CN116042761B - 一种超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法，将藻种培养成平板种子，再培养成摇瓶种子，最后进行发酵罐发酵，当初始葡萄糖浓度耗尽时，开始流加控制培养液中葡萄糖浓度于1‑5 g/L；当培养液中葡萄糖消耗量达30 g/L时，补加其他营养成分的浓缩液以达各自的初始浓度；当藻体生物量浓度达160‑200 g/L时，改脉冲方式流加葡萄糖溶液，使溶氧在10%‑50%之间快速反复波动，以控制培养液中残糖浓度接近于零，从而诱导蛋白质和叶黄素合成。本发明方法不仅实现微藻超高密度异养培养，还可让藻细胞同步积累高含量的蛋白质和叶黄素，发酵周期短，生产工艺简单，能够显著提高微藻联产蛋白质和叶黄素的工业化前景。
Description
技术领域
本发明属于发酵工艺领域，具体涉及一种超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法。
背景技术
叶黄素是一种含氧的类胡萝卜素，由于具有较强的着色、抗氧化和抗炎作用，被广泛应用于饲料、化妆品、食品、保健品和医药等行业。微藻被认为是商业叶黄素的新兴来源。近年来，研究人员对微藻基叶黄素的生产进行了大量研究，所用藻种大多为绿藻。其中，索罗金小球藻（Chlorella sorokiniana）由于生长速度快、能适应不同的营养模式和宽广的培养条件，在生产叶黄素等诸多方面展现出了巨大的商业应用潜力。
此外，微藻能够合成所有类型的氨基酸，且大多数微藻的蛋白质含量与传统蛋白源植物相当甚至更高，是理想的战略蛋白源。大量的营养和毒理学评价也表明，微藻适宜作为一种有价值的饲料添加剂或传统蛋白源（如豆粕、鱼粉）的替代品。然而，目前商业生产的微藻主要是通过光自养模式在开放跑道池中培养获得，由于这种培养方式存在生产效率低、生产成本高等问题，极大限制了微藻作为蛋白源的广泛应用。
异养培养作为一种更为经济、高效的工业化生产模式，是降低微藻生产成本、提升产能的潜在途径。但不同来源的索罗金小球藻在异养过程中存在明显的藻种特异性，表现出不同的生长和产物积累特性。通过异养***培养微藻，我们不仅要考量其所能达到的生物质产量，同时还要考量藻体蛋白质和叶黄素含量，因为这将决定异养微藻作为蛋白源及叶黄素源的最终应用价值和市场价值。
然而，在传统异养工艺下藻细胞密度、蛋白质及叶黄素含量普遍较低，且只限于蛋白质或叶黄素单一成分的生产研究。此外，为减少微藻生物质的开发利用成本，对微藻细胞进行多组分综合利用，以及耦合生产高附加值产品，已是微藻生物质开发的发展趋势。但截至目前，尚没有一种成熟的培养方法既可实现微藻超高密度异养培养，又可让藻细胞同步积累高含量的蛋白质和叶黄素。
发明内容
本发明的目的在于提出一种超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法，通过该方法实现微藻高效联产蛋白质和叶黄素。以解决在传统异养工艺下藻细胞密度、蛋白质及叶黄素含量普遍较低，且只限于蛋白质或叶黄素单一成分生产研究的问题，可为微藻叶黄素和蛋白质的高效耦合生产提供一种新方法。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法，包括以下步骤：
（1）藻种及其保藏：所使用的藻种为Chlorella sorokinianaFZU60，保藏编号为CGMCC NO. 45230，已于2022年08月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，使用20%甘油无菌溶液将藻细胞转移至冻存管中，之后放置于-80℃冰箱保藏。
（2）平板培养：取-80℃冰箱冻存的藻液涂布于含有固体培养基的平板上，并置于25-35℃的培养箱中避光培养4-8天。
（3）种子培养：使用接种环从平板中挑取1-4环藻体至装有种子培养基的摇瓶中，置于25-35℃摇床培养箱中，设置转速为50-300 r/min，避光培养3-7天。
（4）发酵培养：
1）第一阶段：将步骤（3）的种子接种于装有发酵培养基的发酵罐中，控制细胞初始浓度为0.5-3.0 g/L，通气量控制在0.5-2.0 vvm，初始转速控制在100~300 rpm，温度控制在25~35℃，pH控制在6.5~8.0；
2）第二阶段：当初始葡萄糖浓度耗尽时，开始流加浓度为750 g/L的葡萄糖溶液，控制培养液中葡萄糖浓度处于1-5 g/L之间；每当培养液中的葡萄糖消耗量达30 g/L时，补加其他营养成分的浓缩液以达各自的初始浓度；溶氧与转速关联控制在10-30%；
3）第三阶段：当藻体生物量浓度达160-200 g/L时，固定发酵罐最大转速，改为脉冲方式流加750 g/L的葡萄糖溶液，使得溶氧在10%-50%之间快速反复波动，以控制培养液中残糖浓度接近于零，从而诱导蛋白质和叶黄素合成。发酵周期6-8天，藻体生物量可达180-220 g/L，蛋白质含量为40-50%，叶黄素含量为5-7 mg/g。
在步骤（2）和（3）中，固体培养基为种子培养基基础上额外添加琼脂15 g/L；种子培养基为：葡萄糖10 g/L，硝酸钠1.75 g/L，氯化钠5 g/L，七水硫酸镁0.4 g/L，氯化钾0.6g/L，二水氯化钙0.15 g/L，三水磷酸氢二钾0.1 g/L，Tris 0.5 g/L，EDTA·2Na 75 mg/L，硼酸15mg/L，七水硫酸亚铁5 mg/L，四水氯化锰3.5 mg/L，七水硫酸锌0.825 mg/L，六水硝酸钴0.0175mg/L，五水硫酸铜0.005 mg/L。
在步骤（4）中，发酵培养基为：葡萄糖30 g/L，尿素1.854 g/L，七水硫酸镁1.2 g/L，二水氯化钙0.45 g/L，三水磷酸氢二钾0.3 g/L，EDTA·2Na 213 mg/L，硼酸45 mg/L，七水硫酸亚铁15 mg/L，四水氯化锰10.5 mg/L，七水硫酸锌2.475 mg/L，六水硝酸钴0.0525mg/L，五水硫酸铜0.015 mg/L。
在步骤（4）中，浓缩液分为3部分，浓缩液I为二水氯化钙11.25 g/L，浓缩液II为尿素247.33 g/L和七水硫酸镁160 g/L，浓缩液III为三水磷酸氢二钾40 g/L、EDTA·2Na 30g/L、硼酸6 g/L、七水硫酸亚铁2 g/L、四水氯化锰1.4 g/L、七水硫酸锌0.33 g/L、六水硝酸钴7 mg/L、五水硫酸铜2 mg/L。
在步骤（4）中，第三阶段的培养时间为1-2天。
本发明的显著优点在于：本发明所用微藻为高蛋白质且高叶黄素含量藻株，同时采用本发明所提出的异养发酵工艺，不仅可实现微藻超高密度异养培养，而且还可让藻细胞同步积累高含量的蛋白质和叶黄素，所达到的生产效率远高于国内外报道结果，能够显著提高利用微藻耦合生产叶黄素和营养蛋白的工业化前景。
附图说明
图1为实施例1中发酵罐中微藻生物量浓度和葡萄糖浓度的变化趋势图。
图2为实施例1中发酵罐中微藻叶黄素含量和蛋白质含量的变化趋势图。
图3为实施例1中发酵罐中溶氧浓度的变化趋势图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实验，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
（1）藻种及其保藏：所使用的藻种为Chlorella sorokinianaFZU60（保藏编号为CGMCCNO. 45230，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心），使用20%甘油无菌溶液将藻细胞转移至冻存管中，之后放置于-80℃冰箱保藏。
（2）平板培养：取-80℃冰箱冻存的藻液涂布于含有固体培养基的平板上，并置于30℃的培养箱中避光培养5天。
（3）种子培养：使用接种环从平板中挑取4环藻体至装有种子培养基的摇瓶中，置于30℃摇床培养箱中，设置转速为200 r/min，避光培养5天。
（4）发酵培养：
1）第一阶段：将步骤（3）的种子接种于装有发酵培养基的发酵罐中，控制细胞初始浓度为2 g/L，通气量控制在1 vvm，初始转速控制在200 rpm，温度控制在30℃，pH控制在7.5；
2）第二阶段：当初始葡萄糖浓度耗尽时，开始流加浓度为750 g/L的葡萄糖溶液，控制培养液中葡萄糖浓度处于1-5 g/L之间；每当培养液中的葡萄糖消耗量达30 g/L时，补加其他营养成分的浓缩液以达各自的初始浓度；溶氧与转速关联控制在20%；
3）第三阶段：当藻体生物量浓度达200 g/L时，固定发酵罐最大转速，改为脉冲方式流加750 g/L的葡萄糖溶液，使得溶氧在10%-50%之间快速反复波动，以控制培养液中残糖浓度接近于零，从而诱导蛋白质和叶黄素合成。
在步骤（2）和（3）中，固体培养基为种子培养基基础上额外为添加琼脂15 g/L；种子培养基为：葡萄糖10 g/L，硝酸钠1.75 g/L，氯化钠5 g/L，七水硫酸镁0.4 g/L，氯化钾0.6 g/L，二水氯化钙0.15 g/L，三水磷酸氢二钾0.1 g/L，Tris 0.5 g/L，EDTA·2Na 75mg/L，硼酸15 mg/L，七水硫酸亚铁5 mg/L，四水氯化锰3.5 mg/L，七水硫酸锌0.825 mg/L，六水硝酸钴0.0175mg/L，五水硫酸铜0.005 mg/L。
在步骤（4）中，发酵培养基为：葡萄糖30 g/L，尿素1.854 g/L，七水硫酸镁1.2 g/L，二水氯化钙0.45 g/L，三水磷酸氢二钾0.3 g/L，EDTA·2Na 213 mg/L，硼酸45 mg/L，七水硫酸亚铁15 mg/L，四水氯化锰10.5 mg/L，七水硫酸锌2.475 mg/L，六水硝酸钴0.0525mg/L，五水硫酸铜0.015 mg/L。
在步骤（4）中，浓缩液分为3部分，浓缩液I为二水氯化钙11.25 g/L，浓缩液II为尿素247.33 g/L和七水硫酸镁160 g/L，浓缩液III为三水磷酸氢二钾40 g/L、EDTA·2Na 30g/L、硼酸6 g/L、七水硫酸亚铁2 g/L、四水氯化锰1.4 g/L、七水硫酸锌0.33 g/L、六水硝酸钴7 mg/L、五水硫酸铜2 mg/L。
在步骤（4）中，第三阶段的培养时间为2天。
在整个发酵培养过程中，每隔一定时间取样测定生物量浓度、葡萄糖浓度、叶黄素含量和蛋白质含量。生物量浓度采用细胞干重法测定，葡萄糖浓度采用DNS比色法测定，叶黄素含量和类胡萝卜素组成通过高效液相色谱法测定，蛋白质含量通过蛋白质提取及分析试剂盒测定。由图1-3可知，发酵周期7天，藻体生物量可达220 g/L，蛋白质含量为50%，叶黄素含量为7 mg/g。
实施例2
（1）藻种及其保藏：所使用的藻种为Chlorella sorokinianaFZU60（保藏编号为CGMCC NO. 45230，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心），使用20%甘油无菌溶液将藻细胞转移至冻存管中，之后放置于-80℃冰箱保藏。
（2）平板培养：取-80℃冰箱冻存的藻液涂布于含有固体培养基的平板上，并置于25℃的培养箱中避光培养4天。
（3）种子培养：使用接种环从平板中挑取1环藻体至装有种子培养基的摇瓶中，置于25℃摇床培养箱中，设置转速为300 r/min，避光培养7天。
（4）发酵培养：
1）第一阶段：将步骤（3）的种子接种于装有发酵培养基的发酵罐中，控制细胞初始浓度为0.5 g/L，通气量控制在1.5 vvm，初始转速控制在200rpm，温度控制在30℃，pH控制在7.0；
2）第二阶段：当初始葡萄糖浓度耗尽时，开始流加浓度为750 g/L的葡萄糖溶液，控制培养液中葡萄糖浓度处于1-5 g/L之间；每当培养液中的葡萄糖消耗量达30 g/L时，补加其他营养成分的浓缩液以达各自的初始浓度；溶氧与转速关联控制在10%；
3）第三阶段：当藻体生物量浓度达180 g/L时，固定发酵罐最大转速，改为脉冲方式流加750 g/L的葡萄糖溶液，使得溶氧在10%-30%之间快速反复波动，以控制培养液中残糖浓度接近于零，从而诱导蛋白质和叶黄素合成。
在步骤（2）和（3）中，固体培养基为种子培养基基础上额外添加琼脂15 g/L；种子培养基为：葡萄糖10 g/L，硝酸钠1.75 g/L，氯化钠5 g/L，七水硫酸镁0.4 g/L，氯化钾0.6g/L，二水氯化钙0.15 g/L，三水磷酸氢二钾0.1 g/L，Tris 0.5 g/L，EDTA·2Na 75 mg/L，硼酸15mg/L，七水硫酸亚铁5 mg/L，四水氯化锰3.5 mg/L，七水硫酸锌0.825 mg/L，六水硝酸钴0.0175mg/L，五水硫酸铜0.005 mg/L。
在步骤（4）中，发酵培养基为：葡萄糖30 g/L，尿素1.854 g/L，七水硫酸镁1.2 g/L，二水氯化钙0.45 g/L，三水磷酸氢二钾0.3 g/L，EDTA·2Na 213 mg/L，硼酸45 mg/L，七水硫酸亚铁15 mg/L，四水氯化锰10.5 mg/L，七水硫酸锌2.475 mg/L，六水硝酸钴0.0525mg/L，五水硫酸铜0.015 mg/L。
在步骤（4）中，浓缩液分为3部分，浓缩液I为二水氯化钙11.25 g/L，浓缩液II为尿素247.33 g/L和七水硫酸镁160 g/L，浓缩液III为三水磷酸氢二钾40 g/L、EDTA·2Na 30g/L、硼酸6 g/L、七水硫酸亚铁2 g/L、四水氯化锰1.4 g/L、七水硫酸锌0.33 g/L、六水硝酸钴7 mg/L、五水硫酸铜2 mg/L。
在步骤（4）中，第三阶段的培养时间为1天。
检测方法同实施例1。发酵周期8天，藻体生物量可达200 g/L，蛋白质含量为40%，叶黄素含量为5 mg/g。
实施例3
（1）藻种及其保藏：所使用的藻种为Chlorella sorokinianaFZU60（保藏编号为CGMCC NO. 45230，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心），使用20%甘油无菌溶液将藻细胞转移至冻存管中，之后放置于-80℃冰箱保藏。
（2）平板培养：取-80℃冰箱冻存的藻液涂布于含有固体培养基的平板上，并置于35℃的培养箱中避光培养8天。
（3）种子培养：使用接种环从平板中挑取4环藻体至装有种子培养基的摇瓶中，置于35℃摇床培养箱中，设置转速为300 r/min，避光培养3天。
（4）发酵培养：
1）第一阶段：将步骤（3）的种子接种于装有发酵培养基的发酵罐中，控制细胞初始浓度为3.0 g/L，通气量控制在2.0 vvm，初始转速控制在200rpm，温度控制在35℃，pH控制在7.5；
2）第二阶段：当初始葡萄糖浓度耗尽时，开始流加浓度为750 g/L的葡萄糖溶液，控制培养液中葡萄糖浓度处于1-5 g/L之间；每当培养液中的葡萄糖消耗量达30 g/L时，补加其他营养成分的浓缩液以达各自的初始浓度；溶氧与转速关联控制在30%；
3）第三阶段：当藻体生物量浓度达160 g/L时，固定发酵罐最大转速，改为脉冲方式流加750 g/L的葡萄糖溶液，使得溶氧在10%-50%之间快速反复波动，以控制培养液中残糖浓度接近于零，从而诱导蛋白质和叶黄素合成。
在步骤（2）和（3）中，固体培养基为种子培养基基础上额外添加琼脂15 g/L；种子培养基为：葡萄糖10 g/L，硝酸钠1.75 g/L，氯化钠5 g/L，七水硫酸镁0.4 g/L，氯化钾0.6g/L，二水氯化钙0.15 g/L，三水磷酸氢二钾0.1 g/L，Tris 0.5 g/L，EDTA·2Na 75 mg/L，硼酸15mg/L，七水硫酸亚铁5 mg/L，四水氯化锰3.5 mg/L，七水硫酸锌0.825 mg/L，六水硝酸钴0.0175mg/L，五水硫酸铜0.005 mg/L。
在步骤（4）中，发酵培养基为：葡萄糖30 g/L，尿素1.854 g/L，七水硫酸镁1.2 g/L，二水氯化钙0.45 g/L，三水磷酸氢二钾0.3 g/L，EDTA·2Na 213 mg/L，硼酸45 mg/L，七水硫酸亚铁15 mg/L，四水氯化锰10.5 mg/L，七水硫酸锌2.475 mg/L，六水硝酸钴0.0525mg/L，五水硫酸铜0.015 mg/L。
在步骤（4）中，浓缩液分为3部分，浓缩液I为二水氯化钙11.25 g/L，浓缩液II为尿素247.33 g/L和七水硫酸镁160 g/L，浓缩液III为三水磷酸氢二钾40 g/L、EDTA·2Na 30g/L、硼酸6 g/L、七水硫酸亚铁2 g/L、四水氯化锰1.4 g/L、七水硫酸锌0.33 g/L、六水硝酸钴7 mg/L、五水硫酸铜2 mg/L。
在步骤（4）中，第三阶段的培养时间为1.5天。
检测方法同实施例1。发酵周期6天，藻体生物量可达180 g/L，蛋白质含量为45%，叶黄素含量为6.5 mg/g。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (2)
1.一种超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）藻种及其保藏：所使用的藻种为小球藻，使用20%甘油无菌溶液将藻细胞转移至冻存管中，之后放置于-80℃冰箱保藏；
（2）平板培养：取-80℃冰箱冻存的藻液涂布于含有固体培养基的平板上，并置于25-35℃的培养箱中避光培养4-8天；
（3）种子培养：使用接种环从平板中挑取1-4环藻体至装有种子培养基的摇瓶中，置于25-35℃摇床培养箱中，设置转速为50-300 r/min，避光培养3-7天；
（4）发酵培养：
1）第一阶段：将步骤（3）的种子接种于装有发酵培养基的发酵罐中，控制细胞初始浓度为0.5-3.0 g/L，通气量控制在0.5-2.0 vvm，初始转速控制在100~300 rpm，温度控制在25~35℃，pH控制在6.5~8.0；
2）第二阶段：当初始葡萄糖浓度耗尽时，开始流加浓度为750 g/L的葡萄糖溶液，控制培养液中葡萄糖浓度处于1-5 g/L之间；每当培养液中的葡萄糖消耗量达30 g/L时，补加其他营养成分的浓缩液以达各自的初始浓度；溶氧与转速关联控制在10-30%；
3）第三阶段：当藻体生物量浓度达160-200 g/L时，固定发酵罐最大转速，改为脉冲方式流加750 g/L的葡萄糖溶液，使得溶氧在10%-50%之间快速反复波动，以控制培养液中残糖浓度接近于零，从而诱导蛋白质和叶黄素合成；总发酵周期6-8天；
所述小球藻为Chlorella sorokiniana FZU60，保藏编号为CGMCC NO. 45230，已于2022年08月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
步骤（2）和（3）中，固体培养基为种子培养基基础上额外添加琼脂15 g/L；种子培养基为：葡萄糖10 g/L，硝酸钠1.75 g/L，氯化钠5 g/L，七水硫酸镁0.4 g/L，氯化钾0.6 g/L，二水氯化钙0.15 g/L，三水磷酸氢二钾0.1 g/L，Tris 0.5 g/L，EDTA·2Na 75 mg/L，硼酸15mg/L，七水硫酸亚铁5 mg/L，四水氯化锰3.5 mg/L，七水硫酸锌0.825 mg/L，六水硝酸钴0.0175 mg/L，五水硫酸铜0.005 mg/L；
步骤（4）中，发酵培养基为：葡萄糖30 g/L，尿素1.855 g/L，七水硫酸镁1.2 g/L，二水氯化钙0.45 g/L，三水磷酸氢二钾0.3 g/L，EDTA·2Na 213 mg/L，硼酸45 mg/L，七水硫酸亚铁15 mg/L，四水氯化锰10.5 mg/L，七水硫酸锌2.475 mg/L，六水硝酸钴0.0525 mg/L，五水硫酸铜0.015 mg/L；
步骤（4）中，浓缩液分为3部分，浓缩液I为二水氯化钙11.25 g/L，浓缩液II为尿素247.33 g/L和七水硫酸镁160 g/L，浓缩液III为三水磷酸氢二钾40 g/L、EDTA·2Na 30 g/L、硼酸6 g/L、七水硫酸亚铁2 g/L、四水氯化锰1.4 g/L、七水硫酸锌0.33 g/L、六水硝酸钴7 mg/L、五水硫酸铜2 mg/L。
2.根据权利要求1所述的超高密度异养微藻联产蛋白质和叶黄素的方法，其特征在于：步骤（4）中，第三阶段的培养时间为1-2天。
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