUAJWGNOXCYJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.[Cu+2].[O-]S([O-])(=O)=O JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 15
- XQGPKZUNMMFTAL-UHFFFAOYSA-L dipotassium;hydrogen phosphate;trihydrate Chemical compound O.O.O.[K+].[K+].OP([O-])([O-])=O XQGPKZUNMMFTAL-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 15
- SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 15
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 15
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 claims description 15
- CNFDGXZLMLFIJV-UHFFFAOYSA-L manganese(II) chloride tetrahydrate Chemical compound O.O.O.O.[Cl-].[Cl-].[Mn+2] CNFDGXZLMLFIJV-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 15
- RZLVQBNCHSJZPX-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O RZLVQBNCHSJZPX-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 15
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 10
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 10
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 10
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 10
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 9
- 241000195649 Chlorella <Chlorellales> Species 0.000 claims description 8
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 claims description 5
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 4
- 241000195654 Chlorella sorokiniana Species 0.000 claims description 2
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 claims description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 12
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 235000021466 carotenoid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108010001949 Algal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000195628 Chlorophyta Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 235000019733 Fish meal Nutrition 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003064 anti-oxidating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000004467 fishmeal Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
- C12N1/125—Unicellular algae isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/89—Algae ; Processes using algae
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Botany (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法,将藻种培养成平板种子,再培养成摇瓶种子,最后进行发酵罐发酵,当初始葡萄糖浓度耗尽时,开始流加控制培养液中葡萄糖浓度于1‑5 g/L;当培养液中葡萄糖消耗量达30 g/L时,补加其他营养成分的浓缩液以达各自的初始浓度;当藻体生物量浓度达160‑200 g/L时,改脉冲方式流加葡萄糖溶液,使溶氧在10%‑50%之间快速反复波动,以控制培养液中残糖浓度接近于零,从而诱导蛋白质和叶黄素合成。本发明方法不仅实现微藻超高密度异养培养,还可让藻细胞同步积累高含量的蛋白质和叶黄素,发酵周期短,生产工艺简单,能够显著提高微藻联产蛋白质和叶黄素的工业化前景。
Description
技术领域
本发明属于发酵工艺领域,具体涉及一种超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法。
背景技术
叶黄素是一种含氧的类胡萝卜素,由于具有较强的着色、抗氧化和抗炎作用,被广泛应用于饲料、化妆品、食品、保健品和医药等行业。微藻被认为是商业叶黄素的新兴来源。近年来,研究人员对微藻基叶黄素的生产进行了大量研究,所用藻种大多为绿藻。其中,索罗金小球藻(Chlorella sorokiniana)由于生长速度快、能适应不同的营养模式和宽广的培养条件,在生产叶黄素等诸多方面展现出了巨大的商业应用潜力。
此外,微藻能够合成所有类型的氨基酸,且大多数微藻的蛋白质含量与传统蛋白源植物相当甚至更高,是理想的战略蛋白源。大量的营养和毒理学评价也表明,微藻适宜作为一种有价值的饲料添加剂或传统蛋白源(如豆粕、鱼粉)的替代品。然而,目前商业生产的微藻主要是通过光自养模式在开放跑道池中培养获得,由于这种培养方式存在生产效率低、生产成本高等问题,极大限制了微藻作为蛋白源的广泛应用。
异养培养作为一种更为经济、高效的工业化生产模式,是降低微藻生产成本、提升产能的潜在途径。但不同来源的索罗金小球藻在异养过程中存在明显的藻种特异性,表现出不同的生长和产物积累特性。通过异养***培养微藻,我们不仅要考量其所能达到的生物质产量,同时还要考量藻体蛋白质和叶黄素含量,因为这将决定异养微藻作为蛋白源及叶黄素源的最终应用价值和市场价值。
然而,在传统异养工艺下藻细胞密度、蛋白质及叶黄素含量普遍较低,且只限于蛋白质或叶黄素单一成分的生产研究。此外,为减少微藻生物质的开发利用成本,对微藻细胞进行多组分综合利用,以及耦合生产高附加值产品,已是微藻生物质开发的发展趋势。但截至目前,尚没有一种成熟的培养方法既可实现微藻超高密度异养培养,又可让藻细胞同步积累高含量的蛋白质和叶黄素。
发明内容
本发明的目的在于提出一种超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法,通过该方法实现微藻高效联产蛋白质和叶黄素。以解决在传统异养工艺下藻细胞密度、蛋白质及叶黄素含量普遍较低,且只限于蛋白质或叶黄素单一成分生产研究的问题,可为微藻叶黄素和蛋白质的高效耦合生产提供一种新方法。
为了达到上述目的,本发明采取以下技术方案:
一种超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法,包括以下步骤:
(1)藻种及其保藏:所使用的藻种为Chlorella sorokinianaFZU60,保藏编号为CGMCC NO. 45230,已于2022年08月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,使用20%甘油无菌溶液将藻细胞转移至冻存管中,之后放置于-80℃冰箱保藏。
(2)平板培养:取-80℃冰箱冻存的藻液涂布于含有固体培养基的平板上,并置于25-35℃的培养箱中避光培养4-8天。
(3)种子培养:使用接种环从平板中挑取1-4环藻体至装有种子培养基的摇瓶中,置于25-35℃摇床培养箱中,设置转速为50-300 r/min,避光培养3-7天。
(4)发酵培养:
1)第一阶段:将步骤(3)的种子接种于装有发酵培养基的发酵罐中,控制细胞初始浓度为0.5-3.0 g/L,通气量控制在0.5-2.0 vvm,初始转速控制在100~300 rpm,温度控制在25~35℃,pH控制在6.5~8.0;
2)第二阶段:当初始葡萄糖浓度耗尽时,开始流加浓度为750 g/L的葡萄糖溶液,控制培养液中葡萄糖浓度处于1-5 g/L之间;每当培养液中的葡萄糖消耗量达30 g/L时,补加其他营养成分的浓缩液以达各自的初始浓度;溶氧与转速关联控制在10-30%;
3)第三阶段:当藻体生物量浓度达160-200 g/L时,固定发酵罐最大转速,改为脉冲方式流加750 g/L的葡萄糖溶液,使得溶氧在10%-50%之间快速反复波动,以控制培养液中残糖浓度接近于零,从而诱导蛋白质和叶黄素合成。发酵周期6-8天,藻体生物量可达180-220 g/L,蛋白质含量为40-50%,叶黄素含量为5-7 mg/g。
在步骤(2)和(3)中,固体培养基为种子培养基基础上额外添加琼脂15 g/L;种子培养基为:葡萄糖10 g/L,硝酸钠1.75 g/L,氯化钠5 g/L,七水硫酸镁0.4 g/L,氯化钾0.6g/L,二水氯化钙0.15 g/L,三水磷酸氢二钾0.1 g/L,Tris 0.5 g/L,EDTA·2Na 75 mg/L,硼酸15mg/L,七水硫酸亚铁5 mg/L,四水氯化锰3.5 mg/L,七水硫酸锌0.825 mg/L,六水硝酸钴0.0175mg/L,五水硫酸铜0.005 mg/L。
在步骤(4)中,发酵培养基为:葡萄糖30 g/L,尿素1.854 g/L,七水硫酸镁1.2 g/L,二水氯化钙0.45 g/L,三水磷酸氢二钾0.3 g/L,EDTA·2Na 213 mg/L,硼酸45 mg/L,七水硫酸亚铁15 mg/L,四水氯化锰10.5 mg/L,七水硫酸锌2.475 mg/L,六水硝酸钴0.0525mg/L,五水硫酸铜0.015 mg/L。
在步骤(4)中,浓缩液分为3部分,浓缩液I为二水氯化钙11.25 g/L,浓缩液II为尿素247.33 g/L和七水硫酸镁160 g/L,浓缩液III为三水磷酸氢二钾40 g/L、EDTA·2Na 30g/L、硼酸6 g/L、七水硫酸亚铁2 g/L、四水氯化锰1.4 g/L、七水硫酸锌0.33 g/L、六水硝酸钴7 mg/L、五水硫酸铜2 mg/L。
在步骤(4)中,第三阶段的培养时间为1-2天。
本发明的显著优点在于:本发明所用微藻为高蛋白质且高叶黄素含量藻株,同时采用本发明所提出的异养发酵工艺,不仅可实现微藻超高密度异养培养,而且还可让藻细胞同步积累高含量的蛋白质和叶黄素,所达到的生产效率远高于国内外报道结果,能够显著提高利用微藻耦合生产叶黄素和营养蛋白的工业化前景。
附图说明
图1为实施例1中发酵罐中微藻生物量浓度和葡萄糖浓度的变化趋势图。
图2为实施例1中发酵罐中微藻叶黄素含量和蛋白质含量的变化趋势图。
图3为实施例1中发酵罐中溶氧浓度的变化趋势图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明:本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实验,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
(1)藻种及其保藏:所使用的藻种为Chlorella sorokinianaFZU60(保藏编号为CGMCCNO. 45230,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心),使用20%甘油无菌溶液将藻细胞转移至冻存管中,之后放置于-80℃冰箱保藏。
(2)平板培养:取-80℃冰箱冻存的藻液涂布于含有固体培养基的平板上,并置于30℃的培养箱中避光培养5天。
(3)种子培养:使用接种环从平板中挑取4环藻体至装有种子培养基的摇瓶中,置于30℃摇床培养箱中,设置转速为200 r/min,避光培养5天。
(4)发酵培养:
1)第一阶段:将步骤(3)的种子接种于装有发酵培养基的发酵罐中,控制细胞初始浓度为2 g/L,通气量控制在1 vvm,初始转速控制在200 rpm,温度控制在30℃,pH控制在7.5;
2)第二阶段:当初始葡萄糖浓度耗尽时,开始流加浓度为750 g/L的葡萄糖溶液,控制培养液中葡萄糖浓度处于1-5 g/L之间;每当培养液中的葡萄糖消耗量达30 g/L时,补加其他营养成分的浓缩液以达各自的初始浓度;溶氧与转速关联控制在20%;
3)第三阶段:当藻体生物量浓度达200 g/L时,固定发酵罐最大转速,改为脉冲方式流加750 g/L的葡萄糖溶液,使得溶氧在10%-50%之间快速反复波动,以控制培养液中残糖浓度接近于零,从而诱导蛋白质和叶黄素合成。
在步骤(2)和(3)中,固体培养基为种子培养基基础上额外为添加琼脂15 g/L;种子培养基为:葡萄糖10 g/L,硝酸钠1.75 g/L,氯化钠5 g/L,七水硫酸镁0.4 g/L,氯化钾0.6 g/L,二水氯化钙0.15 g/L,三水磷酸氢二钾0.1 g/L,Tris 0.5 g/L,EDTA·2Na 75mg/L,硼酸15 mg/L,七水硫酸亚铁5 mg/L,四水氯化锰3.5 mg/L,七水硫酸锌0.825 mg/L,六水硝酸钴0.0175mg/L,五水硫酸铜0.005 mg/L。
在步骤(4)中,发酵培养基为:葡萄糖30 g/L,尿素1.854 g/L,七水硫酸镁1.2 g/L,二水氯化钙0.45 g/L,三水磷酸氢二钾0.3 g/L,EDTA·2Na 213 mg/L,硼酸45 mg/L,七水硫酸亚铁15 mg/L,四水氯化锰10.5 mg/L,七水硫酸锌2.475 mg/L,六水硝酸钴0.0525mg/L,五水硫酸铜0.015 mg/L。
在步骤(4)中,浓缩液分为3部分,浓缩液I为二水氯化钙11.25 g/L,浓缩液II为尿素247.33 g/L和七水硫酸镁160 g/L,浓缩液III为三水磷酸氢二钾40 g/L、EDTA·2Na 30g/L、硼酸6 g/L、七水硫酸亚铁2 g/L、四水氯化锰1.4 g/L、七水硫酸锌0.33 g/L、六水硝酸钴7 mg/L、五水硫酸铜2 mg/L。
在步骤(4)中,第三阶段的培养时间为2天。
在整个发酵培养过程中,每隔一定时间取样测定生物量浓度、葡萄糖浓度、叶黄素含量和蛋白质含量。生物量浓度采用细胞干重法测定,葡萄糖浓度采用DNS比色法测定,叶黄素含量和类胡萝卜素组成通过高效液相色谱法测定,蛋白质含量通过蛋白质提取及分析试剂盒测定。由图1-3可知,发酵周期7天,藻体生物量可达220 g/L,蛋白质含量为50%,叶黄素含量为7 mg/g。
实施例2
(1)藻种及其保藏:所使用的藻种为Chlorella sorokinianaFZU60(保藏编号为CGMCC NO. 45230,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心),使用20%甘油无菌溶液将藻细胞转移至冻存管中,之后放置于-80℃冰箱保藏。
(2)平板培养:取-80℃冰箱冻存的藻液涂布于含有固体培养基的平板上,并置于25℃的培养箱中避光培养4天。
(3)种子培养:使用接种环从平板中挑取1环藻体至装有种子培养基的摇瓶中,置于25℃摇床培养箱中,设置转速为300 r/min,避光培养7天。
(4)发酵培养:
1)第一阶段:将步骤(3)的种子接种于装有发酵培养基的发酵罐中,控制细胞初始浓度为0.5 g/L,通气量控制在1.5 vvm,初始转速控制在200rpm,温度控制在30℃,pH控制在7.0;
2)第二阶段:当初始葡萄糖浓度耗尽时,开始流加浓度为750 g/L的葡萄糖溶液,控制培养液中葡萄糖浓度处于1-5 g/L之间;每当培养液中的葡萄糖消耗量达30 g/L时,补加其他营养成分的浓缩液以达各自的初始浓度;溶氧与转速关联控制在10%;
3)第三阶段:当藻体生物量浓度达180 g/L时,固定发酵罐最大转速,改为脉冲方式流加750 g/L的葡萄糖溶液,使得溶氧在10%-30%之间快速反复波动,以控制培养液中残糖浓度接近于零,从而诱导蛋白质和叶黄素合成。
在步骤(2)和(3)中,固体培养基为种子培养基基础上额外添加琼脂15 g/L;种子培养基为:葡萄糖10 g/L,硝酸钠1.75 g/L,氯化钠5 g/L,七水硫酸镁0.4 g/L,氯化钾0.6g/L,二水氯化钙0.15 g/L,三水磷酸氢二钾0.1 g/L,Tris 0.5 g/L,EDTA·2Na 75 mg/L,硼酸15mg/L,七水硫酸亚铁5 mg/L,四水氯化锰3.5 mg/L,七水硫酸锌0.825 mg/L,六水硝酸钴0.0175mg/L,五水硫酸铜0.005 mg/L。
在步骤(4)中,发酵培养基为:葡萄糖30 g/L,尿素1.854 g/L,七水硫酸镁1.2 g/L,二水氯化钙0.45 g/L,三水磷酸氢二钾0.3 g/L,EDTA·2Na 213 mg/L,硼酸45 mg/L,七水硫酸亚铁15 mg/L,四水氯化锰10.5 mg/L,七水硫酸锌2.475 mg/L,六水硝酸钴0.0525mg/L,五水硫酸铜0.015 mg/L。
在步骤(4)中,浓缩液分为3部分,浓缩液I为二水氯化钙11.25 g/L,浓缩液II为尿素247.33 g/L和七水硫酸镁160 g/L,浓缩液III为三水磷酸氢二钾40 g/L、EDTA·2Na 30g/L、硼酸6 g/L、七水硫酸亚铁2 g/L、四水氯化锰1.4 g/L、七水硫酸锌0.33 g/L、六水硝酸钴7 mg/L、五水硫酸铜2 mg/L。
在步骤(4)中,第三阶段的培养时间为1天。
检测方法同实施例1。发酵周期8天,藻体生物量可达200 g/L,蛋白质含量为40%,叶黄素含量为5 mg/g。
实施例3
(1)藻种及其保藏:所使用的藻种为Chlorella sorokinianaFZU60(保藏编号为CGMCC NO. 45230,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心),使用20%甘油无菌溶液将藻细胞转移至冻存管中,之后放置于-80℃冰箱保藏。
(2)平板培养:取-80℃冰箱冻存的藻液涂布于含有固体培养基的平板上,并置于35℃的培养箱中避光培养8天。
(3)种子培养:使用接种环从平板中挑取4环藻体至装有种子培养基的摇瓶中,置于35℃摇床培养箱中,设置转速为300 r/min,避光培养3天。
(4)发酵培养:
1)第一阶段:将步骤(3)的种子接种于装有发酵培养基的发酵罐中,控制细胞初始浓度为3.0 g/L,通气量控制在2.0 vvm,初始转速控制在200rpm,温度控制在35℃,pH控制在7.5;
2)第二阶段:当初始葡萄糖浓度耗尽时,开始流加浓度为750 g/L的葡萄糖溶液,控制培养液中葡萄糖浓度处于1-5 g/L之间;每当培养液中的葡萄糖消耗量达30 g/L时,补加其他营养成分的浓缩液以达各自的初始浓度;溶氧与转速关联控制在30%;
3)第三阶段:当藻体生物量浓度达160 g/L时,固定发酵罐最大转速,改为脉冲方式流加750 g/L的葡萄糖溶液,使得溶氧在10%-50%之间快速反复波动,以控制培养液中残糖浓度接近于零,从而诱导蛋白质和叶黄素合成。
在步骤(2)和(3)中,固体培养基为种子培养基基础上额外添加琼脂15 g/L;种子培养基为:葡萄糖10 g/L,硝酸钠1.75 g/L,氯化钠5 g/L,七水硫酸镁0.4 g/L,氯化钾0.6g/L,二水氯化钙0.15 g/L,三水磷酸氢二钾0.1 g/L,Tris 0.5 g/L,EDTA·2Na 75 mg/L,硼酸15mg/L,七水硫酸亚铁5 mg/L,四水氯化锰3.5 mg/L,七水硫酸锌0.825 mg/L,六水硝酸钴0.0175mg/L,五水硫酸铜0.005 mg/L。
在步骤(4)中,发酵培养基为:葡萄糖30 g/L,尿素1.854 g/L,七水硫酸镁1.2 g/L,二水氯化钙0.45 g/L,三水磷酸氢二钾0.3 g/L,EDTA·2Na 213 mg/L,硼酸45 mg/L,七水硫酸亚铁15 mg/L,四水氯化锰10.5 mg/L,七水硫酸锌2.475 mg/L,六水硝酸钴0.0525mg/L,五水硫酸铜0.015 mg/L。
在步骤(4)中,浓缩液分为3部分,浓缩液I为二水氯化钙11.25 g/L,浓缩液II为尿素247.33 g/L和七水硫酸镁160 g/L,浓缩液III为三水磷酸氢二钾40 g/L、EDTA·2Na 30g/L、硼酸6 g/L、七水硫酸亚铁2 g/L、四水氯化锰1.4 g/L、七水硫酸锌0.33 g/L、六水硝酸钴7 mg/L、五水硫酸铜2 mg/L。
在步骤(4)中,第三阶段的培养时间为1.5天。
检测方法同实施例1。发酵周期6天,藻体生物量可达180 g/L,蛋白质含量为45%,叶黄素含量为6.5 mg/g。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (2)
1.一种超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)藻种及其保藏:所使用的藻种为小球藻,使用20%甘油无菌溶液将藻细胞转移至冻存管中,之后放置于-80℃冰箱保藏;
(2)平板培养:取-80℃冰箱冻存的藻液涂布于含有固体培养基的平板上,并置于25-35℃的培养箱中避光培养4-8天;
(3)种子培养:使用接种环从平板中挑取1-4环藻体至装有种子培养基的摇瓶中,置于25-35℃摇床培养箱中,设置转速为50-300 r/min,避光培养3-7天;
(4)发酵培养:
1)第一阶段:将步骤(3)的种子接种于装有发酵培养基的发酵罐中,控制细胞初始浓度为0.5-3.0 g/L,通气量控制在0.5-2.0 vvm,初始转速控制在100~300 rpm,温度控制在25~35℃,pH控制在6.5~8.0;
2)第二阶段:当初始葡萄糖浓度耗尽时,开始流加浓度为750 g/L的葡萄糖溶液,控制培养液中葡萄糖浓度处于1-5 g/L之间;每当培养液中的葡萄糖消耗量达30 g/L时,补加其他营养成分的浓缩液以达各自的初始浓度;溶氧与转速关联控制在10-30%;
3)第三阶段:当藻体生物量浓度达160-200 g/L时,固定发酵罐最大转速,改为脉冲方式流加750 g/L的葡萄糖溶液,使得溶氧在10%-50%之间快速反复波动,以控制培养液中残糖浓度接近于零,从而诱导蛋白质和叶黄素合成;总发酵周期6-8天;
所述小球藻为Chlorella sorokiniana FZU60,保藏编号为CGMCC NO. 45230,已于2022年08月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;
步骤(2)和(3)中,固体培养基为种子培养基基础上额外添加琼脂15 g/L;种子培养基为:葡萄糖10 g/L,硝酸钠1.75 g/L,氯化钠5 g/L,七水硫酸镁0.4 g/L,氯化钾0.6 g/L,二水氯化钙0.15 g/L,三水磷酸氢二钾0.1 g/L,Tris 0.5 g/L,EDTA·2Na 75 mg/L,硼酸15mg/L,七水硫酸亚铁5 mg/L,四水氯化锰3.5 mg/L,七水硫酸锌0.825 mg/L,六水硝酸钴0.0175 mg/L,五水硫酸铜0.005 mg/L;
步骤(4)中,发酵培养基为:葡萄糖30 g/L,尿素1.855 g/L,七水硫酸镁1.2 g/L,二水氯化钙0.45 g/L,三水磷酸氢二钾0.3 g/L,EDTA·2Na 213 mg/L,硼酸45 mg/L,七水硫酸亚铁15 mg/L,四水氯化锰10.5 mg/L,七水硫酸锌2.475 mg/L,六水硝酸钴0.0525 mg/L,五水硫酸铜0.015 mg/L;
步骤(4)中,浓缩液分为3部分,浓缩液I为二水氯化钙11.25 g/L,浓缩液II为尿素247.33 g/L和七水硫酸镁160 g/L,浓缩液III为三水磷酸氢二钾40 g/L、EDTA·2Na 30 g/L、硼酸6 g/L、七水硫酸亚铁2 g/L、四水氯化锰1.4 g/L、七水硫酸锌0.33 g/L、六水硝酸钴7 mg/L、五水硫酸铜2 mg/L。
2.根据权利要求1所述的超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法,其特征在于:步骤(4)中,第三阶段的培养时间为1-2天。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211110076.0A CN116042761B (zh) | 2022-09-13 | 2022-09-13 | 一种超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211110076.0A CN116042761B (zh) | 2022-09-13 | 2022-09-13 | 一种超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116042761A CN116042761A (zh) | 2023-05-02 |
CN116042761B true CN116042761B (zh) | 2024-07-09 |
Family
ID=86120619
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211110076.0A Active CN116042761B (zh) | 2022-09-13 | 2022-09-13 | 一种超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116042761B (zh) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106399111A (zh) * | 2016-11-22 | 2017-02-15 | 福州大学 | 一种同步提高自养微藻的叶黄素和碳水化合物产量的方法 |
CN107075547A (zh) * | 2014-01-20 | 2017-08-18 | 罗盖特兄弟公司 | 用于微藻生物质的蛋白质富集的方法 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1837352A (zh) * | 2006-04-29 | 2006-09-27 | 清华大学 | 高密度培养异养小球藻的方法 |
ES2656337T3 (es) * | 2013-03-29 | 2018-02-26 | Roquette Frères | Procedimiento de enriquecimiento en proteínas de la biomasa de microalgas |
CN110195019A (zh) * | 2019-05-10 | 2019-09-03 | 中国科学院水生生物研究所 | 一种高产蛋白质小球藻的培养方法 |
CN110257458A (zh) * | 2019-06-27 | 2019-09-20 | 福州大学 | 交替培养模式同步提高微藻叶黄素和蛋白质产量的方法 |
CN111500464A (zh) * | 2020-05-21 | 2020-08-07 | 福州大学 | 一种先兼养-后自养微藻生产叶黄素的方法 |
US20220204917A1 (en) * | 2020-12-31 | 2022-06-30 | Sophie?s BioNutrients Pte. Ltd. | Production of functional protein using microalgae in mixotrophic and/or heterotrophic cultivation |
-
2022
- 2022-09-13 CN CN202211110076.0A patent/CN116042761B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107075547A (zh) * | 2014-01-20 | 2017-08-18 | 罗盖特兄弟公司 | 用于微藻生物质的蛋白质富集的方法 |
CN106399111A (zh) * | 2016-11-22 | 2017-02-15 | 福州大学 | 一种同步提高自养微藻的叶黄素和碳水化合物产量的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN116042761A (zh) | 2023-05-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Doucha et al. | Production of high-density Chlorella culture grown in fermenters | |
CN103114041A (zh) | 一种快速培养小球藻的方法 | |
CN109971663B (zh) | 一株耐热亚罗解脂酵母及其应用 | |
CN112608861B (zh) | 一种含有丁酸梭菌和乳酸片球菌的复合制剂及其制备方法和应用 | |
Xie et al. | Mixotrophic cultivation of Platymonas subcordiformis | |
CN111763636B (zh) | 一种工业发酵生产辅酶q10的方法 | |
CN111500464A (zh) | 一种先兼养-后自养微藻生产叶黄素的方法 | |
CN106434817B (zh) | 一种利用碱预处理技术提升雨生红球藻生产虾青素的方法 | |
WO2015085631A1 (zh) | 一种高产率的葡萄藻培养方法 | |
CN100447233C (zh) | 一种中温型虾青素产生菌及其培养方法 | |
CN100467584C (zh) | 水产养殖及景观水体用复合微生态制剂及其制备方法 | |
CN107058440B (zh) | 一种利用旋转生物膜反应器贴壁培养雨生红球藻生产虾青素的方法 | |
CN105483014A (zh) | 发酵法高密度培养小球藻生产工艺 | |
CN103509731A (zh) | 一种海水养殖用微生物制剂及其生产方法 | |
CN116042761B (zh) | 一种超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法 | |
CN110713956B (zh) | 一株赖氨酸芽孢杆菌s12及其应用 | |
CN1710060A (zh) | 三角褐指藻的一种开放式培养方法及其专用培养基 | |
CN103525881A (zh) | 用于20m3大罐发酵培养大肠埃希氏菌再转化富马酸生产L-天冬氨酸的方法 | |
CN116200286B (zh) | 一株高效糖化纤维素的热纤梭菌及其应用 | |
CN110305797B (zh) | 一株花青素产生菌株cj6及其应用 | |
CN114058514A (zh) | 一种利用海洋绿藻青岛大扁藻积累淀粉的方法 | |
CN103849575A (zh) | 一种单细胞蛋白的生产方法 | |
CN110468051B (zh) | 一种k252a发酵培养基及其制备方法 | |
CN108179112B (zh) | 蛋白核小球藻联合菌类产氢的方法 | |
CN104498542A (zh) | 连续法发酵生产l-乳酸的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |