CN115089727B - Kc26多肽修饰的牛奶外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents
Kc26多肽修饰的牛奶外泌体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115089727B CN115089727B CN202210643259.2A CN202210643259A CN115089727B CN 115089727 B CN115089727 B CN 115089727B CN 202210643259 A CN202210643259 A CN 202210643259A CN 115089727 B CN115089727 B CN 115089727B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- milk
- polypeptide
- exosome
- solution
- exosomes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 97
- 239000008267 milk Substances 0.000 title claims abstract description 92
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 title claims abstract description 73
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 title claims abstract description 73
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 58
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 52
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 52
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 22
- 229960004562 carboplatin Drugs 0.000 claims abstract description 20
- 190000008236 carboplatin Chemical compound 0.000 claims abstract description 20
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 4
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 claims description 22
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 18
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 4
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 3
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 15
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 13
- 102000030431 Asparaginyl endopeptidase Human genes 0.000 abstract description 12
- 108010055066 asparaginylendopeptidase Proteins 0.000 abstract description 12
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 abstract description 8
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 abstract description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 3
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 abstract description 2
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 abstract description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 abstract description 2
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 abstract description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 40
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 11
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 9
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 6
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 4
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 102000015790 Asparaginase Human genes 0.000 description 2
- 108010024976 Asparaginase Proteins 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 229940008201 allegra Drugs 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229960003272 asparaginase Drugs 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M asparaginate Chemical compound [O-]C(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 2
- RWTNPBWLLIMQHL-UHFFFAOYSA-N fexofenadine Chemical compound C1=CC(C(C)(C(O)=O)C)=CC=C1C(O)CCCN1CCC(C(O)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)CC1 RWTNPBWLLIMQHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 230000004438 eyesight Effects 0.000 description 1
- 210000000887 face Anatomy 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000013029 homogenous suspension Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000000865 mononuclear phagocyte system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000000649 photocoagulation Effects 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011521 systemic chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004382 visual function Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/555—Heterocyclic compounds containing heavy metals, e.g. hemin, hematin, melarsoprol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明提出KC26多肽修饰的牛奶外泌体的制备方法和应用，属于医药技术领域。所述制备方法包括如下步骤：(a)制备牛奶外泌体，将所得牛奶外泌体添加至溶剂中，得牛奶外泌体溶液；(b)将KC26多肽添加至超纯水中，搅拌，得多肽溶液；(c)将上述牛奶外泌体溶液添加到上述多肽溶液中，反应后，冻干保存，得KC26多肽修饰的牛奶外泌体。本发明以卡铂为细胞毒药物，以牛奶外泌体为载体，以天冬酰胺内肽酶为靶点，三者有机结合，形成“药物‑载体‑靶点”模型，更有利于提高化疗药物的生物利用度，有效降低药物毒性和不良反应，具有很好的抑癌效果。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及KC26多肽修饰的牛奶外泌体的制备方法和应用。
背景技术
视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma，RB)是儿童最常见的眼内恶性肿瘤，好发于3岁以下儿童，平均发病年龄仅18个月，约10％～15％的患者可以发生肿瘤转移，严重危害患儿的视功能及生命。我国每年新增患者约为1100例，且84％为眼内期晚期高风险患者。
治疗技术的进步使RB患者能够在保生命的前提下保存眼球(保眼)和视功能。治疗方法主要包括冷冻、激光光凝、全身化疗、眼球摘除术以及通过眼内、球周和眼动脉介入途径的局部化疗等，并且强调多学科综合治疗。
目前，化学治疗(化疗)仍是眼内期RB的一线治疗方法，其有效抑制RB细胞转移，同时减少放射治疗(放疗)的诸多并发症。根据注药途径分为静脉化疗、动脉化疗和玻璃体腔注药化疗。RB化疗面临两大困境：一是药物缺乏靶向性，全身或局部副作用大；二是药物对视网膜下腔或玻璃体腔的肿瘤渗透性差，残存肿瘤细胞成为复发根源。可见，临床仍然缺乏一种积极有效的新型靶向递药***用于提高化疗药物的生物利用度和安全性。
靶向药物递送***(targeted drug delivery systems,TDDS)是提高化疗效果的重要手段之一。天然细胞来源的外泌体大小约30-150nm，常被用作肿瘤靶向纳米药物递送***的载体。主要具有以下特征：可以逃避单核吞噬细胞***的快速清除，甚至可以穿透血脑屏障；磷脂双分子层构成的中空结构使其既可以在膜上装载亲脂性药物，也可以在内部包裹亲水性药物；其生物来源保证了良好的生物相容性、低免疫原性和低毒性；表面呈现负电为其提供了循环稳定性。然而，天然细胞来源的外泌体生产成本高，操作复杂。
发明内容
本发明提出酶敏感的KC26多肽修饰的牛奶外泌体及其制备方法和应用，根据天冬酰胺内肽酶可作为肿瘤微环境响应型递药设计及治疗应用靶点的特点，引入天冬酰胺内肽酶敏感的KC26多肽修饰牛奶外泌体，以实现药物靶向作用，提高化疗药物生物利用率。
本发明提出一种KC26多肽修饰的牛奶外泌体的制备方法，包括如下步骤：
(a)制备牛奶外泌体，将所得牛奶外泌体添加至溶剂中，得牛奶外泌体溶液；
(b)将KC26多肽添加至超纯水中，搅拌，得多肽溶液；
(c)将上述牛奶外泌体溶液添加到上述多肽溶液中，反应后，冻干保存，得KC26多肽修饰的牛奶外泌体。
进一步地，步骤(c)中，所述牛奶外泌体与所述KC26多肽的质量比为1:3。
进一步地，步骤(c)中，所述反应为4℃反应24小时。
进一步地，步骤(b)中，所述KC26多肽与超纯水的比例为36mg：10mL。
进一步地，步骤(a)中，所述牛奶外泌体与溶剂的比例为12mg：1mL；
所述溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、尿素、甘油、氢氧化钠或乙酸中至少一种。
进一步地，步骤(a)中，所述牛奶外泌体的制备方法，包括如下步骤：
(a1)牛奶第一离心后，去除脂肪球、酪蛋白和碎片，得第一溶液；
(a2)将上述第一溶液第二离心后，去除大颗粒和微泡，得第二溶液；
(a3)将上述第二溶液第三离心后，弃上清液，洗涤沉淀，得外泌体沉淀；
(a4)将上述外泌体沉淀重新悬浮于磷酸盐缓冲液中，通过0.22μm过滤器过滤、灭菌，得牛奶外泌体。
进一步地，步骤(a1)中，所述第一离心为4℃以13000g离心30min；
步骤(a2)中，所述第二离心为4℃以10万g离心60min；
步骤(a3)中，所述第三离心为4℃以135000g离心90min。
本发明还提出上述任一所述的制备方法制备得到的KC26多肽修饰的牛奶外泌体。
本发明还提出上述任一KC26多肽修饰的牛奶外泌体在制备用于治疗视网膜母细胞瘤药物中的应用。
进一步地，将KC26多肽修饰的牛奶外泌体与卡铂混合得用于治疗视网膜母细胞瘤药物。
本发明具有以下优势：
本发明以牛奶外泌体为载体的，选取KC26与肿瘤高表达的天冬酰胺内肽酶(靶点)进行酶响应。其中，牛奶外泌体作为天然的纳米载体，具有良好的生物相容性、低免疫原性、低毒性、循环稳定性、成本低廉、易于获取等优势。KC26多肽可以与肿瘤微环境中的天冬酰胺内肽酶进行酶响应从而实现靶向作用。本发明中的递药体系，以卡铂为细胞毒药物，以牛奶外泌体为载体，以天冬酰胺内肽酶为靶点，三者有机结合，形成“药物-载体-靶点”模型，更有利于提高化疗药物的生物利用度，有效降低药物毒性和不良反应，具有很好的抑癌效果。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例1所得KC26多肽修饰的牛奶外泌体的形貌分析图；
图2为本发明试验例1中视网膜母细胞瘤(Y79)细胞采用CCK-8试剂实验检测给药48小时后，不同浓度下的卡铂、卡铂-牛奶外泌体、卡铂-KC26多肽-牛奶外泌体的细胞抑制率；
图3为本发明试验例1中视网膜母细胞瘤(WERI-Rb1)细胞采用CCK8实验检测给药48小时后，不同浓度下的卡铂、卡铂-牛奶外泌体、卡铂-KC26多肽-牛奶外泌体的细胞抑制率；
图4为本发明试验例2中视网膜母细胞瘤(Y79)细胞采用流式细胞术检测给药24小时后的凋亡率；
图5为本发明试验例2中视网膜母细胞瘤(WERI-Rb1)细胞采用流式细胞术检测给药24小时后的凋亡率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本发明一实施例提出一种KC26多肽修饰的牛奶外泌体的制备方法，包括如下步骤：
(a)制备牛奶外泌体，将所得牛奶外泌体添加至溶剂中，得牛奶外泌体溶液；
(b)将KC26多肽添加到超纯水中，搅拌，得多肽溶液；
(c)将上述牛奶外泌体溶液添加到上述多肽溶液中，反应，冻干保存，得牛奶外泌体。
本发明实施例中提出的KC26多肽修饰的牛奶外泌体的制备方法，以牛奶外泌体为载体的，选取KC26与肿瘤高表达的天冬酰胺内肽酶(靶点)进行酶响应。其中，牛奶外泌体作为天然的纳米载体，具有良好的生物相容性、低免疫原性、低毒性、循环稳定性、成本低廉、易于获取等优势。KC26多肽可以与肿瘤微环境中的天冬酰胺内肽酶进行酶响应从而实现靶向作用。该方法操作简单，成本较低，具有较强的医学应用价值。
本发明一实施例中，步骤(c)中，所述牛奶外泌体与所述KC26多肽的质量比为1:3。步骤(c)中，所述反应为4℃反应24小时。
本发明一实施例中，步骤(b)中，所述KC26多肽与超纯水的比例为36mg：10mL。
本发明一实施例中，步骤(a)中，所述牛奶外泌体与溶剂的比例为12mg：1mL。所述溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、尿素、甘油、氢氧化钠或乙酸中至少一种。
本发明一实施例中，步骤(a)中，所述牛奶外泌体的制备方法，包括如下步骤：
(a1)牛奶第一离心后，去除脂肪球、酪蛋白和碎片，得第一溶液；
(a2)将上述第一溶液第二离心后，去除大颗粒和微泡，得第二溶液；
(a3)将上述第二溶液第三离心后，弃上清液，洗涤沉淀，得外泌体沉淀；
(a4)将上述外泌体沉淀重新悬浮于磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)中，通过0.22μm过滤器过滤、灭菌，得牛奶外泌体。
本发明一实施例中，步骤(a1)中，所述第一离心为4℃以13000g离心30min。具体地，所述第一离心用TA-10.250转子和Allegra 25R离心机；第一离心在250mL离心瓶中进行。
本发明一实施例中，步骤(a2)中，所述第二离心为4℃以10万g离心60min。具体地，所述第二离心为4℃使用Optima LE-80K超速离心机(贝克曼库尔特，美国)在10万g的45-Ti型固定角转子中离心60min。
本发明一实施例中，步骤(a3)中，所述第三离心为4℃以135000g离心90min。步骤(a3)中，所述洗涤为用PBS洗涤三次。步骤(a3)中，用Optima LE-80K超离心机在45-Ti型固定角转子中。具体地，将上述上清液(70mL/管)最终在135000g，4℃，用Optima LE-80K超离心机在45-Ti型固定角转子中离心90min，弃上清，用PBS洗涤三次。
本发明一实施例还提出上述任一制备方法制备得到的KC26多肽修饰的牛奶外泌体。本发明实施例中，KC26多肽是一条基于穿膜肽的“发夹”结构，由三部分组成，一段具有穿膜肽功能的R9序列，一段能封闭R9功能的富含谷氨酸的序列，中间含有一段能被天冬酰胺内肽酶酶切响应的底物肽序列，具体序列为Ke5Ne4GPTN2R9C。当KC26修饰的牛奶外泌体被肿瘤微环境中的天冬酰胺内肽酶切水解后，穿膜肽被激活，包载药物的牛奶外泌体更好地进入肿瘤细胞释放药物，可以有效增加药物在靶细胞的累积。并且，不表达或者低表达天冬酰胺内肽酶的正常细胞将很难与之结合，因此不被化疗药物损伤，可以有效减少化疗药物的副作用。故KC26多肽修饰的牛奶外泌体包载的卡铂等药物可有效地抑制视网膜母细胞瘤细胞的增殖并且促进凋亡，具有很好的作用效果。
本发明一实施例还提出上述KC26多肽修饰的牛奶外泌体在制备用于治疗视网膜母细胞瘤药物中的应用。具体地，将KC26多肽修饰的牛奶外泌体与卡铂混合后得用于治疗视网膜母细胞瘤药物。
本发明实施例提出KC26多肽修饰的牛奶外泌体在作为肿瘤靶向纳米药物递送***的载体中的应用。以牛奶外泌体为载体，使用KC26多肽进行修饰可以靶向肿瘤细胞及其微环境中的天冬酰胺内肽酶，以卡铂作为抗肿瘤药物，三者有机结合制备了卡铂-KC26多肽-牛奶外泌体，具有高生物相容性和安全性。
相较于单独使用卡铂和卡铂-牛奶外泌体，卡铂-KC26多肽-牛奶外泌体对视网膜母细胞瘤细胞增殖和凋亡能力的影响具有显著意义，其作用效果有了显著提高。这主要是由于牛奶外泌体的脂质双层结构具有高的生物相容性，可以载带药物进入视网膜母细胞瘤细胞。与脂质体、树枝状大分子和聚合物等合成纳米制剂相比，外泌体尺寸小、生物相容性好、毒性低，更适合作为药物输送载体。并且，KC26多肽的存在能够让其底物肽与视网膜母细胞瘤细胞分泌的天冬酰胺内肽酶进行酶响应，从而穿膜肽被激活将载药牛奶外泌体靶向肿瘤细胞，从而提高化疗药物的抗肿瘤效果。
下面将结合实施例详细阐述本发明。
实施例1一种KC26多肽修饰的牛奶外泌体的制备方法
牛奶用TA-10.250转子和Allegra 25R离心机，4℃在250mL离心瓶中以13000g离心30min，去除脂肪球、酪蛋白和其他碎片。乳清通过乳酪布收集，随后转移到70mL聚碳酸酯管中，并在4℃使用Optima LE-80K超速离心机(贝克曼库尔特，美国)在10万g的45-Ti型固定角转子中离心60min，去除大颗粒和微泡。上清液(70mL/管)最终在135 000g，4℃，用OptimaLE-80K超离心机在45-Ti型固定角转子中离心90min，弃上清，用PBS洗涤三次。将外泌体沉淀重新悬浮于PBS中，得到匀质的悬浮液，再通过0.22μm过滤器过滤灭菌。
取牛奶外泌体12mg，用1mL甲醇溶解。称取KC26多肽36mg，用10mL超纯水溶解，放在磁力搅拌器上缓慢搅拌。用移液器缓慢的将牛奶外泌体加到多肽溶液中，在4度反应24小时，冻干保存。
所得KC26多肽修饰的牛奶外泌体采用扫描电镜进行形貌分析，结果见图1。
试验例1采用CCK-8法检测药物(KC26多肽修饰的牛奶外泌体包载卡铂)对细胞(视网膜母细胞瘤细胞系Y79、WERI-Rb1细胞)增殖能力的影响
将稳定生长的视网膜母细胞瘤细胞系Y79、WERI-Rb1细胞按照1×104/孔接种于96孔板，每组至少设3个复孔,在不同时间段加入10微升的CCK-8试剂，并在37℃孵育1.5-2小时。使用酶标仪测定在450纳米处每孔的吸光度(OD)值。视网膜母细胞瘤(Y79)细胞采用CCK-8试剂实验检测给药48小时后，测不同浓度下的卡铂、卡铂-牛奶外泌体、卡铂-KC26多肽-牛奶外泌体的细胞抑制率，结果见图2-3。
由图2可得，相同浓度下，卡铂-KC26多肽-牛奶外泌体对Y79细胞的抑制率显著大于另外两组，表明卡铂-KC26多肽-牛奶外泌体显著提高了卡铂的作用效果。
其中，细胞抑制率的计算如下：细胞抑制率(％)＝(对照组吸光度值-实验组吸光度值)/对照组吸光度值×100％。*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001,****P＜0.0001。
由图3可得，相同浓度下，卡铂-KC26多肽-牛奶外泌体对Y79细胞的抑制率显著大于另外两组，表明卡铂-KC26多肽-牛奶外泌体显著提高了卡铂的作用效果。
其中，细胞抑制率的计算如下：细胞抑制率(％)＝(对照组吸光度值-实验组吸光度值)/对照组吸光度值×100％。*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001,****P＜0.0001。
试验例2流式细胞术用于检测药物(KC26多肽修饰的牛奶外泌体包载卡铂)对细胞(视网膜母细胞瘤细胞系Y79和WERI-Rb1细胞)凋亡能力的影响
收集接种于6孔板中的视网膜母细胞瘤细胞系Y79和WERI-Rb1细胞并用磷酸盐缓冲液洗涤两次。根据细胞凋亡检测试剂盒，把收集的细胞悬浮于缓冲液中。然后加入异硫氰酸荧光素和碘化丙啶室温避光反应10-15分钟。最后使用流式细胞仪检测凋亡细胞。
视网膜母细胞瘤细胞系Y79的测试试验中，细胞凋亡率(％)＝Q2+Q3。阴性对照组不给药，三组实验组中卡铂的浓度为50微克/毫升，结果见图4。
由图4可得，卡铂-KC26多肽-牛奶外泌体对肿瘤细胞凋亡率的影响具有显著意义，且相同浓度下卡铂-KC26多肽-牛奶外泌体对Y79细胞的凋亡率显著大于另外两组，表明卡铂-KC26多肽-牛奶外泌体显著提高了卡铂的作用效果。***P＜0.001,****P＜0.0001。
WERI-Rb1细胞的测试试验中，细胞凋亡率(％)＝Q2+Q3。阴性对照组不给药，三组实验组中卡铂的浓度为50微克/毫升，结果见图5。
由图5可得，卡铂-KC26多肽-牛奶外泌体对肿瘤细胞凋亡率的影响具有显著意义，且相同浓度下卡铂-KC26多肽-牛奶外泌体对Y79细胞的凋亡率显著大于另外两组，表明卡铂-KC26多肽-牛奶外泌体显著提高了卡铂的作用效果。**P＜0.01,***P＜0.001,****P＜0.0001。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.KC26多肽修饰的牛奶外泌体在制备用于治疗视网膜母细胞瘤药物中的应用，其特征在于，将KC26多肽修饰的牛奶外泌体与卡铂混合得用于治疗视网膜母细胞瘤药物；
其中，所述KC26多肽修饰的牛奶外泌体的制备方法，包括如下步骤：
(a)制备牛奶外泌体，将所得牛奶外泌体添加至溶剂中，得牛奶外泌体溶液；
(b)将KC26多肽添加至超纯水中，搅拌，得多肽溶液；
(c)将上述牛奶外泌体溶液添加到上述多肽溶液中，反应后，冻干保存，得KC26多肽修饰的牛奶外泌体；所述牛奶外泌体与所述KC26多肽的质量比为1:3。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，
步骤(c)中，所述反应为4℃反应24小时。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，
步骤(b)中，所述KC26多肽与超纯水的比例为36mg：10mL。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，
步骤(a)中，所述牛奶外泌体与溶剂的比例为12mg：1mL；
所述溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、尿素、甘油、氢氧化钠或乙酸中至少一种。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，
步骤(a)中，所述牛奶外泌体的制备方法，包括如下步骤：
(a1)牛奶第一离心后，去除脂肪球、酪蛋白和碎片，得第一溶液；
(a2)将上述第一溶液第二离心后，去除大颗粒和微泡，得第二溶液；
(a3)将上述第二溶液第三离心后，弃上清液，洗涤沉淀，得外泌体沉淀；
(a4)将上述外泌体沉淀重新悬浮于磷酸盐缓冲液中，通过0.22μm过滤器过滤、灭菌，得牛奶外泌体。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，
步骤(a1)中，所述第一离心为4℃以13000g离心30min；
步骤(a2)中，所述第二离心为4℃以10万g离心60min；
步骤(a3)中，所述第三离心为4℃以135000g离心90min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210643259.2A CN115089727B (zh) | 2022-06-08 | 2022-06-08 | Kc26多肽修饰的牛奶外泌体及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210643259.2A CN115089727B (zh) | 2022-06-08 | 2022-06-08 | Kc26多肽修饰的牛奶外泌体及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115089727A CN115089727A (zh) | 2022-09-23 |
| CN115089727B true CN115089727B (zh) | 2024-05-07 |
Family
ID=83289249
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210643259.2A Active CN115089727B (zh) | 2022-06-08 | 2022-06-08 | Kc26多肽修饰的牛奶外泌体及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115089727B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116785194A (zh) * | 2023-08-21 | 2023-09-22 | 天津外泌体科技有限公司 | 牛奶外泌体装载烷基化美容肽及在化妆品中的应用 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104177474A (zh) * | 2014-08-22 | 2014-12-03 | 亚飞（上海）生物医药科技有限公司 | 一种肿瘤微环境靶向激活的多烯紫杉醇衍生物及其用途 |
| CN105727305A (zh) * | 2016-02-24 | 2016-07-06 | 温州医科大学 | 一种Legumain响应释放阿霉素缓释纳米制剂及制备方法与作为制备载体药物的应用 |
| US10166259B1 (en) * | 2016-03-15 | 2019-01-01 | 3P Biotechnologies, Inc. | Isolation of exosomes from colostrum powder and exosomal drug formulations using the same |
| CN111012924A (zh) * | 2020-01-02 | 2020-04-17 | 江南大学附属医院 | 一种基于牛奶外泌体的靶向载药体系 |
| CN112175997A (zh) * | 2020-09-08 | 2021-01-05 | 上海健康医学院 | 靶向外泌体pkm2改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的应用 |
| CN112791092A (zh) * | 2021-01-18 | 2021-05-14 | 大连医科大学 | 一种牛奶外泌体负载淫羊藿苷纳米制剂的制备及应用 |
| CN113198020A (zh) * | 2021-04-29 | 2021-08-03 | 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) | 靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送***的制备方法及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1635858A4 (en) * | 2003-05-29 | 2009-08-26 | Scripps Research Inst | TARGETED RELEASE ON CELLS EXPRESSING LEGUMINUM |
| NZ608748A (en) * | 2010-09-02 | 2015-05-29 | Scripps Research Inst | Nanoparticle-based tumor-targeted drug delivery |
-
2022
- 2022-06-08 CN CN202210643259.2A patent/CN115089727B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104177474A (zh) * | 2014-08-22 | 2014-12-03 | 亚飞（上海）生物医药科技有限公司 | 一种肿瘤微环境靶向激活的多烯紫杉醇衍生物及其用途 |
| CN105727305A (zh) * | 2016-02-24 | 2016-07-06 | 温州医科大学 | 一种Legumain响应释放阿霉素缓释纳米制剂及制备方法与作为制备载体药物的应用 |
| US10166259B1 (en) * | 2016-03-15 | 2019-01-01 | 3P Biotechnologies, Inc. | Isolation of exosomes from colostrum powder and exosomal drug formulations using the same |
| CN111012924A (zh) * | 2020-01-02 | 2020-04-17 | 江南大学附属医院 | 一种基于牛奶外泌体的靶向载药体系 |
| CN112175997A (zh) * | 2020-09-08 | 2021-01-05 | 上海健康医学院 | 靶向外泌体pkm2改善非小细胞肺癌顺铂耐药性的应用 |
| CN112791092A (zh) * | 2021-01-18 | 2021-05-14 | 大连医科大学 | 一种牛奶外泌体负载淫羊藿苷纳米制剂的制备及应用 |
| CN113198020A (zh) * | 2021-04-29 | 2021-08-03 | 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) | 靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送***的制备方法及其应用 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| Bioengineered Macrophages Can Responsively Transform into Nanovesicles To Target Lung Metastasis;Cao Haiqiang等;《NANO LETTERS》;第18卷(第08期);第4762-4770页 * |
| Exosome Mediated Cytosolic Cisplatin Delivery Through Clathrin-Independent Endocytosis and Enhanced Anti-cancer Effect via Avoiding Endosome Trapping in Cisplatin-Resistant Ovarian Cancer;Zhou Guannan等;《FRONTIERS IN MEDICINE》;第09卷;摘要部分、第2页左栏第1行至右栏第22行、第2页右栏第33页至第3页左栏第29行 * |
| Zhou Guannan等 .Exosome Mediated Cytosolic Cisplatin Delivery Through Clathrin-Independent Endocytosis and Enhanced Anti-cancer Effect via Avoiding Endosome Trapping in Cisplatin-Resistant Ovarian Cancer.《FRONTIERS IN MEDICINE》.2022,第09卷摘要部分、第2页左栏第1行至右栏第22行、第2页右栏第33页至第3页左栏第29行. * |
| 叶酸受体-α、Legumain在视网膜母细胞瘤细胞系的表达实验研究;黄平等;《医学研究杂志》;第44卷(第09期);第47-51页 * |
| 基于酶响应型脂质体共递送辛伐他汀及紫杉醇克服肿瘤EMT相关耐药的研究;金红跃;《中国博士学位论文全文数据库 工程科技I辑》(第2020年第1期);第51页第1行至第53页第26行、第59页第11行至第60页第6行 * |
| 外泌体作为药物递送载体的研究进展;周建芬等;《中国医药工业杂志》;第51卷(第04期);第425-433页 * |
| 贺林等主编.《临床遗传学》.上海科学技术出版社,2013,(第2013年5月第1版),第602-603页. * |
| 金红跃.基于酶响应型脂质体共递送辛伐他汀及紫杉醇克服肿瘤EMT相关耐药的研究.《中国博士学位论文全文数据库 工程科技I辑》.2020,(第2020年第1期),第51页第1行至第53页第26行、第59页第11行至第60页第6行. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115089727A (zh) | 2022-09-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108815521B (zh) | 一种用于肿瘤联合治疗的光敏型细胞膜仿生的靶向纳米药物及其制备 | |
| CN112089704B (zh) | 一种仿生纳米载体及其制备方法和应用 | |
| CN109666695B (zh) | 一种靶向整合素αvβ3的外泌体载体及其制备方法和应用 | |
| US6139836A (en) | Method of encapsulating biologically active agents within erythrocytes, and apparatus therefor | |
| AU2005270977B2 (en) | Lysis/resealing process and device for incorporating an active ingredient in erythrocytes | |
| CN105727307B (zh) | 一种硫辛酸修饰的纳米多肽载体及其制备方法和应用 | |
| CN102327230B (zh) | 一种包裹紫杉烷类药物的蛋白纳米颗粒及其制备方法 | |
| CN110623925B (zh) | 一种雷帕霉素纳米缓释剂及其制备方法 | |
| CN114259477B (zh) | 一种促渗透、缓解肿瘤缺氧并能靶向肿瘤细胞的纳米递送体系及其制备方法和应用 | |
| CN112716915A (zh) | 仿生纳米载体及其在制备脑胶质瘤治疗药物的应用 | |
| CN115089727B (zh) | Kc26多肽修饰的牛奶外泌体及其制备方法和应用 | |
| CN111569082A (zh) | 一种包载蛋白多肽类药物外泌体的口服递送*** | |
| NL2033447B1 (en) | Brain-targeting erythrocyte membrane-enveloped salvianolic acid b nanoparticles as well as preparation method and application thereof | |
| CN112773775A (zh) | 一种负载去甲斑蝥素外泌体的制备方法及其应用 | |
| CN113633625A (zh) | 一种杂膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物及其制备方法 | |
| CN111744009A (zh) | 一种双靶向的酸敏感普鲁士蓝载药体系的制备方法及应用 | |
| CN114642736B (zh) | 一种透血脑屏障药物递送***及其制备方法和应用 | |
| CN101391098A (zh) | 一种蜂毒素脂质体制剂及其制备方法 | |
| CN105997892A (zh) | 一种微球生物新材料包裹sod活性药物载体制备方法 | |
| CN116262138A (zh) | 一种具有核壳结构的pH响应型外泌体载体及其制备方法与应用 | |
| CN115975947A (zh) | 一种miR-99b-5p过表达的工程化间充质干细胞源外泌体的制备方法及其应用 | |
| CN109662956A (zh) | 一种齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒的应用 | |
| CN115252790A (zh) | 双靶向的肿瘤微环境响应的多功能纳米递送***及其制备方法与应用 | |
| CN110585168A (zh) | 一种利用细胞表面囊泡作为药物载体的用途 | |
| CN107468651A (zh) | 一种包载基质金属蛋白酶抑制剂的温度响应型纳米脂质体的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |