CN103525881A - 用于20m3大罐发酵培养大肠埃希氏菌再转化富马酸生产L-天冬氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于20m3大罐发酵培养大肠埃希氏菌再转化富马酸生产L-天冬氨酸的方法，是在罐体直径D=2200mm、罐筒体部分高H0=5280mm的大型发酵罐中装液体培养基90%（v/v），接入大肠埃希氏菌种子液，接种量0.12‰（v/v），在通风量280m3/h、转速100rpm、罐压0.05MPa的条件下培养13h，制得活菌数量1.89×108cfu/ml、L-天冬氨酸酶活力4725U/ml的发酵液，再用发酵液转化富马酸生产得到L-天冬氨酸。本发明关键性在于：大肠埃希氏菌HY-05C的20m3大罐发酵，接种量低，只需直接接种2.1L摇瓶种子液，发酵培养13h，可获得具有高L-天冬氨酸酶活力的发酵液。省去了种子罐的逐级放大培养，避免了种子放大培养过程中的染菌风险，同时缩短了发酵周期，提高了生产效率。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其是涉及一种产业应用大罐发酵生产L-天冬氨酸的方法。
背景技术
L-天冬氨酸是一种重要的氨基酸，是生产阿斯巴甜、聚天冬氨酸、L-丙氨酸的主要原料。而这些产品的市场需求也在逐年加大。
阿斯巴甜是一种新型的甜味剂，甜度约为蔗糖的200倍，适用于心血管病和肥胖症人群消费。全球每年需用阿斯巴甜约60000吨，需求量巨大，为L-天冬氨酸提供了极大的市场空间。聚天冬氨酸是一种绿色环保高分子材料，其无毒、易生物降解，拥有良好的亲水性和水溶性，作为优质的缓蚀剂、螯合剂和分散剂，广泛应用于水处理、肥料、洗涤、石油开采、金属削割和化妆品等领域。聚天冬氨酸在各个领域的需求每年呈番翻的增长趋势。L-丙氨酸是一种食品添加剂，也是生产维生素B6和氨基丙醇的重要原料。
L-天冬氨酸产品具有巨大的市场空间，全球年需求量约30万吨。目前中国在该产品生产领域占有绝对优势，如何进一步提升生产水平将有助于推动我国L-天冬氨酸及其相关产业的快速稳定发展。
大肠埃希氏菌在L-天冬氨酸生物转化法生产中具有一定应用基础。同时，大肠埃希氏菌是原核的模式菌株，遗传背景清晰，研究非常详尽。大肠埃希氏菌和它的工程菌被广泛用于生产各类化合物。大肠埃希氏菌应用于L-天门冬氨酸具有以下优势：（1）大肠埃希氏菌的代谢途径清晰，遗传改造方法多样，可以方便的进行代谢工程改造；（2）已有较多的大肠埃希氏菌或其工程菌生产各类产品的研究，为大肠埃希氏菌生产其他产品提供了经验；（3）大肠埃希氏菌高密度或大体系的发酵也有较多研究，其相应的工艺参数及设备流程为L-天门冬氨酸的生产提供了依据。
20世纪60年代，日本田边制药公司利用反丁烯二酸发酵技术率先实现了L-天冬氨酸的工业化生产。随着固定化技术的发展，1973年田边制药公司研发出固定化大肠埃希氏菌细胞法连续生产L-天冬氨酸。1985年，日本三菱石油化学公司利用黄色短杆菌（Brevibacteriumflavum）游离细胞将富马酸转化为L-天冬氨酸，黄色短杆菌离心后可重复使用，降低了生产成本。
20世纪80年代初，我国开始研制开发L-天冬氨酸产品，80年代中期采用固定化细胞法进行了生产中试，随后进行了工业化生产。但是由于固定化细胞法工艺设备投入多，技术要求高，使产品的生产成本相对较高。随着市场竞争的日趋激烈，2000年南京化工大学王雪根等研制出游离整体细胞法，用于工业化生产L-天冬氨酸。目前游离细胞法是生产L-天冬氨酸的主要方法。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种适合于产业应用，大罐发酵生产L-天冬氨酸的方法。
以往的L-天冬氨酸发酵技术研究，都局限在实验室规模和小体积发酵罐规模上，虽然取得了一定的进展，但是一旦应用于真正产业化生产，大规模发酵罐生产，相应的发酵条件均不能取得较好的效果。本发明在此基础上，研究一种对高产L-天冬氨酸酶菌株大肠埃希氏菌HY-05C，在2m3罐成熟发酵工艺的基础上，放大10倍，通过模拟计算及工艺条件优化，确定20m3罐主要尺寸参数及发酵的最佳工艺参数，用于20m3大罐发酵培养大肠埃希氏菌HY-05C，发酵液再转化富马酸生产L-天冬氨酸。
用于20m3大罐发酵培养大肠埃希氏菌再转化富马酸生产L-天冬氨酸的方法，是在罐体直径D=2200mm、罐筒体部分高H0=5280mm的大型发酵罐中装液体培养基90%（v/v），接入大肠埃希氏菌种子液，接种量0.12‰（v/v），在通风量280m3/h、转速100rpm、罐压0.05MPa的条件下培养13h，制得活菌数量1.89×108cfu/ml、L-天冬氨酸酶活力4725U/ml的发酵液，再用发酵液转化富马酸生产得到L-天冬氨酸。
其中所述液体培养基(g/L)：玉米浆干粉13，硫酸镁0.2，磷酸二氢钾1，氯化钠1.45，富马酸5；葡萄糖5，用氨水调pH至6.5-7.0。
其中所述大肠埃希氏菌种子液的制备方法为：3L的摇瓶，分装700mL种子液培养基，灭菌后，取斜面种子一环进行接种；90rpm，37℃±1℃培养12小时；其中种子液培养基(g/L)：富马酸5；葡萄糖5；氨水15ml：氯化纳5；磷酸二氢钾1；硫酸镁0.2；蛋白胨6.5；玉米浆干粉6.5。
其中所述富马酸为16%的富马酸溶液。
L-天冬氨酸转化菌HY-05C为大肠杆菌，又名大肠埃希氏菌，是烟台恒源生物股份有限公司前期选育的L-天冬氨酸游离细胞转化法生产菌（记载在申请号为CN201110382584.X，申请日为：2011年11月25日，发明名称为：“高产L-天冬氨酸酶的大肠埃希氏菌及其应用”的中国发明专利申请中，保藏编号为CGMCC No.5450）。
该菌株具有高L-天冬氨酸酶活力，转化富马酸生产L-天冬氨酸性能良好，为本项目技术研究奠定了良好基础。大肠埃希氏菌HY-05C营养琼脂平板上37℃培养24小种后，菌落淡黄色，圆形，半透明，表面湿润，呈液滴状，凸起。细胞为细短杆状，大小为(0.56×1.22～2.12)μm，革兰氏染色阴性，无芽孢。
本发明应用培养的大肠埃希氏菌HY-05C发酵液用于L-天冬氨酸生产，平均月产L-天门冬氨酸1504吨，收率为106.05%。产品质量符合国家行业标准QB1118-91L-天门冬氨酸要求。
本发明对高产L-天冬氨酸酶菌株大肠埃希氏菌HY-05C进行20m3大罐发酵研究，解决了大罐发酵工艺中的关键技术。关键性在于：大肠埃希氏菌HY-05C的20m3大罐发酵，接种量低，只需直接接种2.1L摇瓶种子液，发酵培养13h，可获得具有高L-天冬氨酸酶活力的发酵液。省去了种子罐的逐级放大培养，避免了种子放大培养过程中的染菌风险，同时缩短了发酵周期，提高了生产效率。发酵培养13h，发酵液活菌数达1.89×108cfu/ml，L-天冬氨酸酶活力达4725U/ml。通过大罐发酵获得的培养液用于L-天冬氨酸生产取得了显著效果，生产效率显著高于同类水平。大肠埃希氏菌HY-05C的20m3大罐发酵技术，可以显著提高生产效率，在L-天冬氨酸转化法生产中具有广阔应用前景。
附图说明
图1通风量对发酵的影响；
图2不同接种量对发酵的影响；
图3接种量对酶活的影响；
图420m3罐发酵菌种生长曲线；
图520m3罐6批次发酵菌体生长曲线；
图620m3罐6批次发酵液酶活。
具体实施方式
为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明：
1、菌种：
大肠埃希氏菌（Escherichia coli），编号为：HY-05C，企业自有（记载在申请号为CN201110382584.X，申请日为：2011年11月25日，发明名称为：“高产L-天冬氨酸酶的大肠埃希氏菌及其应用”的中国发明专利申请中，保藏编号为CGMCC No.5450）。
2、溶液与培养基：
溶液
(1)16%富马酸溶液：富马酸40g，溶于200ml纯水，用氨水调pH7.5，用纯水定容至250ml。
(2)2%硫酸镁溶液：称取2g硫酸镁(分析纯)，用蒸馏水溶解后定容至100ml。
(3)1:10稀硫酸：取98%浓硫酸1份，溶解于10份蒸馏水中。
培养基
(1)保藏斜面培养基(g/L)：氯化纳5；磷酸二氢钾5；2%(W/V)硫酸镁溶液10ml；蛋白胨7；牛肉膏10；琼脂22。
(2)生产斜面培养基(g/L)：富马酸10；氨水10ml：氯化纳5；磷酸二氢钾1；2%(W/V)硫酸镁溶液10ml；蛋白胨7；牛肉膏10；琼脂20。
(3)种子液培养基(g/L)：富马酸5；葡萄糖5；氨水15ml：氯化纳5；磷酸二氢钾1；硫酸镁0.2；蛋白胨6.5；玉米浆干粉6.5。
(4)发酵培养基(g/L)：玉米浆干粉13，硫酸镁0.2，磷酸二氢钾1，氯化钠1.45，富马酸5；葡萄糖5，用氨水调pH至6.5-7.0。
3、种子培养：
3L的摇瓶，分装700mL种子液培养基，灭菌后，取生产斜面种子一环进行接种。90rpm，37℃±1℃培养12小时。
4、L-天冬氨酸酶活力测定：
酶活定义：在45℃，pH值7.5条件下，每小时转化1微摩尔富马酸底物的酶量为一个酶活力单位U。
将16%的富马酸溶液250ml装入三角瓶中，加入发酵液20ml，再加入2ml2%硫酸镁溶液，摇匀。将三角瓶放入45℃的水浴锅中，进行转化，并在0h、1h分别取样检测。
取1:10的H2SO4溶液35ml放入250ml三角瓶中，再吸入0.2ml转化液加入其中，加热至75-80℃，用0.02M KMnO4溶液滴定至微红，半分钟内不褪色，即为终点。读取消耗的KMnO4体积毫升数，0h样品消耗体积记为V空，反应1h终点消耗体积记为V样，按以下公式计算生物转化酶活力：
富马酸与KMnO4化学反应：
C4H4O4+2KMnO4+3H2SO4→HCOOH+3CO2+K2SO4+2MnSO4+4H2O
1ml0.02mol/L KMnO4～1.16mg富马酸
5C4H4O4+4KMnO4+6H2SO4→5C4H4O6(酒石酸)+2K2SO4+4MnSO4+6H2O
1ml0.02mol/L KmnO4～2.9mg富马酸
取(1.16+2.9)/2≈2mg富马酸
注：116—富马酸的分子量；
2—每消耗1ml0.02M高锰酸钾相当于2mg富马酸；
272—反应总体积272ml；
20—加入20ml发酵液；
1—反应时间1小时；
0.2—取0.2ml反应液进行测定。
5、20m3罐发酵工艺优化及结论：
(1)通气量对发酵产酶影响
通气量主要影响发酵液溶氧水平，溶氧高低对菌种生长和酶活力具有重要影响。目前发酵罐的放大还是处于经验或半经验的情况下进行。本研究以2m3发酵罐的操作数据为基础，以几何相似为前提，并以氧的体积传递系数为指标，确定了20m3罐的搅拌转速及通气量，搅拌转速为100rpm，通气量为180m3/h。在进行放大培养试验时，通风量为180m3/h，菌体生长缓慢。因此，固定搅拌转速100rpm，对通气量进行了优化，分别研究了通气量为180、230、280、300、320m3/h时，对菌体生长及产酶的影响。
在转速100rpm时，随着通气量的增加（180-280m3/h），发酵培养基的溶氧得到改善，菌体生长随之好转，酶活力也随之增加，但当通气量大于280m3/h后，菌体的生长维持在较为稳定的水平，酶活的提高也不明显，最终确定最佳的通气量为280m3/h。
表1通风量对发酵及酶活力影响
| 通气量（m3/h） | 180 | 230 | 280 | 300 | 320 |
| 发酵时间(h) | 20 | 18 | 14 | 14 | 14 |
| OD值 | 0.851 | 0.959 | 1.031 | 1.012 | 1.021 |
| 酶活（U/ml） | 2061 | 3557 | 4769 | 4737 | 4680 |
(2)接种量对发酵产酶影响
接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌体繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响酶的表达合成，而且接种量大会也不经济；接种量过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。在20m3罐中考察了接种量的菌体生产及产酶的影响。
图2中的结果表明，接种量主要影响菌种生长，进而影响酶的表达。接种量0.02‰和0.06‰过低，不利于菌体生长和酶活的表达，随着接种量增大，菌体生长和酶活并没有明显的随之增高，而是维持在一个相对稳定的水平，试验最终确定最佳的接种量为0.12‰。
（3）消泡剂对发酵产酶的影响
微生物大罐通风搅拌发酵中，泡沫是影响生产的重要因素，泡沫量大溶氧造成发酵液外溢，污染杂菌风险大。因此发酵生产中常添加消泡剂抑制泡沫产生。在2m3罐时每罐消泡剂加量在150ml，20m3罐时对消泡剂加量进行了适当减少。在表2中的结果表明，当消泡剂加量大于等于1350ml每罐时，可以有效地消除发酵过程中可能产生的泡沫。在1200ml每罐时有轻微起泡。
表2发酵消泡剂加量
| 消泡剂加量（ml/罐） | 1200 | 1350 | 1400 | 1450 | 1500 |
| OD值 | 1.029 | 1.02 | 1.019 | 0.976 | 0.957 |
| 酶活（U/ml） | 4645 | 4759 | 4742 | 4717 | 4811 |
| 泡沫程度 | + | - | - | - | - |
+/-：+有一定起泡，-表示没有起泡；
（4）最佳工艺条件下菌种生长曲线
确定了最佳发酵工艺条件后确定了，测定了20m3罐发酵菌种生长曲线。菌种生长和产酶曲线如图4，结果显示培养11h后pH达到8.0以上，OD值和酶活力在13h后基本不变，13h酶活力达4686U/ml。因此20m3罐发酵培养时间确定为13h，与2m3罐发酵一致。在实际生产中可以根据OD值和pH变化判断发酵终点。
（5）多批次发酵验证试验
20m3罐的发酵稳定试验共进行了6个批次的发酵，测定了13h发酵液的OD值，pH，活菌数和酶活力。
连续6批次20m3发酵罐放大试验，装液量为18000L，接种量为2.1L（0.12‰），培养温度为37℃，罐压为0.05Mpa，通风量为280m3/h，转速100rpm，发酵罐的发酵时间、活菌数量、pH值、酶活等参数详细数据见表3。
从表3和图5，6可以看出，连续发酵6罐的发酵周期均为13h。菌体的OD值均达到1.0，且在整个发酵期间菌种生长呈增长趋势。菌体生长的同时伴随L-天冬氨酸酶合成，pH值缓慢上升，在发酵终点均在8.0左右。发酵液L-天冬氨酸酶活力平均值为4725U/ml，活菌数1.89×108cfu/ml，略高于原始2m3发酵罐发酵水平。20m3罐的6批次发酵试验稳定，发酵液用于转化富马酸生产L-天冬氨酸效果良好。
表320m3罐连续发酵6批次参数
| 批次 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| pH值 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 |
| 发酵时间(h) | 13 | 13 | 13 | 13 | 13 | 13 |
| 活菌数量(cfu/ml) | 1.91×108 | 1.92×108 | 1.89×108 | 1.87×108 | 1.90×108 | 1.87×108 |
| 酶活 | 4737 | 4797 | 4752 | 4708 | 4667 | 4691 |
大罐发酵技术应用于L-天冬氨酸生产，已经连续稳定生产7个月，L-天冬氨酸生产数据见下表。
表4连续7个月L-天冬氨酸生产数据（2012.10-2013.4）
| 月份 | 富马酸投料(吨) | 生产L-天冬氨酸(吨) | 收得率(%) |
| 2012年10月 | 1363.470 | 1357.365 | 107.43 |
| 2012年11月 | 1307.585 | 1407.253 | 107.62 |
| 2012年12月 | 1369.932 | 1460.210 | 106.59 |
| 2013年1月 | 1408.475 | 1480.410 | 105.11 |
| 2013年2月 | 1373.365 | 1443.408 | 105.10 |
| 2013年3月 | 1577.710 | 1656.282 | 104.98 |
| 2013年4月 | 1636.210 | 1721.293 | 105.53 |
| 总计 | 10036.75 | 10526.22 | / |
注：收得率为L-天冬氨/富马酸
2012年10月到2013年4月，大肠埃希氏菌HY-05C的20m3大罐发酵技术应用于L-天冬氨酸生产，7个月共投料富马酸10036.75吨，得L-天冬氨酸10526.22吨，最低收率为104.98%，最高收率为107.62%，平均收率为106.05%。大罐发酵技术应用于L-天冬氨酸生产，实现了月产1504吨的生产规模。L-天冬氨酸产品符合国家行业标准QB1118-91L-天门冬氨酸要求。
本发明针对高产L-天冬氨酸酶菌株大肠埃希氏菌HY-05C，在2m3罐成熟发酵工艺的基础上，放大10倍，通过模拟计算及工艺条件优化，确定了20m3罐主要尺寸参数及发酵的最佳工艺参数，用于20m3大罐发酵培养大肠埃希氏菌HY-05C。20m3大罐发酵培养大肠埃希氏菌HY-05C，发酵液活菌数达1.89×108cfu/ml，L-天冬氨酸酶活力达4725U/ml。发酵液用于转化富马酸生产L-天冬氨酸取得良好效果。20m3发酵罐规模，大肠埃希氏菌HY-05C省去种子罐逐级放大培养，低接种量水平，直接接种摇瓶种子液，发酵培养13h，可获得具有高L-天冬氨酸酶活力的发酵液，酶活力达4725U/ml。省去种子罐的逐级放大培养，可避免种子放大培养过程中的染菌风险，同时可缩短发酵周期，提高生产效率。该技术应用于L-天冬氨酸生产，已连续稳定运行7个月，累计生产L-天门冬氨酸10526.22吨，平均月产L-天门冬氨酸1504吨，收率为106.05%。产品符合国家行业标准QB1118-91L-天门冬氨酸要求。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (4)
1.用于20m3大罐发酵培养大肠埃希氏菌再转化富马酸生产L-天冬氨酸的方法，其特征在于：在罐体直径D=2200mm、罐筒体部分高H0=5280mm的大型发酵罐中装液体培养基90%（v/v），接入大肠埃希氏菌种子液，接种量0.12‰（v/v），在通风量280m3/h、转速100rpm、罐压0.05MPa的条件下培养13h，制得活菌数量1.89×108cfu/ml、L-天冬氨酸酶活力4725U/ml的发酵液，再用发酵液转化富马酸生产得到L-天冬氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述液体培养基(g/L)：玉米浆干粉13，硫酸镁0.2，磷酸二氢钾1，氯化钠1.45，富马酸5；葡萄糖5，用氨水调pH至6.5-7.0。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述大肠埃希氏菌种子液的制备方法为：3L的摇瓶，分装700mL种子液培养基，灭菌后，取斜面种子一环进行接种；90rpm，37℃±1℃培养12小时；其中种子液培养基(g/L)：富马酸5；葡萄糖5；氨水15ml：氯化纳5；磷酸二氢钾1；硫酸镁0.2；蛋白胨6.5；玉米浆干粉6.5。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述富马酸为16%的富马酸溶液。
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Denomination of invention: Method for production of L-aspartic acid by fermentation of Escherichia coli in 20 m3large tank Effective date of registration: 20221228 Granted publication date: 20150722 Pledgee: Yantai Longkou sub branch of Rizhao Bank Co.,Ltd. Pledgor: YANTAI HENGYUAN BIOENGINEERING Co.,Ltd. Registration number: Y2022980028953 |