CN116036298B - 牛奶外泌体在制备药物载体中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物制剂领域,特别涉及牛奶外泌体在制备药物载体中的应用。本发明采用牛奶外泌体作为药物载体,该外泌体来源于牛奶,安全可靠,又具有牛奶外泌体的功能性质,将其作为药物载体,可实现蛋白质药物的口服给药。通过利用牛奶外泌体装载利拉鲁肽,实现利拉鲁肽的口服给药,治疗二型糖尿病。
Description
技术领域
本发明涉及药物制剂领域,特别涉及牛奶外泌体在制备药物载体中的应 用。
背景技术
外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm),现今,其 特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年,外泌体首次于绵羊网织红细胞中 被发现,1987年Johnstone将其命名为"exosome"。多种细胞在正常及病理状 态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体, 经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。
目前现有的外泌体纯化技术主要有以下几种方法
1、超速离心法(差速离心)
超离法是最常用的外泌体纯化手段,是外泌体提取的金标准,但规模较 小,过程比较费时,且回收率不稳定(可能与转子类型有关),纯度也受到 质疑;此外,重复离心操作还有可能对囊泡造成损害,从而降低其质量。
2、密度梯度离心
在超速离心力作用下,使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层, 是一种区带分离法。密度梯度离心存在的问题是步骤繁琐,耗时。
3、超滤离心
超滤离心法提取外泌体可能会阻塞过滤孔,导致膜的寿命减短,分离效 率较低。
4、磁珠免疫法
磁珠法提取外泌体效率低,外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响,不 利于下游实验,难以广泛普及。
5、PEG-base沉淀法
聚乙二醇(PEG)沉淀外泌体存在不少问题:比如纯度和回收率低,杂 蛋白较多(假阳性),颗粒大小不均一,产生难以去除的聚合物,机械力或者吐温-20等化学添加物将会破坏外泌体等。
6、试剂盒提取
商业化的外泌体提取试剂盒,提取外泌体规模小,并且会产生很多杂蛋 白,外泌体纯度和回收率低。
因此本发明拟解决不依赖于离心,高效大规模提取牛奶外泌体的方法。
更重要的是,外泌体的载药是难点,本发明实现并提高了外泌体对蛋白 药的载药。
目前蛋白药常用的给药方式是注射给药,注射给药复杂,并且存在安全性风 险。
发明内容
有鉴于此,因此本发明采用牛奶外泌体作为药物载体,该外泌体来源于 牛奶,安全可靠,又具有牛奶外泌体的功能性质,将其作为药物载体,可实 现蛋白质药物的口服给药。通过利用牛奶外泌体装载利拉鲁肽,实现利拉鲁 肽的口服给药,治疗二型糖尿病。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了牛奶外泌体在制备药物载体中的应用。在本发明的一些具 体实施方案中,所述药物包括蛋白质药物。在本发明的一些具体实施方案中, 所述药物包括利拉鲁肽。
本发明还提供了牛奶外泌体作为药物载体在制备预防和/或治疗疾病的药 物中的应用。在本发明的一些具体实施方案中,所述药物包括蛋白质药物。 在本发明的一些具体实施方案中,所述药物包括利拉鲁肽。在本发明的一些 具体实施方案中,所述药物的给药途径为口服给药。在本发明的一些具体实 施方案中,所述疾病包括II型糖尿病。
更重要的是,本发明还提供了口服药物,包括有效成分和作为药物载体 的牛奶外泌体。
本发明中,所述应用或所述口服药物中,所述牛奶外泌体的制备方法, 包括如下步骤:
步骤1、前处理;
步骤2、初步纯化、浓缩;
步骤3、精纯;
所述前处理包括去除脂肪和/或去除蛋白;
所述初步纯化、浓缩采用切向流超滤;
所述精纯包括CIMmultus QA柱纯化、Capto core700柱纯化、S400分子筛色 谱法纯化中的一种或两者以上的组合。
在本发明的一些具体实施方案中,步骤1中去除脂肪包括:
(1)采用静置自然沉降和过滤的方法去除脂肪;和/或
(2)采用离心的方法去除脂肪;
所述过滤包括深层过滤和/或囊式滤器过滤。
在本发明的一些具体实施方案中,步骤1中所述去除蛋白采用溶解蛋白 法和/或沉淀蛋白法;
所述溶解蛋白法包括柠檬酸钠溶解法;
所述沉淀蛋白法包括EDTA沉淀蛋白法、磷酸钠沉淀蛋白法、硫酸铵沉 淀蛋白法中的一种或两者的组合。
在本发明的一些具体实施方案中,所述柠檬酸钠溶解法包括如下步骤: 取等体积的牛奶与质量浓度为2%的柠檬酸钠溶液混合,冰浴震摇,滤膜过滤。
所述柠檬酸钠溶解法具体为:将等体积的牛奶倒入质量浓度为2%的柠檬 酸钠溶液中,摇床冰浴震摇60min,牛奶样品均变澄清,将澄清的牛奶样品用 0.2μm滤膜进行过滤。
在本发明的一些具体实施方案中,所述EDTA沉淀蛋白法包括如下步骤: 取等体积的牛奶与EDTA溶液混合,室温静置,离心,滤膜过滤;所述EDTA 溶液的浓度为0.35M,pH值为7.0。
在本发明的一些具体实施方案中,所述柠檬酸钠溶解法具体为:取等体 积的牛奶倒入EDTA溶液中,室温沉淀,静置15min,沉淀后的牛奶样品 12000rpm,离心40min,接着将上清用0.45μm和0.2μm的滤膜进行过滤。
在本发明的一些具体实施方案中,所述磷酸钠溶液的浓度为1M,pH值 为6.3。
在本发明的一些具体实施方案中,所述磷酸钠沉淀蛋白法包括如下步骤:
不同的牛奶种类,磷酸钠沉淀蛋白法的具体步骤不相同:
(1)全脂牛奶
取牛奶于16000rpm离心30min去除脂肪,将等体积的牛奶与磷酸钠溶液 混合,搅拌,沉淀,-80℃冷冻;
(2)脱脂牛奶
取牛奶于16000rpm离心30min去除脂肪,将等体积的牛奶与磷酸钠溶液 混合,搅拌,沉淀,室温静置,于3500rpm离心10min,收集上清经滤膜过 滤。
在本发明的一些具体实施方案中,所述磷酸钠沉淀蛋白法具体包括如下 步骤:取牛奶16000rpm,离心30min去除脂肪,将等体积的牛奶倒入磷酸钠 溶液中,磁力搅拌器350rpm,搅拌15min,沉淀后的牛奶样品3500rpm,离 心10min,接着将上清依次用0.8μm,0.45μm和0.2μm的滤膜进行过滤。
在本发明的一些具体实施方案中,所述硫酸铵沉淀蛋白法包括如下步骤: 取等体积的牛奶与硫酸铵溶液混合,室温静置,离心,滤膜过滤;所述硫酸铵溶液的浓度为3.0M。
在本发明的一些具体实施方案中,所述硫酸铵沉淀蛋白法具体包括如下 步骤:将等体积的牛奶倒入硫酸铵溶液中,边倒边轻轻用玻璃棒搅拌,室温 进行沉淀,静置1.5h,沉淀后的牛奶样品6000rpm,离心20min,接着将上清 依次用0.8μm,0.45μm和0.2μm的滤膜进行过滤。
本发明还提供了治疗疾病的方法,以牛奶外泌体为药物载体,担载药物 施用于动物体。
在本发明的一些具体实施方案中,所述药物包括蛋白质药物。
在本发明的一些具体实施方案中,所述药物包括利拉鲁肽。
在本发明的一些具体实施方案中,所述药物的给药途径为口服给药。
在本发明的一些具体实施方案中,所述疾病包括II型糖尿病。
本发明采用牛奶外泌体作为药物载体,该外泌体来源于牛奶,安全可靠, 又具有牛奶外泌体的功能性质,将其作为药物载体,可实现蛋白质药物的口 服给药。通过利用牛奶外泌体装载利拉鲁肽,实现利拉鲁肽的口服给药,治 疗二型糖尿病。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示TFF+BE-SEC和UC提取牛奶外泌体工艺路线图;
图2示TEM下3种方法提取的外泌体的形态表现(Bar=500nm)(A: TFF;B:TFF+BE-SEC;C:UC);
图3示3种方法提取外泌体的粒径分布(A:TFF;B:TFF+BE-SEC;C: UC.);
图4示3种方法提取牛奶外泌体的SEC-HPLC色谱图(A:TFF;B: TFF+BE-SEC;C:UC.);
图5示超声后的利拉鲁肽溶液(左,超声后有较多沉淀析出,溶液呈胶体 状)及牛奶外泌体-利拉鲁肽混合液(右);
图6示Core700柱子纯化牛奶外泌体超声装载利拉鲁肽样品;
图7示Core700柱子纯化超声处理的利拉鲁肽样品;
图8示QA柱纯化Milk外泌体和利拉鲁肽超声后样品;
图9示QA柱纯化超声处理的利拉鲁肽样品;
图10示超声并过Core700后的利拉鲁肽溶液及外泌体-利拉鲁肽混合液对 荧光素酶表达量的影响(阳性对照均为0.375ug/ml未经超声处理的利拉鲁肽原 料药处理组);
图11示探索利用电转方法实现外泌体转装载PKH67的条件;其中,图11A 示不同电压条件下电转PKH67-外泌体混合液(100μF电容),样品FITC阳性 率和颗粒浓度;图11B示500V电压不同电容条件下电转PKH67-外泌体混合 液,样品FITC阳性率和颗粒浓度;
图12示Core700柱子纯化牛奶外泌体电穿孔装载利拉鲁肽样品;
图13示Core700柱子纯化电穿孔处理利拉鲁肽样品;
图14示电转并过core700后的利拉鲁肽溶液及外泌体-利拉鲁肽混合液对 荧光素酶表达量的影响(阳性对照均为0.375ug/ml未经电转处理的利拉鲁肽原 料药处理组);
图15示探索利用孵育方法实现外泌体转装载PKH67的条件;其中,图15 左图示不同温度条件下孵育PKH67-外泌体混合液(0.5h),样品FITC阳性率 和颗粒浓度;图15右图示50℃孵育不同时间,样品FITC阳性率和颗粒浓度;
图16示Core700柱子纯化电穿孔处理利拉鲁肽样品;
图17示共孵育并过Core700后的利拉鲁肽溶液及外泌体-利拉鲁肽混合液 对荧光素酶表达量的影响(阳性对照均为0.375ug/ml未经共孵育处理的利拉鲁 肽原料药处理组);
图18示外泌体装载不同药物的细胞药效;
图19示纳米流式检测灌胃给药不同时间点小鼠血清中阳性外泌体颗粒 数;
图20示纳米流式检测舌下给药不同时间点小鼠血清中阳性外泌体颗粒 数;
图21示小鼠舌下给不同载药的外泌体,1小时后灌胃葡萄糖溶液,检测小 鼠血糖的随时间的变化;
图22示小鼠舌下给不同浓度的外泌体-利拉鲁肽,检测小鼠随机血糖随时 间的变化;
图23示小鼠禁食6小时后,舌下给不同浓度的外泌体-利拉鲁肽,检测小鼠 空腹血糖随时间的变化。
具体实施方式
本发明公开了牛奶外泌体在制备药物载体中的应用,本领域技术人员可 以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的 替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发 明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能 在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明提供的牛奶外泌体在制备药物载体中的应用中,所用原料及试剂 均可由市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1可工业放大的牛外泌体纯化工艺
1)采用不同蛋白去除方法对牛奶样品进行预处理
a.EDTA沉淀蛋白法:将脱脂牛奶与相同体积、不同浓度、不同pH的 EDTA混合,室温孵育15min,沉淀酪蛋白。EDTA的浓度为0.15~0.35mol·L-1,pH值为6.0~8.0。12 000r·min-1,离心40min,上清依次采用0.80、0.45 和0.20μm滤膜过滤。
b.磷酸钠沉淀蛋白法:在磷酸钠溶液中加入等量的脱脂牛奶。对磷酸钠 的浓度和pH范围进行几次预实验,如采用0.5mol·L-1(pH 5.3、pH 6.5和 pH 7.6)、1.0mol·L-1(pH5.2、pH6.3和pH7.6)和2.0mol·L-1(pH 6.0、 pH 7.0和pH 8.0)磷酸钠。4℃过夜沉淀蛋白,沉淀后的上清依次通过0.80、 0.45和0.20μm滤膜过滤。
c.柠檬酸钠溶解蛋白法:将脱脂乳与等量的2%、4%、6%、8%和16% 的柠檬酸钠混合,冰上孵育2h溶解酪蛋白,0.20μm滤膜过滤。
2)TFF法初纯和浓缩牛奶外泌体
预处理后的牛奶上清采用相对分子质量为750 000的中空纤维柱进行处 理。设置***参数TMP最大压力为2个大气压,报警压力为2个大气压; 体积:最小体积为100mL,报警体积为100mL。将样品倒入循环杯中,采 用1×PBS进行置换,直至透过的蛋白浓度为0.00g·L-1后,将杯中的液体 继续浓缩到原液的1/20收集样品。
3)BE-SEC和UC精纯牛奶外泌体BE-SEC:
Pure 25纯化***采用超纯水进行冲洗,并连接HiScreen Capto Core700柱继续采用超纯水冲洗3个柱体积,冲洗结束继续采用缓冲液 1×PBS平衡3个柱体积,将初纯样品采用HiScreen CaptoCore 700柱进行纯化,流速为2mL·min-1,收集流穿出峰位置样品,即为牛奶外泌体。
实验结果:
如图1所示,采用蛋白沉淀的方法获取预处理样品,并采用TFF结合 BE-SEC的纯化方法,获得牛奶外泌体。通过与传统外泌体提取方法——UC 进行对比证明本工艺方法所获的的样品得率和纯度更高。
如图2所示,TFF、BE-SEC和UC提取的外泌体在TEM下均能观察 到膜结构,呈现出茶托状或圆盘状。但TEM下UC提取的外泌体拍摄背景 较杂,蛋白聚集物较多。蛋白沉淀预处理样品,并采用TFF结合BE-SEC的 纯化方法背景比较干净。
采用NanoFCM检测外泌体的颗粒粒径、浓度和纯度的结果如图3所示: TFF获得的外泌体平均粒径为(66.92±16.39)nm,得率为3.6×1013个颗 粒·L-1,纯度为58%;TFF+BE-SEC制备的牛奶外泌体直径大小较为集中, 为30~150nm,外泌体平均粒径为(66.41±15.81)nm,得率为2.5×1013个颗粒·L-1,纯度为90%;UC获得的外泌体平均粒径为(68.87±18.04)nm, 得率为2.4×1011个颗粒·L-1,纯度为25%。说明TFF+BE-SEC制备的外泌 体得率更高,纯度更高。
如图4所示:采用HPLC检测外泌体样品中游离蛋白(粒径小于外泌 体尺寸)含量。3种方法提取所得牛奶外泌体中在TSKgel G6000 PWXL柱 上的保留时间均为8min。但TFF与BE-SEC提取的外泌体样品较UC所 得样品的杂质峰(RT>8min)比例更小,TFF+BE-SEC所得终产物更体现 为单一峰。
采用蛋白沉淀预处理牛奶加上TFF结合BE-SEC的纯化方法,能收获 得率和纯度更高的外泌体样品,更重要的是TFF可实现样品从几升至上百升 的初纯和浓缩,将TFF与BE-SEC结合,最终可实现牛奶外泌体的规模制备。
实施例2牛奶外泌体载药工艺——超声装载法
原理:由于超声能够打乱膜中脂质链的排列出现暂时性的小孔,因此对外 泌体进行低频率的连续超声,声波引起包封空气膨胀,囊泡内压升高达到双 分子层的弹性极限,磷脂层出现孔隙,由于膜外药物浓度高,渗透压的差异 使得药物通过孔隙向脂质体内扩散。
操作步骤:
利用PKH67探索超声装载最优条件:PKH67与牛奶外泌体室温共孵育 30min后,细胞破碎仪分别摸索超声功率
150w/300w/450w/600w/800w/1000w/1200w,并探索超声时间
0s/50s/250s/500s/750s/20min/30min/1h/2h/4h/6h。超声后的样品利用NanoFCM检测样品颗粒数,及PKH67阳性率。根据超声装载优化后条件,探索超声体 积,超声后的样品利用NanoFCM检测样品颗粒数,粒径及PKH67阳性率。
实验结果:
表1超声功率和超声时间对外泌体装载阳性率的影响
表2超声功率和超声时间对外泌体颗粒数(1010particals/mL)的影响
表3不同超声体积对外泌体装载的影响(600w超声500s)
不同功率超声后外泌体装载效率有很大区别,超声后阳性率在5%-90%之 间;450W-1200W功率,超声时间超过20min,装载效率差距不明显,基本稳 定在80%左右。随着超声时间延长,颗粒数有所下降。且可实现3ml-500ml 体系的装载规模,装载后颗粒数和装载阳性率比较稳定。
超声装载利拉鲁肽:
按照1×1011个外泌体颗粒与5mg利拉鲁肽的比例混合,进行超声,超声 后用Core700或QA柱进行纯化,超声前后溶液状态有明显变化,如图5所示: 超声后的利拉鲁肽溶液(左,超声后有较多沉淀析出,溶液呈胶体状)及牛 奶外泌体-利拉鲁肽混合液(右)。
取利拉鲁肽25mg,及利拉鲁肽25mg与5×1011个外泌体颗粒混合液超声, 超声后过Core700,收集流穿。结果如图6~7所示,5mL Core700色谱柱,收 集进样开始后2-4mL的流穿样品,此部分为装载利拉鲁肽的外泌体颗粒,游 离利拉鲁肽吸附在色谱柱上,进而洗脱被去除。
取利拉鲁肽250mg,及利拉鲁肽250mg与5×1012个外泌体颗粒混合,超 声,超声后经QA柱纯化,收集流穿和洗脱各组分样品。结果如图8~9所示, 装载利拉鲁肽的外泌体和游离利拉鲁肽根据带电荷量的差异,在不同盐浓度 分别被洗脱。
接种GLP-1R-CHO细胞至96孔板,细胞培养24h后,将培养基更换为含 有空白牛奶外泌体,或105/mL,106/mL,107/mL,108/mL,109/mL,1010/mL的milk- 外泌体-liraglutide,,以及对应颗粒浓度的利拉鲁肽溶液培养5h。收样按照荧 光素酶试剂盒说明书进行收样,没孔加入100ul细胞裂解液进行裂解细胞,裂 解5min,收集细胞裂解液用1200rpm,离心5min,然后加入底物(孵育5min) 然后用酶标仪进行检测荧光。结果如图10和表4所示。
表4
实验结论:从原料药与牛奶外泌体-利拉鲁肽混合液超声后的液体形状对 比看出,在含有外泌体的时候,利拉鲁肽不会析出,而是负载到外泌体上。 牛奶外泌体-利拉鲁肽混合液超声后,经过QA纯化,色谱图显示超声装载后 样品在高盐洗脱中(电导率70.44Ms/cm)A260/A280吸收比例提高至1.88, 外泌体经超声后双层膜被打破,此处为释放出的核酸内容物的吸收峰,超声时间延长后外泌体颗粒数有所下降。在经过core700或QA纯化后,按比例稀 释给药处理细胞,能看到检测的荧光素酶表达情况呈剂量依赖。1×1010颗粒 数牛奶外泌体-外泌体-利拉鲁肽处理细胞,显著提高细胞荧光素酶的表达量,说明实现了牛奶外泌体对利拉鲁肽的装载,并且仍具有生物活性。
实施例3牛奶外泌体载药工艺——电穿孔法
原理:电穿孔是微生物学技术,其中将电场施加到细胞以增加细胞膜的渗 透性,从而允许化学品,药物或DNA被引入细胞。
操作步骤:
利用PKH67探索电穿孔装载药物最优条件:PKH67与牛奶外泌体室温共 孵育30min后,电穿孔仪按电压100-500v,电容100-500uF进行实。电转后 的样品利用NanoFCM检测样品颗粒数,粒径及PKH67阳性率。
取利拉鲁肽25mg,及利拉鲁肽25mg与5×1011个外泌体颗粒混合液进行 电转,电转后过core700除去游离的利拉鲁肽,收集流穿。
接种GLP-1R-CHO细胞至96孔板,细胞培养24h后,将培养基更换 为含有空白牛奶外泌体,或105/mL,106/mL,107/mL,108/mL,109/mL,1010/mL的 milk-外泌体-liraglutide,,以及对应颗粒浓度的利拉鲁肽溶液培养5h。收样按 照荧光素酶试剂盒说明书进行收样,没孔加入100ul细胞裂解液进行裂解细 胞,裂解5min,收集细胞裂解液用1200rpm,离心5min,然后加入底物(孵 育5min)然后用酶标仪进行检测荧光。
实验结果如图11~14、表5~7所示:
表5电压对外泌体装载的影响
电压V | 阳性率% | 浓度颗粒数×1010/mL |
0 | 7.12 | 8.55 |
100 | 8.2 | 2.8 |
200 | 28.5 | 2.52 |
300 | 39 | 2.26 |
400 | 62.9 | 1.56 |
500 | 59.5 | 2.14 |
表6电容对外泌体装载的影响
电容uF | 阳性率% | 浓度颗粒数×1010/mL |
0 | 6.35 | 8.55 |
100 | 46.8 | 3.2 |
200 | 51.8 | 3.78 |
300 | 71.2 | 2.78 |
400 | 69.8 | 2.96 |
500 | 57.1 | 2.11 |
表7
实施例4牛奶外泌体载药工艺——共孵育法
原理:利用物质间的相互作用力,使得药物吸附在药物载体上。
操作步骤:
利用PKH67探索共孵育装载药物最优条件:PKH67与牛奶外泌体室温共 孵育30min后,样品置于4℃,37℃,50℃共孵育30min,1h,2h,500rpm摇 晃。共孵育后的样品利用NanoFCM检测样品颗粒数,粒径及PKH67阳性率。
取利拉鲁肽25mg,及利拉鲁肽25mg与5×1011个外泌体颗粒混合液进行 共孵育共孵育后的样品过Core700除去游离的利拉鲁肽,收集流穿。
接种GLP-1R-CHO细胞至96孔板,细胞培养24h后,将培养基更换 为含有空白牛奶外泌体,或105/mL,106/mL,107/mL,108/mL,109/mL,1010/mL的 milk-外泌体-liraglutide,,以及对应颗粒浓度的利拉鲁肽溶液培养5h。收样按 照荧光素酶试剂盒说明书进行收样,没孔加入100ul细胞裂解液进行裂解细 胞,裂解5min,收集细胞裂解液用1200rpm,离心5min,然后加入底物(孵 育5min)然后用酶标仪进行检测荧光。
实验结果如图14~17、表8~10所示。
表8孵育温度对外泌体装载的影响
温度 | 阳性率% | 浓度颗粒数×1010/mL |
4℃ | 7.12 | 8.55 |
37℃ | 8.2 | 3.18 |
42℃ | 28.5 | 3.32 |
50℃ | 49 | 3.26 |
60℃ | 22.9 | 1.56 |
表9孵育时长对外泌体装载的影响
时长 | 阳性率% | 浓度颗粒数×1010/mL |
0.5h | 32.1 | 3.6 |
1h | 46.8 | 3.78 |
2h | 29.8 | 3.78 |
4h | 21.2 | 2.78 |
8h | 9.8 | 1.96 |
表10共孵育法细胞药效
实验结论:在经过core700纯化后,按比例稀释给药处理细胞,能看到检 测的荧光素酶表达情况呈剂量依赖。1×1010颗粒数牛奶外泌体-外泌体-利拉 鲁肽处理细胞,显著提高细胞荧光素酶的表达量,说明实现了牛奶外泌体对 利拉鲁肽的装载,并且仍具有生物活性。
实施例5牛奶外泌体装载不同T2DM药物
目前,市面上具有多种治疗二型糖尿病(type 2diabetes mellitus,T2DM) 的药物,如德谷胰岛素,地特胰岛素,利拉鲁肽,索马鲁肽,以及已在国外 上市的Tirzepatide。本发明实现了牛奶外泌体装载不同的T2DM药物,从而 可将这些药物的给药方式从注射该为口服,解决市面上无口服糖尿病药物的 困境。
操作:
1)根据4.2介绍的牛奶外泌体的载药方式,选择电穿孔方法,利用牛奶外 泌体分别装载德谷胰岛素,地特胰岛素,利拉鲁肽,索马鲁肽,Tirzepatide, 并经过core700柱纯化;
2)接种GLP-1R-CHO细胞至96孔板,细胞培养24h后,将培养基更换 为含有空白牛奶外泌体,或105/mL,106/mL,107/mL,108/mL,109/mL,1010/mL的 装载不同药物的牛奶外泌体,,培养5h。收样按照荧光素酶试剂盒说明书进行收样,没孔加入100ul细胞裂解液进行裂解细胞,裂解5min,收集细胞裂解 液用1200rpm,离心5min,然后加入底物(孵育5min)然后用酶标仪进行检 测荧光。
实验结果如图18、表11所示:
表11外泌体装载不同药物的细胞药效
实验结论:
从结果上看,负载不同药物的牛奶外泌体均能使细胞释放GLP,并且具 剂量依赖性。说明本发明能实现对不同类型的蛋白多肽类药物的装载。
实施例6牛奶外泌体舌下给药
原理:本发明利用舌下粘膜未角质化,毛细血管丰富,血流速度快的特 点,针对牛奶外泌体经过胃肠道易被胃酸破坏,导致装载的药物生物利用度 低,以及利拉鲁肽口服会被降解等问题,将装载利拉鲁肽的牛奶外泌体制成 舌下片,实现利拉鲁肽口服给药,并且可通过舌下粘膜吸收,通过颈静脉和上腔静脉直接进入血液循环,起效迅速;并且服药时无需用水,置于舌下含 化,服用方便,口感好。
实验操作:
A.将PKH67标记的牛奶外泌体,分别尝试灌胃,舌下给药,以及制备肠 溶胶囊给药;
B.给药后,采集不同时间点的小鼠血液,利用纳米流式检测血液中的阳 性颗粒数,确定外泌体的入血吸收效果。
结果如图19~20、表12~14所示:
表12灌胃给药数据
表13舌下给药数据
表14肠溶胶囊数据
mean | SD | |
0min | 4.58×107 | 2.67×107 |
30min | 6.10×107 | 1.89×107 |
1h | 1.53×107 | 9.87×106 |
2h | 1.53×107 | 8.22×106 |
3h | 3.05×107 | 1.24×107 |
4h | 6.86×107 | 2.78×107 |
5h | 1.30×108 | 9.18×106 |
8h | 1.53×107 | 7.35×106 |
22h | 9.92×107 | 3.22×107 |
通过灌胃给小鼠PKH67标记的牛奶外泌体,不同时间点采集血液检测阳 性颗粒,每只小鼠灌胃4×1011颗粒,5min时检测到颗粒最高,小鼠血液中检 测到2×109阳性颗粒,因此,相当于有0.5%的外泌体进入到了血液中。当舌 下给PKH67标记的牛奶外泌体时,5min检测到的阳性颗粒数最多,约为2× 1010阳性颗粒,相当于有5%的外泌体进入到了血液。而尝试肠溶胶囊给药, 在小鼠血液中,给药组的阳性颗粒数并未显著增加。因此,舌下给药的生物 利用度明显高于灌胃给药的生物利用度。
实施例7牛奶外泌体舌下片剂
实验操作:装载利拉鲁肽的牛奶外泌体冻干粉,与崩解剂,填充剂,粘 合剂,润滑剂,矫味剂混合后,制备成舌下片。每1000片利拉鲁肽牛奶外泌 体舌下片中,主药的含量为105-1017颗粒数,崩解剂的含量为1-50g,填充剂 的含量为20-400g;矫味剂0-50g,粘合剂5-100g,润滑剂1g-10g;
所选用的崩解剂:微晶纤维素,交联羧甲基纤维素钠,交联聚乙烯吡咯烷 酮,羧甲基淀粉钠,低取代羟丙基纤维素,淀粉,吐温,十二烷基硫酸钠中 的仍一种或两种以上的混合物;
所选用的填充剂:微晶纤维素,微晶纤维素-甘露醇,微晶纤维素-微粉硅 胶,乳糖,淀粉,改性淀粉,甘露醇,山梨醇,木糖醇,赤藓糖,海藻糖,预胶化淀粉,糖粉,葡萄糖,糊精,硫酸钙中的任一种或两种以上的混合物。
所选用矫味剂:甜菊甙,糖粉,甘草甜素,阿司帕坦,三氯蔗糖,甜蜜素, 索马甜,糖精等一种或两种以上的混合物。
所选用的粘合剂:纯化水,淀粉浆,羟丙基甲基纤维素,聚乙烯吡咯烷酮, 卡波姆,糊精,明胶浆,***胶浆,海藻酸钠和糖浆中的一种或两种以上 的混合物。
所用润滑剂:硬脂酸,硬脂酸镁,硬脂酸钙,微粉硅胶,滑石粉,氢化植 物油,聚乙二醇4000,聚乙二醇6000,十二烷基硫酸钠,十二万级硫酸镁, 富马酸硬质酸钠中的任一种或两种以上的混合物。
最优配方如下:1×1015颗粒外泌体-利拉鲁肽,4g交联羧甲基纤维素钠, 80g甘露醇,25g纯化水,3.5g硬脂酸镁,按下述制备步骤进行制备
制备步骤如下:
第一步:将所述的主药冷冻干燥,过筛80-120目;
第二步:将填充剂,崩解剂,矫味剂,润滑剂烘干,粉碎,过筛80-120 目预处理;
第三步:将预处理的主药,填充剂,矫味剂和崩解剂混合均匀;
第四步:将粘合剂加入混匀的上述无聊中,制成软材,制粒,干燥;
第五步:干颗粒加入润滑剂混匀,再进行压片得到成品。
实施例8
将1×1013颗粒数主药利拉鲁肽牛奶外泌体加入甘露醇0.6g,冷冻干燥后, 与填充剂55g微晶纤维素,1g崩解剂羧甲基纤维素钠,1g润滑剂硬脂酸镁进 行烘干,粉碎,过筛混合,制成软材,用20目网筛制粒,并风干至水分≤3%, 再加入润滑剂,进行总混,最后压片得到利拉鲁肽牛奶外泌体舌下片。
实施例9
实验操作:
采用电穿孔方法,将德谷胰岛素,地特胰岛素,利拉鲁肽,索马鲁肽, Tirzepatide装载到牛奶外泌体并进行纯化,获得载药外泌体,并按照上述制剂 配方制备舌下片;
每只小鼠舌下给药1×1011颗粒数的舌下片,注射葡萄糖后,检测小鼠对 糖耐受效果。
结果如图21、表15所示:
表15
结果分析:
通过利用牛奶外泌体,可实现多种降血糖药物的装载。载药的外泌体通 过口服给药,能够在15min内实现明显的降血糖效果。并且能够维持血糖的 稳定,提高小鼠对糖的耐受反应。
实施例10
采用电穿孔方法,将利拉鲁肽(不限于利拉鲁肽,也包括德谷胰岛素, 地特胰岛素,索马鲁肽,Tirzepatide)装载到牛奶外泌体并进行纯化,获得载 药外泌体,并按舌下片最优配方制备舌下片,此处以装载利拉鲁肽的牛奶外泌体的结果为例进行说明。
糖尿病小鼠舌下给不同浓度的装载利拉鲁肽的牛奶外泌体,检测小鼠的 随机血糖。
结果如图22、表16所示:
表16
/>
结论:从随机血糖的结果上看,装载利拉鲁肽的外泌体能明显降低血糖。
实施例11
采用电穿孔方法,将利拉鲁肽(不限于利拉鲁肽,也包括德谷胰岛素, 地特胰岛素,索马鲁肽,Tirzepatide)装载到牛奶外泌体并进行纯化,获得载 药外泌体,并制备舌下片,此处以装载利拉鲁肽的牛奶外泌体的结果为例进行说明;
糖尿病小鼠禁食6h后,口腔给不同浓度的装载利拉鲁肽的牛奶外泌体, 检测小鼠的空腹血糖。
结果如图23、表17所示:
表17
/>
结论:从空腹血糖的结果上看,装载利拉鲁肽的外泌体能明显降低血糖。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普 通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润 饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.牛奶外泌体在制备药物载体中的应用;
所述药物的给药途径为口服给药;
所述牛奶外泌体的制备方法,包括如下步骤:
步骤1、前处理;
步骤2、初步纯化、浓缩;
步骤3、精纯;
所述前处理包括去除脂肪和/或去除蛋白;
所述初步纯化、浓缩采用切向流超滤;所述精纯包括Capto core700柱纯化;
步骤1中去除脂肪包括:
(1)采用静置自然沉降和过滤的方法去除脂肪;和/或
(2)采用离心的方法去除脂肪;
所述过滤包括深层过滤和/或囊式滤器过滤;
步骤1中所述去除蛋白采用溶解蛋白法和/或沉淀蛋白法;
所述溶解蛋白法包括柠檬酸钠溶解法;
所述沉淀蛋白法包括EDTA沉淀蛋白法、磷酸钠沉淀蛋白法、硫酸铵沉淀蛋白法中的一种或两者的组合;
所述柠檬酸钠溶解法具体为:将等体积的牛奶倒入质量浓度为2%的柠檬酸钠溶液中,摇床冰浴震摇60min,牛奶样品均变澄清,将澄清的牛奶样品用0.2μm滤膜进行过滤;
所述EDTA沉淀蛋白法具体为:取等体积的牛奶倒入EDTA溶液中,室温沉淀,静置15min,沉淀后的牛奶样品12000rpm,离心40min,接着将上清用0.45μm和0.2μm的滤膜进行过滤;所述EDTA溶液的浓度为0.35M,pH值为7.0;
所述磷酸钠沉淀蛋白法包括如下步骤:
不同的牛奶种类,磷酸钠沉淀蛋白法的具体步骤不相同:
(1)全脂牛奶
取牛奶于16000rpm离心30min去除脂肪,将等体积的牛奶与磷酸钠溶液混合,搅拌,沉淀,-80℃冷冻;
(2)脱脂牛奶
取牛奶于16000rpm离心30min去除脂肪,将等体积的牛奶与磷酸钠溶液混合,搅拌,沉淀,室温静置,于3500rpm离心10min,收集上清经滤膜过滤;
所述磷酸钠溶液的浓度为1M,pH值为6.3;
所述磷酸钠沉淀蛋白法具体包括如下步骤:取牛奶16000rpm,离心30min去除脂肪,将等体积的牛奶倒入磷酸钠溶液中,磁力搅拌器350rpm,搅拌15min,沉淀后的牛奶样品3500rpm,离心10min,接着将上清依次用0.8μm,0.45μm和0.2μm的滤膜进行过滤;
所述硫酸铵沉淀蛋白法具体包括如下步骤:将等体积的牛奶倒入硫酸铵溶液中,边倒边轻轻用玻璃棒搅拌,室温进行沉淀,静置1.5h,沉淀后的牛奶样品6000rpm,离心20min,接着将上清依次用0.8μm,0.45μm和0.2μm的滤膜进行过滤;所述硫酸铵溶液的浓度为3.0M;
所述药物包括德谷胰岛素,地特胰岛素,利拉鲁肽,索马鲁肽或Tirzepatide中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述药物包括利拉鲁肽。
3.牛奶外泌体作为药物载体在制备药物中的应用;
所述药物的给药途径为口服给药;
所述牛奶外泌体的制备方法,包括如下步骤:
步骤1、前处理;
步骤2、初步纯化、浓缩;
步骤3、精纯;
所述前处理包括去除脂肪和/或去除蛋白;
所述初步纯化、浓缩采用切向流超滤;
所述精纯包括Capto core700柱纯化;
步骤1中去除脂肪包括:
(1)采用静置自然沉降和过滤的方法去除脂肪;和/或
(2)采用离心的方法去除脂肪;
所述过滤包括深层过滤和/或囊式滤器过滤;
步骤1中所述去除蛋白采用溶解蛋白法和/或沉淀蛋白法;
所述溶解蛋白法包括柠檬酸钠溶解法;
所述沉淀蛋白法包括EDTA沉淀蛋白法、磷酸钠沉淀蛋白法、硫酸铵沉淀蛋白法中的一种或两者的组合;
所述柠檬酸钠溶解法具体为:将等体积的牛奶倒入质量浓度为2%的柠檬酸钠溶液中,摇床冰浴震摇60min,牛奶样品均变澄清,将澄清的牛奶样品用0.2μm滤膜进行过滤;
所述EDTA沉淀蛋白法具体为:取等体积的牛奶倒入EDTA溶液中,室温沉淀,静置15min,沉淀后的牛奶样品12000rpm,离心40min,接着将上清用0.45μm和0.2μm的滤膜进行过滤;所述EDTA溶液的浓度为0.35M,pH值为7.0;
所述磷酸钠沉淀蛋白法包括如下步骤:
不同的牛奶种类,磷酸钠沉淀蛋白法的具体步骤不相同:
(1)全脂牛奶
取牛奶于16000rpm离心30min去除脂肪,将等体积的牛奶与磷酸钠溶液混合,搅拌,沉淀,-80℃冷冻;
(2)脱脂牛奶
取牛奶于16000rpm离心30min去除脂肪,将等体积的牛奶与磷酸钠溶液混合,搅拌,沉淀,室温静置,于3500rpm离心10min,收集上清经滤膜过滤;
所述磷酸钠溶液的浓度为1M,pH值为6.3;
所述磷酸钠沉淀蛋白法具体包括如下步骤:取牛奶16000rpm,离心30min去除脂肪,将等体积的牛奶倒入磷酸钠溶液中,磁力搅拌器350rpm,搅拌15min,沉淀后的牛奶样品3500rpm,离心10min,接着将上清依次用0.8μm,0.45μm和0.2μm的滤膜进行过滤;
所述硫酸铵沉淀蛋白法具体包括如下步骤:将等体积的牛奶倒入硫酸铵溶液中,边倒边轻轻用玻璃棒搅拌,室温进行沉淀,静置1.5h,沉淀后的牛奶样品6000rpm,离心20min,接着将上清依次用0.8μm,0.45μm和0.2μm的滤膜进行过滤;所述硫酸铵溶液的浓度为3.0M;
所述药物包括德谷胰岛素,地特胰岛素,利拉鲁肽,索马鲁肽或Tirzepatide中的一种或多种。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述药物包括利拉鲁肽。
5.如权利要求3或4所述的应用,其特征在于,所述药物治疗的疾病包括II型糖尿病。
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